JP6792124B2 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents

Description

本発明は、グルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサ等に関する。

血液中のグルコース（血糖）濃度の測定は、主に糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要である。血糖測定において、酵素を利用した血糖測定機器として、バイオセンサが広く使われている。

バイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素やグルコース脱水素酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。グルコース脱水素酵素のうち、真核細胞由来のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないこと、補酵素の添加を必要としないこと及び基質特異性に優れることから、バイオセンサ用の酵素として有用である（特許文献１〜５）。

国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット 国際公開２００６／１０１２３９号パンフレット 国際公開２００８／００１９０３号パンフレット 国際公開２０１３／０３１６６４号パンフレット 国際公開２０１３／１４７２０６号パンフレット

血糖測定において、より基質特異性の高い酵素が求められていた。本発明は、基質特異性の高いグルコース脱水素酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたグルコースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサを提供する。更に、測定試薬組成物の製造方法及びバイオセンサの製造方法を提供する。

発明者らは、種々の微生物由来のグルコース脱水素酵素を探索し、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素を見出した。更に、効率的なフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法を見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［８］の態様に関する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列。
［２］以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）からなるポリヌクレオチド：
（ｉ）［１］記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［３］［２］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［４］［３］に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
［５］［４］に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
［６］［１］に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
［７］［１］に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
［８］［１］に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。

本発明によって、基質特異性の高いフラビン結合型グルコース脱水素酵素が得られた。該酵素を簡便に製造できるようになった。更に、該酵素を使用することで、他の糖類の影響を受け難い測定が可能になり、精度の高い測定が可能な測定試薬組成物及びバイオセンサが製造できるようになった。

本発明の酵素によるＤ−グルコース測定結果を示す図である。

本発明のグルコース脱水素酵素は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。「タンパク質」とは糖タンパク質も含む。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。変異数は、好ましくは多くとも６０個、５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１５個、１０個、５個、３個又は２個である。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列。同一性を有するとは、同一性が好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％又は９７％のアミノ酸配列である。
該酵素は、好ましくは（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。

本発明のグルコース脱水素酵素は、前記配列を有するタンパク質であれば特に限定されず、野生株由来の酵素でもよく、遺伝子組換えによって得られた組換え酵素でもよく、合成によって得られた合成酵素でもよい。好ましくは組換え酵素である。

本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、下記の性質（１）〜（４）を有する。フラビンとしては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられ、好ましくはＦＡＤである。
（１）作用：電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。
（２）可溶性である。

（３）基質特異性が高い。５０ｍＭ グルコースに対する作用性を１００％とした場合に、５０ｍＭ マルトース、Ｄ−キシロース又はＤ−ガラクトースに対する作用性が、何れも好ましくは多くとも２．０％、より好ましくは多くとも１．５％、１．０％又は０．５％である。

（４）酵素のポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである。好ましくは、６５〜７０ｋＤａである。酵素のポリペプチドの分子量とは、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定した場合の分子量のことである。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素全体の分子量については、培養条件や精製条件等により、糖鎖付加量が変われば分子量は異なり、組換え酵素においてはその宿主等によっても糖鎖の有無や糖付加量が変わり、分子量は異なってくる。

本発明のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）からなる。
（ｉ）前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。変異数は、好ましくは多くとも１０個、８個、５個、３個又は２個である。
（ｉｖ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｖ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、９５％又は９７％の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

本発明において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。

本書での同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値とする。

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列を用いて、機能未知の公開配列に対して例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）等のホモロジー検索を行い、同一性が少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性でヒットしたアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を利用することができる。具体的には、該公開配列から全長配列を合成して利用できる。又は、該公開配列からプライマーをデザインし、該公開配列の由来株のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。更に増幅して得たポリヌクレオチドを用いて常法により組換えタンパク質を得て、グルコース脱水素酵素活性を確認することができ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば良い。ＤＮＡ又はＲＮＡは、公開配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。更に、取得したポリヌクレオチドを一部改変したポリヌクレオチドであって、グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドも、本発明のポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、イントロンを含んだＤＮＡでも良く、ｃＤＮＡでも良い。

本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択し、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含み、インサートとはヘテロな核酸配列を含む。インサートとしては、宿主細胞に対応して、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。更に、宿主が原核細胞の場合は、イントロンを含まない遺伝子を用いる。真核細胞の場合、イントロンを含んだ遺伝子でも良い。終止コドンを宿主に最適な終止コドンに置換することで組換えタンパク質の発現量を向上させても良い。インサート側に開始コドンを含まない場合は、インサート側に開始コドンを付加するか、又はベクター側の開始コドンを利用して、融合タンパク質として発現するベクターを選択しても良い。発現ベクターとしては、原核細胞発現用ベクター又は真核細胞発現用ベクターの何れでも良い。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの発現に寄与するポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一及び／又は別のベクターに導入することも可能である。更に、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現できるベクターを使用して、本発明のグルコース脱水素酵素を発現しても良い。

分泌シグナル配列をコードする配列を含むグルコース脱水素酵素遺伝子を用いて、大腸菌などのグラム陰性菌で組換えタンパク質を発現させる場合は、組換えタンパク質がペリプラズムに移行されるため、生産性が悪い。そのため、組換えタンパク質を効率よく回収したい場合は、シグナル配列をコードする遺伝子配列を削除した配列を用いるのが良い。特にグラム陰性菌の場合、イントロンを含まずシグナル配列をコードする配列を含まないｃＤＮＡに開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドが好ましい。発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。

一方、真核細胞で発現させて生産させる場合には、分泌シグナル配列をコードする配列を含むグルコース脱水素酵素遺伝子全体をベクターに挿入すれば良い。又は、シグナル配列をコードする配列を、例えば宿主に適切な配列に置換したポリヌクレオチドでも良い。更に、ベクター側のシグナル配列をコードする配列を利用しても良い。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。

分泌シグナル配列は、例えば、シグナル配列予測サイト（例：Ｓｉｇｎａｌ Ｐ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて推測できる。

本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターで形質転換させて得ることができる。前記ベクターを、プラスミドのような状態で形質転換細胞内に維持しても良く、染色体中に組み込ませて維持しても良い。更に、糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができるが、糖鎖付加可能な宿主を選択し、糖鎖を有する酵素を製造することが好ましい。

本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物からグルコース脱水素酵素を採取することによって、組換えグルコース脱水素酵素を製造することができる。

本発明で使用されるグルコース脱水素酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン及び糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ−アラニン及びＬ−グルタミン酸等のアミノ酸類、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス及びコーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム及び塩化第二鉄等が使用できる。

本発明のグルコース脱水素酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法による好気的条件下で行うのが良い。グルコース脱水素酵素生産菌の特性を踏まえて、グルコース脱水素酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は２０℃から５０℃、かつｐＨ４からｐＨ８の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は、２日から１０日の範囲が好ましい。この様な方法で培養することにより、培養物中にグルコース脱水素酵素を生成蓄積することができる。

培養物中からグルコース脱水素酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初にグルコース脱水素酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれるグルコース脱水素酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。

本発明のグルコース脱水素酵素は乾燥して使用することができる。酵素が失活しなければ乾燥方法は制限されないが、凍結乾燥により、凍結乾燥品を得るのが好ましい。乾燥工程で、緩衝液剤及び安定化剤を添加することができる。乾燥後に粉砕して、粉末化し、粉末品にしても良い。

本発明のグルコース脱水素酵素を用いて、グルコースを測定することができる。本発明のグルコース測定方法は、グルコースを含む被検試料と本発明のグルコース脱水素酵素とを接触させる工程を含むことにより、被検試料中のグルコースを定量できる。被検試料は特に限定されないが、例えば生体試料が例示でき、具体例として血液試料、涙、唾液、尿、間質液等が例示できる。本発明の酵素は、特に血糖測定に有用である。

本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコース測定試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサを製造する製造方法を提供する。本発明の酵素は基質特異性が高く、酸素を実質的に電子受容体としないため、グルコース測定において、測定試料中の他の糖類及び溶存酸素の影響を受け難い。よって、他の糖類や溶存酸素の影響を受け難いグルコース測定試薬組成物、グルコース測定用キット又はグルコース測定用バイオセンサが提供でき、測定精度の高いグルコース測定が可能である。

本発明のグルコース測定試薬組成物は、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、試料中のグルコースを測定できれば特に限定されないが、１測定あたりの酵素量が０．０１から１００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましく、０．１から２０Ｕ程度が更に好ましい。該組成物は、緩衝剤を含むことが好ましく、安定化剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めるのがより好ましい。前記成分としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、タンパク質等を例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませても良い。本発明のグルコース測定用キットは、前記試薬組成物を含み、グルコース標準液を含ませても良い。

本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を含むセンサであれば良い。例えば、電気化学式バイオセンサは、基板、対極、作用極メディエータ及び前記酵素を備えることによって作製される。メディエータは、ヘム等の蛋白質性電子メディエータ、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等が例示できる。この他に、イオン変化、発色強度、ｐＨ変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。該バイオセンサを用いてグルコース測定が可能である。

更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース脱水素酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金族金属等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。

本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１５−０．６Ｕ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。尚、該酵素の酵素活性単位（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明のグルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。

（グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性測定法）
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬ及び超純水０．６１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。

グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（−（ΔＡ６００−ΔＡ６００ｂｌａｎｋ）×３．０×酵素の希釈倍率）／（１０．８×１．０×０．０５）
尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］
（フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）の取得）
ＧＬＤ生産菌の探索を行った結果、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ ＮＢＲＣ１０７０００の培養上清にＧＬＤ活性が確認できた。

（１）菌体培養
パインデックス（松谷化学工業社製）４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社製）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１０ｍＬを太試験管に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記ＧＬＤ生産菌を接種し、２５℃で７２時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。

（２）全ＲＮＡの単離
（１）で取得した湿菌体２００ｍｇを−８０℃で凍結した後、ＩＳＯＧＥＮＩＩ（ニッポンジーン社製）を用いて１００μｇの全ＲＮＡを抽出した。

（３）ｃＤＮＡライブラリーの調製
（２）で取得したＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。

（４）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子取得用プライマー対を用いてＰＣＲを行った。その結果、ＧＬＤ遺伝子の内部配列と思われるＰＣＲ産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ配列を基に、種々のＧＬＤ遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記ＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ ＰＭＤ２０（タカラバイオ社製）にライゲーションした。

得られたプラスミドベクターを用い、公知の方法で大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドベクターを抽出・精製し、インサートの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を基に、ＧＬＤ遺伝子の上流及び下流配列を解明するためのプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によって、ＧＬＤ遺伝子全長を解明した。

ＧＬＤ遺伝子配列を配列番号１に示した。更に、当該遺伝子配列より予測したアミノ酸配列を配列番号２に示した。

（５）ＧＬＤ遺伝子を含む発現用プラスミドベクターの調製
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、（３）で取得したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。下記のＦ５３３１−Ｏｒｉ（配列番号３）及びＦ５３３１−Ｒ−１ｓｔ（配列番号４）のプライマー対を使用した。次に、前記ＰＣＲ産物を鋳型とし、ベクター挿入用のＧrＧＬＤ遺伝子を調製した。下記のＦ５３３１−Ｏｒｉ（配列番号３）及びＦ５３３１−Ｒ−２ｎｄ（配列番号５）のプライマー対を使用した。

最終的に、前記プロモーターの下流に調製したＧＬＤ遺伝子を結合させて、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを作製した。作製した発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、ｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてプラスミドベクターを抽出した。該プラスミドベクター中のインサートの配列解析を行ったところ、ＧＬＤ遺伝子を含む塩基配列が確認できた。

Ｆ５３３１−Ｏｒｉ（配列番号３）：
5’−CCGCAGCTCGTCAAAATGACGCTCTTTCGCCAGTC−3’
Ｆ５３３１−Ｒ−１ｓｔ（配列番号４）：
5’−GTTCATTTAGATGCTCTGCTTGATGAT−3’
Ｆ５３３１−Ｒ−２ｎｄ（配列番号５）：
5’−GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTAGATGCTCTGC−3’

（６）形質転換体の取得
（５）で抽出したプラスミドベクターを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＧＬＤを生産する組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製した。得られた組換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。

（７）組換えカビ由来ＧＬＤの確認
パインデックス（松谷化学工業社製）４％（ｗ／ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）１％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク社製）０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．０５％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整し、１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のＧＬＤ活性測定法でＧＬＤ活性を測定したところ、本発明のＧＬＤ活性が確認できた。

（８）ＧＬＤの精製
（７）に記載の液体培地１５０ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、（６）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成にクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）０．００５％（ｗ／ｖ）、消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２１℃、３０分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記種培養液を１００ｍＬ植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで９６時間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収した。

回収した培養上清について、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ａ−５００（ＪＮＣ社製）カラム及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）カラムを用いて夾雑蛋白を除去して精製した。精製サンプルを分画分子量５，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換し、精製ＧＬＤとした。該精製ＧＬＤをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、単一バンドを示すことを確認した。

［実施例２］
（本発明のＧＬＤの酵素化学的性質の検討）
実施例１で得られた精製ＧＬＤの諸性質を調べた。
（１）吸収スペクトルの測定
実施例１で得られたＧＬＤについて、Ｄ−グルコース添加前後の３００−６００ｎｍにおける吸収スペクトルをプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。その結果、波長３６０−３８０ｎｍ付近及び波長４５０−４６０ｎｍ付近に認められた吸収極大が、Ｄ−グルコース添加により消失したことから、本発明のＧＬＤはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。

（２）グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性の測定
１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース２．０ｍＬ、２５ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．２ｍＬ、４２０ｍＭ フェノール０．２ｍＬ、１ｍｇ／ｍL ペルオキシダーゼ０．２ｍＬ及び超純水０．２ｍＬを混合し、混合液０．１ｍＬを９６穴プレートに入れ、２５℃で５分間保温した。実施例１で得られたＧＬＤ０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度変化を前記プレートリーダーで測定し、ＧＯＤ活性を調べた。尚、コントロールは、ＧＬＤの代わりに水を添加して反応を開始した。その結果、ＧＬＤはコントロールと同様に吸光度変化は見られなかった。

よって、本発明のＧＬＤは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を受けにくいことが示された。

（３）基質特異性
前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、基質に終濃度５０ｍＭのＤ−グルコース、マルトース、Ｄ−キシロース又はＤ−ガラクトースをそれぞれ用いて、各基質に対する各ＧＬＤの活性を測定した。結果を表１に示す。

本発明のＧＬＤは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−キシロース又はＤ−ガラクトースに対する活性は０．２％、０．４％又は０．１％であり、何れも２．０％以下だった。

［実施例３］
（本発明のＧＬＤによるグルコースの測定）
実施例１で得られたＧＬＤを用いて、前記ＧＬＤ活性測定法に準じ、５０、１００、２００及び３３３ｍＭ Ｄ−グルコースにおける、吸光度変化を測定した。各グルコース濃度における相対活性値を図１に示す。その結果、本発明のＧＬＤでＤ−グルコースの定量が可能であることが示された。

Claims (8)

1. 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有し酸素を実質的に電子受容体としないタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において多くとも６０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
   （ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列。
2. 以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）からなるポリヌクレオチド：
   （ｉ）請求項１記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド；
   （ｉｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有し酸素を実質的に電子受容体としないタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｉｖ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有し酸素を実質的に電子受容体としないタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
3. 請求項２記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
4. 請求項３記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
5. 請求項４記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
6. 請求項１記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
7. 請求項１記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
8. 請求項１記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。

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