JP2010057474A - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、およびその利用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のタンパク質は、クリプトコッカス・ネオフォーマンス(Cryptococcus neoformans)に由来するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのカルボキシル末端領域の34または39アミノ酸残基が欠失されてなる。本発明のタンパク質は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼに比して、基質へのオキシダーゼ活性を保持したまま熱安定性が向上している。
【選択図】図1
Description
(I)カルボキシル末端から34〜39アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質;
(II)上記(I)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および/または付加されたタンパク質。
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)上記(a)または(b)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
(e)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(g)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(h)上記(e)または(g)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明にかかるタンパク質は、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質において、カルボキシル末端領域が欠失しており、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
(I)カルボキシル末端から34〜39アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質;
(II)上記(I)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および/または付加されたタンパク質。
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)上記(a)および(b)において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(e)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(g)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(h)上記(e)または(g)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるタンパク質をコードしている。
本発明にかかるタンパク質の製造方法は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程(「培養工程」という)を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に本発明にかかる形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。
上記培養工程では、本発明にかかる形質転換体が栄養培地で培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
本発明にかかる形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明のタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明にかかるタンパク質としてそのまま利用することが可能である。この時、例えばろ過や遠心分離などにより、培養液と本発明にかかる形質転換体とを分離してもよい。
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。精製工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、本発明にかかるタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いる)、または親水性有機溶媒(例えばメタノール、エタノール、アセトンなど)による分別沈殿法に供すればよい。上記操作によって、目的である本発明にかかるタンパク質を沈殿させ、精製することができる。
本発明にかかる糖化タンパク質の測定方法(以下「本発明の測定方法」という)は、少なくとも糖化アミンに本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。また本項の説明において「本発明にかかるタンパク質」は「本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤」と読み替えることが可能である。
(1)試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程(便宜上「第1工程」という)、
(2)前記(1)の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程(便宜上「第2工程」という)、および、
(3)前記(2)の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程(便宜上「第3工程」という)、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。
第1工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。
第2工程は、上記第1工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程である。
第3工程は、上記第2工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第3工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。
(5−1)糖化ヘモグロビン測定キット
本発明にかかる糖化ヘモグロビン測定キット(以下「本発明のキット」という)は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)を含むことを特徴としている。本発明のキットに含まれる、本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)の形態は特に限定されるものではないが、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末など形態が採用され得る。上記凍結乾燥粉末は常法に従って作製され得る。
本発明にかかる糖化タンパク質センサー(以下「本発明のセンサー」)は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明にかかるタンパク質(またはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤)を備えている。本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法および本発明のキットの項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
各基質に対する酵素活性は、酵素反応により生成する過酸化水素を追随するペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加で測定した。活性測定試薬3mlを37℃で5分間予備加温後、予め、酵素希釈液(50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5))で希釈した酵素溶液0.1mlを加え、反応を開始する。37℃で5分間反応させ、500nmの吸光度変化を測定する(ΔODtest/min)。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液0.1mlを加え、上記同様に操作を行って吸光度変化を測定した(ΔODblank/min)。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づき酵素活性を算出した。尚、上記条件で1分間に1マイクロモルの基質を酸化する酵素量を1単位(U)とする。
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.1(ml)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.1(ml):全液量
13:ミリモル吸光係数
1.0cm:セルの光路長
0.1(ml):酵素サンプル液量
<実施例1.FAODcDNAのクローニング>
クリプトコッカス・ネオフォーマンス(Cryptococcus neoformans)由来の野生型FAODのcDNAクローニングを行うために、クリプトコッカス・ネオフォーマンスのゲノムデータベース(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/cna1/)を検索した。ゲノムデータベースから、FAD−dependent oxidoreductaseをコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、フルクトシルバリンに実質的に作用するFAOD遺伝子として、Cryptococcusneoformans|chr_2|chr2|186.m03431|CNB00220(http://tigrblast.tigr.org/er-blast/getSeq.cgi?id=186.m03431&db=/usr/local/db/euk/private/c_neoformans/annotation_dbs/CNA1.cds)をクローニング候補とした。
上記FAOD遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。FAOD遺伝子の終止コドンを除いた全長cDNA領域(配列番号2の1番目〜1431番目の塩基)をPCRで増幅した。その際、N末端側に配列番号7に示すプライマー(5’-GGAATTCCATATGCCACCTTCGCGCGCCAGTACTAAGGTCATA-3’)(上記塩基配列における「CATATG」はNdeI部位)を用いてNdeI部位、C末端側に配列番号8に示すプライマー(5'-CCGCTCGAGTTATTAAGCTAGAACTTTGACTCCGACTCGTGCTCC-3’)(上記塩基配列における「CTCGAG」はXhoI部位)を用いてXhoI部位を挿入した。本PCR断片をpET−23bベクター(ノバジェン社)のNdeI−XhoI部位へT7プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、組換えFAOD発現用プラスミドとして、pIE313NAと命名した。
発現プラスミドであるpIE313NA、およびに合成オリゴヌクレオチド(配列番号9および配列番号10)を用いて、KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit(東洋紡績社製)を使用して、規定のプロトコールに従って変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号1に示したアミノ酸配列のカルボキシル末端34残基が欠失したFAODタンパク質(配列番号3)をコードする組換えプラスミド(pIE313NA−Cdel34)を取得した。同様に、配列番号10および配列番号11に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号1示したアミノ酸配列のカルボキシル末端39残基が欠失されたFAODタンパク質(配列番号4)をコードする組換えプラスミド(pIE313NA−Cdel39)を取得した。
野生型FAOD(IE313NA)、および組換えFAODタンパク質(IE313NA−Cdel34、およびIE313NA−Cdel39)の各精製酵素標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリン、およびフルクトシルリジンをそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定した結果を表2に示す。この結果から明らかなように、野生型FAOD、および各組換えFAODタンパク質はフルクトシルバリン、フルクトシルリジン、およびフルクトシルバリルヒスチジンに作用することが確認された。
黒丸 :野生型FAOD(IE313NA)、40℃処理
黒三角:IE313NA−Cdel34、40℃処理
黒四角:IE313NA−Cdel39、40℃処理
白丸 :野生型FAOD(IE313NA)、45℃処理
白三角:IE313NA−Cdel34、45℃処理
白四角:IE313NA−Cdel39、45℃処理
図1によれば、IE313NAを、40℃で、10分間、20分間、30分間、60分間加熱処理した場合のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの残存活性は、それぞれ86%、79%、71%、60%であった。またIE313NA−Cdel34を、40℃で、10分間、20分間、30分間、60分間加熱処理した場合のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの残存活性は、それぞれ98%、96%、93%、92%であった。また、IE313NA−Cdel39を、40℃で、10分間、20分間、30分間、60分間加熱処理した場合のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの残存活性は、それぞれ97%、96%、92%、89%であった。
Claims (16)
- 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質において、
カルボキシル末端領域が欠失しており、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質であって、以下の(I)または(II)を特徴とするタンパク質:
(I)カルボキシル末端から34〜39アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質;
(II)上記(I)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および/または付加されたタンパク質。 - 請求項1または2に記載のタンパク質であって、以下の(a)〜(c)のいずれかを特徴とするタンパク質:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)上記(a)または(b)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 40℃で60分間加熱処理された場合に、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に低下しない請求項1〜3いずれか1項に記載のタンパク質。
- 45℃で10分間加熱処理された場合に、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が40%以上残存する請求項1〜3いずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号5に示される塩基配列を有する、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号6に示される塩基配列を有する、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項6〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
- 請求項6〜9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項11に記載の形質転換体を培養する工程を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの製造方法。
- 以下の(e)〜(h)のいずれかのタンパク質を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤:
(e)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(g)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(h)上記(e)または(g)のタンパク質において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 少なくとも糖化アミンに請求項1〜5いずれか1項に記載のタンパク質、または請求項13に記載のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を作用させる工程を含む、糖化タンパク質の測定方法。
- 少なくとも請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質、または請求項13に記載のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を含む、糖化タンパク質測定キット。
- 少なくとも請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質、または請求項13に記載のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を備える、糖化タンパク質センサー。
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