JPS61280297A - アマドリ化合物の定量法及びその定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼによる新
規なアマドリ化合物の定量法及びそれに用いられる定量
用試薬に関する。

食品や生体内では還元性の糖、特にアルドースと呼ばれ
るアルデヒド基を有する糖と蛋白質、ペプチド、アミノ
酸等のようにアミノ基を有する物質が共存する場合、両
者が不可逆的に結合してケトアミン化合物が生成して（
る。この化合物はアルデヒド基とアミノ基の結合物がア
マドリ転移を起こした結果生成されることからアマドリ
化合物と呼ばれている。例えばグルコースとアラニンか
らは次式Ａのフルクトシルアラニンが生成する。またグ
リセルアルデヒドとグリシンからは次式Ｂのハイドロキ
シアセトニルグリシンが生成する。

Ｌｌｋｉ　　　（Ｊ このよ５にアルドースとα−アミノ酸が結合してブマド
リ転移を起こした化合物は、七の分子内に共通にイミノ
２酢酸の基本骨格を含有しており、一般的に構造は次式
で表わされる。

式中Ｘは基−［ＣＨ（ＯＨ）　）、−ＣＨ２０Ｈ％ｎは
ａ〜４の整数、Ｙはα−アミノ酸の側鎖残基を示す。

一方アマドリ化合物はアルデヒド基を有する物質とアミ
ノ基を有する物質が接触した瞬間から化学的にかつ不可
逆的に生成蓄積されてくる。

その生成速度は原料物質の濃度、接触時間、温度などの
関数で表わされる。それ故、その蓄積量を測定すること
によって、過去の糖及びアミノ化合物の濃度、接触時間
、保持温度などを推定することができるが、その定量は
比較的困難であり、処理中の分解に起因する精度の低下
を免れなかった。

従来の定量法としては例えば下記の方法が知られている
。アミノ酸分析」を用いる方法（ジャーナル・アグリカ
ルチュアル・フード・ケミストリー、２４巻１号（１９
７６）７０頁参照）、アマドリ化合物を水素化ホウ素ナ
トリウムで還元したのち塩酸分解してカラムクロマトグ
ラフィーで分離する方法（アチーブス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド番バイオフィジックス（１９７７）
１８１．５４２〜５４９頁参照）、アマドリ化合物を弱
酸と加熱して生成する５−ハイドロキシメチル−２−フ
ルフラルデヒドをチオバルビッール酸によって比色定量
する方法（Ｆ’ＥＢＳレター（１９７６）７１，３５６
〜６６０頁参照）など。しかしこれらの方法は操作の容
易性及び精度の点で満足できるものでなかった。

そこで当業界では１食品や生体中に含まれるアマドリ化
合物を簡易に精度良く測定する方法の開発が特に要望さ
れている。このような実情に鑑み、本発明者らは、迅速
かつ正確なアマドリ化合物の定量法を確立すべく鋭意研
究を重ねた結果、本発明を完成した。

本発明はアマドリ化合物含有液に、酸素の存在下でフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、酸化反応に
より消費される酸素量を測定するか、あるいは該反応に
より生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、
アマドリ化合物の定量法である。

本発明は更に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含
有することを特徴とする、アマドリ化合物の定量用試薬
である。

本発明の定量法は下記の反応を基礎としている。

○　ＨＨＨ ０Ｈ この式中、Ｒ１は基−ＯＨ，−（ａＨ（ｏＨ）：）。−
ＣＨ２０Ｈ又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ｎは０〜４の
整数、Ｒ２はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。

本発明の定量法における被検液としては、上記反応式中
に示されたアマドリ化合物を含有する液であればいかな
るものでもよく、例えば醤油や蜂蜜のような高濃度のア
ミノ酸又は糖を含有するものが好適に用いられる。また
生体試料などに由来する蛋白やポリペプチド鎖中に存在
するものについては、温和な条件で遊離させる手段に解
決すべき問題はあるが、定量の果たす効果が更に大きい
。

本発明の定量に用いられるフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼとしては、如何なる起源のものでも使用できるが
、例えば微生物、殊にコリネバクテリウム属に属する細
菌から選ばれた菌を培養して得られるフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼを用いることが好ましい。コリネバク
テリウム属に属する上記酵素生産菌としては、例えばコ
リネバクテリウム・ｓｐ、Ａ２　６　１　Ｃ微工研菌寄
第８２４５号（ＦｗＲＭＩ）−８２４５）３等があげら
れる。コリネバクテリウム・ｓｐ−Ａ２、−　！ｉ　−
１は本発明者らが土壌中より分離した新菌株であり、そ
の菌学的性質は下記のとおりである。

（ａ）形態：顕微鏡的観察（肉汁寒天培地６０℃、１〜
３日間の観察） （１）細胞の大きさ：０．３Ｘ０．９〜０．３　Ｘ　１
．０ミクロンの桿菌 （２）細胞の多形性：わずかにわん曲した形態を持つ、
菌糸状の生育、分枝は認められない。

（′５）運動性：認められない。

（４）胞子の有無：認められない。

（５）ダラム染色性：陽性 （６）抗酸性：陰性 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：６０℃、４８時間の培養で直
径１．５　ミＩＪメートルの円型で表面平滑で光沢のあ
るコロニーを作り、半透明で淡黄色を帯びる。培養時間
の経過とともに不透明になっていく、拡散性の色素は作
らない。

（２）肉汁寒天斜面培養：生育は良好で（１）に同じ。

（６）肉汁液体培地：静置培養では、生育悪くわずかな
混濁と菌の沈殿を認めるだけであるが振盪すると均一に
良く生育する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：２５℃、６日程では菌べ
の生育はわずかに認められるが、溶解は認められない。

６日目程度になると菌の周囲だけわずかに液化する。

（５）リドマスミルク：紫色になり長時間の培養を行う
と凝固せずペプトン化する。

（Ｃ）生理的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応：陰性 （３）　ＭＲテスト：陰性 （４）　ＶＰテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成二弱い陽性 （７）殿粉の加水分解：陰性 （８）クエン酸の利用：コーザー及びクリステンセンの
両方で陽性 （９）無機窒素源：　ＮＨ４＋及びＮＯ３−の両方とも
利用する。

（１０）色素の生成：淡黄色色素を作る。

（１１）ウレアーゼ：陽性 （１２）オキシダーゼ二陰性 （１６）カタラーゼ：陽性 （１４）生育の範囲温度：１０〜６９°ＣｐＨ：４．２
〜１０．０ （１５）酸素に対する態度：好気的 （１６）　Ｏ−Ｆテスト：極めて弱い酸化的（１７）糖
から酸及びガスの生成 酸　　　　　ガス （１）Ｌ−アラビノース　　　　−− （２）Ｄ−キシロース　　　　　−− （３）Ｄ−グルコース　　　　　−− （４）Ｄ−マンノース　　　　　−− （５）Ｄ−フラクトース　　　　−− （６）Ｄ−ガラクトース　　　　−− （力麦芽糖　　　　　　　−− （８）シよ糖　　　　　　　　−− （９）乳　糖　　　　　　　−− （１０）　）レバロース　　　　　、−一（１１）　Ｄ
−ソルビット　　　　−−（１２）　Ｄ−マンニット　
　　　−−（１３）イノジット　　　　　　−− （１４）グリセリン　　　　　−− （１５）殿　粉　　　　　−− その他セルロースの分解能は認められない。

前記の菌学的性質を有するコリネバクテリウム・エスピ
ー＆２　３　１の分類学上の位置につイ”Ｃ１「パージ
エイズ・マニュアルφオブｅデタミネイティブ・バクテ
リオロジイ」第８版（１９７４年）の分類と対比検討し
た結果、本菌株はグラム陽性の好気的無胞子桿菌であり
、カタラーゼ陽性、運動性がない、ゼラチン、カゼイン
をわずかながら分解する。糖から酸の生成を行わない、
生活環にともなって極端な細胞の多形性を示さない、セ
ルロースを分解しないことからコリネバクテリウム属に
属するものと判定される。さらに本菌株の分離源が動物
質に由来しないこと、ゼラチンを溶解すること、ウレア
ーゼを生産すること、６７℃で生育することから、コリ
ネバクテリウム・ファシアンス（Ｃｏｚｙｎｅｂａｃｔ
ｓｒｉｕｍ　ｆａｓｃｉａｎｓ　）に近縁な菌株と認め
られるが１本国株が土壌から分離したものであり、植物
病源菌でなく、グロスファクターを必要とせず、通常培
地で良く生育する点で異なっており１、コリネバクテリ
ウム属に属する新菌株の菌と判定され、本菌株をコリネ
バクテリウム・エスピーＡ２−３−１と命名した。なお
、コリネバクテリウム・エスピーＡ２−３−１は１通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄
第８２４５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８２４５）として寄託さ
れている。

上記菌株を培養する培地としては、炭素源。

窒素源、無機塩、その他栄養素を適宜含有していれば合
成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源と
しては、例えばグルコース、フルクトース、キシロース
、グリセリン等ヲ用いることができる。窒素源としては
、ペプトン、カゼイン消化物、大豆粉等の蛋白質又はそ
の消化物、あるいは酵母エキス等の窒素性有機物が好適
に利用できる。無機物としては、ナトリウム、カリウム
、カルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルト
等の塩類が使用できる。

本発明においては、フルクトシルアミノ酸を含有する培
地で培養したときには、フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼが最も収量よく得られる。

該培地の好適な例としては、例えばグルコース０．３％
、フルクトシルグリシン０．５％、酵母エキス０．２％
、ポリペプトン０，２％、燐酸水素１カルウム０．２％
、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム０゜０
１％、硫酸第１鉄０６０１％（ｐＨ６，５）の培地が挙
げられる。培養は通常２５〜６７℃の範囲で、好適には
３０℃付近で行われる。培養開始のｐＨは６〜８の範囲
であるが、好適には６．５付近である。このような条件
下で１６〜２４時間振盪又は深部攪拌培養すれば、培養
物中にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが効率良く生
産され、蓄積する。

本酵素は、培養時間を長くすると菌が溶解して菌体外に
も存在するようになるが、通常は菌体中に存在するので
、培養物を遠心分離又は濾過して菌体な集め、適量の緩
衝液に懸濁して菌体な破壊することによって酵素を可溶
化することが必要である。こうして得られた酵素含有液
から、核酸、細胞壁断片等を取り除くことによってフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを得ることができる。さ
らに本酵素は必要により酵素の単離精製の常法に従って
、例えば（１）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグ
ラフィー、（２）硫安分画、（６）フェニルセファロー
スカラムクロマトグラフィー、（４）セファデックスＧ
−２００カラムクロマトグラフイー等の方法、又はその
他の方法を必要に応じて組み合わせて用いることにより
精製酵素を得ることができる。本酵素の精製の具体例を
示すと下記のとおりである。

培養物中から菌体を集めたのち、０．０２Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ７，５に懸濁し、１０％量のグリセリンと１％量
のトリトンｘ−ｉｏｏを加え溶解したのち、ダイノミル
（シンマルエンタープライズ社（スウェーデン）製）を
使用して菌体を破砕する。遠心分離して上清を集め、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースカラム（Ｃ１，０２Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７，５に平衡化しである）にかげて酵素を吸着させ
る。食塩０．２５Ｍを含んだ０．０２　Ｍ　リン酸緩衝
液ｐＨ７，５で洗浄したのち、０．５Ｍ食塩濃度にして
酵素を溶出させる。活性画分を集め、１６％になるよう
に硫安粉末を加える。これを１６％硫安を含有した０、
　１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７゜５に平衡化したフェ
ニルセファロースカラムに通過させて酵素を吸着させる
。この酵素を硫安濃度で１６％量０％の逆濃度勾配とエ
チレングリコール濃度で０→２５％の濃度勾配をあわせ
持ったｎ、　Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液で溶出し、その活
性部について、０．１Ｍ食塩を含有したリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，５で平衡化したセファデックスＧ−２００のカラ
ムクロマトグラフィーを行い精製酵素を得ることができ
る。

上記の精製手段により得られた酵素の理化学的性質は下
記のとおりである。

（１）作用及び基質特異性： 酸素の存在下で、イミノ２酢酸又はその誘導体を酸化し
て、グリオキシル酸又はα−ケトアルデヒド、α−アミ
ノ酸及び過酸化水素を生成する下記の酵素反応を触媒す
る酵素である。

ＨＲ２ ＨＨＨ Ｒ２ この式中、Ｒ１は基−ＯＨ、−（ＣＨ（ＯＨ）１ｎ−Ｃ
Ｈ２０Ｈ又は−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３、ｎは０〜４の整
数、Ｒ２はα−アミノ酸の側鎖残基を示す。

なお、本酵素はβ−アミノ酸例えばβ−アラニン等、イ
ミノ酸例えばプロリン等、メチルアミン、エタノールア
ミン等のアマドリ化合物に対しては作用しない。またケ
トンを還元したもの例えばグルタ）　ＩＪルグリシン等
にも作用しない。

（２）至適ｐＨ： 本酵素の至適ｐＨは、フルクトシルグリシンを基質とし
た場合、第１図に示すごとくｐＨ８，０〜８．５である
。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニターで計測す
ることにより行った。なお図中の使用緩衝液は下記のと
おりである。

○−○：　０．１　Ｍリン酸カリウム緩新液Ｘ−Ｘ：０
．１Ｍベロナール−塩酸緩衝液△−△：　０．１　Ｍグ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（３）　ｐＨ安定性： 本酵素０．１単位を含有する各種緩衝液０．２　ｍｌを
４０℃、１０分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。

その結果は第４図に示すとおりである。なお図中の使用
緩衝液は下記のとおりである。

○−○：　０．１　Ｍリン酸カリウム緩新液△−△：　
０．１　Ｍリン酸ナトリウム−０，１Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液 （４）力価の測定法： 第１法：生成される過酸化水素を発色定量する方法 ０．０５％４−アミノアンチピリン及び０．０１５％２
，４−ジクロロフェノールサルホネートを含有する０、
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｕｓ、ｏ　）　２．８ｄを試験管
にとり、４００　Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ溶液１０
μ詔を加える。温度平衡を３７°Ｃに達せしめたのち、
適当な活性を有する酵素溶液０．１１ｎｌを加え、さら
に０．５Ｍフルクトシルグリシン−Ｑ、　１ｍｌを加え
て１０分間反応させ、生じた色素な光電比色計を用いて
５１０　ｎｍにおける吸光度を測定する。別にあらかじ
め過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成色素量との
関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、
３７℃、１分間当りに生成される過酸化水素のマイクロ
モルを計算し、この数字を使用酵素液中の活性単位とす
る。

第２法：酵素反応にともなって吸収される酸素量を測定
する方法 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２．９　ｍｌを
ＹＳＩ社製社製オキシセンモニタ一定容器にとり、０゜
５Ｍフルクトシルグリシン３．１ａｌを加え、５７℃で
１０分間攪拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめる。

これに酸素電極を差し込み、密閉したのち、酵素溶液５
０μ形を注入し、生じる酸素吸収をモニターに接続した
記録計で連続的に計測し、その最初の速度を測定する。

あらかじめ同様にして容器内の酸素濃度と記録値の間で
標準曲線を作成し、これを用いて測定値から酸素濃度を
求める。６７℃、１分間当り１マイクロモルの酸素吸収
を起こす酵素の活性を１単位とする。

（５）作用適温の範囲： フルクトシルグリシンを基質にして、０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８，０）中で、酵素反応により生成するグリ
シンを液体クロマトグラフィで分離定量する方法によっ
て測定した。その結果は第２図に示すとおりで、本酵素
の作用適温の範囲は６５〜４５℃である。

（６）熱安定性： 精製酵素０．１単位を含有する酵素液Ｑ、　５　ｍｌ　
（０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐａ　ｓ、　Ｏ）を各温度で
１０分間放置したのち、残存した酵素活性を調べた。

その結果は第３図に示すとおりで、６５℃以下では安定
であるが、４５℃で９０％が失活する。

（７）阻害活性化及び安定化： ０、１　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で、
酸素吸収を測定することによって調べた。濃度’ｌ　ｍ
Ｍの各物質の本酵素に対する影響は、下記のとおりであ
る。）（ｇ　　、Ｐｂ　　、ＳＤＳは強く阻害し、Ｎｆ
ｆ＋、Ｚ　ｎ＋＋は中程度に阻害する。各種キレータ−
及びＳＨ試薬は微弱な阻害しか与えなかった。また本酵
素に対する活性化剤及び安定化剤については未知である
。

（８）精製方法： 本酵素は前記の精製方法によって精製することができる
。

（９）分子量： 本酵素の分子量は、セファデックスＧ−２００を用いた
カラムゲルｆ過法で測定した結果、０．１Ｍ食塩含有０
．０５　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液中では６５０００であった
。

（１０）等電点： ディスク焦点電気泳動法により測定した結果、ＰＩ　＝
　４．６であった。

（１１）ディスク電気泳動： デービスのｐＨ９，４のゲルを用いて３ｍＡ／ゲルで５
℃、８０分泳動を行い、酵素蛋白をクマジープリリアン
トプルー（）−２５０で染色した。その結果、ゲルのア
クリルアミド濃度７．５％の時は陽極側に４．１　ｃｒ
ｎ（ブロムフェノールブルーは４、５　ｃｒｎ）、１５
％の時には同じく陽極側に１．７ｍの所に酵素活性を持
つ単一なバンドを認めた。

以上のように本酵素は、その作用及び基質特異性におい
て従来全く知られていない新規な酵素である。

上記のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをアマドリ化
合物の含有液に作用させる場合には、ｐＨ６，５〜１０
及び温度５０℃以下、好ましくはｐＨ″１．５〜９及び
温度６７〜４５℃の条件で、通常は１０〜２０分間程度
反応させる。ｐＨの調整には、前記反応のｐＨ範囲を維
持することができ、かつ酵素反応を阻害しない任意の緩
衝液が用いられ、例えばリン酸カリウム緩衝液、ベロナ
ール緩衝液、リン酸カリウム−炭酸ソーダ緩衝液、クエ
ン酸−リン酸ソーダ緩衝液等が好ましい。フルクトシル
アミノ酸オキシダーゼの使用量は、通常は０．５単位／
　ｍ１以上である。

本発明においては、下記の何れかの測定法によりアマド
リ化合物を定量する。

（１）酵素反応により生成する過酸化水素の測定法：反
応により生成する過酸化水素を、過酸化水素定量の常法
に従って、例えば発色方法、過酸化水素電極を用いる方
法等により定量し、あらかじめ別に用意した過酸化水素
量とアマドリ化合物量との標準曲線よりアマドリ化合物
を定量する。なお発色法により過酸化水素を測定する場
合には、例えば前記の「力価の測定法」に記載した測定
法と同様に操作する。

（２）酸素消費に基づく定量法： この定量法は、反応開始時の酸素量より反応終了時の酸
素量を差引いた値（酸素消費量）を、測定し、あらかじ
め別に用意した酸素消費量とアマドリ化合物量との標準
曲線よりアマドリ化合物含有量を定量するもので、酸素
量の測定は常法に従って、例えばワールブルグ検圧法、
酸素電極法等により行われる。なお酸素電極法により酸
素消費量を測定する場合には、例えば前記の「力価の測
定法」に記載した測定法と同様に操作する。

本発明のアマドリ化合物定量用試薬は、フルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼ及び酵素作用を行わしめるに好適な
ｐＨ範囲、一般にｐＨ６，５〜１０好ましくはｐＨ７，
５〜９を与える緩衝剤、更に反応生成物を測定する場合
には、必要により発色剤等を適宜組合せて成る。

フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとしては、液状、粉
末状の何れでもよく、１検体当りの酵素量は通常は０．
５単位／ゴ以上である。緩衝剤としては、例えばリン酸
カリウム緩衝液、ベロナール緩衝液、リン酸カリウム−
炭酸ソーダ緩衝液、クエン酸−リン酸ソーダ緩衝液等が
好ましい。反応生成物を測定する際の発色剤としては、
該生成物と反応して発色する物質が用いられ、過酸化水
素の発色剤としては、パーオキシダーゼと例えば４−ア
ミノアンチピリン／Ｎ、Ｎ’−ジエチルアミン、４−ア
ミノアンチピリン／フェノール、４−アミノアンチピリ
ン／Ｎ、Ｎ’−ジメチルアニリン、ＡＢＴＳ　、　ＭＢ
ＴＨ／　Ｎ、マージメチルアニリン、４−アミノアンチ
ピリン／２，４−ジクロロフェノールサルホネート等の
組合せがあげられる。本発明のアマドリ化合物定量用試
薬は冷暗所、特に５℃以下に保存することが好ましい。

本発明によれば、従来困難であったアマドリ化合物の測
定が容易になり醤油等の食品や輸液等の製造時及び保存
中の状態を反映するアマドリ化合物を効率良（測定する
ことができる。また、尿や血液及び生体に由来する蛋白
質やポリペプチド鎖に結合したものも、適当なペプチダ
ーゼを作用させ、遊離状態にしたのちには同様に測定す
ることができ、特忙糖尿病の病態測定に利用できる。

実施例１ ４−アミノアンチピリン０．５％　　　　０．３ｍ１２
．４−ジクロロフェノールサルホネート０．１５％　Ｑ
、３ｍｌリン酸緩衝液０．２　Ｍ、　ｐＨ８，０１，５
ｍｌパーオキシダーゼ４００単位／ｍｌ　　　　　　１
０１Ｌｅフルクトシルバリン１．５　ｍＭ　　　　　　
Ｏ〜１００１Ｌｅ蒸留水を加えて全量を２．９５　ｍｌ
に調整した。

上記反応液の入った試験管にフルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼ（１９８単位／ｍｌ含有）５０妬づつを加えて
、６７℃にて１０分間反応させたのち、発色した色素を
５１０　ｎｍで比色定量した。その結果、加えたフルク
トシルバリンと吸光度の間に比例関係が認められた。

実施例２ オキシゲンモニター（米国ＹＳＩ社製）の酸素測定容器
に０．２　Ｍ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、２）を
１．５　ｍｌとり、カタラーゼ（５００００単位／ｍｌ
　）　１０　ｌＬｅ、フルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ（１９８単位／　ｍｌ含有）５０１Ｌｅ及び蒸留水１
．２５　ｍｌを加えて３７℃で１０分間攪拌を続けて平
衡に達せしめた。酸素電極をさしこんで密閉したのち、
醤油、溶液（ｐＨ７，０に調整後誂で２倍に希釈したも
の）２０ｄを加えて反応させた。反応経過はモニターに
接続した記録計ですべて記録し、２０分後に反応結果を
測定したところ、反応前から１１．８目盛の酸素濃度の
変化が読みとれた。同様にしてフルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼの代りに水を用いて操作した場合には、１．
２目盛の変化が読みとれた。

その差は１０．６目盛であった。醤油溶液の代りにフル
クトシルグリシンの標準液を用いて同様に操作して得た
検量線から、この値は０．２６μモルと算出された。

実施例６ ４−アミノアンチピリン６〜．０．２Ｍリン酸カリウム
水溶液３２ｒｎｌ及び０．２　Ｍ炭酸ナトリウム水溶液
２Ｂｒｔｔｔを混合して分析用キット（Ａ）とした。ま
た添付液として０．１％２，４−ジクロロフェノールサ
ルホネート水溶液（Ｂ）　１８　ｍｌ並びにフルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼ６００単位及びパーオキシダー
ゼ１３２単位を含有する６０％グリセリン液（Ｃ）　５
　ｍｌを調製した。使用に際しては３者を混合して蒸留
水を加え全量１００＋＋＋Ｊとした。試料溶液Ｑ、　５
　ｍＡ！に対し試薬溶液２．５ｍＪを使用する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いられる酵素の一例についての至適
ｐＨを示すグラフ、第２図は至適温度を示すグラフ、第
６図は各温度における失活を示すグラフ、第４図は各ｐ
Ｈにおける失活を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アマドリ化合物含有液に、酸素の存在下にフルクト
   シルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、酸化反応により
   消費される酸素量を測定するか、あるいは該反応により
   生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、アマ
   ドリ化合物の定量法。 ２、アマドリ化合物が、アルドースとα−アミノ酸から
   生成された化合物であることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 ３、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含有すること
   を特徴とする、アマドリ化合物の定量用試薬。