WO2017122650A1 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents

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WO2017122650A1
WO2017122650A1 PCT/JP2017/000546 JP2017000546W WO2017122650A1 WO 2017122650 A1 WO2017122650 A1 WO 2017122650A1 JP 2017000546 W JP2017000546 W JP 2017000546W WO 2017122650 A1 WO2017122650 A1 WO 2017122650A1
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seq
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glucose
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PCT/JP2017/000546
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涼 竹中
高史 宅見
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池田食研株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)

Definitions

  • the present invention relates to a glucose dehydrogenase, a polynucleotide encoding the enzyme, a method for producing the enzyme, a method for measuring glucose using the enzyme, a measuring reagent composition, a biosensor, and the like.
  • Measurement of glucose (blood glucose) concentration in blood is mainly important in blood glucose control of diabetic patients.
  • biosensors are widely used as blood glucose measurement devices using enzymes.
  • Glucose oxidase and glucose dehydrogenase are known as enzymes that can be used in biosensors.
  • glucose oxidase has a problem that measurement errors occur due to dissolved oxygen in the blood.
  • glucose dehydrogenases flavin-binding glucose dehydrogenases derived from eukaryotic cells are not affected by dissolved oxygen, do not require the addition of coenzymes, and are excellent in substrate specificity. It is useful as an enzyme for use (Patent Documents 1 to 5).
  • the present invention provides a glucose dehydrogenase having high substrate specificity, a polynucleotide encoding the enzyme, a method for producing the enzyme, a method for measuring glucose using the enzyme, a measurement reagent composition, and a biosensor. Furthermore, a measurement reagent composition and a method for producing a biosensor are provided.
  • the inventors searched for glucose dehydrogenases derived from various microorganisms and found a flavin-binding glucose dehydrogenase with high substrate specificity. Furthermore, they found an efficient method for producing flavin-binding glucose dehydrogenase and completed the present invention.
  • [2] The protein according to [1], wherein oxygen is not an electron acceptor.
  • [4] A polynucleotide encoding the protein according to [1].
  • [5] A recombinant vector comprising the polynucleotide according to [4].
  • [6] A transformed cell transformed with the vector according to [5].
  • a method for producing a flavin-binding glucose dehydrogenase comprising culturing the cell according to [6] and collecting a flavin-binding glucose dehydrogenase from the culture.
  • It consists of a protein having the following amino acid sequence (a), (b), (c), (d) or (e) and having glucose dehydrogenase activity, and does not use oxygen as an electron acceptor:
  • a method for measuring glucose that is substantially unaffected by dissolved oxygen using a flavin-binding glucose dehydrogenase (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (B) an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (C) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having an N-terminus of SS; (D) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and
  • the protein has the following amino acid sequence (a), (b), (c), (d) or (e) and has glucose dehydrogenase activity, and oxygen is not used as an electron acceptor.
  • a reagent composition for glucose measurement which contains a flavin-binding glucose dehydrogenase and is substantially unaffected by dissolved oxygen: (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (B) an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (C) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having an N-terminus of SS; (D) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and not including the sequence shown in SEQ ID NO: 8 at the N-terminus; (E) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the protein comprises the following amino acid sequence (a), (b), (c), (d) or (e) and has glucose dehydrogenase activity, and oxygen is not used as an electron acceptor.
  • a flavin-binding glucose dehydrogenase with high substrate specificity was obtained.
  • the enzyme can be easily produced. Furthermore, by using the enzyme, measurement that is not easily influenced by other saccharides or dissolved oxygen can be performed, and a measurement reagent composition and a biosensor capable of highly accurate measurement can be manufactured.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is a protein having the following amino acid sequence (a), (b), (c), (d) or (e) and having glucose dehydrogenase activity. “Protein” also includes glycoproteins.
  • A The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • B An amino acid sequence in which 1, 2, or 3 amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. Or an amino acid sequence in which 1 to 10, preferably at most 9, 8, 6, 5, 4, 3 or 2 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 have been deleted or substituted .
  • C an amino acid sequence having identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and N-terminal being SS.
  • the N-terminus is preferably SSQ, SSQR, SSQRF or SSQRFD.
  • D An amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and does not include the sequence shown in SEQ ID NO: 8 at the N-terminus.
  • E An amino acid sequence having identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. The identity is preferably at least 80%, 85%, 90%, 92% or 95%, more preferably at least 97%, 98%, 99% or 99.5%.
  • the enzyme is preferably a protein having an amino acid sequence of (a), (b), (c), (d) or (e) and having glucose dehydrogenase activity.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is not particularly limited as long as it is a protein having the above sequence, and may be an enzyme obtained by culturing cells or a synthetic enzyme obtained by synthesis. A recombinant enzyme obtained by genetic recombination is preferred.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase of the present invention has the following properties (1) to (5).
  • flavins include flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN), and FAD is preferred.
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • FAD is preferred.
  • Soluble. Soluble.
  • Oxygen is not substantially used as an electron acceptor.
  • the activity against 50 mM glucose is 100%
  • the activity against 50 mM maltose or D-galactose is preferably at most 2.0%, more preferably at most 1.5%, 1.0% or 0.5%.
  • the molecular weight of the polypeptide of the enzyme is 50 to 70 kDa. Preferably, it is 55 to 65 kDa.
  • the molecular weight of the polypeptide of the enzyme is the molecular weight when the molecular weight of the protein part from which the sugar chain has been removed is measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the molecular weight of the entire enzyme as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis varies depending on the culture conditions, purification conditions, etc., depending on the amount of glycan addition. The amount of added sugar changes and the molecular weight changes.
  • the molecular weight of the whole enzyme by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is preferably 60 to 120 kDa, more preferably 70 to 90 kDa, and even more preferably 75 to 85 kDa.
  • the polynucleotide of the present invention encodes a protein comprising the following (i), (ii), (iii), (iv), (v) or (vi) and having glucose dehydrogenase activity.
  • nucleotide (Iv) A polynucleotide encoding a protein having a base sequence identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an N-terminus that is SS. The N-terminus is preferably SSQ, SSQR, SSQRF or SSQRFD.
  • V a polynucleotide encoding a protein having a base sequence identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and not containing the sequence shown in SEQ ID NO: 8 at the N-terminus.
  • (Vi) A polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a base sequence having identity to the sequence.
  • the identity is preferably at least 80%, 85%, 90%, 92% or 95%, more preferably at least 97%, 98%, 99% or 99.5%.
  • the identity in this specification is an identity value calculated by homology analysis between the base sequences of GENETYX (registered trademark: manufactured by Genetics) or between amino acid sequences.
  • GENETYX registered trademark: manufactured by Genetics
  • GENETYX genetic information analysis software (Genetic Information Processing Software), and “Lipman-Pearson method” (Biochem, J. vol. 203, 527-528) is adopted as a homology analysis program.
  • the recombinant vector of the present invention is a cloning vector or an expression vector, and the vector can be appropriately selected.
  • the vector includes the polynucleotide of the present invention as an insert, and further includes a nucleic acid sequence that is heterogeneous with the insert.
  • the polynucleotide of the present invention may be an intron-containing sequence or a cDNA sequence as long as it can be expressed in a host.
  • the insert may be a polynucleotide optimized for codon usage corresponding to the host cell.
  • the expression level of the recombinant protein may be improved by replacing the stop codon with a stop codon optimal for the host.
  • a polynucleotide encoding a protein that contributes to the expression of chaperone, lysozyme, etc. is introduced into the same vector as the polynucleotide of the present invention and / or introduced into another vector and introduced into the same host. It is also possible to hold it.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention may be expressed using a vector that can be expressed as a fusion protein to which various tags such as a His tag, a FLAG tag, and GFP are added.
  • expression vectors for expressing recombinant proteins in prokaryotic cells include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system, and pCold expression system.
  • expression vectors for expressing recombinant proteins in eukaryotic cells include pKA1, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, and pYE82.
  • Examples of host cells that can be used include prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as fungi (yeast, filamentous fungi (ascomycetes, basidiomycetes, etc.)), insect cells, and mammalian cells.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the vector of the present invention into the cell for transformation.
  • the vector may be maintained in a transformed cell in the state of a plasmid, or may be maintained by being integrated into a chromosome.
  • the host can be appropriately selected according to the necessity of the sugar chain, the necessity, and the necessity of other peptide modifications. However, the host to which the sugar chain can be added is selected, and the enzyme (glycoprotein) having the sugar chain is selected. It is preferable to manufacture.
  • Recombinant glucose dehydrogenase can be produced by collecting glucose dehydrogenase from a culture obtained by culturing the transformed cells of the present invention.
  • a normal microbial culture medium For cultivation of the glucose dehydrogenase-producing bacterium used in the present invention, a normal microbial culture medium can be used.
  • any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as they contain moderate amounts of carbon sources, nitrogen sources, vitamins, inorganic substances, and other micronutrients required by microorganisms to be used.
  • the carbon source glucose, sucrose, dextrin, starch, glycerin, molasses and the like can be used.
  • nitrogen sources include inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, amino acids such as DL-alanine and L-glutamic acid, and peptone, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, etc. Nitrogen-containing natural products can be used. As an inorganic substance, monosodium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, ferric chloride and the like can be used.
  • the culture for obtaining the glucose dehydrogenase of the present invention is usually preferably carried out under aerobic conditions by methods such as shaking culture and aeration stirring.
  • culture conditions suitable for the production of glucose dehydrogenase may be set.
  • the culture temperature is preferably 20 to 50 ° C. and pH 4 to pH 8, and the pH may be adjusted during the culture in consideration of productivity.
  • the culture period is preferably in the range of 2 days to 10 days.
  • an ordinary protein production method can be used as a method for obtaining glucose dehydrogenase from the culture. For example, after first culturing a glucose dehydrogenase-producing bacterium, a culture supernatant is obtained by centrifugation. Alternatively, cultured cells are obtained, the cultured microorganisms are crushed by an appropriate method, and a supernatant is obtained from the crushed liquid by centrifugation or the like. Next, the glucose dehydrogenase contained in these supernatants can be purified by an ordinary protein purification method to obtain a purified enzyme. For example, it can be purified by combining purification operations such as ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, heat treatment, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and affinity chromatography.
  • purification operations such as ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, heat treatment, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and affinity chromat
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be used after drying. If the enzyme is not inactivated, the drying method is not limited, but it is preferable to obtain a lyophilized product by lyophilization. Buffering agents and stabilizers can be added in the drying step. You may grind
  • Glucose can be measured using the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the glucose measurement method of the present invention can quantitate glucose in a test sample by including a step of bringing a test sample containing glucose into contact with the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the test sample is not particularly limited, but a biological sample can be exemplified, and specific examples include blood, tears, saliva, urine, interstitial fluid, and the like.
  • the enzyme of the present invention is particularly useful for blood glucose measurement.
  • the present invention provides a production method for producing a glucose measurement reagent composition, a glucose measurement kit or a glucose measurement biosensor using the glucose dehydrogenase of the present invention. Since the enzyme of the present invention has high substrate specificity and does not substantially use oxygen as an electron acceptor, it is hardly affected by other saccharides and dissolved oxygen in the measurement sample in glucose measurement. Therefore, it is possible to provide a glucose measurement reagent composition, a glucose measurement kit, or a glucose measurement biosensor that is hardly affected by other saccharides or dissolved oxygen, and glucose measurement with high measurement accuracy is possible.
  • the reagent composition for glucose measurement of the present invention may be a reagent composition containing the glucose dehydrogenase of the present invention as an enzyme.
  • the amount of enzyme in the composition is not particularly limited as long as glucose in a sample can be measured, but the amount of enzyme per measurement is preferably about 0.01 to 100 U, more preferably about 0.05 to 50 U, more preferably 0.1 To about 20U is more preferable.
  • the composition preferably contains a buffer, and may contain other optional components known to those skilled in the art, such as stabilizers, to improve the thermal stability and storage stability of the enzyme and reagent components. preferable.
  • the component examples include bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin, saccharides or sugar alcohols having no activity with the enzyme, carboxyl group-containing compounds, alkaline earth metal compounds, ammonium salts, sulfates or proteins. .
  • BSA bovine serum albumin
  • a known substance that suppresses the influence of a contaminant substance that affects the measurement present in the test sample may be included in the measurement reagent.
  • the glucose measurement kit of the present invention may contain the reagent composition and a glucose standard solution.
  • the biosensor of the present invention may be a sensor containing the glucose dehydrogenase of the present invention as an enzyme.
  • an electrochemical biosensor is manufactured by including a substrate, a counter electrode, a working electrode, a mediator, and the enzyme.
  • mediators include proteinaceous electron mediators such as heme, ferricyanide compounds, quinone compounds, osmium compounds, phenazine compounds, phenothiazine compounds, and the like.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention can be used in a biobattery.
  • the biobattery according to the present invention includes an anode electrode that performs an oxidation reaction and a cathode electrode that performs a reduction reaction, and includes an electrolyte layer that separates the anode and the cathode as necessary.
  • An enzyme electrode containing the above-mentioned electron mediator and glucose dehydrogenase is used as an anode electrode, and electrons generated by oxidizing the substrate are taken out to the electrode and protons are generated.
  • an enzyme generally used for the cathode electrode may be used on the cathode side, for example, by using laccase, ascorbate oxidase or bilirubin oxidase, and reacting protons generated on the anode side with oxygen. Generate water.
  • the electrode generally used for a bio battery such as carbon, gold
  • the enzyme is preferably diluted as appropriate so that the final concentration is 0.15-0.6 U / mL.
  • the enzyme activity unit (U) of the enzyme is an enzyme activity that oxidizes 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • the enzyme activity of the glucose dehydrogenase of the present invention can be measured by the following method.
  • the amount of decrease per minute ( ⁇ A600) in absorbance at 600 nm accompanying the progress of the enzyme reaction was measured for 5 minutes from the start of the reaction, and the enzyme activity was calculated from the linear portion according to the following formula. At this time, the enzyme activity was defined as 1 U for the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute at 37 ° C. and pH 6.0.
  • 3.0 is the amount of reaction reagent + enzyme solution (mL)
  • 10.8 is the molar extinction coefficient of DCIP at pH 6.0
  • 1.0 is the optical path length (cm) of the cell
  • 0.05 represents the amount of the enzyme solution (mL)
  • ⁇ A600 blank represents the amount of decrease in absorbance per minute at 600 nm when the reaction was started by adding a diluted enzyme solution instead of the enzyme solution.
  • cDNA library was prepared from the RNA obtained in (2) by reverse transcription using reverse transcriptase and an oligo dT primer with an adapter sequence.
  • SMARTER RACE cDNA Amplification kit manufactured by Takara Bio Inc. was used, and the reaction conditions were performed according to the protocol described in the manual.
  • E. coli JM109 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed by a known method.
  • a plasmid vector was extracted and purified from the obtained transformant using NucleoSpin Plasmid QuickPure (Takara Bio Inc.), and the base sequence of the insert was determined.
  • primers for elucidating the upstream and downstream sequences of the GLD gene were designed. Using these primers, 1758 bases of the full-length GLD gene from the start codon to the stop codon were elucidated by 5'RACE method and 3'RACE method. The gene sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Plasmid vectors were prepared using an improved promoter of the amylase system derived from oryzae.
  • a PCR product containing the GLD gene was obtained using the cDNA library obtained in (3) as a template.
  • the following primer pairs of F4570-Ori (SEQ ID NO: 4) and F4570-R-1st (SEQ ID NO: 5) were used.
  • a GfGLD gene for vector insertion was prepared using the PCR product as a template.
  • the following primer pairs F4570-Ori (SEQ ID NO: 4) and F4570-R-2nd (SEQ ID NO: 6) were used.
  • the GLD gene prepared downstream of the promoter was ligated to produce a plasmid vector that can express the gene.
  • the prepared plasmid vector for expression was introduced into E. coli JM109 strain for transformation.
  • the obtained transformant was cultured, and a plasmid vector was extracted from the collected cells using illustra plasmidPrep Midi Flow Kit (manufactured by GE Healthcare).
  • illustra plasmidPrep Midi Flow Kit manufactured by GE Healthcare
  • F4570-Ori (SEQ ID NO: 4): 5 '-(CCGCAGCTCGTCAAA) ATGCTGCGCTCCATTGTCTC-3' (In parentheses: transcription enhancer) F4570-R-1st (SEQ ID NO: 5): 5 '-((GTTCATTTA)) GGCGGAAGCCTTGATGATG-3' (In double brackets: pSEN vector sequence) F4570-R-2nd (SEQ ID NO: 6): 5 '-((GTTACGCTTCTAGA GCATGC GTTCATTTA)) GGCGG-3' (In double brackets: pSEN vector sequence, underlined: restriction enzyme site (SphI))
  • the transformant obtained in (6) was inoculated into the cooled liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the supernatant was collected by centrifugation, and the GLD activity was measured by the aforementioned GLD activity measurement method. As a result, the GLD activity of the present invention was confirmed.
  • 100 mL of the seed culture solution was inoculated into a cooled liquid medium and cultured at 30 ° C., 400 rpm, 1 v / v / m for 96 hours. After completion of the culture, the culture solution was filtered with a filter cloth, and the collected filtrate was centrifuged to collect the supernatant, and further filtered with a membrane filter (10 ⁇ m, manufactured by Advantech) to collect the crude enzyme solution.
  • the recovered crude enzyme solution was purified by removing contaminating proteins using a Cellufine A-500 (manufactured by JNC) column and a TOYOPEARL Butyl-650C (manufactured by Tosoh Corp.) column.
  • the purified sample was concentrated with an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 8,000, and then water-replaced to obtain purified GLD.
  • the purified GLD was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis and confirmed to show a single band.
  • Example 1 (Examination of enzymatic chemistry of GLD of the present invention) Various properties of the purified GLD obtained in Example 1 were examined.
  • (1) Measurement of absorption spectrum With respect to the purified GLD obtained in Example 1, the absorption spectrum at 300-600 nm before and after the addition of D-glucose was measured using a plate reader (SpectraMax Plus 384, manufactured by Molecular Devices). As a result, the absorption maximums observed at wavelengths of about 360 to 380 nm and about 450 to 460 nm disappeared by the addition of D-glucose, which revealed that the GLD of the present invention is a flavin-binding protein.
  • the GLD of the present invention has no glucose oxidase activity. Therefore, it was shown that the GLD of the present invention does not use oxygen as an electron acceptor, and thus is hardly affected by dissolved oxygen in the reaction system when quantifying D-glucose.
  • the GLD of the present invention had an activity against maltose or D-galactose of 0.3% or 0.4% when the activity against D-glucose was 100%, and both were 2.0% or less.
  • N-terminal sequence Analysis of the N-terminal of purified GLD obtained in Example 1 revealed that it was SSQRF. That is, among the 1758 bases of the full-length GLD gene starting from the start codon described in SEQ ID NO: 1, 63 bases shown in SEQ ID NO: 7 are sequences encoding a signal sequence, and 21 amino acids shown in SEQ ID NO: 8 are signal sequences. There is a possibility.
  • the amino acid sequence of the mature protein obtained in Example 1 is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • L2G906 is a sequence consisting of 585 amino acids derived from Colletotrichum gloeosporioides (strain Nara gc5), and is annotated as “glucose oxidase” (glucose oxidase). Furthermore, 1 to 17 amino acids of the sequence are signal peptides, and 18 to 585 amino acids are mature proteins (http://www.uniprot.org/uniprot/L2G906). That is, the signal sequence is 17 amino acids of MLRSIVSLPLLAATALA, and the N-terminal sequence is YPAAS.
  • the purified GLD obtained in Example 1 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the N-terminal sequence is SSQRF, and the protein consisting of the amino acid shown in SEQ ID NO: 3 is not glucose oxidase,
  • the fact that it is a glucose dehydrogenase that does not use oxygen as an electron acceptor, and that the GLD of the present invention can be used for glucose measurement that is substantially unaffected by dissolved oxygen is a novel technical content with respect to L2G906. Since then, it was impossible to predict.
  • the molecular weight of the purified GLD obtained in Example 1 before and after sugar chain cleavage was determined by the following method. As a sugar chain cleavage treatment, 10 ⁇ L (50 mU) of endoglycosidase H (Roche) was added to the sample and reacted at 25 ° C. for 16 hours. 5 ⁇ L of GLD solution (prepared to 1.0 mg / mL each) before and after glycosylation, and 5 ⁇ L of 0.4 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 1% SDS and 2% ⁇ -mercaptoethanol, Heat treatment was performed at 100 ° C. for 3 minutes.
  • Samples before and after the sugar chain cleavage treatment were subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis using 7.5% of e-pagel (manufactured by Atto), and stained after the electrophoresis by Coomassie brilliant blue (with CBB).
  • the molecular weight was determined by comparing the mobility of GLD and molecular weight marker (excellband all blue regular range protein marker marker PM1500 manufactured by SMOBIO. As a result, the molecular weight before sugar chain cleavage was about 83 kDa, It was about 58 kDa.
  • Example 2 The purified GLD obtained in Example 1 was put in a glass container and allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 1 hour or longer to perform preliminary freezing. The pre-frozen GLD was placed in a vacuum freeze dryer and processed for about 16 hours. The obtained freeze-dried GLD was finely pulverized to recover powdered GLD. In addition, the activity fall was not seen before and after the process of this process.
  • Example 3 (Measurement of glucose by biosensor) Using the GLD obtained in Example 3, the response current value with respect to the glucose concentration was measured.
  • a reagent for measuring glucose was prepared so that the final concentration was as follows, and 1 ⁇ L of the reagent was applied on a chip (DEP-chip, manufactured by Biodevice Technology) and dried.
  • Reagent for glucose measurement 33 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), 10 mM mediator, 100 mM sodium chloride and 1,000 U / mL GLD. 2 ⁇ L of 0, 5, 10, 20 or 40 mM glucose solution was added to the chip and applied in the range of ⁇ 0.4 to +0.4 V, and the response current value was measured.
  • the current value at each glucose concentration when +0.4 V was applied is shown in FIG. As a result, it was shown that D-glucose can be quantified using the GLD of the present invention in D-glucose measurement using a biosensor.

Abstract

本発明の課題は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供すること。　本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質： （ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列； （ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列； （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列； （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列、等に関する。

Description

フラビン結合型グルコース脱水素酵素
　本発明は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサ等に関する。
　血液中のグルコース（血糖）濃度の測定は、主に糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。
　バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素やグルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である（特許文献１～５）。
国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット 国際公開２００６／１０１２３９号パンフレット 国際公開２００８／００１９０３号パンフレット 国際公開２０１３／０３１６６４号パンフレット 国際公開２０１３／１４７２０６号パンフレット
　血糖測定において、より基質特異性の高い酵素が求められていた。本発明は、基質特異性の高いグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する。更に、測定試薬組成物、及びバイオセンサの製造方法を提供する。
　発明者らは、種々の微生物由来のグルコース脱水素酵素を探索し、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素を見出した。更に、効率的なフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［８］の態様に関する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列。
［２］酸素を電子受容体としない、［１］記載のタンパク質。
［３］グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製し、該ベクターにより形質転換した形質転換細胞を培養して得られる組換えタンパク質である、［１］又は［２］記載のタンパク質。
［４］［１］に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［６］［５］に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
［７］［６］に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
［８］以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用する、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコースの測定方法：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
［９］以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定試薬組成物：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
［１０］以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用バイオセンサ：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
　本発明によって、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素が得られた。該酵素を簡便に製造できるようになった。更に、該酵素を使用することで、他の糖類や溶存酸素の影響を受け難い測定が可能になり、精度の高い測定が可能な測定試薬組成物及びバイオセンサが製造できるようになった。
本発明の酵素によるＤ－グルコース測定結果（吸光度計）を示す図である。 本発明の酵素によるＤ－グルコース測定結果（バイオセンサ）を示す図である。
　本発明のグルコース脱水素酵素は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。「タンパク質」とは糖タンパク質も含む。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１、２又は３個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。又は配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～１０個、好ましくは多くとも９個、８個、６個、５個、４個、３個又は２個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列。Ｎ末端は、好ましくはＳＳＱ、ＳＳＱＲ、ＳＳＱＲＦ又はＳＳＱＲＦＤである。
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列。
　前記同一性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％又は９５％が好ましく、少なくとも９７％、９８％、９９％又は９９．５％がより好ましい。
　該酵素は、好ましくは（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
　本発明のグルコース脱水素酵素は、前記配列を有するタンパク質であれば特に限定されず、細胞を培養して得られた酵素でもよく、合成によって得られた合成酵素でもよい。好ましくは遺伝子組換えによって得られた組換え酵素である。
　本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、下記の性質（１）～（５）を有する。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられ、好ましくはＦＡＤである。
　（１）作用：電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。
　（２）可溶性である。
　（３）酸素を実質的に電子受容体としない。
　（４）基質特異性が高い。５０ｍＭグルコースに対する作用性を１００％とした場合に、５０ｍＭマルトース又はＤ－ガラクトースに対する作用性が、何れも好ましくは多くとも２．０％、より好ましくは多くとも１．５％、１．０％又は０．５％である。
　（５）酵素のポリペプチドの分子量が５０～７０ｋＤａである。好ましくは、５５～６５ｋＤａである。酵素のポリペプチドの分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。例えばＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量は、６０～１２０ｋＤａが好ましく、７０～９０ｋＤａがより好ましく、７５～８５ｋＤａが更に好ましい。
　本発明のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）又は（ｖｉ）からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする。
（ｉ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ｉｉ）配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｉｉ）配列番号２に示される塩基配列において３、６又は９個の塩基が欠失又は付加されたポリヌクレオチド。又は配列番号２に示される塩基配列において１～１０個、好ましくは多くとも９個、８個、６個、５個、４個、３個もしくは２個の塩基が置換された塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｖ）配列番号２に示される塩基配列と同一性を有する塩基配列を有し、かつＮ末端がＳＳであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。Ｎ末端は、好ましくはＳＳＱ、ＳＳＱＲ、ＳＳＱＲＦ又はＳＳＱＲＦＤである。
（ｖ）配列番号２に示される塩基配列と同一性を有する塩基配列を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｖｉ）配列番号１に示される塩基配列又は該配列と同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド。
　前記同一性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％又は９５％が好ましく、少なくとも９７％、９８％、９９％又は９９．５％がより好ましい。
　本明細書での同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標：ゼネティックス社製）の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値とする。尚、「ＧＥＮＥＴＹＸ」は、遺伝情報解析ソフトウェア（Genetic Information Processing Software）であり、ホモロジー解析プログラムとして「Lipman-Pearson法」（Biochem,J.vol.203,527-528）が採用されている。
　本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択できる。ベクターは、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含み、更にインサートとはヘテロな核酸配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、宿主で発現可能であれば、イントロンを含んだ配列でも良く、ｃＤＮＡ配列でも良い。インサートは、宿主細胞に対応して、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドでも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパク質の発現量を向上させても良い。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの発現に寄与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一のベクターに導入する、及び／又は別のベクターに導入して同一宿主に保持させることも可能である。更に、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として発現できるベクターを使用して、本発明のグルコース脱水素酵素を発現しても良い。
　原核細胞で組換えタンパク質を発現させる場合の発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
　真核細胞で組換えタンパク質を発現させる場合の発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、糸状菌（子嚢菌、担子菌等）等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターを該細胞に導入して形質転換させることで、本発明の形質転換細胞を得ることができる。前記ベクターを、プラスミドのような状態で形質転換細胞内に維持しても良く、染色体中に組み込ませて維持しても良い。更に、糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素（糖タンパク質）を製造することが好ましい。
　本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物からグルコース脱水素酵素を採取することによって、組換えグルコース脱水素酵素を製造することができる。
　本発明で使用されるグルコース脱水素酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン及び糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ－アラニン及びＬ－グルタミン酸等のアミノ酸類、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス及びコーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム及び塩化第二鉄等が使用できる。
　本発明のグルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法による好気的条件下で行うのが良い。グルコース脱水素酵素生産菌の特性を踏まえて、グルコース脱水素酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は２０℃から５０℃、かつｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は、２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中にグルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。
　培養物中からグルコース脱水素酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初にグルコース脱水素酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれるグルコース脱水素酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。
　本発明のグルコース脱水素酵素は乾燥して使用することができる。酵素が失活しなければ乾燥方法は制限されないが、凍結乾燥により、凍結乾燥品を得るのが好ましい。乾燥工程で、緩衝液剤及び安定化剤を添加することができる。乾燥後に粉砕して、粉末化し、粉末品にしても良い。
　本発明のグルコース脱水素酵素を用いて、グルコースを測定することができる。本発明のグルコース測定方法は、グルコースを含む被検試料と本発明のグルコース脱水素酵素とを接触させる工程を含むことにより、被検試料中のグルコースを定量できる。被検試料は特に限定されないが、生体試料が例示でき、具体例として血液、涙、唾液、尿又は間質液等が例示できる。本発明の酵素は、特に血糖測定に有用である。
　本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコース測定用試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサを製造する製造方法を提供する。本発明の酵素は基質特異性が高く、酸素を実質的に電子受容体としないため、グルコース測定において、測定試料中の他の糖類及び溶存酸素の影響を受け難い。よって、他の糖類や溶存酸素の影響を受け難いグルコース測定用試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサが提供でき、測定精度の高いグルコース測定が可能である。
　本発明のグルコース測定用試薬組成物は、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、試料中のグルコースを測定できれば特に限定されないが、１測定あたりの酵素量が０．０１から１００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましく、０．１から２０Ｕ程度が更に好ましい。該組成物は、緩衝剤を含むことが好ましく、安定化剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めるのがより好ましい。前記成分としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等を例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませても良い。本発明のグルコース測定用キットは、前記試薬組成物を含み、グルコース標準液を含ませても良い。
　本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含むセンサであれば良い。例えば、電気化学式バイオセンサは、基板、対極、作用極、メディエータ及び前記酵素を備えることによって作製される。メディエータは、ヘム等のタンパク質性電子メディエータや、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等が例示できる。この他に、イオン変化、発色強度又はｐＨ変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。該バイオセンサを用いてグルコース測定が可能である。
　更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース脱水素酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金族金属等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
　本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５－０．６Ｕ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
（グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性測定法）
　１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ　Ｄ－グルコース溶液１．００ｍＬ、３ｍＭ ２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ　１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬ及び超純水０．６１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
　グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（－（ΔＡ６００－ΔＡ６００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．８×１．０×０．０５）
　尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
（フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）の取得）
　ＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ　ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ　ＮＢＲＣ５９５１の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。
（１）菌体培養
　パインデックス（松谷化学工業社製）４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社製）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１０ｍＬを太試験管に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記ＧＬＤ生産菌を接種し、２５℃で７２時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。
（２）全ＲＮＡの単離
　（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを－８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。
（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
　（２）で取得したＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
　（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子取得用プライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、ＧＬＤ遺伝子の内部配列と思われるＰＣＲ産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ配列を基に、種々のＧＬＤ遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記ＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ　ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。
　得られたプラスミドベクターを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドベクターを抽出・精製し、インサートの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を基に、ＧＬＤ遺伝子の上流及び下流配列を解明するためのプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によって、開始コドンから終止コドンまでの全長ＧＬＤ遺伝子１７５８塩基を解明した。該遺伝子配列を配列番号１に示した。
（５）ＧＬＤ遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製
　公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１－８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。下記のＦ４５７０－Ｏｒｉ（配列番号４）及びＦ４５７０－Ｒ－１ｓｔ（配列番号５）のプライマー対を使用した。次に、前記ＰＣＲ産物を鋳型とし、ベクター挿入用のＧｆＧＬＤ遺伝子を調製した。下記のＦ４５７０－Ｏｒｉ（配列番号４）及びＦ４５７０－Ｒ－２ｎｄ（配列番号６）のプライマー対を使用した。
　最終的に、前記プロモーターの下流に調製したＧＬＤ遺伝子を結合させて、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを作製した。作製した発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、ｉｌｌｕｓｔｒａ　ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ　Ｍｉｄｉ　Ｆｌｏｗ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてプラスミドベクターを抽出した。該プラスミドベクター中のインサートの配列解析を行ったところ、ＧＬＤ遺伝子を含む塩基配列が確認できた。
Ｆ４５７０－Ｏｒｉ（配列番号４）：
5’－(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTGCGCTCCATTGTCTC－3’
（括弧内：転写増強因子）
Ｆ４５７０－Ｒ－１ｓｔ（配列番号５）：
5’－((GTTCATTTA))GGCGGAAGCCTTGATGATG－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列）
Ｆ４５７０－Ｒ－２ｎｄ（配列番号６）：
5’－((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GGCGG－3’
（二重括弧内：ｐＳＥＮベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
（６）形質転換体の取得
　（５）で抽出したプラスミドベクターを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７－１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４－５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製した。得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。
（７）組換えカビ由来ＧＬＤの確認
　パインデックス（松谷化学工業社製）４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社製）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整し、１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法でＧＬＤ活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。
（８）ＧＬＤの精製
　（７）に記載の液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成にクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）０．００５％（ｗ／ｖ）、消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２１℃、３０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記種培養液を１００ｍＬ植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで９６時間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して粗酵素液を回収した。
　回収した粗酵素液について、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　Ａ－５００（ＪＮＣ社製）カラム及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｃ（東ソー社製）カラムを用いて夾雑タンパクを除去して精製した。精製サンプルを分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換し、精製ＧＬＤとした。該精製ＧＬＤをＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、単一バンドを示すことを確認した。
（本発明のＧＬＤの酵素化学的性質の検討）
　実施例１で得られた精製ＧＬＤの諸性質を調べた。
（１）吸収スペクトルの測定
　実施例１で得られた精製ＧＬＤについて、Ｄ－グルコース添加前後の３００－６００ｎｍにおける吸収スペクトルをプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。その結果、波長３６０－３８０ｎｍ付近及び波長４５０－４６０ｎｍ付近に認められた吸収極大が、Ｄ－グルコース添加により消失したことから、本発明のＧＬＤはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。
（２）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
　１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬ、１Ｍ　Ｄ－グルコース２．０ｍＬ、２５ｍＭ　４－アミノアンチピリン０．２ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．２ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬペルオキシダーゼ０．２ｍＬ及び超純水０．２ｍＬを混合し、混合液０．１ｍＬを９６穴プレートに入れ、２５℃で５分間保温した。実施例１で得られた精製ＧＬＤ０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度変化を前記プレートリーダーで測定し、ＧＯＤ活性を調べた。尚、コントロールは、ＧＬＤの代わりに水を添加して反応を開始した。その結果、ＧＬＤはコントロールと同様に吸光度変化は見られなかった。
　この結果から、本発明のＧＬＤにはグルコース酸化酵素活性がないことが確認された。よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ－グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。
（３）基質特異性
　前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、基質に終濃度５０ｍＭのＤ－グルコース、マルトース又はＤ－ガラクトースをそれぞれ用いて、各基質に対する各ＧＬＤの活性を測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のＧＬＤは、Ｄ－グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース又はＤ－ガラクトースに対する活性は０．３％又は０．４％であり、何れも２．０％以下だった。
（４）Ｎ末端配列
　実施例１で得られた精製ＧＬＤのＮ末端を解析したところ、ＳＳＱＲＦであることが明らかになった。つまり、配列番号１記載の開始コドンから始まる全長ＧＬＤ遺伝子１７５８塩基のうち、配列番号７に示した６３塩基はシグナル配列をコードする配列で、配列番号８に示した２１アミノ酸がシグナル配列というような可能性が考えられる。実施例１で得られたマチュアなタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示し、該タンパク質をコードする塩基配列を配列番号２に示した。
　一方、全長ＧＬＤ遺伝子１７５８塩基がコードする５８５アミノ酸からなるアミノ酸配列を用いて、ＵｎｉＰｒｏｔでＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、９８．６％の同一性を有する配列“Ｌ２Ｇ９０６”がヒットした。Ｌ２Ｇ９０６は、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ（ｓｔｒａｉｎ　Ｎａｒａ　ｇｃ５）由来の５８５アミノ酸からなる配列で、“ｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅ”（グルコース酸化酵素）とアノテーションされている。更に、該配列の１～１７アミノ酸はシグナルペプチドで、１８～５８５アミノ酸がマチュアなタンパク質とされている（http://www.uniprot.org/uniprot/L2G906）。つまり、シグナル配列はＭＬＲＳＩＶＳＬＰＬＬＡＡＴＡＬＡの１７アミノ酸で、Ｎ末端配列はＹＰＡＡＳである。
　よって、実施例１で得られた精製ＧＬＤは配列番号３に示したアミノ酸配列からなること、Ｎ末端配列はＳＳＱＲＦであること、配列番号３に示したアミノ酸からなるタンパク質はグルコース酸化酵素ではなく、酸素を電子受容体としないグルコース脱水素酵素であること、更に、本発明のＧＬＤは実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定に利用できることは、前記Ｌ２Ｇ９０６に対して新規な技術内容であって、それからは到底予測できなかった。
（５）分子量
　実施例１で得られた精製ＧＬＤの糖鎖切断前後の分子量を以下の方法で求めた。糖鎖切断処理として、サンプルにエンドグリコシダーゼＨ（ロシュ製）を１０μＬ（５０ｍＵ）添加し、２５℃で１６時間反応させた。糖鎖切断処理前後のＧＬＤ溶液（各々１．０ｍｇ／ｍＬに調製）５μＬと１％ＳＤＳ及び２％β―メルカプトエタノールを含む０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５μＬを混合し、１００℃で３分間熱処理を行った。糖鎖切断処理前後のサンプルをｅ－パジェル７．５％（アトー社製）を用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供し、泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢで）染色した。
　ＧＬＤと分子量マーカー（ＳＭＯＢＩＯ社製　ＥｘｃｅｌｌＢａｎｄ　Ａｌｌ　Ｂｌｕｅ　Ｒｅｇｕｌａｒ　Ｒａｎｇｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ　ＰＭ１５００との移動度を比較して分子量を求めた。その結果、糖鎖切断前の分子量は約８３ｋＤａ、糖鎖切断後の分子量は、約５８ｋＤａだった。
（ＧＬＤの乾燥及び粉末化）
　実施例１で得られた精製ＧＬＤをガラス容器に入れ、－８０℃で１時間以上静置し、予備凍結を行った。予備凍結したＧＬＤを真空凍結乾燥機に入れ、１６時間程度処理した。得られた凍結乾燥ＧＬＤを細かく粉砕し、粉末化ＧＬＤを回収した。尚、該工程の処理前後で活性低下は見られなかった。
（吸光度計によるグルコースの測定）
　実施例１で得られた精製ＧＬＤを用いて、前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、２、５、１０、２０又は４０ｍＭ　Ｄ－グルコースにおける、吸光度変化を測定した。各グルコース濃度における相対活性値を図１に示す。その結果、吸光度計を用いたＤ－グルコース測定において、本発明のＧＬＤを用いてＤ－グルコースの定量が可能であることが示された。
（バイオセンサによるグルコースの測定）
　実施例３で得られたＧＬＤを用いて、グルコース濃度に対する応答電流値を測定した。終濃度が以下の通りになるようにグルコース測定用試薬を作製し、その内１μＬをチップ（ＤＥＰ－ｃｈｉｐ、バイオデバイステクノロジー社製）上に塗布して乾燥させた。グルコース測定用試薬：３３ｍＭリン酸ナリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１０ｍＭメディエータ、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１，０００Ｕ／ｍＬ　ＧＬＤ。該チップに、０、５、１０、２０又は４０ｍＭグルコース溶液を２μＬ添加し、－０．４～＋０．４Ｖの範囲で印加して、応答電流値を測定した。＋０．４Ｖ印加時の各グルコース濃度における電流値を図２に示した。その結果、バイオセンサを用いたＤ－グルコース測定において、本発明のＧＬＤを用いてＤ－グルコースの定量が可能であることが示された。

Claims (10)

  1. 　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質：
    （ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列。
  2. 　酸素を電子受容体としない、請求項１記載のタンパク質。
  3. 　請求項１又は２記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製し、該ベクターにより形質転換した形質転換細胞を培養して得られる組換え酵素である、請求項１又は２記載のタンパク質。
  4. 　請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  5. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  6. 　請求項５に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
  7. 　請求項６に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
  8. 　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用する、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコースの測定方法：
    （ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
  9. 　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用試薬組成物：
    （ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
  10. 　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用バイオセンサ：
    （ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端がＳＳであるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつＮ末端に配列番号８に示される配列を含まないアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
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