KR20180136946A - HbA1c 디히드로게나아제 - Google Patents

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Abstract

산소 농도의 영향을 받기 어려운 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 HbA1c 디히드로게나아제 및 이를 이용한 HbA1c의 측정 방법과 측정 시약 키트를 제공한다. 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하고 코니오카에타(Coniochaeta) 속 등 유래의 아마도리아제의 280위, 269위, 54위, 241위 또는 267위에 대응하는 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환함으로써 얻어지는, 디히드로게나아제 활성을 가지며 HbA1c에 직접 작용하는 HbA1c 디히드로게나아제 및 이를 이용한 HbA1c의 측정 방법, 측정 시약 키트 및 센서. 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 옥시다아제 활성이 저감되고 및/또는 디히드로게나아제 활성이 향상되어 헤모글로빈 A1c의 프로테아제 처리가 필요 없을 뿐만 아니라 HbA1c 측정에서 전자 매개자의 이용이 가능해지고, 산소 농도의 영향을 저감시켜 고감도로 HbA1c를 측정할 수 있다.

Description

HbA1c 디히드로게나아제
본 발명은 HbA1c에 작용하는, 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제, 옥시다아제 활성이 저감된 아마도리아제, 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감된 아마도리아제, 그 유전자 및 재조합체 DNA와 상기 아마도리아제의 제조법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨병 진단용 효소로서, 센서로서, 또한 당뇨병 마커의 측정 키트에 유리하게 이용될 수 있는 HbA1c에 작용하는 디히드로게나아제에 관한 것이다.
당화 단백질은 글루코오스 등의 알도오스(알데히드기를 잠재적으로 갖는 단당 및 그 유도체)의 알데히드기와 단백질의 아미노기가 비효소적으로 공유결합을 형성하여 아마도리 전이함으로써 생성한 것이다. 단백질의 아미노기로서는 아미노 말단의 α아미노기, 단백질 중의 리신 잔기 측쇄의 ε아미노기를 들 수 있다. 생체 내에서 발생하는 당화 단백질로서는 혈액 중의 헤모글로빈이 당화된 당화 헤모글로빈, 알부민이 당화된 당화 알부민 등이 알려져 있다.
이들 생체 내에서 발생하는 당화 단백질 중에서도 당뇨병의 임상 진단 분야에서 당뇨병 환자의 진단이나 증상 관리를 위한 중요한 혈당 컨트롤 마커로서 당화 헤모글로빈(HbA1c)이 주목받고 있다. 혈액 중의 HbA1c 농도는 과거 일정 기간의 평균 혈당치를 반영하고, 그 측정값은 당뇨병 증상의 진단이나 관리에 있어서 중요한 지표가 된다.
이 HbA1c를 신속하고 간편하게 측정하는 방법으로서 아마도리아제를 이용하는 효소적 방법, 즉 HbA1c를 프로테아제 등으로 분해하고 그 β쇄 아미노 말단에서 유리시킨 α-프럭토실 발릴 히스티딘(이후, 「αFVH」라고 나타냄) 혹은 α-프럭토실 발린(이후, 「αFV」라고 나타냄)을 정량하는 방법이 제안되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1~7 참조).
나아가 아마도리아제를 이용한 HbA1c의 측정 방법으로서는 HbA1c를 Glu-C 프로테아제를 이용하여 소화하고 당화된 β쇄 아미노 말단의 발린을 포함하는 6아미노산으로 이루어지는 α-프럭토실 헥사펩티드(α-프럭토실 발릴 히스티딜 류실 트레오닐 프롤릴 글루타민산, 이후 αF6P라고 나타냄)를 유리시킨 후에 유리된 αF6P를 정량하는 방법이 있다(예를 들어 특허문헌 16, 17, 18, 19 참조). 이 방법은 IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)에 의해 정해진 HbA1c 측정법(비특허문헌 10 참조)에 준거한, 효소에 의한 HbA1c의 측정 방법이다.
그러나, 프로테아제나 펩티다아제는 아마도리아제, 퍼옥시다아제 및 다른 단백질 시약에도 작용할 수 있다. 그래서 본 발명자들은 프로테아제를 필요로 하지 않고 HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제를 개발하였다(특허문헌 20). 또한, 유사한 보고예가 있다(특허문헌 21). 이들 아마도리아제는 당화 기질을 산화할 때에 전자를 산소 분자에 전달한다.
아마도리아제는 산소의 존재 하에서 이미노2아세트산 혹은 그 유도체(「아마도리 화합물」이라고도 함)를 산화하여 글리옥실산 또는 α-케토알데히드, 아미노산 또는 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매한다.
아마도리아제는 세균, 효모, 진균으로부터 발견되어 있지만, 특히 HbA1c의 측정에 유용한 αFVH 및/또는 αFV에 대한 효소 활성을 갖는 아마도리아제로서는 예를 들어 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스로박터(Arthrobacter) 속, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 유래의 아마도리아제가 보고되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1, 6~15, 비특허문헌 1~11 참조). 또, 상기 보고예 중에서 아마도리아제는 문헌에 따라서는 케토아민 옥시다아제나 프럭토실 아미노산 옥시다아제, 프럭토실 펩티드 옥시다아제, 프럭토실아민 옥시다아제 등의 표현으로 기재되어 있는 경우도 있다.
아마도리아제는 퍼옥시다아제와 공역시켜 발색 기질을 이용함으로써 시료 중의 당화 기질의 측정에 이용할 수 있다. 종래의 아마도리아제는 당화 기질을 산화할 때에 산소 분자에 전자를 전달할 수 있다. 이 활성을 옥시다아제 활성이라고 한다. 한편, 종래의 아마도리아제는 당화 기질을 산화할 때에 산소 분자와는 상이한 전자 억셉터(전자 매개자(mediator))에 전자를 전달할 수도 있다. 이 활성을 디히드로게나아제 활성이라고 한다. 효소의 옥시다아제 활성을 저감하고 디히드로게나아제 활성을 증대시키면 당화 기질을 산화할 때에 전자 억셉터(전자 매개자)에 우선적으로 전자를 전달할 수 있다. 그 때문에 시료 중의 산소의 영향을 받지 않고 당화 기질에 유래하는 전자의 측정을 행할 수 있다.
공지의 문헌 중에 아마도리아제의 디히드로게나아제 활성의 향상에 관한 개시가 보인다: 예를 들어, Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제의 56위의 아스파라긴을 알라닌으로 치환함으로써 디히드로게나아제 활성에서의 αFV에 대한 Vmax/Km이 2.3배 향상되는 것이 나타나 있다(특허문헌 16 참조). 그러나, 개시되어 있는 변이체는 옥시다아제 활성에서의 αFV에 대한 Vmax/Km도 야생형과 비교하여 1.2배 향상되기 때문에 산소의 영향을 여전히 받는다고 생각된다. 또한, 개시되어 있는 변이체는 αFV를 기질로 하지만 HbA1c 그 자체에는 직접 작용하지 않는다고 생각된다.
특허문헌 22는 아마도리아제의 열안정성을 향상시키는 변이를 보고하고 있고, Coniochaeta 속 유래 아마도리아제의 267위의 Phe가 Tyr로 개변된 열안정성 향상 변이체(F267Y)가 기재되어 있다.
특허문헌 1: 국제공개 제2004/104203호 특허문헌 2: 국제공개 제2005/49857호 특허문헌 3: 일본공개특허 2001-95598호 공보 특허문헌 4: 일본공고특허 평05-33997호 공보 특허문헌 5: 일본공개특허 평11-127895호 공보 특허문헌 6: 국제공개 제97/13872호 특허문헌 7: 일본공개특허 2011-229526호 공보 특허문헌 8: 일본공개특허 2003-235585호 공보 특허문헌 9: 일본공개특허 2004-275013호 공보 특허문헌 10: 일본공개특허 2004-275063호 공보 특허문헌 11: 일본공개특허 2010-35469호 공보 특허문헌 12: 일본공개특허 2010-57474호 공보 특허문헌 13: 국제공개 제2010/41715호 특허문헌 14: 국제공개 제2010/41419호 특허문헌 15: 국제공개 제2011/15325호 특허문헌 16: 국제공개 제2011/015325호 특허문헌 17: 국제공개 제2008/108385호 특허문헌 18: 국제공개 제2015/005258호 특허문헌 19: 국제공개 제2013/162035호 특허문헌 20: 국제공개 제2015/060429호 특허문헌 21: 국제공개 제2015/005257호 특허문헌 22: 국제공개 제2013/100006호
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본 발명은 HbA1c에 작용하는, 옥시다아제 활성이 저하되고 디히드로게나아제 활성이 증대된 아마도리아제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 HbA1c에 작용하는, 활성이 용존 산소 레벨의 영향을 거의 받지 않는 아마도리아제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
효소의 옥시다아제 활성의 저하 및 디히드로게나아제 활성을 부여하기 위한 정보는 거의 개시되지 않은 현재, 본 발명자들은 면밀히 연구를 거듭한 결과, Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에 대해 특정의 아미노산 잔기의 치환을 도입함으로써 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 HbA1c 디히드로게나아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소가 아닌 환원형 전자 매개자 혹은 소비되는 산소가 아닌 산화형 전자 매개자를 측정하는 것을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
[2] 측정이 HbA1c 디히드로게나아제, HbA1c 디히드로게나아제를 포함한 효소 전극 또는 이 효소 전극을 작용 전극으로서 갖는 효소 센서 및 산소가 아닌 전자 매개자를 이용하는 전기 화학적 측정이거나 혹은 HbA1c 디히드로게나아제, 발색 기질 및 산소가 아닌 전자 매개자를 이용하는 흡광도 측정인, 1에 기재된 측정 방법.
[3] 개변 전 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 (친)아마도리아제와 비교하여 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 저감된 HbA1c에 직접 작용하는 디히드로게나아제로서,
(i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위, 269위, 54위, 241위 및 267위로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 하나 이상의 아미노산이 치환되어 있고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제,
(ii) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위, 269위, 54위, 241위 및 267위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제,
(iii) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 상기 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지고, 서열 번호 1의 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열 번호 1의 상동성 영역은 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 것이고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제,
(iv) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 상기 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가지고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제, 혹은
(v) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 서열 번호 1의 보존 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제가 유래하는 천연 아마도리아제의 대응하는 보존 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열 번호 1의 보존 영역은 서열 번호 1의 제11, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 36, 37, 41, 46, 47, 50, 51, 52, 54, 56, 57, 58, 75, 79, 82, 84, 85, 93, 95, 149, 158, 159, 162, 165, 166, 177, 180, 202, 208, 218, 220, 221, 222, 224, 228, 233, 239, 243, 246, 250, 255, 258, 260, 266, 267, 270, 272, 277, 278, 280, 281, 282, 284, 285, 286, 318, 321, 326, 329, 334, 339, 346, 347, 348, 351, 352, 354, 358, 359, 362, 363, 370, 373, 376, 382, 385, 386, 389, 406, 407, 409, 418, 425 및 427위로 이루어지는 것이고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제.
[4] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 아미노산, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하전 아미노산, 또는 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신, 트립토판, 발린 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 히스티딘, 글리신 또는 발린으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 리신, 글루타민산, 아스파라긴, 아르기닌, 아스파라긴산 또는 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신, 트립토판, 발린 또는 알라닌으로 치환되어 있는, 3에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[5] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있는, 4에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[6] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있는, 5에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[7] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 세린으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있는, 5에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[8] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 히스티딘으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는, 5에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[9] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는, 5에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[10] 옥시다아제 활성이 개변 전 아마도리아제(100%)와 비교하여 60% 미만으로 저감되어 있거나 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 개변 전 아마도리아제(100%)와 비교하여 40% 미만으로 저감되어 있는, 3 내지 9 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[11] 상기 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 또는 아스로박터(Arthrobacter) 속 유래인, 3 내지 10 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[12] 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 16-26 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 서열을 가지며, 3 내지 9 중 어느 하나에 규정한 아미노산 치환을 갖는, 3 내지 11 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제.
[13] 추가적으로 HbA1c 디히드로게나아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에 아미노산 치환 또는 결실을 하나 이상 가지고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는, 3 내지 12 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제:
(A) 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위, 356위, 64위 및/또는 99위로의 치환,
(B) 262위, 257위, 249위, 253위, 337위, 340위, 232위, 129위, 132위, 133위, 44위, 256위, 231위 및/또는 81위로의 치환,
(C) 카르복실 말단의 435위, 436위 및 437위의 3아미노산 잔기의 결실.
[14] 추가적으로 HbA1c 디히드로게나아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 아미노산의 하나 이상이 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나 결실되어 있고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는, 13에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제:
(A) 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환,
63위의 류신에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘 또는 알라닌으로 치환,
102위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환,
110위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 류신 또는 티로신으로 치환,
113위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환,
355위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환,
419위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 아스파라긴으로 치환,
356위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 트레오닌으로 치환,
64위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산을 글리신, 세린, 메티오닌, 류신, 트레오닌, 발린 또는 이소류신으로 치환,
99위의 히스티딘에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환,
(B) 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘으로 치환,
257위의 발린에 대응하는 위치의 아미노산을 시스테인, 세린, 트레오닌으로 치환,
249위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
253위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
337위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
340위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
133위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로 치환,
44위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
256위의 글리신에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
231위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
81위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
(C) 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신에 대응하는 위치의 카르복실 말단 3아미노산의 결실.
[15] 3 내지 14 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 HbA1c 측정 시약 키트.
[16] 3 내지 14 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 효소 전극.
[17] 16에 기재된 효소 전극을 작용 전극으로서 갖는 효소 센서.
[18] HbA1c 디히드로게나아제가 3 내지 14 중 어느 하나에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제인, 1 또는 2에 기재된 측정 방법.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허출원번호 2016-086592호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면 프로테아제 등을 처방하지 않고 HbA1c를 측정할 수 있으며 산소의 영향을 받기 어렵고 나아가 고감도 측정이 가능한 당뇨병 진단용 효소로서, 또한 당뇨병 마커 측정용 센서에 이용할 수 있는 우수한 아마도리아제 및 이를 코드하는 유전자 등을 제공할 수 있다. 이 아마도리아제를 이용하면 프로테아제 등을 처방하지 않고 산소 존재 하에서도 보다 정확하게 당화 헤모글로빈의 측정을 행할 수 있다.
도 1a은 각종 공지의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 동일성 및 유사 아미노산을 예시하는 도면이다. Co, Et, Py, Ar, Cc, Nv, Cn, Pn, An, En, Ul 및 Pj를 얼라이먼트하였다.
도 1b는 도 1a의 연속이다.
도 1c은 도 1b의 연속이다.
도 1d는 도 1c의 연속이다.
도 1e는 도 1d의 연속이다.
도 2a는 각종 공지의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 동일성 및 유사 아미노산을 예시하는 도면이다. 도 1에 도시된 아마도리아제에 더하여 Ao2, Af2, At, Fo, Ao1, Af1, Pi, Dh를 얼라이먼트하였다.
도 2b는 도 2a의 연속이다.
도 2c는 도 2b의 연속이다.
도 2d는 도 2c의 연속이다.
도 2e는 도 2d의 연속이다.
도 2f는 도 2e의 연속이다.
도 2g는 도 2f의 연속이다.
도 2h는 도 2g의 연속이다.
도 2i는 도 2h의 연속이다.
도 2j는 도 2i의 연속이다.
도 3은 아마도리아제의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성을 나타낸다. 도 3은 효소 반응을 설명하기 위한 모식도로서 효소의 기질 특이성 등의 특성을 한정하는 것은 아니다.
도 4는 A1cDH를 이용한 HbA1c 측정의 결과를 나타낸다.
도 5는 여러 가지 HbA1c 농도에서의 전류 응답값을 플롯한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 아마도리아제는 당화 단백질이나 당화 펩티드를 기질로 할 수 있다.
(당화 단백질, 헤모글로빈 A1c)
본 발명에서의 당화 단백질이란 비효소적으로 당화된 단백질을 가리킨다. 당화 단백질은 생체 내외를 불문하고 존재하며, 생체 내에 존재하는 예로서는 혈액 중의 당화 헤모글로빈, 당화 알부민 등이 있고, 당화 헤모글로빈 중에서도 헤모글로빈의 β쇄 아미노 말단의 발린이 당화된 당화 헤모글로빈을 특히 헤모글로빈 A1c(HbA1c)라고 한다. 생체 밖에 존재하는 예로서는 단백질이나 펩티드와 당이 공존하는 액상 조미료 등의 음식품이나 수액 등이 있다.
(당화 펩티드, 프럭토실 펩티드)
본 발명에서의 당화 펩티드란 당화 단백질 유래의 비효소적으로 당화된 펩티드를 가리키며, 펩티드가 직접 비효소적으로 당화된 것이나 프로테아제 등에 의해 당화 단백질이 분해된 결과 발생한 것이나 당화 단백질을 구성하는 (폴리)펩티드가 당화된 것이 포함된다. 당화 펩티드를 프럭토실 펩티드라고 표기하는 경우도 있다. 당화 단백질에 있어서 당화를 받는 펩티드측의 아미노기로서는 아미노 말단의 α-아미노기, 펩티드 내부의 리신 잔기 측쇄의 ε-아미노기 등을 들 수 있지만, 본 발명에서의 당화 펩티드란 보다 구체적으로 α-당화 펩티드(α-프럭토실 펩티드)이다. α-당화 펩티드는 N 말단의 α-아미노산이 당화된 당화 단백질로부터 어떠한 수단, 예를 들어 프로테아제에 의한 한정 분해 등에 의해 유리시켜 형성된다. 예를 들어 대상의 당화 단백질이 헤모글로빈 A1c(HbA1c)인 경우, 해당하는 α-당화 펩티드는 N말단이 당화되어 있는 HbA1c의 β쇄로부터 절단되는 당화된 펩티드를 가리킨다. 146잔기의 아미노산에 의해 구성되어 있는 HbA1c의 β쇄도 α-당화 펩티드에 해당한다(αF146P).
어떤 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질(기질)은 HbA1c, 보다 구체적으로 HbA1c의 β쇄이다. 별도의 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 HbA1c의 β쇄로부터 절단되는 α-당화 펩티드, 예를 들어 αFV~αF128P, αFV~αF64P, αFV~αF32P, αFV~αF16P, 예를 들어 αF6P(α-프럭토실 발릴 히스티딜 류실 트레오닐 프롤릴 글루타민산)이다. 별도의 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 αFVH(α-프럭토실 발릴 히스티딘) 또는 αFV(α-프럭토실 발린)이다.
(아마도리아제)
아마도리아제는 케토아민 옥시다아제, 프럭토실 아미노산 옥시다아제, 프럭토실 펩티드 옥시다아제, 프럭토실아민 옥시다아제 등으로도 칭하며 산소의 존재 하에서 이미노2아세트산 혹은 그 유도체(아마도리 화합물)를 산화하여 글리옥실산 또는 α-케토알데히드, 아미노산 또는 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 말한다. 아마도리아제는 자연계에 널리 분포되어 있고, 미생물이나 동물 혹은 식물 기원의 효소를 탐색함으로써 얻을 수 있다. 미생물에 있어서 예를 들어 사상균, 효모 혹은 세균 등으로부터 얻을 수 있다.
(HbA1c 옥시다아제)
여러 가지 아마도리아제 중 HbA1c 그 자체를 기질로서 인식하고 HbA1c를 직접 산화하는 활성을 갖는 것을 본 명세서에서 HbA1c 옥시다아제라고 하고, 이를 A1cOX라고 기재하는 경우가 있다. HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제는 예를 들어 국제공개 제2015/060429호의 기재에 기초하여 취득할 수 있다. 또한, 이는 국제공개 제2015/005257호의 기재에 기초하여 취득할 수도 있다. 참고로 이들의 전체 내용을 본 명세서에 도입한다. HbA1c 옥시다아제는 이러한 공지 문헌에 기재된 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또한, 공지의 HbA1c 옥시다아제에 추가적으로 기질 특이성을 개변하는 변이 등이 도입되어도 된다.
HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 가질 수 있는 아미노산 치환의 예로서, 서열 번호 1의 아미노산 서열에서의 이하의 위치에 대응하는 위치에서의 아미노산 치환을 들 수 있다.
(a) 62위(아르기닌)
(b) 63위(류신)
(c) 102위(글루타민산)
(d) 106위(아스파라긴산)
(e) 110위(글루타민)
(f) 113위(알라닌)
(g) 355위(알라닌)
(h) 419위(알라닌)
(i) 68위(아스파라긴산)
(j) 356위(알라닌)
(k) 64위(아르기닌)
(l) 99위(히스티딘)
이 경우 바람직하게는 (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산은 아스파라긴, 알라닌, 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 메티오닌, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산은 히스티딘, 알라닌 또는 글리신으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산은 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산은 류신, 티로신, 페닐알라닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신 또는 아르기닌으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산은 세린으로 치환될 수 있다. 경우에 따라 (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산은 트레오닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (k) 서열 번호 1의 64위에 대응하는 위치의 아미노산은 글리신, 세린, 메티오닌, 류신, 트레오닌, 발린 또는 이소류신으로 치환될 수 있다. 경우에 따라 (l) 서열 번호 1의 99위에 대응하는 위치의 아미노산은 세린으로 치환될 수 있다.
특정의 실시형태에서 HbA1c 옥시다아제는 상기의 변이와는 별도로 또는 상기의 변이에 더하여 이하의 위치 또는 이에 대응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다:
(l) 서열 번호 1의 67위,
(m) 서열 번호 1의 72위,
(n) 서열 번호 1의 76위,
(o) 서열 번호 1의 96위,
(p) 서열 번호 1의 109위,
(q) 서열 번호 1의 116위
경우에 따라 (l) 서열 번호 1의 67위에 대응하는 위치의 아미노산은 히스티딘일 수 있다. 경우에 따라 (m) 서열 번호 1의 72위에 대응하는 위치의 아미노산은 세린일 수 있다. 경우에 따라 (n) 서열 번호 1의 76위에 대응하는 위치의 아미노산은 알라닌 또는 페닐알라닌일 수 있다. 경우에 따라 (o) 서열 번호 1의 96위에 대응하는 위치의 아미노산은 글루타민산일 수 있다. 경우에 따라 (p) 서열 번호 1의 109위에 대응하는 위치의 아미노산은 아르기닌 또는 리신일 수 있다. 경우에 따라 (q) 서열 번호 1의 116위에 대응하는 위치의 아미노산은 아르기닌일 수 있다.
이들 위치(62위/63위/102위/106위/110위/113위/355위/419위/68위/356위/64위/99위 및 67위/72위/76위/96위/109위/116위)의 변이는 아마도리아제의 기질 특이성을 개변하는 변이의 예이다. 단, 이는 예시로서 기질 특이성을 개변하는 변이는 이에 한정하지 않는다. 어떤 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제는 하나 또는 복수의 기질 특이성을 개변하는 변이를 가진다.
(본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제)
어떤 실시형태에서 본 발명은 HbA1c 디히드로게나아제를 제공한다. HbA1c 디히드로게나아제는 아마도리아제에 본 발명의 변이를 도입함으로써 제작할 수 있다. 어떤 실시형태에서 HbA1c 디히드로게나아제는 HbA1c 옥시다아제(A1cOX)에 기초하여 취득할 수 있다. HbA1c 옥시다아제로서는 상기의 것이 예시되지만 이에 한정되지 않고, HbA1c를 기질로서 인식하고 HbA1c를 직접 산화하는 것이면 어떠한 것으로도 된다. 다른 실시형태에서는 아마도리아제에 본 발명의 변이를 도입하여 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제를 제작하고, 다음으로 이에 기질 특이성을 개변하는 변이를 도입하여 HbA1c에 직접 작용하는 HbA1c 디히드로게나아제를 제작할 수 있다.
본 명세서에서 HbA1c 디히드로게나아제란 본 발명의 변이를 도입하기 전의 (친)아마도리아제와 비교하여 변이 도입 후 아마도리아제의 디히드로게나아제 활성이 향상되거나 옥시다아제 활성이 저감되거나 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감되거나 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 저감된, HbA1c에 작용하는 아마도리아제를 말한다. 이는 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제가 옥시다아제 활성을 가짐을 배제하는 것은 아니다. 또한, HbA1c를 기질로서 전혀 인식하지 않는, 즉 HbA1c에 전혀 작용하지 않는 아마도리아제는 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제에 포함되지 않는다.
어떤 실시형태에서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 Coniochaeta속 유래의 아마도리아제(서열 번호 1)에 기초하여 제작된 HbA1c 디히드로게나아제이다. 어떤 실시형태에서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 3), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 4), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 5), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 6), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 7), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 8), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 9), Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 10), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 11), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 12), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 13), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(서열 번호 19), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af2(서열 번호 20), Aspergillus terreus 유래의 아마도리아제 At(서열 번호 21), Fusarium oxysporum 유래의 아마도리아제 Fo(서열 번호 22), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao1(서열 번호 23), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af1(서열 번호 24), Pichia sp. 유래의 아마도리아제 Pi(서열 번호 25), Debaryomyces hansenii 유래의 아마도리아제 Dh(서열 번호 26) 또는 이들의 균등물에 기초하여 제작된 HbA1c 디히드로게나아제이다.
이러한 HbA1c 디히드로게나아제의 예로서는 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 서열 번호 16-26 중 어느 하나로 높은 서열 동일성(예를 들어 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제 및 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 서열 번호 16-26 중 어느 하나에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제를 들 수 있다.
또, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 예를 들어 Eupenicillium 속, Pyrenochaeta 속, Arthrinium 속, Curvularia 속, Neocosmospora 속, Cryptococcus 속, Phaeosphaeria 속, Aspergillus 속, Emericella 속, Ulocladium 속, Penicillium 속, Fusarium 속, Achaetomiella 속, Achaetomium 속, Thielavia 속, Chaetomium 속, Gelasinospora 속, Microascus 속, Leptosphaeria 속, Ophiobolus 속, Pleospora 속, Coniochaetidium 속, Pichia 속, Corynebacterium 속, Agrobacterium 속, Arthrobacter 속, Debaryomyces 속 등의 생물종에 유래하는 아마도리아제에 기초하여 제작된 것으로도 된다. 이들 중에서도 HbA1c에 작용하고 디히드로게나아제 활성을 가지며 아미노산 서열이 상기와 같이 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 서열 번호 16-26으로 높은 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
HbA1c 디히드로게나아제는 HbA1c 옥시다아제의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 부가하거나 결실시킴으로써 얻을 수 있다.
(디히드로게나아제 활성의 향상/옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 치환)
디히드로게나아제 활성의 향상 및/또는 옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 아미노산의 치환으로서 서열 번호 1의 아미노산 서열에서의 이하의 위치에 대응하는 위치의 아미노산 치환을 들 수 있다. 이들을 본 발명의 디히드로게나아제 활성을 향상시키는 변이, 본 발명의 옥시다아제 활성을 저감시키는 변이, 본 발명의 디히드로게나아제 활성을 향상시키고 및/또는 옥시다아제 활성을 저감시키는 변이, 혹은 단지 본 발명의 변이 또는 본 발명의 치환이라고 하는 경우가 있다.
(1) 280위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 아미노산, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하전 아미노산, 또는 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환.
(2) 267위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 티로신, 류신, 메티오닌, 트립토판, 이소류신, 발린, 시스테인 또는 알라닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 소수성 아미노산 잔기로 치환.
(3) 269위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 티로신, 류신, 메티오닌, 트립토판, 이소류신, 발린, 시스테인 또는 알라닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 소수성 아미노산 잔기로 치환.
(4) 54위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 히스티딘, 글리신 또는 발린으로 치환.
(5) 241위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 글루타민, 리신, 글루타민산, 아스파라긴, 아스파라긴산, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환.
본 명세서에서는 편의상 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴을 극성 아미노산이라고 하는 경우가 있다. 또한, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 하전 아미노산이라고 하는 경우가 있다. 또한, 알라닌, 시스테인, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판을 소수성 아미노산이라고 하는 경우가 있다. 또한, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린을 부피가 큰 아미노산이라고 하는 경우가 있다.
본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 상기 아미노산 치환을 적어도 하나 가지고 있으면 되고, 복수의 아미노산 치환을 가지고 있어도 된다. 예를 들어 상기 아미노산 치환의 1, 2, 3, 4 또는 5를 가지고 있다.
그 중에서도 이하의 아미노산의 위치에 대응하는 아미노산의 치환을 가지고 있는 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감된 변이체가 바람직하다.
(1) 280위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 메티오닌, 리신, 아르기닌 또는 아스파라긴으로 치환.
(2) 267위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 티로신, 류신 또는 메티오닌으로 치환.
(3) 269위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 티로신, 류신 또는 메티오닌으로 치환.
(4) 54위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 아스파라긴, 알라닌으로 치환.
(5) 241위에 대응하는 위치의 치환, 예를 들어 글루타민, 리신 또는 글루타민산으로 치환.
본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 위치에 대응하는 위치에서 상기 디히드로게나아제 활성의 향상 및/또는 옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 아미노산의 치환을 가질 수 있다. 나아가 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 이들 치환 아미노산 이외의 위치에서 하나 또는 수개(예를 들어 1~30개, 1~20개, 1~15개, 예를 들어 1~10개, 바람직하게는 1~5개, 더욱 바람직하게는 1~3개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환되어 있어도 된다. 나아가 본 발명은 상기 디히드로게나아제 활성의 향상 및/또는 옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 아미노산의 치환, 기질 특이성 등 디히드로게나아제 활성 향상 이외의 성질을 향상시키는 아미노산의 치환을 가지고, 상기 치환한 아미노산을 제외한 부분의 아미노산 서열에 대해 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 서열 번호 16-26의 아미노산 서열과 비교하여 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, HbA1c에 직접 작용하고, 디히드로게나아제 활성이 개변된 아마도리아제 변이체를 포함한다.
또, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제는 국제공개 2007/125779호에서 pKK223-3-CFP-T7이라고 부르는 재조합체 플라스미드(기탁 번호: FERM BP-10593)를 보유하는 대장균이 생산하는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제(CFP-T7)로서, 전에 출원인이 발견한 열안정성이 우수한 개변형 아마도리아제이다. 이 CFP-T7은 천연형 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에 대해 272위, 302위 및 388위에 인위적인 변이를 순차적으로 도입함으로써 획득한 3중 변이체이다.
또한, 국제공개 제2015/060429호에 개시되어 있는 CFP-T7-H35는 CFP-T7에 R62D, L63H, E102K, D106K, Q110L, A113K, A355S의 아미노산 치환을 도입한 것이다. CFP-T7-H37(서열 번호 14)은 CFP-T7-H35에 변이 D68N/A356T를 도입한 것이다.
상기 아미노산 치환에 있어서, 아미노산의 위치는 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 나타내고 있지만, 다른 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서는 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열에서의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 치환되어 있다. 「대응하는 위치」의 의미에 대해서는 후술한다.
(추가적인 치환)
(아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 아미노산 치환에 대해)
본 발명자들은 아마도리아제의 아미노산 잔기를 치환함으로써 그 계면활성제 내성을 향상시킬 수 있음을 보고하였다. 예를 들어 국제공개 제2015/020200호 명세서를 참조할 것. 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입한다.
아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 아미노산 치환으로서 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하의 위치에 대응하는 위치에서의 아미노산 치환을 들 수 있다.
(i) 262위,
(ii) 257위,
(iii) 249위
(iv) 253위,
(v) 337위,
(vi) 340위,
(vii) 232위,
(viii) 129위,
(ix) 132위,
(x) 133위,
(xi) 44위,
(xii) 256위,
(xiii) 231위,
(xiv) 81위
경우에 따라 262위에 대응하는 위치의 아미노산은 히스티딘으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 257위에 대응하는 위치의 아미노산은 시스테인, 세린, 트레오닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 249위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 253위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 337위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 340위에 대응하는 위치의 아미노산은 프롤린으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 232위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 129위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 132위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 133위에 대응하는 위치의 아미노산은 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 44위에 대응하는 위치의 아미노산은 프롤린으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 256위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 231위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 81위에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
본 명세서에서는 이들 위치(44위/133위/253위/257위/262위/337위/340위 및 249위/232위/129위/132위/256위/231위/81위)의 변이를 아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 변이라고 부르는 경우가 있다. 어떤 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제는 계면활성제 내성을 향상시키는 변이를 더 가질 수 있다.
(아마도리아제의 열안정성을 향상시키는 아미노산 결실에 대해)
본 발명자들은 이전에 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실시킴으로써 그 열안정성을 향상시킬 수 있음을 보고하였다(국제공개 제2013/100006호 명세서를 참조. 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입함). 어떤 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제는 상기 치환에 더하여 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실하여도 된다. 본 명세서에서 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기의 결실을 열안정성을 향상시키는 결실이라고 부르는 경우가 있다.
(아마도리아제를 코드하는 유전자의 취득)
이들 아마도리아제를 코드하는 본 발명의 유전자(이하, 단지 「아마도리아제 유전자」라고도 함)를 얻으려면 통상 일반적으로 이용되고 있는 유전자의 클로닝 방법이 이용된다. 예를 들어, 아마도리아제 생산능을 가지는 미생물 균체나 여러 가지 세포로부터 통상의 방법 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 1989)에 기재된 방법에 의해 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 나아가 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 염색체 DNA 또는 cDNA를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.
다음으로 상기 아마도리아제의 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프로브 DNA를 합성하고, 이를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 아마도리아제 유전자를 선발하는 방법, 혹은 상기 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프라이머 DNA를 제작하여 5'RACE법이나 3'RACE법 등의 적당한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR법)에 의해 아마도리아제를 코드하는 목적의 유전자 단편을 포함하는 DNA를 증폭시키고, 이들 DNA 단편을 연결시켜 목적의 아마도리아제 유전자의 전체길이를 포함하는 DNA를 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 아마도리아제를 코드하는 유전자의 바람직한 일례로서 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제 유전자(일본공개특허 2003-235585호 공보)의 예 등을 들 수 있다.
이들 아마도리아제 유전자는 통상의 방법과 같이 각종 벡터에 연결되어 있는 것이 취급상 바람직하다. 예를 들어, Coniochaeta sp. NISL 9330주 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA가 pKK223-3 Vector(GE 헬스케어사 제품)에 삽입된 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP(일본공개특허 2003-235585호 공보)를 들 수 있다.
(벡터)
본 발명에서 이용할 수 있는 벡터로서는 상기 플라스미드에 한정되지 않고, 그 이외의 예를 들어 박테리오파지, 코스미드 등의 당업자에게 공지의 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 구체적으로 예를 들어 pBluescriptII SK+(STRATAGENE사 제품) 등이 바람직하다.
(아마도리아제 유전자의 변이 처리)
아마도리아제 유전자의 변이 처리는 기도하는 변이 형태에 따른 공지의 임의의 방법으로 행할 수 있다. 즉, 아마도리아제 유전자 혹은 그 유전자가 도입된 재조합체 DNA와 변이원이 되는 약제를 접촉·작용시키는 방법; 자외선 조사법; 유전자 공학적 수법; 또는 단백질 공학적 수법을 구사하는 방법 등을 널리 이용할 수 있다.
상기 변이 처리에 이용되는 변이원이 되는 약제로서는 예를 들어 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 아질산, 아황산, 히드라진, 포름산 혹은 5-브로모우라실 등을 들 수 있다.
상기 접촉·작용의 여러 가지 조건은 이용하는 약제의 종류 등에 따른 조건을 채용하는 것이 가능하고, 현실적으로 원하는 변이를 아마도리아제 유전자에서 야기할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 통상 바람직하게는 0.5~12M의 상기 약제 농도에서 20~80℃의 반응 온도 하에서 10분간 이상, 바람직하게는 10~180분간 접촉·작용시킴으로써 원하는 변이를 야기 가능하다. 자외선 조사를 행하는 경우에도 상기와 같이 통상의 방법에 따라 행할 수 있다(현대화학, p24~30, 1989년 6월호).
단백질 공학적 수법을 구사하는 방법으로서는 일반적으로 Site-Specific Mutagenesis로서 알려진 수법을 이용할 수 있다. 예를 들어, Kramer법(Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)), Eckstein법(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)), Kunkel법(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488 (1985): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)) 등을 들 수 있다. DNA 중의 염기 서열을 변환하는 구체적인 방법으로서는 예를 들어 시판의 키트(Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech사, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene 제품, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene 제품 등)의 이용을 들 수 있다.
또한, 일반적인 PCR법(폴리메라아제 체인 리액션, Polymerase Chain Reaction)으로서 알려진 수법을 이용할 수도 있다(Technique, 1, 11(1989)). 또, 상기 유전자 개변법 외에 유기 합성법 또는 효소 합성법에 의해 직접 원하는 개변 아마도리아제 유전자를 합성할 수도 있다.
상기 방법에 의해 얻어지는 아마도리아제 유전자의 DNA 염기 서열의 결정 혹은 확인을 행하는 경우에는 예를 들어 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 CEQ2000(베크만 쿨터사 제품) 또는 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Thermo Fisher Scientific 제품) 등을 이용함으로써 행할 수 있다.
(형질 전환·형질 도입)
상술한 바와 같이 하여 얻어진 아마도리아제 유전자를 통상의 방법에 의해 박테리오파지, 코스미드 또는 원핵 세포 혹은 진핵 세포의 형질 전환에 이용되는 플라스미드 등의 벡터에 도입하고, 각각의 벡터에 대응하는 숙주를 통상의 방법에 의해 형질 전환 또는 형질 도입을 할 수 있다. 예를 들어, 얻어진 재조합체 DNA를 이용하여 임의의 숙주, 예를 들어 에세리키아 속에 속하는 미생물, 구체예로서는 대장균 K-12주, 바람직하게는 대장균 JM109주, 대장균 DH5α주(모두 다카라 바이오사 제품)나 대장균 B주, 바람직하게는 대장균 BL21주(니폰진사 제품) 등을 형질 전환 또는 이들에 형질 도입하여 각각의 균주를 얻을 수 있다.
(아미노산 서열의 동일성 또는 유사성)
아미노산 서열의 동일성 또는 유사성은 GENETYX Ver.11(제네틱스사 제품)의 맥시멈 매칭이나 서치 호몰로지 등의 프로그램 또는 DNASIS Pro(히타치 솔루션즈사 제품)의 맥시멈 매칭이나 멀티플 얼라이먼트 등의 프로그램에 의해 계산할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 계산하기 위해 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 그 2개 이상의 아마도리아제에서 동일한 아미노산의 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 동일 영역을 결정할 수 있다.
또한, 2개 이상의 아마도리아제에서 유사한 아미노산의 위치를 조사할 수도 있다. 예를 들어 CLUSTALW를 이용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라이먼트할 수 있고, 이 경우 알고리즘으로서 Blosum62를 사용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라이먼트하였을 때에 유사하다고 판단되는 아미노산을 유사 아미노산이라고 부르는 경우가 있다. 본 발명의 변이체에 있어서, 아미노산 치환은 이러한 유사 아미노산 사이의 치환에 의한 것일 수 있다. 이러한 얼라이먼트에 의해 복수의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 동일한 영역 및 유사 아미노산에 의해 차지하는 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 상동성 영역이나 보존 영역을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 「상동성 영역」이란 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 어떤 기준이 되는 아마도리아제와 비교 대상의 아마도리아제의 대응하는 위치에서의 아미노산이 동일하거나 유사 아미노산으로 이루어지는 영역으로서, 연속되는 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지는 영역을 말한다. 예를 들어, 도 1~도 5에서는 전체길이 아미노산 서열의 서열 동일성이 74% 이상인 아마도리아제를 얼라이먼트하였다. 이 중, 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제10위~32위는 동일 또는 유사 아미노산으로 이루어지고, 따라서 상동성 영역에 해당한다. 마찬가지로 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위는 상동성 영역에 해당할 수 있다.
바람직하게는 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11위~32위, 36~41위, 50~52위, 54~58위, 84~86위, 88~90위, 145~150위, 157~168위, 202~205위, 207~212위, 215~225위, 236~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 347~354위, 357~363위, 370~383위, 385~387위 및 405~410위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
더욱 바람직하게는 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11~18위, 20~32위, 50~52위, 54~58위, 266~268위, 270~273위, 277~286위 및 370~383위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 서열 번호 16-26에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제와 얼라이먼트하였을 때에 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 예를 들어 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 전체길이 아미노산 서열 동일성을 가지고 HbA1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 가진다. 나아가 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제의 상동성 영역에서의 아미노산 서열은 서열 번호 1에서의 상동성 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 75% 이상, 예를 들어 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 서열 동일성을 가진다.
본 명세서에서 「보존 영역」이란 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 어떤 기준이 되는 아마도리아제와 비교 대상의 아마도리아제의 대응하는 위치에서의 아미노산이 동일하거나 유사 아미노산으로 이루어지는 영역을 말한다. 예를 들어, 도 2a~도 2j에서는 전체길이 아미노산 서열의 서열 동일성이 30% 이상인 아마도리아제를 얼라이먼트하였다. 이 중 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 36, 37, 41, 46, 47, 50, 51, 52, 54, 56, 57, 58, 75, 79, 82, 84, 85, 93, 95, 149, 158, 159, 162, 165, 166, 177, 180, 202, 208, 218, 220, 221, 222, 224, 228, 233, 239, 243, 246, 250, 255, 258, 260, 266, 267, 270, 272, 277, 278, 280, 281, 282, 284, 285, 286, 318, 321, 326, 329, 334, 339, 346, 347, 348, 351, 352, 354, 358, 359, 362, 363, 370, 373, 376, 382, 385, 386, 389, 406, 407, 409, 418, 425 및 427위는 동일 또는 유사 아미노산으로 이루어지고, 따라서 보존 영역에 해당한다. 마찬가지로 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제15, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 41, 46, 47, 51, 52, 54, 56, 57, 79, 82, 93, 149, 158, 159, 162, 177, 180, 202, 208, 221, 222, 233, 243, 250, 258, 266, 267, 270, 278, 280, 282, 284, 285, 318, 334, 347, 348, 351, 362, 363, 373, 376, 386, 407, 409 및 418위는 동일 아미노산으로 이루어지고, 따라서 보존 영역에 해당한다.
단, 상기 상동성 영역 및 보존 영역은 어디까지나 천연 아마도리아제의 아미노산 서열끼리의 비교에 대한 영역이며, 천연 아마도리아제에 기초하여 여러 가지 변이를 도입한 개변 아마도리아제에 대해서는 이들 상동성 영역 또는 보존 영역 중의 각각 대응하는 아미노산은 치환되어 있어도 되고, 개변 후는 반드시 동일 또는 유사 아미노산이 아니어도 된다.
예를 들어, 어떤 실시형태에서는 천연 아마도리아제로부터 출발하여 변이를 도입하여 개변 아마도리아제(예를 들어 HbA1c 옥시다아제)를 취득할 수 있다. 다음으로 개변 아마도리아제에 본 발명의 변이를 도입하여 HbA1c 디히드로게나아제로 할 수 있다. 이 때, 보존 영역의 서열 동일성의 비교는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 개변 아마도리아제가 아니라 서열 번호 1의 아미노산 서열과 개변 아마도리아제가 유래하는 천연 아마도리아제의 아미노산 서열로 행하는 것으로 한다.
따라서, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제가 유래하는 천연 아마도리아제의 보존 영역의 아미노산 서열과 서열 번호 1의 보존 영역의 아미노산 서열의 서열 동일성은 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상이어도 되고, 예를 들어 어떤 실시형태에서는 100%이다. 나아가 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 서열 번호 16-26에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제와 얼라이먼트하였을 때에 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 예를 들어 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 전체길이 아미노산 서열 동일성을 가지고 HbA1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 가진다.
(대응하는 위치의 특정)
본 명세서에서 어떤 위치에 「대응하는 위치」란 특별히 언급하지 않는 한 서열 번호 1에 나타내는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 특정 위치에 대응하는 다른 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 말한다. 본 명세서에서 대응하는 위치를 상당하는 위치라고 하는 경우가 있다. 또한, 특정 위치에 「대응하는 위치의 아미노산」을 대응 아미노산이라고 하는 경우가 있다.
어떤 아미노산 서열 중의 특정 위치에 대한 다른 아미노산 서열 중의 「대응하는 위치」를 특정하는 방법으로서는 예를 들어 리프만 피어슨법 등의 공지의 알고리즘을 이용하여 아미노산 서열을 비교하고, 각 아마도리아제의 아미노산 서열 중에 존재하는 보존 아미노산 잔기에 최대의 동일성을 부여함으로써 행할 수 있다. 아마도리아제의 아미노산 서열을 이러한 방법으로 정렬시킴으로써 아미노산 서열 중에 존재하는 삽입, 결실에 관계없이 상동 아미노산 잔기의 각 아마도리아제 서열에서의 서열 중의 위치를 결정하는 것이 가능하다. 상동 위치는 3차원 구조 중에서 같은 위치에 존재한다고 생각되며, 대상이 되는 아마도리아제의 특이적 기능에 관해 유사한 효과를 가지는 것을 추정할 수 있다.
도 1a~도 1e 및 도 2a~도 2j에 여러 가지 공지의 생물종 유래의 아마도리아제의 서열을 예시한다. 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 최상단에 나타낸다. 도 1a~도 1e에 도시된 각종 서열은 모두 서열 번호 1의 서열과 70% 이상의 동일성을 가지고, 공지의 알고리즘을 이용하여 정렬시켰다. 도 2a~도 2j에 도시된 각종 서열은 모두 서열 번호 1의 서열과 30% 이상의 동일성을 가지고, 공지의 알고리즘을 이용하여 정렬시켰다. 도 1a~도 1e 및 도 2a~도 2j로부터 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열의 특정 위치에 대응하는 다른 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 알 수 있다. 또한, 대응하는 위치를 알 수 있음과 아울러 그 대응 위치에서의 대응 아미노산을 알 수 있다. 도 1~도 5에는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제(서열 번호 1), Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 3), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 4), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 5), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 6), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 7), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 8), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 9), Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 10), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 11), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 12) 및 Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 13)의 아미노산 서열을 나타내고 있다. 도 2a~도 2j에는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제(서열 번호 1) 등 도 1a~도 1e에 기재된 것에 더하여 Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(별칭 FaoAo2, 서열 번호 19), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af2(별칭 AmadoriaseII, 서열 번호 20), Aspergillus terreus 유래의 아마도리아제 At(별칭 FAOD-A, 서열 번호 21), Fusarium oxysporum 유래의 아마도리아제 Fo(서열 번호 22), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao1(별칭 FaoAo 1, 서열 번호 23), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af1(별칭 AmadoriaseI, 서열 번호 24), Pichia sp. 유래의 아마도리아제 Pi(서열 번호 25), Debaryomyces hansenii 유래의 아마도리아제 Dh(서열 번호 26)의 아미노산 서열을 나타내고 있다.
(특정 위치에 대응하는 위치의 아미노산)
본 발명에서 「서열 번호 1의 아미노산 서열의 280위에 대응하는 위치의 아미노산」이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 280위에 대응하는 위치에서의 아미노산을 의미한다. 이는 상기 「대응하는 위치」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1a~도 1e 또는 도 2a~도 2j로부터 특정할 수 있다. 이하의 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열의 267위, 269위, 54위 및 241위에 대응하는 위치의 아미노산에 대해서도 각각 동일하다.
즉, 「서열 번호 1의 아미노산 서열의 280위에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 280위의 시스테인, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 278위의 시스테인, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 278위의 시스테인, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 276위의 시스테인, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 278위의 시스테인, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 280위의 시스테인이다.
서열 번호 1 및 3~13의 각 서열에서 서열 번호 1의 아미노산 서열의 280위, 267위, 269위, 54위 및 241위에 대응하는 각각의 위치는 다음의 표와 같다.
Figure pct00001
예를 들어 표 중, 서열 번호 1의 267위에 대응하는 위치의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 3)에서는 267위의 페닐알라닌이다. 다른 위치에 대해서도 마찬가지로 표에서 판독할 수 있다.
나아가 Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(서열 번호 19), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af2(서열 번호 20), Aspergillus terreus 유래의 아마도리아제 At(서열 번호 21), Fusarium oxysporum 유래의 아마도리아제 Fo(서열 번호 22), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao1(서열 번호 23), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af1(서열 번호 24), Pichia sp. 유래의 아마도리아제 Pi(서열 번호 25) 및 Debaryomyces hansenii 유래의 아마도리아제 Dh(서열 번호 26)의 각 서열에서 서열 번호 1의 아미노산 서열의 280위, 267위, 269위, 54위 및 241위에 대응하는 각각의 위치는 다음의 표와 같다.
Figure pct00002
예를 들어 표 중, 서열 번호 1의 280위에 대응하는 위치의 아미노산은 Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(서열 번호 19)에서는 276위의 시스테인이다.
(기질 특이성 개변 변이의 대응 위치)
본 명세서에서 「서열 번호 1의 아미노산 서열의 62위에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산을 의미한다. 이는 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1a~도 1e 또는 도 2a~도 2j로부터 특정할 수 있다. 이하의 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열의 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위, 356위, 64위 및 99위, 나아가 하기의 262위, 257위, 249위, 253위, 337위, 340위, 232위, 129위, 132위, 133위, 44위, 256위, 231위 및 81위에 대응하는 위치의 아미노산에 대해서도 각각 동일하다.
서열 번호 1 및 3~13의 각 서열에서 서열 번호 1의 아미노산 서열의 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위, 356위, 64위 및 99위에 대응하는 각각의 위치는 다음의 표와 같다.
Figure pct00003
나아가 Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(서열 번호 19), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af2(서열 번호 20), Aspergillus terreus 유래의 아마도리아제 At(서열 번호 21), Fusarium oxysporum 유래의 아마도리아제 Fo(서열 번호 22), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao1(서열 번호 23), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af1(서열 번호 24), Pichia sp. 유래의 아마도리아제 Pi(서열 번호 25) 및 Debaryomyces hansenii 유래의 아마도리아제 Dh(서열 번호 26)의 각 서열에서 서열 번호 1의 아미노산 서열의 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위, 356위, 64위 및 99위에 대응하는 각각의 위치는 다음의 표와 같다. 표 중, Dh에 대해서는 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치는 존재하지 않는다. 그 때문에 Dh에 대해서는 아미노산을 치환하는 위치로서 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치가 선택되는 일은 없다. 대응하는 위치가 정의되지 않은 다른 위치에 대해서도 동일하다.
Figure pct00004
(계면활성제 내성 향상 변이의 대응 위치)
서열 번호 1 및 3~13의 각 서열에서 서열 번호 1의 아미노산 서열의 44위, 133위, 253위, 257위, 262위, 337위, 340위, 249위, 232위, 129위, 132위, 256위, 231위 및 81위에 대응하는 각각의 위치는 다음의 표와 같다.
Figure pct00005
나아가 Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(서열 번호 19), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af2(서열 번호 20), Aspergillus terreus 유래의 아마도리아제 At(서열 번호 21), Fusarium oxysporum 유래의 아마도리아제 Fo(서열 번호 22), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao1(서열 번호 23), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af1(서열 번호 24), Pichia sp. 유래의 아마도리아제 Pi(서열 번호 25) 및 Debaryomyces hansenii 유래의 아마도리아제 Dh(서열 번호 26)의 각 서열에서 서열 번호 1의 아미노산 서열의 44위, 133위, 253위, 257위, 262위, 337위, 340위, 249위, 232위, 129위, 132위, 256위, 231위 및 81위에 대응하는 각각의 위치는 다음의 표와 같다.
Figure pct00006
(열안정성 향상 결실의 대응 위치)
본 명세서에서 「서열 번호 1의 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」란 대상이 되는 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 3아미노산 잔기의 위치를 의미한다. Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에서 이 위치의 3잔기의 서열은 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신으로 이루어지고, 이들에 대응하는 위치의 아미노산 서열도 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1a~도 1e 또는 도 2a~도 2j로부터 특정할 수 있다.
또, 진핵생물에서는 단백질을 퍼옥시좀으로 수송하기 위한 시그널 서열로서 카르복실 말단의 3아미노산으로 구성되는 모티프인 「퍼옥시좀 이행 시그널(Peroxisome Targeting Signal1; PTS1) 서열」이 알려져 있다. 잘 알려진 공지의 PTS1 모티프로서는 (프롤린/세린/알라닌/시스테인)-(리신/히스티딘/아르기닌/아스파라긴)-(류신/메티오닌) 서열로 이루어지는 모티프가 있다(예를 들어 FEBS J., 272, 2362 (2005), Plant Cell Physiol., 38, 759 (1997), Eur. J. Cell Biol., 71, 248 (1996) 참조). 이 지견에 기초하면 「서열 번호 1의 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」의 영역이 아마도리아제에서의 이른바 PTS1 모티프에 상당한다. 따라서, 어떤 측면에서는 「서열 번호 1의 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」는 「PTS1 모티프에 상당하는 위치」라고 해석할 수도 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 히스티딘 및 437위의 류신으로 이루어지고, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 438위의 알라닌, 439위의 리신 및 440위의 류신으로 이루어지며, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 450위의 히스티딘, 451위의 리신 및 452위의 류신으로 이루어지고, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 438위의 세린, 439위의 리신 및 440위의 류신으로 이루어지며, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 아스파라긴 및 437위의 류신으로 이루어지고, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 436위의 알라닌, 437위의 리신 및 438위의 메티오닌으로 이루어지며, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 436위의 알라닌, 437위의 리신 및 438위의 메티오닌으로 이루어지고, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 439위의 알라닌, 440위의 리신 및 441위의 류신으로 이루어지며, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 리신 및 437위의 류신으로 이루어진다.
또, 어떤 실시형태에서 「서열 번호 1의 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」, 즉 「PTS1 모티프에 상당하는 위치」는 본래부터 C말단측의 1잔기(류신/메티오닌)가 결실되어 있어도 된다. 예를 들어 Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 「서열 번호 1의 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」, 즉 「PTS1 모티프에 상당하는 위치」는 440위의 세린, 441위의 아르기닌으로 이루어진다. Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에 대해서는 서열 번호 1에 기재된 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치는 존재하지 않는 것으로 한다.
나아가 Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao2(서열 번호 19), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af2(서열 번호 20), Aspergillus terreus 유래의 아마도리아제 At(서열 번호 21), Fusarium oxysporum 유래의 아마도리아제 Fo(서열 번호 22), Aspergillus oryzae 유래의 아마도리아제 Ao1(서열 번호 23), Aspergillus fumigatus 유래의 아마도리아제 Af1(서열 번호 24), Pichia sp. 유래의 아마도리아제 Pi(서열 번호 25) 및 Debaryomyces hansenii 유래의 아마도리아제 Dh(서열 번호 26)의 각 서열에서 「서열 번호 1의 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」, 즉 「PTS1 모티프에 상당하는 위치」는 다음의 표와 같다. Pi에 대해서는 424, 425, 426위를 결실시킬 때에 추가로 427위도 결실시켜도 된다(카르복시 말단 4아미노산 결실). 이러한 Pi에 대한 카르복시 말단 4아미노산 결실도 편의상 서열 번호 1을 기준으로 한 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터의 3아미노산 잔기 결실에 포함시키는 것으로 한다. 또, 서열 번호 1을 기준으로 하였을 때의 대응하는 위치가 정의되지 않은 위치는 아미노산 결실을 행하는 위치로서 선택되지 않는다.
Figure pct00007
(본 발명의 아마도리아제의 생산)
상기와 같이 하여 얻어진 아마도리아제의 생산능을 가지는 균주를 이용하여 그 아마도리아제를 생산하려면 이 균주를 통상의 고체 배양법으로 배양해도 되지만, 가능한 한 액체 배양법을 채용하여 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 균주를 배양하는 배지로서는 예를 들어 효모 엑기스, 트립톤, 펩톤, 고기 엑기스, 옥수수 침지액 혹은 대두 또는 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에 염화 나트륨, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 마그네슘, 염화 제2철, 황산 제2철 혹은 황산 망간 등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고, 나아가 필요에 따라 당질 원료, 비타민 등을 적절히 첨가한 것이 이용된다.
또, 배지의 초기 pH는 pH 7~9로 조정하는 것이 적당하다.
또한, 배양은 임의의 조건을 이용할 수 있지만, 예를 들어 20~42℃의 배양 온도, 바람직하게는 30℃ 전후의 배양 온도로 4~24시간, 더욱 바람직하게는 30℃ 전후의 배양 온도로 8~16시간, 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 실시할 수 있다.
배양 종료 후 그 배양물로부터 아마도리아제를 채취하려면 통상의 효소 채취 수단을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 통상의 방법에 의해 균체를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나 리소자임 등의 용균 효소를 이용하여 본 효소를 추출하거나 톨루엔 등의 존재 하에서 진탕 혹은 방치하여 용균을 행하게 하여 본 효소를 균체 밖으로 배출시킬 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심분리하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염, 프로타민 황산염 혹은 황산 망간 등에 의해 핵산을 제거한 후, 이에 황안, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고 침전물을 채취하여 아마도리아제의 조효소를 얻는다.
상기 아마도리아제의 조효소로부터 추가로 아마도리아제 정제 효소 표품을 얻으려면, 예를 들어 세파덱스, 슈퍼덱스 혹은 울트로겔 등을 이용하는 겔 여과법; 이온 교환체를 이용하는 흡착 용출법; 폴리아크릴아미드겔 등을 이용하는 전기 영동법; 히드록시 아파타이트를 이용하는 흡착 용출법; 자당 밀도 기울기 원심법 등의 침강법; 어피니티 크로마토그래피법; 분자체막 혹은 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나 이들을 조합하여 실시함으로써 정제된 아마도리아제 효소 표품을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 원하는 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제를 얻을 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 아마도리아제는 Eupenicillium 속, Pyrenochaeta 속, Arthrinium 속, Curvularia 속, Neocosmospora 속, Cryptococcus 속, Phaeosphaeria 속, Aspergillus 속, Emericella 속, Ulocladium 속, Penicillium 속, Fusarium 속, Achaetomiella 속, Achaetomium 속, Thielavia 속, Chaetomium 속, Gelasinospora 속, Microascus 속, Leptosphaeria 속, Ophiobolus 속, Pleospora 속, Coniochaetidium 속, Pichia 속, Corynebacterium 속, Agrobacterium 속, Arthrobacter 속 등에 유래하는 천연 아마도리아제 또는 이들의 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열의 280위의 시스테인, 267위의 페닐알라닌, 269위의 페닐알라닌, 54위의 아스파라긴산, 241위의 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 위치의 아미노산에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가진다. 당업자라면 예를 들어 후술하는 시험법 등에 의해 어떤 아마도리아제 또는 그 변이체가 본 발명의 키트에 사용 가능한지, 즉 원하는 디히드로게나아제 활성을 가지는지 용이하게 조사할 수 있다.
(본 발명의 아마도리아제에서의 디히드로게나아제 활성의 향상)
본 발명의 아마도리아제는 유전자 개변 등에 의해 그 아미노산 서열에 변이를 발생시킨 결과 개변 전의 것과 비교하여 옥시다아제 활성이 저하되고 또한/또는 디히드로게나아제 활성이 향상되어 있다. 구체적으로는 개변 전의 것과 비교하여 「디히드로게나아제 활성」에 대한 「옥시다아제 활성」의 비율이 저감되어 있는 것을 특징으로 한다. 옥시다아제 활성이란 기질을 산화할 때 산소 분자에 전자를 주고받는 활성을 말한다. 디히드로게나아제 활성이란 기질을 산화할 때 하이드라이드(H-)를 전자 억셉터에 주고받는 활성을 말한다.
센서를 이용한 당화 헤모글로빈의 측정에 있어서 산소의 영향을 저감하려면 옥시다아제 활성이 낮은 것이 바람직하다. 한편, 기질과의 반응성의 관점에서는 디히드로게나아제 활성이 높은 것이 바람직하다. 이 양자를 고려하면 전자 매개자를 사용하는 당화 헤모글로빈 측정에서는 아마도리아제의 옥시다아제 활성(OX)과 디히드로게나아제 활성(DH)의 비 OX/DH가 낮은 것이 바람직하고, 또한 아마도리아제의 옥시다아제 활성(OX)이 낮고 디히드로게나아제 활성(DH)이 높은 것이 바람직하다. 그래서, 본 명세서에서는 편의상 아마도리아제의 특성을 옥시다아제 활성에 대한 디히드로게나아제 활성의 비율을 나타내는 DH/OX 또는 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율 OX/DH를 이용하여 표현하는 경우가 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 디히드로게나아제 활성이 증대되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 디히드로게나아제 활성과 옥시다아제 활성의 비 OX/DH가 낮다(DH/OX 비가 높다). 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 디히드로게나아제 활성이 증대되어 있을 뿐만 아니라 나아가 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 구체적으로 본 발명의 개변 아마도리아제에서의 옥시다아제 활성에 대한 디히드로게나아제 활성의 비율을 나타내는 DH/OX는 개변 전(1.0배)에 대해 1.3배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 예를 들어 450배 이상 증대되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 개변 아마도리아제에서의 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 나타내는 OX/DH는 개변 전(100%)과 비교하여 90% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 31% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4.5% 미만, 4% 미만, 3.6% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 예를 들어 0.2% 미만으로 저감되어 있는 것이 바람직하다.
디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율은 공지의 아마도리아제의 측정법을 이용하여 임의의 조건 하에서 측정하여 개변 전의 것과 비교할 수 있다. 예를 들어, pH 7.0에서 1mM의 어떤 당화 기질, 예를 들어 αFV를 첨가하여 측정한 옥시다아제 활성을 1mM의 상기 당화 기질, 예를 들어 αFV를 첨가하여 측정한 디히드로게나아제 활성으로 나눈 비율로서 구함으로써 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 산출하고, 이를 개변 전의 것과 개변 후의 것으로 비교할 수 있다. 기질은 HbA1c나 αF6P로도 된다.
(하이 스루풋 스크리닝)
아마도리아제는 기능성 아마도리아제 변이체, 예를 들어 새로운 HbA1c 디히드로게나아제를 취득하기 위해 하이 스루풋 스크리닝에 제공할 수 있다. 예를 들어 변이 도입한 아마도리아제 유전자를 갖는 형질 전환 또는 형질 도입주의 라이브러리를 제작하고, 이를 마이크로타이터 플레이트에 기초한 하이 스루풋 스크리닝에 제공해도 되고, 또는 액적형 마이크로 유체에 기초한 초하이 스루풋 스크리닝에 제공해도 된다. 예로서는 베리언트를 코드하는 변이 유전자의 콤비나트 리얼 라이브러리를 구축하고, 다음으로 파지 디스플레이(예를 들어 Chem. Rev. 105(11): 4056-72, 2005), 이스트 디스플레이(예를 들어 Comb Chem High Throughput Screen. 2008; 11(2): 127-34), 박테리알 디스플레이(예를 들어 Curr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007) 등을 이용하여 변이 아마도리아제의 큰 집단을 스크리닝하는 방법을 들 수 있다. 또한, Agresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107(9): 4004-4009(Mar, 2010)를 참조할 것. 아마도리아제 베리언트의 스크리닝에 사용할 수 있는 초하이 스루풋 스크리닝 수법에 대한 이 문헌의 기재를 참조에 의해 본 명세서에 도입한다. 예를 들어 에러 프론 PCR법에 의해 라이브러리를 구축할 수 있다. 또한, 포화 돌연변이 유발을 이용하여 본 명세서에 기재된 위치 또는 이에 대응하는 위치를 표적으로서 변이 도입하여 라이브러리를 구축해도 된다. 라이브러리를 이용하여 전기 컴피턴트 EBY-100 세포 등의 적당한 세포를 형질 전환하여 약 10의 7승의 변이체를 취득할 수 있다. 이 라이브러리에서 형질 전환한 효모 세포를 다음으로 셀 소팅에 제공할 수 있다. 표준 소프트 리소그래피법을 이용하여 제작한 폴리디메톡실실록산(PDMS) 마이크로 유체 디바이스를 이용해도 된다. 플로우 포커스 디바이스를 이용하여 단분산의 액적을 형성할 수 있다. 개별적인 변이체를 함유하여 형성된 액적을 적당한 소팅 디바이스에 제공할 수 있다. 세포를 선별할 때에는 디히드로게나아제 활성의 유무를 이용할 수 있다. 변이 도입과 선별은 복수회 반복해도 된다.
또, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제를 제작함에 있어서 변이를 도입하는 순서는 특별히 한정되지 않는다. 우선 출발 아마도리아제에 본 발명의 디히드로게나아제 활성 향상 변이를 도입하고, 다음으로 얻어진 디히드로게나아제 활성을 갖는 아마도리아제에 대해 기질 특이성을 개변하는 변이 등을 도입하고, 또한/또는 스크리닝을 적절히 행하여 이를 HbA1c에 작용하는 디히드로게나아제로 할 수도 있다.
(아마도리아제 활성의 측정 방법)
아마도리아제의 활성은 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성이 있고, 이들은 여러 가지 방법에 의해 측정할 수 있다. 이하에 아마도리아제 활성의 측정 방법을 예시한다.
효소의 특성을 평가하기 위해 기질로서 HbA1c, αF6P, 프럭토실발린(FV) 등의 당화 아미노산 및 프럭토실 발릴 히스티딘(FVH) 등의 당화 펩티드를 기질로 할 수도 있다. FV나 FVH는 사카우에 등의 방법에 기초하여 합성, 정제할 수 있다(일본공개특허 2001-95598호 참조). αF6P는 합성 기질을 사용할 수 있다.
(αF6P를 기질로 한 옥시다아제 활성의 측정 방법)
이하, αF6P를 기질로서 이용하는 옥시다아제 활성 측정을 기재한다. 어떤 실시형태에 있어서 효소역가는 αF6P를 기질로 하였을 때 1분간 1μmol의 과산화수소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의할 수 있다. 또, 이는 효소의 특성 평가나 측정 방법상 편의로서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제가 αF6P만을 기질로 하는 것을 의미하는 것은 아니다. 디히드로게나아제 활성 측정법에 대해서도 동일하다.
시약의 조제
(시약 1): 5U/ml　퍼옥시다아제, 0.49mM　4-아미노안티피린을 포함하는 0.1M　인산 완충액 pH 6.5
5kU의 퍼옥시다아제(기꼬만사 제품), 100mg의 4-아미노안티피린(와코 순약공업사 제품)을 0.1M의 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)에 용해하여 1000ml로 정용(定容)한다.
(시약 2): 15mM TOOS 용액
500mg의 TOOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘나트륨, 도진 화학 연구소 제품)를 이온 교환수에 용해하여 100ml로 정용한다.
(시약 3): 기질 용액(30mM; 종농도 1mM)
αF6P(펩티드 연구소 제품) 257.1mg을 이온 교환수에 용해하여 10ml로 정용한다.
측정법
675μl의 시약 1, 25μl의 시약 2 및 25μl의 효소액을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 25μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 555nm에서의 흡광도의 경시 변화를 관측하여 555nm에서의 흡광도의 1분당 변화량(ΔAs)을 측정한다. 또, 대조액은 25μl의 시약 3 대신에 25μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 하여 555nm에서의 흡광도의 1분당 변화량(ΔA0)을 측정한다. 옥시다아제 활성(U/ml)은 하기의 식에 따라 산출한다.
옥시다아제 활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(39.2×0.5×0.025)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
39.2: 반응에 의해 생성되는 퀴노이민 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
0.5: 1mol의 과산화수소에 의해 생성되는 퀴노이민 색소의 mol수
df: 희석 계수.
(αF6P를 기질로 한 디히드로게나아제 활성의 측정 방법)
이하, αF6P를 기질로서 이용하는 디히드로게나아제 활성 측정법을 기재한다. 어떤 실시형태에 있어서 효소역가는 αF6P를 기질로 하였을 때 1분간 1μmol의 포르마잔 색소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의할 수 있다.
시약의 조제
(시약 4): 0.25M 인산 완충액(pH 6.5)
(시약 5): 10mM WST-3 용액
690mg의 WST-3(2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt, 도진 화학 연구소 제품)을 이온 교환수에 용해하여 100mL로 정용한다.
(시약 6): 5.4mM mPMS 용액
180mg의 mPMS(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, 도진 화학 연구소 제품)를 이온 교환수에 용해하여 100ml로 정용한다.
측정법
270μl의 시약 4, 150μl의 시약 5, 25μl의 시약 6, 255μl의 이온 교환수 및 25μl의 효소액을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 25μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 433nm에서의 흡광도를 측정한다. 또, 대조액은 25μl의 효소액 대신에 25μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 조제한다. 디히드로게나아제 활성(U/ml)은 하기의 식에 따라 산출한다.
디히드로게나아제 활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(31×0.025)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
31: 반응에 의해 생성되는 WST-3의 포르마잔 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
df: 희석 계수.
(HbA1c를 기질로 한 디히드로게나아제 활성 측정 방법)
이하, HbA1c를 기질로서 이용하는 디히드로게나아제 활성 측정법을 기재한다. 어떤 실시형태에 있어서 효소역가는 HbA1c를 기질로 하였을 때 1분간 1μmol의 포르마잔 색소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의할 수 있다.
시약의 조제
(시약 7): 1.84mg/ml HbA1c 용액
(시약 8): 10% n-도데실-β-D-말토사이드
(시약 9): 185mM 인산 완충액 pH 6.0
(시약 5): 10mM WST-3 용액
측정법
우선, 540μl의 시약 7과 60μl의 시약 8을 혼합하고 98℃에서 5분간 가열하여 HbA1c 시료 전처리액을 조제한다. 이어서 305μl의 시약 9에 125μl의 시약 5, 62.5μl의 효소액 및 7.5μl의 이온 교환수를 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, HbA1c 시료 전처리액을 125μl 가하여 교반한 후, 분광 광도계에 의해 433nm에서의 흡광도를 측정한다. 대조 실험은 62.5μl의 효소액 대신에 62.5μl의 HbA1c에 작용하지 않는 아마도리아제를 첨가하여 실시한다. 디히드로게나아제 활성(U/ml)은 하기의 식에 따라 산출한다.
디히드로게나아제 활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×0.625×df}÷(31×0.0625)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
31: 반응에 의해 생성되는 WST-3의 포르마잔 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
df: 희석 계수.
(측정 시약 키트, 센서, 측정 방법)
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명은 HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 HbA1c 측정 키트 및 HbA1c 측정 장치를 제공한다. 이 키트 또는 장치는 경우에 따라 전자 매개자를 포함해도 된다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명은 HbA1c 디히드로게나아제를 이용하는 HbA1c의 측정 방법을 제공한다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명은 HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 고정된 효소 전극을 제공한다. 어떤 실시형태에 있어서, HbA1c 디히드로게나아제는 효소 전극에 도포, 흡착 또는 고정화되어 있어도 된다. 다른 실시형태에서는 전자 매개자도 전극에 도포, 흡착 또는 고정화되어도 된다. 전극으로서는 탄소 전극, 백금, 금, 은, 니켈, 팔라듐 등의 금속 전극 등을 이용할 수 있다. 탄소 전극의 경우 재료로서 열분해 그래파이트 카본(PG), 글라시 카본(GC), 카본 페이스트, 플라스틱 폼드 카본(PFC) 등을 들 수 있다. 측정 시스템은 2전극계이어도 되고 3전극계이어도 되며, 예를 들어 작용 전극 상에 효소를 고정할 수 있다. 참조 전극으로서는 표준 수소 전극, 가역 수소 전극, 은-염화 은 전극(Ag/AgCl), 팔라듐·수소 전극, 포화 칼로멜 전극 등을 들 수 있고, 안정성이나 재현성의 관점에서 Ag/AgCl을 이용하는 것이 바람직하다.
효소는 가교, 투석막에 의한 피복, 고분자 매트릭스에의 봉입, 광가교성 폴리머의 사용, 전기 전도성 폴리머의 사용, 산화/환원 폴리머의 사용 등에 의해 전극에 고정할 수 있다. 또한, 효소를 전자 매개자와 함께 폴리머 중에 고정 혹은 전극 상에 흡착 고정해도 되고, 이들 수법을 조합해도 된다.
본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 포텐쇼스탯이나 갈바노스탯 등을 이용함으로써 여러 가지 전기 화학적인 측정 수법에 적용할 수 있다. 전기 화학적 측정법으로서는 암페로메트리, 포텐쇼메트리, 쿨로메트리 등의 다양한 수법을 들 수 있다. 예를 들어 암페로메트리법에 의해, 환원된 매개자가 인가 전압에 의해 산화될 때에 발생하는 전류값을 측정함으로써 시료 중의 당화 기질의 농도를 산출할 수 있다. 인가 전압은 매개자나 장치의 설정에도 따르지만, 예를 들어 -1000 ~ +1000mV(v.s. Ag/AgCl) 등으로 할 수 있다.
HbA1c의 농도 측정은 예를 들어 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 항온 셀에 완충액을 넣고 일정 온도로 유지한다. 매개자로서는 페리시안화 칼륨, 페나진 메토설페이트 등을 이용할 수 있다. 작용 전극으로서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제를 고정화한 전극을 이용하고, 대극(對極)(예를 들어 백금 전극) 및 참조 전극(예를 들어 Ag/AgCl 전극)을 이용한다. 카본 전극에 일정한 전압을 인가하여 전류가 정상이 된 후, HbA1c를 포함하는 시료를 더하여 전류의 증가를 측정한다. 표준 농도의 HbA1c 용액에 의해 제작한 캘리브레이션 커브에 따라 시료 중의 HbA1c 농도를 계산할 수 있다.
나아가 측정에 필요한 용액량을 저감하기 위해 인쇄 전극을 이용할 수도 있다. 이 경우, 전극은 절연 기판 상에 형성되어 이루어지는 것이 바람직하다. 구체적으로 포토리소그래피 기술이나 스크린 인쇄, 그라비아 인쇄, 플렉소 인쇄 등의 인쇄 기술에 의해 전극이 기판 상에 형성되는 것이 바람직하다. 또한, 절연 기판의 소재로서는 실리콘, 유리, 세라믹, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 등을 들 수 있지만, 각종 용매나 약품에 대한 내성이 강한 것을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
어떤 실시형태에 있어서 본 발명은 상기 효소 전극을 포함하는 센서를 제공한다.
다른 실시형태에서는 본 발명의 효소 전극을 이용하여 시료 중의 아마도리 화합물의 농도를 효소 반응에 의해 발생하는 전류를 측정함으로써 결정할 수 있다. 일례로서 효소 전극을 작용 전극으로 하고, 이를 대극 및 참조 전극과 함께 사용한다. 대극은 예를 들어 백금 전극으로 할 수 있고, 참조 전극은 예를 들어 Ag/AgCl 전극으로 할 수 있다. 온도를 일정하게 유지하고, 전극을 매개자를 포함하는 완충액 중에 삽입한다. 작용 전극에 전압을 인가하여 시료를 첨가 후, 전류의 변화를 측정한다.
본 발명의 측정 방법, 키트, 장치 및 센서에 이용하는 매개자(인공 전자 매개자, 인공 전자 억셉터, 전자 매개자라고도 함)는 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제로부터 전자를 받을 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 매개자로서는 퀴논류, 페나진류, 비올로겐류, 시토크롬류, 페녹사진류, 페노티아진류, 페리시안화물, 예를 들어 페리시안화 칼륨, 페레독신류, 페로센, 오스뮴 착체 및 그 유도체 등을 들 수 있고, 페나진 화합물로서는 예를 들어 PMS, 메톡시 PMS를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본원 명세서에서는 특별히 언급하지 않는 한 전자 매개자라는 용어에는 산소, 과산화수소는 포함되지 않는 것으로 한다.
어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 개변 전 효소와 비교하여 디히드로게나아제 활성이 향상되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 개변 전 효소와 비교하여 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 개변 전 효소와 비교하여 옥시다아제 활성/디히드로게나아제 활성비(OX/DH비)가 저하되어 있다. 또한, 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 개변 전 효소와 비교하여 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 이러한 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제가 촉매하는 효소 반응은 산소의 영향을 받지 않거나 거의 받지 않거나 받기 어렵다. 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 종래의 아마도리아제와 같은 용도로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 시료 중의 HbA1c 등의 당화 기질 농도의 측정에 사용할 수 있고, 이는 예를 들어 당뇨병 진단에 도움이 될 수 있다. 또한, 본 발명의 아마도리아제는 효소 전극으로서 사용할 수 있다. 이는 여러 가지 전기 화학적 측정에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 효소 센서로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제는 당뇨병 마커의 측정 키트에 이용할 수 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명은 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 HbA1c 디히드로게나아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소가 아닌 환원형 전자 매개자 혹은 소비되는 산소가 아닌 산화형 전자 매개자를 측정하는 것을 포함하는, 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법을 제공한다. 측정계는 용액계이어도 되고 건조계이어도 된다. 또한, 측정은 효소, 효소 전극 혹은 효소 센서 효소 전극을 이용하는 전기 화학적 측정이어도 되고, 또는 발색 기질을 이용하는 흡광도 측정이어도 된다. 단, 이는 예시이며, 본 발명의 HbA1c 디히드로게나아제의 용도는 이에 한정되지 않는다.
(실시예)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(디히드로게나아제 활성 향상형 변이에 대해)
(1) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H38 DNA의 조제
서열 번호 14는 Coniochaeta sp. 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제를 프럭토실 헥사펩티드에 작용하도록 개변한 효소(CFP-T7-H37)의 아미노산 서열이다. CFP-T7-H37 유전자(서열 번호 15)를 포함하는 재조합체 플라스미드를 갖는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H37)주(국제공개 2015/060429호 참조)를 LB-amp 배지[1%(W/V) 박토트립톤, 0.5%(W/V) 펩톤, 0.5%(W/V) NaCl, 50μg/ml Ampicilin] 2.5ml에 접종하고 37℃에서 20시간 진탕 배양하여 배양물을 얻었다.
이 배양물을 7,000rpm으로 5분간 원심분리함으로써 집균하여 균체를 얻었다. 다음으로 이 균체로부터 QIAGEN tip-100(키아겐사 제품)을 이용하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H37을 추출하고 정제하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H37의 DNA 2.5μg을 얻었다.
(2) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H37 DNA의 부위 특이적 개변 조작
얻어진 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H37 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 27, 28의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 이하의 조건으로 PCR 반응을 행하였다.
즉, 10×KOD-Plus- 완충액을 5μl, dNTP가 각 2mM이 되도록 조제된 dNTPs 혼합 용액을 5μl, 25mM의 MgSO4 용액을 2μl, 주형이 되는 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 50ng, 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 각각 15pmol, KOD-Plus-를 1Unit 가하여 멸균수에 의해 전체량을 50μl로 하였다. 조제한 반응액을 서멀 사이클러(에펜도르프사 제품)를 이용하여 94℃에서 2분간 인큐베이트하고, 이어서 「94℃, 15초」-「50℃, 30초」-「68℃, 6분」의 사이클을 30회 반복하였다.
반응액의 일부를 1.0% 아가로스 겔로 전기 영동하여 약 6,000bp의 DNA가 특이적으로 증폭되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA를 제한 효소 DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS사 제품)로 처리하고, 잔존하고 있는 주형 DNA를 절단한 후, 대장균 JM109를 형질 전환하여 LB-amp 한천 배지에 전개하였다. 생육한 콜로니를 LB-amp 배지에 접종하여 진탕 배양하고, 상기 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 단리하였다. 이 플라스미드 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열을 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Thermo Fisher Scientific사 제품)를 이용하여 결정하고, 그 결과 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환된 개변형 아마도리아제(서열 번호 16)를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H38)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H38을 주형으로 하고, 서열 번호 29, 30의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 110위의 류신이 티로신으로 치환된 개변형 아마도리아제(서열 번호 17)를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H39)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H39를 주형으로 하고, 서열 번호 31, 32의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 110위의 류신이 티로신으로 치환되며 99위의 히스티딘이 세린으로 치환된 개변형 아마도리아제(서열 번호 18)를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H40)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H38을 주형으로 하고, 서열 번호 33, 34의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 269위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H38-dh1)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H38을 주형으로 하고, 서열 번호 35, 33의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 280위의 269위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H38-dh2)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H38을 주형으로 하고, 서열 번호 36, 37의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H38-dh3)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H40을 주형으로 하고, 서열 번호 33, 34의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 110위의 류신이 티로신으로 치환되며 99위의 히스티딘이 세린으로 치환되고 269위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H40-dh1)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H40을 주형으로 하고, 서열 번호 35, 33의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 110위의 류신이 티로신으로 치환되며 99위의 히스티딘이 세린으로 치환되고 269위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H40-dh2)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H40을 주형으로 하고, 서열 번호 36, 37의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 110위의 류신이 티로신으로 치환되며 99위의 히스티딘이 세린으로 치환되고 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H40-dh3)를 얻었다.
이어서 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-H40-dh3을 주형으로 하고, 서열 번호 33, 34의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 64위의 아르기닌이 글리신으로 치환되고 110위의 류신이 티로신으로 치환되며 99위의 히스티딘이 세린으로 치환되고 269위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환되며 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-H40-dh4)를 얻었다.
(3) 각종 개변형 아마도리아제의 생산
상기 순서에 의해 얻어진 상기 재조합체 플라스미드를 보유하는 각각의 대장균 JM109주를 0.1mM의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 4ml에서 25℃에서 16시간 배양하였다. 그 후, 각 균체를 pH 7.5의 10mM 인산 완충액으로 현탁하여 균체를 초음파 파쇄하고 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 각 조효소액 0.5ml를 조제하였다.
(4) 각종 개변형 아마도리아제의 옥시다아제 활성 및 디히드로게나아제 활성 평가
이와 같이 하여 조제한 각 조효소액을 샘플로 하고, αF6P를 기질로 하여 하기의 옥시다아제 활성 측정법 및 디히드로게나아제 활성 측정법에 따라 각종 개변형 아마도리아제의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 평가를 행하였다.
(αF6P를 기질로 한 옥시다아제 활성의 측정 방법)
시약의 조제
(시약 1): 5U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품), 0.49mM 4-아미노안티피린(와코 순약공업 제품)을 포함하는 0.1M 인산 완충액 pH 6.5
(시약 2): 15mM TOOS(도진 화학 연구소 제품) 용액
(시약 3): 30mM αF6P(펩티드 연구소 제품) 용액(종농도 1mM)
675μl의 시약 1, 25μl의 시약 2 및 25μl의 효소액을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 25μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 555nm에서의 흡광도의 경시 변화를 관측하여 555nm에서의 흡광도의 1분간당의 변화량(ΔAs)을 측정한다. 또, 대조액은 25μl의 시약 3 대신에 25μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 하여 555nm에서의 흡광도의 1분당 변화량(ΔA0)을 측정한다. 종농도 1mM의 αF6P를 기질로 하였을 때 1분간 1μmol의 과산화수소를 생성하는 효소량(효소 활성)을 1U라고 정의한다. 옥시다아제 활성(U/ml)은 하기의 식에 따라 산출한다.
옥시다아제 활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(39.2×0.5×0.025)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
39.2: 반응에 의해 생성되는 퀴노이민 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
0.5: 1mol의 과산화수소에 의해 생성되는 퀴노이민 색소의 mol수
df: 희석 계수.
(αF6P를 기질로 한 디히드로게나아제 활성의 측정 방법)
시약의 조제
(시약 3): 30mM αF6P(펩티드 연구소 제품) 용액(종농도 1mM)
(시약 4): 0.25M 인산 완충액(pH 6.5)
(시약 5): 10mM WST-3(도진 화학 연구소 제품) 용액
(시약 6): 5.4mM mPMS(도진 화학 연구소 제품) 용액
270μl의 시약 4, 150μl의 시약 5, 25μl의 시약 6, 255μl의 이온 교환수 및 25μl의 효소액을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 25μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 433nm에서의 흡광도를 측정한다. 또, 대조액은 25μl의 효소액 대신에 25μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 조제한다. 종농도 1mM의 αF6P를 기질로 하였을 때 1분간 1μmol의 포르마잔 색소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다. 디히드로게나아제 활성(U/ml)은 하기의 식에 따라 산출한다.
디히드로게나아제 활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(31×0.025)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
31: 반응에 의해 생성되는 WST-3의 포르마잔 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
df: 희석 계수.
결과를 표 8, 표 9에 나타낸다. 표 8에서 CFP-H38은 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-H38)주 유래의 아마도리아제를 나타낸다. 표 9에서 CFP-H40은 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-H40)주 유래의 아마도리아제를 나타낸다. 또, 본 실시예에서는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H37)주 유래의 아마도리아제인 CFP-T7-H37을 변이 원효소로 하였기 때문에, 표 중에 기재된 「아미노산 변이」의 기재에는 CFP-T7-H37에 이미 도입 완료된 각종 변이점은 포함하지 않았다. 표 중, 옥시다아제 활성(%)과 디히드로게나아제 활성(%)은 원효소 CFP-T7-H38 또는 CFP-T7-H40의 옥시다아제 활성(U/mL)을 100으로 한 경우의 퍼센티지로 나타낸다. 또한, 표 중의 OX/DH(%)는 원효소 CFP-T7-H38 또는 CFP-T7-H40의 OX/DH비를 100으로 한 경우의 퍼센티지를 나타낸다.
Figure pct00008
Figure pct00009
표 8에 나타내는 바와 같이 CFP-H38을 기준으로 하여 F269M, F269L, C280Q의 각 변이에 의해 각각의 개변 효소의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 저감되었다.
표 9에 나타내는 바와 같이 CFP-H40을 기준으로 하여 F269M, F269L, C280Q의 각 변이에 의해 각각의 개변 효소의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 저감되었다. 또한, CFP-H40으로부터 제작한 F269M/C280Q 이중 변이체에 대해 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 더욱 저감되었다.
[실시예 2]
(CFP-H38-dh3의 생산 및 정제)
대장균 JM109(CFP-H38-dh3)주를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 200ml에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고 20,000×g으로 10분간 원심분리하여 조효소액 40ml를 조제하였다.
Q-sepharose FF(GE 헬스케어사 제품)를 충전한 칼럼을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 후, 조제한 CFP-H38-dh3을 포함한 각 조효소액을 어플라이하여 아마도리아제를 음이온 교환 수지에 결합시켰다. 그 후, 30mM의 NaCl 농도를 포함한 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 20칼럼 부피분 송액하여 협잡 단백질을 용출시킨 후, 80mM의 NaCl을 포함한 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 수지에 결합된 단백질을 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 분획을 회수하였다.
얻어진 각각의 아마도리아제 활성을 나타내는 분획을 Amicon Ultra Ultracel-30K(밀리포어사 제품)에 의해 농축하고, HiLoad 26/60 Superdex 200에 의해 정제하였다. 수지의 평형화, 용출에는 150mM의 NaCl를 포함한 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)을 이용하였다. 용출한 각 프랙션의 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하고, 협잡 단백질을 포함하지 않은 프랙션을 회수하여 CFP-H38-dh3의 정제 표품으로 하였다.
[실시예 3]
(CFP-H38-dh3의, HbA1c에 대한 디히드로게나아제 활성의 평가)
분광 광도계 U-3010(히타치 하이테크놀로지즈 제품)을 이용하여 하기와 같이 CFP-H38-dh3의 HbA1c에 대한 디히드로게나아제 활성의 평가를 실시하였다.
(시약 7): 1.84mg/ml HbA1c 용액(BBI solution 제품)
(시약 8): 10% n-도데실-β-D-말토사이드(도진 화학 연구소 제품)
(시약 9): 185mM 인산 완충액 pH 6.0
(시약 5): 10mM WST-3 용액
(시약 10): 8.8mg/ml(4.1U/ml) CFP-H38-dh3 용액
(U는 1mM의 αF6P를 기질로 하였을 때 디히드로게나아제 활성을 나타냄)
(시약 11): 8.8mg/ml CFP-T7 용액
우선, 540μl의 시약 7과 60μl의 시약 8을 혼합하고 98℃에서 5분간 가열하여 HbA1c 시료 전처리액을 조제하였다. 이어서 305μl의 시약 9에 125μl의 시약 5, 62.5μl의 시약 10 및 7.5μl의 이온 교환수를 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, HbA1c 시료 전처리액을 125μl 가하여 교반한 후, 분광 광도계에 의해 433nm에서의 흡광도를 측정한다. 대조 실험은 62.5μl의 시약 10 대신에 62.5μl의 시약 11을 첨가하여 실시하였다. CFP-T7은 αF6P 및 HbA1c에 대해 반응성을 나타내지 않는 아마도리아제이다(국제공개 제2015/060429호 참조).
결과를 도 4에 나타낸다. 본 발명의 A1cDH를 이용한 바, 대조와 비교하여 의미 있는 흡광도 상승이 확인되었다. 즉, CFP-H38-dh3은 HbA1c에 대해 디히드로게나아제 활성을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 4]
(인쇄 전극에 의한 HbA1c의 정량)
우선, 실시예 3에서 조제한 HbA1c 시료 전처리액을 이용하여 20mM 인산 완충액(pH 6.5), 1M KCl, 0.65% n-도데실-β-D-말토사이드를 포함한 HbA1c 용액을 조제하였다. HbA1c 농도는 83, 166, 249, 332μg/ml의 4레벨로 하였다. 스크린 인쇄 카본 전극(DRP-110, DropSens 제품) 상에 조제 완료된 HbA1c 용액 10μl 및 500mM의 RuCl3(도쿄 화성공업 제품)을 4μl 첨가하여 혼합하였다. 스크린 인쇄 카본 전극을 연결 케이블(CAC, DropSens 제품)을 통해 ALS 전기 화학 애널라이저 814D(BAS 제품)에 접속한 후, 38.4mg/ml(17.8U/ml)의 CFP-H38-dh3 용액 6μl를 전극 상에 첨가하고 +200mV(vs. Ag/AgCl)의 전압을 인가하여 반응시켜 60초 후의 전류값을 측정하였다. 각 HbA1c 농도에서의 전류 응답값을 플롯한 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5에 도시된 바와 같이 CFP-H38-dh3을 이용하여 정밀도 높게 HbA1c를 정량할 수 있었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제(CFP-T7)
서열 번호 2 CFP-T7 유전자 서열
서열 번호 3 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제
서열 번호 4 Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 5 Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 6 Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 7 Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 8 Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 9 Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제
서열 번호 10 Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 11 Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제
서열 번호 12 Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 13 Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 14 CFP-T7-R62D/L63H/E102K/D106K/Q110L/A113K/A355S/D68N/A356T(CFP-T7-H37)의 아미노산 서열
서열 번호 15 CFP-T7-H37 염기 서열
서열 번호 16 CFP-T7-H38 아미노산 서열(CFP-T7-H37-R64G)
서열 번호 17 CFP-T7-H39 아미노산 서열(CFP-T7-H37-R64G/L110Y)
서열 번호 18 CFP-T7-H40 아미노산 서열(CFP-T7-H37-R64G/L110Y/H99S)
서열 번호 19 Ao2(Aspergillus oryzae 유래, 별칭 FaoAo2)
서열 번호 20 Af2(Aspergillus fumigatus 유래, 별칭 AmadoriaseII)
서열 번호 21 At(Aspergillus terreus 유래, 별칭 FAOD-A)
서열 번호 22 Fo(Fusarium oxysporum 유래)
서열 번호 23 Ao1(Aspergillus oryzae 유래, 별칭 FaoAo 1)
서열 번호 24 Af1(Aspergillus fumigatus 유래, 별칭 AmadoriaseI)
서열 번호 25 Pi(Pichia sp. 유래)
서열 번호 26 Dh(Debaryomyces hansenii 유래)
서열 번호 27 프라이머 서열(R64G 도입용)
서열 번호 28 프라이머 서열(R64G 도입용)
서열 번호 29 프라이머 서열(L110Y 도입용)
서열 번호 30 프라이머 서열(L110Y 도입용)
서열 번호 31 프라이머 서열(H99S 도입용)
서열 번호 32 프라이머 서열(H99S 도입용)
서열 번호 33 프라이머 서열(F269M 도입용)
서열 번호 34 프라이머 서열(F269M 도입용)
서열 번호 35 프라이머 서열(F269L 도입용)
서열 번호 36 프라이머 서열(C280Q 도입용)
서열 번호 37 프라이머 서열(C280Q 도입용)
SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> HbA1c Dehydrogenase <130> PH-6938-PCT <150> JP 2016-086592 <151> 2016-04-22 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 1 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Gln Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Gly 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Gln Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys Tyr Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Pro Lys Leu 435 <210> 2 <211> 1314 <212> DNA <213> Coniochaeta sp. <400> 2 atgacgtcga atcgtgcaga tacaagggtg attgtcgtcg gtggcggagg aacgattggt 60 tcctcgacag cgctgcatct tgtgaggagt ggttatgctc ccgcaaatat cacggtcttg 120 gacacatttg agattccatc ggctcaatca gccggccatg atctcaacaa gatcatggga 180 atacgactgc gcaacaaggt ggacctgcaa atgagtctag aggctagaca gatgtggaag 240 gaggatgagt tattccagcc cttctttcac aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgaggacct gaaaaagcag taccaggcac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 3 <211> 437 <212> PRT <213> Eupenicillium terrenum <400> 3 Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln 65 70 75 80 Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu 115 120 125 Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu 130 135 140 Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Gln Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Ala Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ile Gly Leu Glu Thr Thr Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Phe Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Lys Glu Ala Asp Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asp Gly Glu Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu Tyr Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Leu His Gln Pro Tyr Gly Ala Ala Ser Pro Lys Met Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Arg Lys Ala Ile Ala Arg Phe Leu Pro Glu Phe 325 330 335 Lys Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Thr Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Ser Leu Ser Gln Glu 385 390 395 400 Met Ala Gly Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Arg Ser 405 410 415 Arg Arg Gly Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Glu Met Pro Gly 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190 Leu Ala Glu Gly Ile Cys Ile Gly Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Arg 195 200 205 Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Ala 210 215 220 Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val Tyr Ala 225 230 235 240 His Met Gln Leu Thr Pro Lys Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asp Thr Pro 245 250 255 Val Val Tyr Asn Gly Asp Leu Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn Glu His 260 265 270 Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys 275 280 285 Lys His Gln Pro Phe Gly Ala Arg Ala Pro Lys Arg Ile Ser Val Pro 290 295 300 Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala Ser Glu 305 310 315 320 Ala Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Ala Phe Leu Pro Gln Phe Lys Asp 325 330 335 Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr Ala Asp 340 345 350 Ala Ala Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Gln Trp Lys Asn Phe Met Leu 355 360 365 Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gly 370 375 380 Lys His Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Leu Ala 385 390 395 400 His Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ile Gly Asp Ala Leu Gln Ser Arg 405 410 415 Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Asn His 420 425 430 Asp Glu Ser Pro Arg Ala Lys Leu 435 440 <210> 5 <211> 452 <212> PRT <213> Arthrinium sp. <400> 5 Met Ala Ala Ser Arg Lys Thr Thr Lys Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Ala Thr Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Pro Val Asp Lys Gln Leu Ser Leu Glu Ala Gln Asp Met Trp Cys 65 70 75 80 His Asp Glu Leu Phe Lys Pro Tyr Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu Gly Thr Glu Lys Gly Ile Ala Ala Leu Lys Gln Gln Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Asp Val Gly Leu Glu Lys Thr Thr Glu Trp Leu 115 120 125 Asp Ser Glu Asp Ala Ile Leu Ala Lys Met Pro Leu Leu Glu Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Lys Gly Trp Lys Ala Ile Phe Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Glu Glu Leu Lys Arg Gln 165 170 175 Gly Val Asn Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ala Phe Lys Lys Pro Leu 180 185 190 Phe Ala Pro Asp Gly Ser Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Gly Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Ala Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Met Gln Leu Thr Pro His Glu Ala Ala Glu Tyr Gln Gly 245 250 255 Cys Pro Val Val Tyr His Gly Asp Leu Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu His Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg 275 280 285 Phe Leu Glu Gln His Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Ala Pro Thr Arg Val 290 295 300 Ser Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp 305 310 315 320 Ala Ser Glu Gln Ser Ile Arg Arg Ala Val Ala Ala Phe Leu Pro Arg 325 330 335 Phe Gln Ser Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp 340 345 350 Thr Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Arg Trp Arg Asn 355 360 365 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Pro Asp Pro Lys His Gly Gly Glu Val Arg Ser 290 295 300 Ile Pro Phe Ala Lys His Gln Ile Pro Leu Glu Ala Glu Ala Arg Ala 305 310 315 320 Arg Asp Phe Leu Arg Asp Thr Met Pro His Leu Ala Asp Arg Pro Leu 325 330 335 Ser Phe Ala Arg Ile Cys Trp Asp Ala Asp Thr Val Asp Arg Ala Phe 340 345 350 Leu Ile Asp Arg His Pro Glu Tyr Arg Ser Leu Leu Leu Ala Val Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Asn Gly Ala Met Gln Met Pro Thr Ile Gly Gly Phe Ile 370 375 380 Ala Asp Ala Leu Glu Gly Asn Leu Gln Lys Glu Leu Lys His Ala Leu 385 390 395 400 Arg Trp Arg Pro Glu Ile Ala Ala Gln Arg Asp Trp Lys Asp Thr Gln 405 410 415 Asn Arg Phe Gly Gly Pro Asn Lys Val Met Asp Phe Gln Lys Val Gly 420 425 430 Glu Asn Glu Trp Thr Lys Ile Gly Asp Lys Ser Arg Leu 435 440 445 <210> 24 <211> 445 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus <400> 24 Met Ala Pro Ser Ile Leu Ser Thr Glu Ser Ser Ile Ile Val Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly 20 25 30 Tyr Lys Asp Val Thr Val Leu Asp Pro His Pro Val Pro Ser Pro Ile 35 40 45 Ala Ala Gly Asn Asp Ile Asn Lys Ile Met Glu His Ser Glu Leu Lys 50 55 60 Asp Gly Ser Ser Asp Pro Arg Ser Ala Ala Phe Ser Thr Phe Thr Arg 65 70 75 80 Ala Ala Leu Lys Ala Trp Lys Thr Asp Pro Val Phe Gln Pro Tyr Phe 85 90 95 His Glu Thr Gly Phe Ile Ile Ser Gly His Thr Pro Ala Leu Ile Asp 100 105 110 His Ile Arg Lys Asp Glu Val Glu Pro Ser Glu Thr Asn Phe Val Lys 115 120 125 Leu Glu Thr Ala Glu Asp Phe Arg Arg Thr Met Pro Pro Gly Val Leu 130 135 140 Thr Gly Asp Phe Pro Gly Trp Lys Gly Trp Leu His Lys Ser Gly Ala 145 150 155 160 Gly Trp Ile His Ala Lys Lys Ala Met Ile Ser Ala Phe Asn Glu Ala 165 170 175 Lys Arg Leu Gly Val Arg Phe Val Thr Gly Ser Pro Glu Gly Asn Val 180 185 190 Val Ser Leu Val Tyr Glu Asp Gly Asp Val Val Gly Ala Arg Thr Ala 195 200 205 Asp Gly Arg Val His Lys Ala His Arg Thr Ile Leu Ser Ala Gly Ala 210 215 220 Gly Ser Asp Ser Leu Leu Asp Phe Lys Lys Gln Leu Arg Pro Thr Ala 225 230 235 240 Trp Thr Leu Cys His Ile Gln Met Gly Pro Glu Glu Val Lys Gln Tyr 245 250 255 Arg Asn Leu Pro Val Leu Phe Asn Ile Ala Lys Gly Phe Phe Met Glu 260 265 270 Pro Asp Glu Asp Lys His Glu Leu Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly 275 280 285 Tyr Cys Asn Phe Leu Pro Asp Pro Asn Arg Pro Gly Gln Glu Lys Ser 290 295 300 Val Pro Phe Ala Lys His Gln Ile Pro Leu Glu Ala Glu Ala Arg Ala 305 310 315 320 Arg Asp Phe Leu His Asp Thr Met Pro His Leu Ala Asp Arg Pro Leu 325 330 335 Ser Phe Ala Arg Ile Cys Trp Asp Ala Asp Thr Pro Asp Arg Ala Phe 340 345 350 Leu Ile Asp Arg His Pro Glu His Pro Ser Leu Leu Val Ala Val Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Asn Gly Ala Met Gln Met Pro Thr Ile Gly Gly Phe Ile 370 375 380 Ala Asp Ala Leu Glu Ser Lys Leu Gln Lys Glu Val Lys Asp Ile Val 385 390 395 400 Arg Trp Arg Pro Glu Thr Ala Val Asp Arg Asp Trp Arg Ala Thr Gln 405 410 415 Asn Arg Phe Gly Gly Pro Asp Arg Ile Met Asp Phe Gln Gln Val Gly 420 425 430 Glu Asp Gln Trp Thr Lys Ile Gly Glu Ser Arg Gly Pro 435 440 445 <210> 25 <211> 427 <212> PRT <213> Pichia sp. <400> 25 Met Glu Ser Ile Ile Ile Val Gly Ala Gly Thr Phe Gly Leu Ser Thr 1 5 10 15 Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Tyr Lys Asn Ile Lys Cys Phe Asp 20 25 30 Lys Phe Pro Val Pro Ser Glu Ile Ala Ala Gly Asn Asp Ser Asn Lys 35 40 45 Ile Phe His Tyr Asp Tyr Val Ala Pro Leu Ala Lys Pro Asn Ser Lys 50 55 60 Glu Arg Leu Ser Leu Glu Ala Leu His Leu Trp Lys Thr Asp Pro Val 65 70 75 80 Tyr Lys Pro Tyr Tyr His Pro Val Gly Phe Ile Leu Ala Ala Ser Ser 85 90 95 Asp Ala Pro Leu Leu His Asp Lys Glu Tyr Tyr Glu Glu Leu Gln Lys 100 105 110 Asn Gly Leu Arg Asn Tyr Arg Tyr Ile Ser Thr Pro Glu Glu Phe Arg 115 120 125 Glu Tyr Leu Pro Ile Leu Lys Gly Pro Leu Pro Asn Trp Arg Gly Tyr 130 135 140 Val Leu Asp Gly Asp Asn Gly Trp Leu His Ala Arg Asp Ser Leu Lys 145 150 155 160 Ser Ala Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Leu Gly Val Glu Phe Val Phe Gly 165 170 175 Asp Asp Gly Glu Ile Val Glu Leu Leu Asn Glu Asn Gly Lys Leu Thr 180 185 190 Gly Ile Arg Ala Arg Ser Gly Ala Ile Phe Ser Ala Gln Lys Tyr Val 195 200 205 Leu Ser Ser Gly Ala Asn Ala Val Thr Leu Leu Asn Phe Gln Arg Gln 210 215 220 Leu Glu Gly Lys Cys Phe Thr Leu Ala His Phe Lys Val Thr Asp Glu 225 230 235 240 Glu Ala Lys Ala Phe Lys Ser Leu Pro Val Leu Phe Asn Ala Glu Lys 245 250 255 Gly Phe Phe Phe Glu Ala Asp Glu Asn Asn Glu Ile Lys Ile Cys Asn 260 265 270 Glu Tyr Pro Gly Phe Thr His Thr Asn Glu Ser Gly Glu Ser Ile Pro 275 280 285 Leu Tyr Arg Met Glu Ile Pro Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ile Arg Gln 290 295 300 Tyr Leu Lys Glu Thr Met Pro Gln Phe Ala Asp Arg Pro Phe Thr Lys 305 310 315 320 Thr Arg Ile Cys Trp Cys Thr Asp Ser Pro Asp Met Gln Leu Ile Leu 325 330 335 Cys Thr His Pro Glu Tyr Thr Asn Leu Ile Val Ala Ser Gly Asp Ser 340 345 350 Gly Asn Ser Phe Lys Ile Met Pro Ile Ile Gly Lys Tyr Val Ser Lys 355 360 365 Val Val Thr Lys Gly Asp Lys Gly Leu Asp Pro Glu Asp Lys Glu Cys 370 375 380 Trp Lys Trp Arg Pro Glu Thr Trp Asp Lys Arg Gly Gln Val Arg Trp 385 390 395 400 Gly Gly Arg Tyr Arg Val Ala Asp Leu Asn Glu Ile Glu Glu Trp Val 405 410 415 Ser Val Glu Asn Pro Thr Pro His Lys Leu Glu 420 425 <210> 26 <211> 426 <212> PRT <213> Debaryomyces hansenii <400> 26 Met Asp Lys Pro Gly Lys Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly Thr Phe Gly 1 5 10 15 Leu Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Gln Gly Glu Lys Asp Val Ile 20 25 30 Leu Val Asp Pro Tyr Ala Val Pro Ser Pro Phe Ser Ala Gly Asn Asp 35 40 45 Val Asn Lys Ile Ile Gln Thr Thr Ser Asp Asp Asp Phe Tyr Ser Lys 50 55 60 Leu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Met Trp Arg Glu Asp Asn Val Phe Asn 65 70 75 80 Lys Ala Phe Ala Glu Thr Gly Ile Ile Tyr Ala Ala Thr Gly Lys Glu 85 90 95 Gln Arg Glu Ser Ile Asp Tyr Arg Tyr Glu Tyr Leu Leu Gly Arg Lys 100 105 110 Asp Lys Val Val Lys Leu Asn Ser Val Glu Asp Tyr Glu Lys Tyr Val 115 120 125 Pro Asn Lys Glu Gly Ser Lys Ser Tyr Pro Asn Lys Phe Gln Lys Trp 130 135 140 Tyr Gly Tyr Tyr Gln Glu Lys Asn Cys Gly Trp Ala Phe Ala Arg Leu 145 150 155 160 Ala Leu Glu Asn Cys Val Glu Glu Cys Arg Lys Leu Gly Ala Lys Phe 165 170 175 Val Ile Asp Ser Ala Glu Glu Leu Leu Phe Ser Glu Asp Gly Ala Cys 180 185 190 Val Gly Val His Thr Ser Asn Gly Asn Ile Ile Glu Ala Asp Arg Thr 195 200 205 Ile Ile Cys Ala Gly Ala Asn Ser Phe Lys Phe Leu Asn Phe Glu Gln 210 215 220 Gln Leu Leu Ala Lys Cys Tyr Thr Leu Gly His Ile Lys Leu Thr Asp 225 230 235 240 Asp Glu Ala Ala Leu Leu Lys Gly Met Pro Val Val Leu Asn Leu Asp 245 250 255 Gly Gly Phe Val Phe Glu Pro Asp Leu Asn Asn Glu Ile Lys Phe Cys 260 265 270 Asn Glu Phe Pro Gly Tyr Val Asn Ile Val Asn Glu Asp Ser Val Pro 275 280 285 Ser Phe Lys Asp Ser Ile Pro Lys Glu Ala Glu Asp Gln Met Arg Ala 290 295 300 Phe Leu Arg Gln Val Phe Pro Glu Phe Ala Glu Arg Glu Phe Ser Leu 305 310 315 320 Ala Arg Ile Cys Trp Cys Thr Asp Thr Pro Asp Arg His Phe Leu Ile 325 330 335 Cys Glu His Pro Gly His Lys Asn Leu Val Leu Gly Thr Gly Asp Ser 340 345 350 Gly Gln Gly Phe Lys Tyr Met Pro Asn Val Gly Lys Tyr Ile Ser Gln 355 360 365 Val Ala Leu Lys Gly Glu Asn Ser Leu Asp Lys Asp Lys Lys Glu Leu 370 375 380 Trp Arg Trp Arg Pro Asp Met Gly Lys Lys Arg Asp Leu Lys Asp Leu 385 390 395 400 Gln Gly Arg Tyr Gly Gly Ser Asn Glu Val Lys Asp Leu Lys Asn Val 405 410 415 Lys Gln Trp Ser Asn Gly Lys Ser His Leu 420 425 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 atgatctatt cccatgatct tgttgag 27 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 tgggaataga tcatggcaac aaggtgaacc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 ctttttcagt ttctcgatac ccttaggcgt 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 agaaactgaa aaagtattac cagaaactgc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 ttcgcagtcc attctgccgg tattgtgaaa 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 atggactgcg aaagcacgcc taagggtatc 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 gaagaagcca aattcgccat tatacacaac 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 gaatttggct tcttcatgga acctgatgag 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 gaatttggct tcttcctcga acctgatgag 30 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 cacctttatt acaccaaact catcagg 27 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 gtgtaataaa ggtgcaggac gaattcccag 30

Claims (18)

  1. 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 HbA1c 디히드로게나아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소가 아닌 환원형 전자 매개자 혹은 소비되는 산소가 아닌 산화형 전자 매개자를 측정하는 것을 포함하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    측정이 HbA1c 디히드로게나아제, HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 효소 전극 또는 이 효소 전극을 작용 전극으로서 갖는 효소 센서 및 산소가 아닌 전자 매개자를 이용하는 전기 화학적 측정이거나 혹은 HbA1c 디히드로게나아제, 발색 기질 및 산소가 아닌 전자 매개자를 이용하는 흡광도 측정인 측정 방법.
  3. 개변 전 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제와 비교하여 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 저감된 HbA1c에 직접 작용하는 디히드로게나아제로서,
    (i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위, 269위, 54위, 241위 및 267위로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 하나 이상의 아미노산이 치환되어 있고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제,
    (ii) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위, 269위, 54위, 241위 및 267위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제,
    (iii) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 상기 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지고, 서열 번호 1의 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열 번호 1의 상동성 영역은 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 것이고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제,
    (iv) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 상기 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 3-14 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가지고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제, 혹은
    (v) 상기 (i)의 HbA1c 디히드로게나아제에 있어서, 서열 번호 1의 보존 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제가 유래하는 천연 아마도리아제의 대응하는 보존 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 서열 번호 1의 보존 영역은 서열 번호 1의 제11, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 31, 36, 37, 41, 46, 47, 50, 51, 52, 54, 56, 57, 58, 75, 79, 82, 84, 85, 93, 95, 149, 158, 159, 162, 165, 166, 177, 180, 202, 208, 218, 220, 221, 222, 224, 228, 233, 239, 243, 246, 250, 255, 258, 260, 266, 267, 270, 272, 277, 278, 280, 281, 282, 284, 285, 286, 318, 321, 326, 329, 334, 339, 346, 347, 348, 351, 352, 354, 358, 359, 362, 363, 370, 373, 376, 382, 385, 386, 389, 406, 407, 409, 418, 425 및 427위로 이루어지는 것이고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제.
  4. 청구항 3에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 아미노산, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하전 아미노산, 또는 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신, 트립토판, 발린 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 히스티딘, 글리신 또는 발린으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 리신, 글루타민산, 아스파라긴, 아르기닌, 아스파라긴산 또는 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신, 트립토판, 발린 또는 알라닌으로 치환되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  5. 청구항 4에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  6. 청구항 5에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  7. 청구항 5에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 세린으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  8. 청구항 5에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 히스티딘으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  9. 청구항 5에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  10. 청구항 3 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    옥시다아제 활성이 개변 전 아마도리아제(100%)와 비교하여 60% 미만으로 저감되어 있거나 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비(OX/DH)가 개변 전 아마도리아제(100%)와 비교하여 40% 미만으로 저감되어 있는 HbA1c 디히드로게나아제.
  11. 청구항 3 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 또는 아스로박터(Arthrobacter) 속 유래인 HbA1c 디히드로게나아제.
  12. 청구항 3 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 1, 서열 번호 3-14 또는 16-26 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 서열을 가지며, 청구항 3 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 규정한 아미노산 치환을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제.
  13. 청구항 3 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    추가적으로 HbA1c 디히드로게나아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에 아미노산 치환 또는 결실을 하나 이상 가지고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제:
    (A) 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위, 356위, 64위 및/또는 99위로의 치환,
    (B) 262위, 257위, 249위, 253위, 337위, 340위, 232위, 129위, 132위, 133위, 44위, 256위, 231위 및/또는 81위로의 치환,
    (C) 카르복실 말단의 435위, 436위 및 437위의 3아미노산 잔기의 결실.
  14. 청구항 13에 있어서,
    추가적으로 HbA1c 디히드로게나아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 아미노산의 하나 이상이 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나 결실되어 있고 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하며 디히드로게나아제 활성을 갖는 HbA1c 디히드로게나아제:
    (A) 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환,
    63위의 류신에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘 또는 알라닌으로 치환,
    102위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
    106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환,
    110위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 류신 또는 티로신으로 치환,
    113위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환,
    355위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환,
    419위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
    68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 아스파라긴으로 치환,
    356위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 트레오닌으로 치환,
    64위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산을 글리신, 세린, 메티오닌, 류신, 트레오닌, 발린 또는 이소류신으로 치환,
    99위의 히스티딘에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환,
    (B) 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘으로 치환,
    257위의 발린에 대응하는 위치의 아미노산을 시스테인, 세린, 트레오닌으로 치환,
    249위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    253위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    337위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    340위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
    232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    133위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로 치환,
    44위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
    256위의 글리신에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    231위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    81위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    (C) 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신에 대응하는 위치의 카르복실 말단 3아미노산의 결실.
  15. 청구항 3 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 HbA1c 측정 시약 키트.
  16. 청구항 3 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제를 포함하는 효소 전극.
  17. 청구항 16에 기재된 효소 전극을 작용 전극으로서 갖는 효소 센서.
  18. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    HbA1c 디히드로게나아제가 청구항 3 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 HbA1c 디히드로게나아제인 측정 방법.
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