JP3068061B2 - 非酵素的グリコシル化タンパク質の測定方法 - Google Patents
非酵素的グリコシル化タンパク質の測定方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は測定方法に関し、よ
り具体的には生物学的材料中のフルクトサミン類または
他の非酵素的グリコシル化タンパク質(glycated protei
n：本用語はグリケーションを受けたタンパク質を意味
する)の測定方法に関する。
り具体的には生物学的材料中のフルクトサミン類または
他の非酵素的グリコシル化タンパク質(glycated protei
n：本用語はグリケーションを受けたタンパク質を意味
する)の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】フルクトサミン類は、例えば
血清などの生物学的材料中に存在する非酵素的グリコシ
ル化タンパク質である。“グリケーション”は、還元糖
類(グルコースなど)とタンパク質(血清アルブミンなど)
の縮合によるタンパク質の非酵素的なグリコシル化と定
義される(Roth,M.,(1983),Clin.Chem.,29,1991を参照の
こと)。グルコースのアルブミンとの反応には、グルコ
ース・カルボニル基に対する該タンパク質上の遊離アミ
ノ基の求核攻撃が関与する。これによって生じるシッフ
塩基は加水分解されてグルコースとタンパク質に戻るこ
ともあり、またアマドリ転移(Hodge,J.E.,(1955),Adv.C
arbohydr.Chem.,10,169-205を参照のこと)を受けてケト
アミン構造を形成することもある。この一連の反応を添
付の図１に記載する。アマドリ化合物は溶液状態で、そ
の直鎖状ケトアミン構造の数種の環状ヘミケタール立体
配座への平衡によって安定化される。主なグリコシル化
部位はリジン残基のε-アミノ基ならびにそのタンパク
質の末端アミノ酸のα-アミノ基である。一旦ケトアミ
ン構造が生成すれば、この安定なケトアミン構造はその
タンパク質の寿命の間ずっとそのタンパク質に残存す
る。
血清などの生物学的材料中に存在する非酵素的グリコシ
ル化タンパク質である。“グリケーション”は、還元糖
類(グルコースなど)とタンパク質(血清アルブミンなど)
の縮合によるタンパク質の非酵素的なグリコシル化と定
義される(Roth,M.,(1983),Clin.Chem.,29,1991を参照の
こと)。グルコースのアルブミンとの反応には、グルコ
ース・カルボニル基に対する該タンパク質上の遊離アミ
ノ基の求核攻撃が関与する。これによって生じるシッフ
塩基は加水分解されてグルコースとタンパク質に戻るこ
ともあり、またアマドリ転移(Hodge,J.E.,(1955),Adv.C
arbohydr.Chem.,10,169-205を参照のこと)を受けてケト
アミン構造を形成することもある。この一連の反応を添
付の図１に記載する。アマドリ化合物は溶液状態で、そ
の直鎖状ケトアミン構造の数種の環状ヘミケタール立体
配座への平衡によって安定化される。主なグリコシル化
部位はリジン残基のε-アミノ基ならびにそのタンパク
質の末端アミノ酸のα-アミノ基である。一旦ケトアミ
ン構造が生成すれば、この安定なケトアミン構造はその
タンパク質の寿命の間ずっとそのタンパク質に残存す
る。
【０００３】多くの疾患状態は、その身体の中間代謝物
の特異な成分の異常に高いか、もしくは異常に低いレベ
ルによって特徴づけられる。健康集団におけるある成分
の正常な濃度範囲が知られている場合には、この成分の
異常レベルの検出が、疾患のもたらす代謝障害の有用な
指標を提供する。したがって臨床的診断試験の目的は、
血液、尿および髄液などの体液ならびに組織および他の
材料についての定性的および定量的な分析の実施を可能
にすることである。これらの試験から得られる情報は医
師にとって疾患の監視および治療に際して有用である。
この情報が有意義であるためには、実施される試験が信
頼でき正確でなければならない。一般に診断的検定法は
その検定法の根拠として、分析物に特有のなんらかの化
学的特性を利用する。測定すべき分析物を含有する体液
または他の材料の試料を、一般に適切な処理の後、特定
の様式で分析物と相互作用して測定可能な信号をもたら
すように設計された試薬と接触させる。したがって、化
学的検定法には分析物と測定可能な様式で反応し、その
試料中の他の成分とは反応しない試薬が含まれるであろ
う。試薬と分析物との反応は、理想的には、他の物質が
同じ様式では反応しない程度に特異的でなければならな
い。しかしこれは化学薬品に基づく検定法では稀なこと
であり、妨害的な副反応がしばしば問題になる。
の特異な成分の異常に高いか、もしくは異常に低いレベ
ルによって特徴づけられる。健康集団におけるある成分
の正常な濃度範囲が知られている場合には、この成分の
異常レベルの検出が、疾患のもたらす代謝障害の有用な
指標を提供する。したがって臨床的診断試験の目的は、
血液、尿および髄液などの体液ならびに組織および他の
材料についての定性的および定量的な分析の実施を可能
にすることである。これらの試験から得られる情報は医
師にとって疾患の監視および治療に際して有用である。
この情報が有意義であるためには、実施される試験が信
頼でき正確でなければならない。一般に診断的検定法は
その検定法の根拠として、分析物に特有のなんらかの化
学的特性を利用する。測定すべき分析物を含有する体液
または他の材料の試料を、一般に適切な処理の後、特定
の様式で分析物と相互作用して測定可能な信号をもたら
すように設計された試薬と接触させる。したがって、化
学的検定法には分析物と測定可能な様式で反応し、その
試料中の他の成分とは反応しない試薬が含まれるであろ
う。試薬と分析物との反応は、理想的には、他の物質が
同じ様式では反応しない程度に特異的でなければならな
い。しかしこれは化学薬品に基づく検定法では稀なこと
であり、妨害的な副反応がしばしば問題になる。
【０００４】この問題は、酵素に基づく検定法を設計す
ることによってしばしば克服され得る。酵素はまさにそ
の本質ゆえに、その基質分子に対して高度に特異的であ
る。特異的な反応を行うために酵素はその基質の化学的
特性に依存するが、酵素はまず、結合が起こり得るよう
に基質の物理的および化学的“形状”を認識しなければ
ならない。そうして初めて酵素反応が起こる。したがっ
て酵素に基づく検定法では、通常、分析物に対して特異
的な酵素を含有する試薬を用いることによって分析物を
結合し、測定可能な様式で分析物を変換する。したがっ
て酵素に基づく診断的検定法は化学薬品法と比較して特
異性という利点を提供し得る。
ることによってしばしば克服され得る。酵素はまさにそ
の本質ゆえに、その基質分子に対して高度に特異的であ
る。特異的な反応を行うために酵素はその基質の化学的
特性に依存するが、酵素はまず、結合が起こり得るよう
に基質の物理的および化学的“形状”を認識しなければ
ならない。そうして初めて酵素反応が起こる。したがっ
て酵素に基づく検定法では、通常、分析物に対して特異
的な酵素を含有する試薬を用いることによって分析物を
結合し、測定可能な様式で分析物を変換する。したがっ
て酵素に基づく診断的検定法は化学薬品法と比較して特
異性という利点を提供し得る。
【０００５】血中に存在するフルクトサミンのレベル
は、血清中に溶解しているグルコースなどの糖類の濃度
によって決定される。フルクトサミン類は血清中で２〜
３週間の半減期を持つので、フルクトサミンの存在レベ
ルは１〜３週間の期間にわたる平均血液グルコースレベ
ルを反映する。したがって、このパラメーターの測定は
真性糖尿病における血糖制御を監視する有用な手段であ
る。
は、血清中に溶解しているグルコースなどの糖類の濃度
によって決定される。フルクトサミン類は血清中で２〜
３週間の半減期を持つので、フルクトサミンの存在レベ
ルは１〜３週間の期間にわたる平均血液グルコースレベ
ルを反映する。したがって、このパラメーターの測定は
真性糖尿病における血糖制御を監視する有用な手段であ
る。
【０００６】現在、血清フルクトサミン類のレベルを測
定するために数種の非酵素的方法が確立されている。例
えばある方法は、アフィニティークロマトグラフィーに
よって非酵素的グリコシル化タンパク質をグリケーショ
ンされていないタンパク質(unglycated protein)から分
離する操作を伴う(Diabetes,(1980),29,1044-1047を参
照のこと)。
定するために数種の非酵素的方法が確立されている。例
えばある方法は、アフィニティークロマトグラフィーに
よって非酵素的グリコシル化タンパク質をグリケーショ
ンされていないタンパク質(unglycated protein)から分
離する操作を伴う(Diabetes,(1980),29,1044-1047を参
照のこと)。
【０００７】固定化ｍ-アミノフェニル-ホウ酸は、アル
カリ性条件下でグリケーション化糖類(glycating sugar
s)のシス-ジオール基と錯化する。未結合の物質を緩衝
液を用いる洗浄によって除去し、フルクトサミン類を高
濃度のソルビトールで溶出させる。次いで、溶出液中の
フルクトサミンのレベルを２８０nmにおける吸光度か、
もしくは化学的方法によって測定することができる。こ
のような方法の欠点は、遊離のグルコースをまず試料か
ら除去しなければならないこと、ならびに固定化ｍ-ア
ミノフェニル-ホウ酸に結合する非酵素的グリコシル化
タンパク質の量がクロマトグラフィー条件に決定的に依
存するということである。したがってこれはこの方法の
精度を減少させるであろう。
カリ性条件下でグリケーション化糖類(glycating sugar
s)のシス-ジオール基と錯化する。未結合の物質を緩衝
液を用いる洗浄によって除去し、フルクトサミン類を高
濃度のソルビトールで溶出させる。次いで、溶出液中の
フルクトサミンのレベルを２８０nmにおける吸光度か、
もしくは化学的方法によって測定することができる。こ
のような方法の欠点は、遊離のグルコースをまず試料か
ら除去しなければならないこと、ならびに固定化ｍ-ア
ミノフェニル-ホウ酸に結合する非酵素的グリコシル化
タンパク質の量がクロマトグラフィー条件に決定的に依
存するということである。したがってこれはこの方法の
精度を減少させるであろう。
【０００８】もう１つの既知の方法はケトアミン結合の
酸加水分解反応の分解生成物の検出を伴う。非酵素的グ
リコシル化タンパク質を高温下強酸(例えば６mol／l Ｈ
Ｃｌ,９５℃)で処理すると非酵素的グリコシル化リジン
残基(グリケーションを受けたリジン残基)の加水分解が
起こり、特異的生成物：Ｎ-(２-フロイルメチル)-Ｌ-リ
ジン［フロシン］が得られる。逆相カラムと２５４およ
び２８０nmの同時ＵＶ検出を用いるＨＰＬＣでフロシン
を測定する(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,(1981),19,81-
87を参照のこと)。既知量の非酵素的グリコシル化リジ
ン残基を含有するヒト血清アルブミンを較正に用いる。
しかしこの方法には時間がかかり、日常的な操作あるい
は自動化には適さない。
酸加水分解反応の分解生成物の検出を伴う。非酵素的グ
リコシル化タンパク質を高温下強酸(例えば６mol／l Ｈ
Ｃｌ,９５℃)で処理すると非酵素的グリコシル化リジン
残基(グリケーションを受けたリジン残基)の加水分解が
起こり、特異的生成物：Ｎ-(２-フロイルメチル)-Ｌ-リ
ジン［フロシン］が得られる。逆相カラムと２５４およ
び２８０nmの同時ＵＶ検出を用いるＨＰＬＣでフロシン
を測定する(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,(1981),19,81-
87を参照のこと)。既知量の非酵素的グリコシル化リジ
ン残基を含有するヒト血清アルブミンを較正に用いる。
しかしこの方法には時間がかかり、日常的な操作あるい
は自動化には適さない。
【０００９】フルクトサミンの酸加水分解反応は、弱酸
もしくは希酸での処理によって５-ヒドロキシメチル-２
-フルフルアルデヒドを得る別の方法でも用いられてい
る。ＨＰＬＣ分離の後、この生成物を２８０nmでの分光
光度測定法で測定することができる。しかし、より便利
な方法はこのフルフラール生成物と２-チオバルビツー
ル酸との反応を含み、この反応により４４３nmに最大吸
光度を有する誘導体が得られる(FEBS Lett.,(1976),71,
356-360を参照のこと)。この方法は専用の装置を用いて
部分的に自動化されている。しかしその結果の精度は、
試料中のタンパク質レベル、酸加水分解反応の条件およ
びグルコースの除去を含むいくつかの要素に依存する。
もしくは希酸での処理によって５-ヒドロキシメチル-２
-フルフルアルデヒドを得る別の方法でも用いられてい
る。ＨＰＬＣ分離の後、この生成物を２８０nmでの分光
光度測定法で測定することができる。しかし、より便利
な方法はこのフルフラール生成物と２-チオバルビツー
ル酸との反応を含み、この反応により４４３nmに最大吸
光度を有する誘導体が得られる(FEBS Lett.,(1976),71,
356-360を参照のこと)。この方法は専用の装置を用いて
部分的に自動化されている。しかしその結果の精度は、
試料中のタンパク質レベル、酸加水分解反応の条件およ
びグルコースの除去を含むいくつかの要素に依存する。
【００１０】最近上記の方法の多くに代わって用いられ
るようになった別法は、アルカリ性溶液中のフルクトサ
ミンの還元能に依存している。このような方法の１つ
は、ニトロブルー・テトラゾリウム(ＮＢＴ)を含有する
炭酸塩緩衝液(ｐＨ１０.３５)への血清試料の添加を伴
う。ＮＢＴがおそらくスーパーオキシドラジカル中間体
を経由して還元され、そのホルマザン生成物の吸光度を
５５０nmで測定する。この方法は血清中のほとんどの妨
害成分が最初の１０分間に反応するという観測に頼って
おり、それゆえに特異的な血清還元活性を１０分と１５
分の間に測定する。この方法は迅速であり、臨床的な診
断に用いるために種々の分析機で自動化されている。し
かし非酵素的グリコシル化タンパク質に関するこの方法
の特異性は疑問視されており、非特異的成分が結果の干
渉および誤解を招き得ることが示されている。さらにフ
クルトサミンレベルはその試料中のアルブミンのレベル
による影響を受けるので、とりわけ低アルブミン血症の
場合に、結果を調節する必要があり得る。
るようになった別法は、アルカリ性溶液中のフルクトサ
ミンの還元能に依存している。このような方法の１つ
は、ニトロブルー・テトラゾリウム(ＮＢＴ)を含有する
炭酸塩緩衝液(ｐＨ１０.３５)への血清試料の添加を伴
う。ＮＢＴがおそらくスーパーオキシドラジカル中間体
を経由して還元され、そのホルマザン生成物の吸光度を
５５０nmで測定する。この方法は血清中のほとんどの妨
害成分が最初の１０分間に反応するという観測に頼って
おり、それゆえに特異的な血清還元活性を１０分と１５
分の間に測定する。この方法は迅速であり、臨床的な診
断に用いるために種々の分析機で自動化されている。し
かし非酵素的グリコシル化タンパク質に関するこの方法
の特異性は疑問視されており、非特異的成分が結果の干
渉および誤解を招き得ることが示されている。さらにフ
クルトサミンレベルはその試料中のアルブミンのレベル
による影響を受けるので、とりわけ低アルブミン血症の
場合に、結果を調節する必要があり得る。
【００１１】本発明の目的は、例えば糖尿病制御の指標
として血清フルクトサミン・レベルを測定する方法であ
って、現行の方法よりかなり有利な方法を提供すること
にある。これを実行するためには、非酵素的グリコシル
化タンパク質を基質として使用し得る酵素を提供する必
要があった。
として血清フルクトサミン・レベルを測定する方法であ
って、現行の方法よりかなり有利な方法を提供すること
にある。これを実行するためには、非酵素的グリコシル
化タンパク質を基質として使用し得る酵素を提供する必
要があった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の非酵
素的グリコシル化タンパク質の測定法であって、その試
料をプロテアーゼで処理し、プロテアーゼ処理したタン
パク質をケトアミンオキシダーゼで処理し、この反応の
生成物を測定することからなることを特徴とする方法を
提供する。(このケトアミンオキシダーゼ類の特徴は、
その反応によって糖オソンおよび過酸化水素が生成し、
そのどちらかを試料中の非酵素的グリコシル化タンパク
質含量の指標として従来の手段で測定できるということ
である。)
素的グリコシル化タンパク質の測定法であって、その試
料をプロテアーゼで処理し、プロテアーゼ処理したタン
パク質をケトアミンオキシダーゼで処理し、この反応の
生成物を測定することからなることを特徴とする方法を
提供する。(このケトアミンオキシダーゼ類の特徴は、
その反応によって糖オソンおよび過酸化水素が生成し、
そのどちらかを試料中の非酵素的グリコシル化タンパク
質含量の指標として従来の手段で測定できるということ
である。)
【００１３】ケトアミンオキシダーゼが細菌群クレブシ
エラまたはコリネバクテリウム、真菌属フサリウムまた
はアクレモニウム、あるいは酵母属デバリオマイセスか
ら入手可能なものであることが好ましく、ケトアミンオ
キシダーゼがデバリオマイセス・バンリジアエ変種バン
リジアエ(Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae)か
ら入手可能なものであることがより好ましい。一般的に
は、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナナイン(ana
nain)、サーモリシン、ズブシリシンおよび牛膵臓プロ
テアーゼ類から選択されるプロテアーゼを用いて、プロ
テアーゼ予備処理を行う。このプロテアーゼ処理を適切
な界面活性剤、具体的にはＳＤＳ、“ブリッグ(Brig)３
５”および“トウィーン２０"、の存在下で行うことが
好ましい。通常は、含まれている過酸化水素を測定する
方がオソンを測定するより便利であり、これは既知のト
リンダー(Trinder)法によって容易に行うことができる。
エラまたはコリネバクテリウム、真菌属フサリウムまた
はアクレモニウム、あるいは酵母属デバリオマイセスか
ら入手可能なものであることが好ましく、ケトアミンオ
キシダーゼがデバリオマイセス・バンリジアエ変種バン
リジアエ(Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae)か
ら入手可能なものであることがより好ましい。一般的に
は、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナナイン(ana
nain)、サーモリシン、ズブシリシンおよび牛膵臓プロ
テアーゼ類から選択されるプロテアーゼを用いて、プロ
テアーゼ予備処理を行う。このプロテアーゼ処理を適切
な界面活性剤、具体的にはＳＤＳ、“ブリッグ(Brig)３
５”および“トウィーン２０"、の存在下で行うことが
好ましい。通常は、含まれている過酸化水素を測定する
方がオソンを測定するより便利であり、これは既知のト
リンダー(Trinder)法によって容易に行うことができる。
【００１４】さらに本発明は、試料中の非酵素的グリコ
シル化タンパク質の測定用キットであって、プロテアー
ゼおよびケトアミンオキシダーゼを含有することを特徴
とするキットをも提供する。
シル化タンパク質の測定用キットであって、プロテアー
ゼおよびケトアミンオキシダーゼを含有することを特徴
とするキットをも提供する。
【００１５】また本発明は、非酵素的グリコシル化タン
パク質の糖部分の１位の炭素原子の酸化を触媒し、その
結果としてアミン結合の加水分解的破壊によるアミノ酸
からの糖オソンおよび過酸化水素の放出をもたらすこと
を特徴とするケトアミンオキシダーゼ、ならびにその生
産法であって、モデル基質、好ましくはブチルアミノ-
デオキシ-フルクトース(ＢＡＤＦ)を誘導物質および／
または選択手段として使用することからなる方法をも提
供する。このような酵素の好ましい供給源は上述の通り
である。
パク質の糖部分の１位の炭素原子の酸化を触媒し、その
結果としてアミン結合の加水分解的破壊によるアミノ酸
からの糖オソンおよび過酸化水素の放出をもたらすこと
を特徴とするケトアミンオキシダーゼ、ならびにその生
産法であって、モデル基質、好ましくはブチルアミノ-
デオキシ-フルクトース(ＢＡＤＦ)を誘導物質および／
または選択手段として使用することからなる方法をも提
供する。このような酵素の好ましい供給源は上述の通り
である。
【００１６】本発明はアマドリ型のケトアミン化合物に
対して特異的なこのような酵素の使用を包含する。酵素
に基づく本発明の方法はこのような化合物に対して高度
な特異性を有する。本発明のさらなる利点は、使用する
酵素がその反応の副生成物としてＨ2Ｏ2を放出するオキ
シダーゼであることにある。放出されたＨ2Ｏ2は容易
に、好ましくは広く用いられているトリンダー法(Ann.C
lin.Biochem.,(1969),6,24-27を参照のこと)によって測
定でき、したがって現存の自動分析機で容易に自動化さ
れ得るフルクトサミン類の測定法を提供する。
対して特異的なこのような酵素の使用を包含する。酵素
に基づく本発明の方法はこのような化合物に対して高度
な特異性を有する。本発明のさらなる利点は、使用する
酵素がその反応の副生成物としてＨ2Ｏ2を放出するオキ
シダーゼであることにある。放出されたＨ2Ｏ2は容易
に、好ましくは広く用いられているトリンダー法(Ann.C
lin.Biochem.,(1969),6,24-27を参照のこと)によって測
定でき、したがって現存の自動分析機で容易に自動化さ
れ得るフルクトサミン類の測定法を提供する。
【００１７】望ましい酵素活性の選択は充分に確立され
ている微生物学的技術に基づいた。選択技術は規定培養
培地の使用に依存し、この培地に何らかの必須原子(例
えば窒素など)の単一供給源を指定された標的分子もし
くは分析物として補足する。次に、この最小培養培地に
ある範囲の環境試料を接種する。これらの試料中に存在
するであろう多くの微生物のうち、標的分析物を分解す
るに適した酵素を生産できるものだけが制限的栄養素を
解離させて成長することができるであろう。次に、この
培地で生育する微生物を単離し、必要な酵素活性を抽出
することができる。
ている微生物学的技術に基づいた。選択技術は規定培養
培地の使用に依存し、この培地に何らかの必須原子(例
えば窒素など)の単一供給源を指定された標的分子もし
くは分析物として補足する。次に、この最小培養培地に
ある範囲の環境試料を接種する。これらの試料中に存在
するであろう多くの微生物のうち、標的分析物を分解す
るに適した酵素を生産できるものだけが制限的栄養素を
解離させて成長することができるであろう。次に、この
培地で生育する微生物を単離し、必要な酵素活性を抽出
することができる。
【００１８】この方法は単純な標的分子あるいは低分子
量の標的分子での使用に特に適している。しかし標的分
子がフルクトサミンのように大きく複雑である場合に
は、この方法の信頼性はかなり低くなる。これは、大き
い標的分子中には種々の手段で放出され得る複数の制限
的原子が存在し得るからである。例えば、フルクトサミ
ンを選択培地中で成長のための単一窒素源として用いた
場合、多くの微生物がタンパク加水分解酵素を用いてこ
の分子から窒素を抽出する能力を有するであろう。フル
クトサミン中の窒素分子の豊富さゆえに、成長をこのタ
ンパク質のケトアミン部分の窒素に依存させるような選
択圧は培地中の生物に加わらない。したがって、この分
析物は選択培養培地中での使用には不適当である。
量の標的分子での使用に特に適している。しかし標的分
子がフルクトサミンのように大きく複雑である場合に
は、この方法の信頼性はかなり低くなる。これは、大き
い標的分子中には種々の手段で放出され得る複数の制限
的原子が存在し得るからである。例えば、フルクトサミ
ンを選択培地中で成長のための単一窒素源として用いた
場合、多くの微生物がタンパク加水分解酵素を用いてこ
の分子から窒素を抽出する能力を有するであろう。フル
クトサミン中の窒素分子の豊富さゆえに、成長をこのタ
ンパク質のケトアミン部分の窒素に依存させるような選
択圧は培地中の生物に加わらない。したがって、この分
析物は選択培養培地中での使用には不適当である。
【００１９】したがってこれらの制限ゆえに、選択培地
の設計には異なる方法を用いた。本当の分析物であるフ
ルクトサミンに特有のケトアミン結合に極めて類似して
いるが、そのケトアミン結合自体の中の窒素原子以外に
は窒素原子を含有しないモデル標的分子を設計した。培
養培地中のこれらの分子からその窒素を遊離させるため
には、適切な酵素がなんらかの様式でケトアミン結合を
切断する必要があろう。したがって、この培地で成長し
たあらゆる生物は、その代謝構成の一部として、ケトア
ミン基を基質として使用できる酵素または酵素群を持っ
ているはずである。一度単離すれば、より大きなフルク
トサミン分子に対する作用能についてこれらの酵素をス
クリーニングすることができる。
の設計には異なる方法を用いた。本当の分析物であるフ
ルクトサミンに特有のケトアミン結合に極めて類似して
いるが、そのケトアミン結合自体の中の窒素原子以外に
は窒素原子を含有しないモデル標的分子を設計した。培
養培地中のこれらの分子からその窒素を遊離させるため
には、適切な酵素がなんらかの様式でケトアミン結合を
切断する必要があろう。したがって、この培地で成長し
たあらゆる生物は、その代謝構成の一部として、ケトア
ミン基を基質として使用できる酵素または酵素群を持っ
ているはずである。一度単離すれば、より大きなフルク
トサミン分子に対する作用能についてこれらの酵素をス
クリーニングすることができる。
【００２０】上述のように、フルクトサミン類のケトア
ミン結合にはグルコースとアミノ酸リジンが関与してい
る。この分析物の最も単純なモデル化合物は非酵素的グ
リコシル化リジン、即ちフルクトシルリジンであろう。
しかしリジンは２つの窒素含有アミノ基を有しているの
で、フルクトシルリジンは選択培地中の単一窒素源とし
てはフルクトサミンと類似の欠点を持つであろう。つま
り、必ずしも標的ケトアミン結合が破壊されなくても、
窒素がこの分子から放出され得るのである。そこで、こ
れに緊密に関連し、窒素原子を１つしか有さない分子フ
ルクトシルバリン(添付の図２を参照のこと)をモデル基
質として調製した。フルクトシルバリンを既知の方法で
調製した(Keilら,Acta.Chem.Scand.,(1985),B39,191-19
3)。このモデル・ケトアミン化合物を、ケトアミン代謝
活性に関する環境選択における窒素源として使用した。
この方法を用いて、フルクトシルバリンを分解し得るい
くつかの微生物を単離した。
ミン結合にはグルコースとアミノ酸リジンが関与してい
る。この分析物の最も単純なモデル化合物は非酵素的グ
リコシル化リジン、即ちフルクトシルリジンであろう。
しかしリジンは２つの窒素含有アミノ基を有しているの
で、フルクトシルリジンは選択培地中の単一窒素源とし
てはフルクトサミンと類似の欠点を持つであろう。つま
り、必ずしも標的ケトアミン結合が破壊されなくても、
窒素がこの分子から放出され得るのである。そこで、こ
れに緊密に関連し、窒素原子を１つしか有さない分子フ
ルクトシルバリン(添付の図２を参照のこと)をモデル基
質として調製した。フルクトシルバリンを既知の方法で
調製した(Keilら,Acta.Chem.Scand.,(1985),B39,191-19
3)。このモデル・ケトアミン化合物を、ケトアミン代謝
活性に関する環境選択における窒素源として使用した。
この方法を用いて、フルクトシルバリンを分解し得るい
くつかの微生物を単離した。
【００２１】フルクトシルバリン中のアミノ酸のサイズ
が小さいことの欠点は、このアミノ酸の遊離カルボキシ
ル基が糖とアミノ酸の間のケトアミン結合に極めて近接
していることである。このカルボキシル基質はフルクト
シルバリン・ケトアミン結合における酸-塩基触媒反応
を促進することによってケトアミン結合の切断を容易に
し得る。これは標的であるフルクトサミン中では起こら
ないことであるから、ケトアミン結合に反応性基が接近
しない第２のモデル基質を設計した。この第２のモデル
であるＢＡＤＦも既知の方法で調製した(Micheelおよび
Hogemann,Chem.Ber.,(1960),93,238)。このモデル基質
を添付の図２に記載する。ＢＡＤＦを最小培地中の単一
窒素源として用いることによってさらに微生物選択を行
い、ケトアミン結合を酸化し得るいくつかの単離物を発
見した。異なる特徴を有する目的のケトアミンオキシダ
ーゼ酵素のいくつかを、上記の選択によって得た微生物
単離物から抽出した。
が小さいことの欠点は、このアミノ酸の遊離カルボキシ
ル基が糖とアミノ酸の間のケトアミン結合に極めて近接
していることである。このカルボキシル基質はフルクト
シルバリン・ケトアミン結合における酸-塩基触媒反応
を促進することによってケトアミン結合の切断を容易に
し得る。これは標的であるフルクトサミン中では起こら
ないことであるから、ケトアミン結合に反応性基が接近
しない第２のモデル基質を設計した。この第２のモデル
であるＢＡＤＦも既知の方法で調製した(Micheelおよび
Hogemann,Chem.Ber.,(1960),93,238)。このモデル基質
を添付の図２に記載する。ＢＡＤＦを最小培地中の単一
窒素源として用いることによってさらに微生物選択を行
い、ケトアミン結合を酸化し得るいくつかの単離物を発
見した。異なる特徴を有する目的のケトアミンオキシダ
ーゼ酵素のいくつかを、上記の選択によって得た微生物
単離物から抽出した。
【００２２】これらの新規ケトアミンオキシダーゼが触
媒する反応を添付の図３に示す。このような酵素は糖部
分の１位の炭素原子の酸化を触媒し、その結果としてア
ミン結合の加水分解的破壊が起こることにより、そのア
ミノ酸から糖オソンが放出される。この酸化反応では酸
素が電子受容体として作用し、過酸化水素が副生成物と
して生成する。
媒する反応を添付の図３に示す。このような酵素は糖部
分の１位の炭素原子の酸化を触媒し、その結果としてア
ミン結合の加水分解的破壊が起こることにより、そのア
ミノ酸から糖オソンが放出される。この酸化反応では酸
素が電子受容体として作用し、過酸化水素が副生成物と
して生成する。
【００２３】本発明のケトアミンオキシダーゼ酵素の好
ましい供給源は、細菌群クレブシエラまたはコリネバク
テリウム、真菌属フサリウムまたはアクレモニウム、お
よび酵母属デバリオマイセスである。デバリオマイセス
・バンリジアエ変種バンリジアエから得られるこのよう
なケトアミンオキシダーゼを用いた場合、本発明に従っ
て特に良い結果を得ることができる。
ましい供給源は、細菌群クレブシエラまたはコリネバク
テリウム、真菌属フサリウムまたはアクレモニウム、お
よび酵母属デバリオマイセスである。デバリオマイセス
・バンリジアエ変種バンリジアエから得られるこのよう
なケトアミンオキシダーゼを用いた場合、本発明に従っ
て特に良い結果を得ることができる。
【００２４】デバリオマイセス・バンリジアエ変種バン
リジアエは一段階麦芽エキスブロス培地中で培養でき
る。ケトアミンオキシダーゼの生産は、フルクトシルバ
リンまたはＢＡＤＦなどのケトアミンモデル化合物を誘
導物質として培地中に含有させることにより特に促進さ
れる。この生物は例えば５〜９のｐＨ範囲で１５〜４０
℃で培養することができる。生育にとって好ましい条件
は一般に２２〜２８℃およびｐＨ６.０〜８.０である。
この生物の生育および該酵素の生産には一般に１〜６日
を要する。
リジアエは一段階麦芽エキスブロス培地中で培養でき
る。ケトアミンオキシダーゼの生産は、フルクトシルバ
リンまたはＢＡＤＦなどのケトアミンモデル化合物を誘
導物質として培地中に含有させることにより特に促進さ
れる。この生物は例えば５〜９のｐＨ範囲で１５〜４０
℃で培養することができる。生育にとって好ましい条件
は一般に２２〜２８℃およびｐＨ６.０〜８.０である。
この生物の生育および該酵素の生産には一般に１〜６日
を要する。
【００２５】あるいは、このような酵素の生産は２段階
工程でも起きる。高バイオマスを得るために、生物をト
リプトン-大豆培地などの栄養豊富な培地に接種するこ
とができる。最大バイオマスに達したら(一般に１〜３
日間)、細胞を遠心分離によって収集し、誘導物質とし
てある量のケトアミンモデル化合物を含有する最小塩類
培地に入れることができる。誘導させるためにこの培地
中で細胞をインキュベートすることができ、この工程に
は２〜２４時間を要するであろう。
工程でも起きる。高バイオマスを得るために、生物をト
リプトン-大豆培地などの栄養豊富な培地に接種するこ
とができる。最大バイオマスに達したら(一般に１〜３
日間)、細胞を遠心分離によって収集し、誘導物質とし
てある量のケトアミンモデル化合物を含有する最小塩類
培地に入れることができる。誘導させるためにこの培地
中で細胞をインキュベートすることができ、この工程に
は２〜２４時間を要するであろう。
【００２６】現在好ましい１態様として、非酵素的グリ
コシル化タンパク質を検出するための本発明の方法は、
血清中のフルクトサミンなどの検定すべき非酵素的グリ
コシル化タンパク質試料をプロテアーゼ類(例：プロテ
イナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナナイン、サーモリシ
ン、ズブシリシンおよびウシ膵臓プロテアーゼ類)を含
有するタンパク加水分解試薬で予備処理することを含
む。この予備消化は、ラウリル硫酸ナトリウム(ＳＤ
Ｓ)、“Brij３５”または“Tween２０”などの界面活性
剤の存在下で実行し得る。次いで、予備処理した試料を
細菌群クレブシエラまたはコリネバクテリウム、真菌属
フサリウムまたはアクレモニウム、あるいは酵母属デバ
リオマイセスから選択されるケトアミンオキシダーゼ調
製物と接触させることができる。
コシル化タンパク質を検出するための本発明の方法は、
血清中のフルクトサミンなどの検定すべき非酵素的グリ
コシル化タンパク質試料をプロテアーゼ類(例：プロテ
イナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナナイン、サーモリシ
ン、ズブシリシンおよびウシ膵臓プロテアーゼ類)を含
有するタンパク加水分解試薬で予備処理することを含
む。この予備消化は、ラウリル硫酸ナトリウム(ＳＤ
Ｓ)、“Brij３５”または“Tween２０”などの界面活性
剤の存在下で実行し得る。次いで、予備処理した試料を
細菌群クレブシエラまたはコリネバクテリウム、真菌属
フサリウムまたはアクレモニウム、あるいは酵母属デバ
リオマイセスから選択されるケトアミンオキシダーゼ調
製物と接触させることができる。
【００２７】この方法によってフルクトサミン中の非酵
素的グリコシル化リジン基がそのタンパク質から放出さ
れ、次いで、この分子がグルコソンの放出を伴って切断
され得る。ケトアミンオキシダーゼによる非酵素的グリ
コシル化アミノ酸酸化の特徴は、この酵素による過酸化
水素の化学量論的生成である。このように生成した過酸
化水素を酵素的に測定することができる。１つの選択枝
は、ケトアミンオキシダーゼの調製物に、あらかじめ決
定した量の西洋ワサビペルオキシダーゼおよびこの酵素
に適した色素原基質群(例えば４-アミノフェナゾンおよ
びＮ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-
ｍ-トルイジン(ＴＯＯＳ))を含有させることである。こ
の場合には、ペルオキシダーゼによる色素原基質群の酸
化に、ケトアミンオキシダーゼの作用によって生成した
過酸化水素が用いられる。
素的グリコシル化リジン基がそのタンパク質から放出さ
れ、次いで、この分子がグルコソンの放出を伴って切断
され得る。ケトアミンオキシダーゼによる非酵素的グリ
コシル化アミノ酸酸化の特徴は、この酵素による過酸化
水素の化学量論的生成である。このように生成した過酸
化水素を酵素的に測定することができる。１つの選択枝
は、ケトアミンオキシダーゼの調製物に、あらかじめ決
定した量の西洋ワサビペルオキシダーゼおよびこの酵素
に適した色素原基質群(例えば４-アミノフェナゾンおよ
びＮ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-
ｍ-トルイジン(ＴＯＯＳ))を含有させることである。こ
の場合には、ペルオキシダーゼによる色素原基質群の酸
化に、ケトアミンオキシダーゼの作用によって生成した
過酸化水素が用いられる。
【００２８】この反応はその検定混合物中に発色をもた
らし、適切な波長で検定混合物の吸光度の変化を測定す
ることによってこれを検出することができる。したがっ
て、変換された非酵素的グリコシル化タンパク質の量を
化学量論的な同値で計算することができる。ジフェニル
アミンなどのアルドース試薬を用いてグルコソンを決定
することもできる。
らし、適切な波長で検定混合物の吸光度の変化を測定す
ることによってこれを検出することができる。したがっ
て、変換された非酵素的グリコシル化タンパク質の量を
化学量論的な同値で計算することができる。ジフェニル
アミンなどのアルドース試薬を用いてグルコソンを決定
することもできる。
【００２９】本発明は、２つの試薬または試薬群からな
る、非酵素的グリコシル化タンパク質またはフルクトサ
ミンを測定するための診断用キットを提供する。１つの
試薬群は、１または複数のプロテアーゼ、および試料の
予備処理で使用する界面活性剤を含有する。他方の試薬
群は、予備処理中に生成した非酵素的グリコシル化アミ
ノ酸を酸化する本発明のケトアミンオキシダーゼ、なら
びにトリンダー試薬類(例：ペルオキシダーゼ、色信号
を形成させるために使用するフェノール性またはアニリ
ン性共役剤および４-アミノフェナゾン)を含む検定成分
を含有する。典型的には、検定すべき試料の一部を適切
な体積の検定試薬に加える。この検定混合物を１０〜６
０℃、より好ましくは３０〜５０℃の温度で、５〜９.
５、より好ましくは６〜８のｐＨで適切な時間、通常は
２〜２０分間インキュベートすることができる。酸化速
度を速度法または終点法で測定することができる。
る、非酵素的グリコシル化タンパク質またはフルクトサ
ミンを測定するための診断用キットを提供する。１つの
試薬群は、１または複数のプロテアーゼ、および試料の
予備処理で使用する界面活性剤を含有する。他方の試薬
群は、予備処理中に生成した非酵素的グリコシル化アミ
ノ酸を酸化する本発明のケトアミンオキシダーゼ、なら
びにトリンダー試薬類(例：ペルオキシダーゼ、色信号
を形成させるために使用するフェノール性またはアニリ
ン性共役剤および４-アミノフェナゾン)を含む検定成分
を含有する。典型的には、検定すべき試料の一部を適切
な体積の検定試薬に加える。この検定混合物を１０〜６
０℃、より好ましくは３０〜５０℃の温度で、５〜９.
５、より好ましくは６〜８のｐＨで適切な時間、通常は
２〜２０分間インキュベートすることができる。酸化速
度を速度法または終点法で測定することができる。
【００３０】本発明は新しいフクルトサミン検定法を提
供する。この方法はフルクトサミン中に存在する型のケ
トアミン結合に対して特異的な新しい酵素に基づくの
で、現行のフルクトサミン検定法より優れている。この
特異性ゆえに、本発明の検定法は一般に、おそらく血液
試料中に存在する他の物質によるのであろう妨害に対し
て現行の方法より感受性が低い。本法を現存する自動分
析機での使用に適合させることは容易であろう。
供する。この方法はフルクトサミン中に存在する型のケ
トアミン結合に対して特異的な新しい酵素に基づくの
で、現行のフルクトサミン検定法より優れている。この
特異性ゆえに、本発明の検定法は一般に、おそらく血液
試料中に存在する他の物質によるのであろう妨害に対し
て現行の方法より感受性が低い。本法を現存する自動分
析機での使用に適合させることは容易であろう。
【００３１】以下の実施例によって本発明がより明確に
なるであろう。
なるであろう。
【００３２】
【実施例】実施例１ フサリウム・オキシスポラム(ＩＭＩ３５３４５６)を、
次に示す成分からなる培地 １００mlを含有する５００m
lエルレンマイヤーフラスコに接種した［培地組成；グ
リセロール(１０g／ｌ)、Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ(１４g
／ｌ)、ＫＣｌ(０.５g／ｌ)、ＭｇＳＯ4(０.５g／ｌ)、
ＣａＣｌ2(０.０２g／ｌ)およびフルクトシルバリン(２
g／ｌ)］。この振盪フラスコ培養を楕円浸透機上３０℃
で４日間インキュベートした。この期間の後、３５００
rpm１５分間の遠心分離によって細胞を収集した。この
細胞を０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で洗浄し、前と
同様に再度遠心分離した。次に、得られた細胞ペレット
を０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)に懸濁することによ
って、その体積を最初の収集体積の２０％とした。目的
の酵素はこの生物の細胞内に存在するので、この細胞懸
濁液の各２０mlをそれぞれ１５分間超音波処理すること
により、この酵素を溶液中に放出させた。次に超音波処
理物を３５００rpmで３０分間遠心分離することによ
り、細胞デブリス(残骸)を除去した。得られた酵素溶液
を０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)３ｌ(２回交換)に対
して４℃で２０時間透析した。
次に示す成分からなる培地 １００mlを含有する５００m
lエルレンマイヤーフラスコに接種した［培地組成；グ
リセロール(１０g／ｌ)、Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ(１４g
／ｌ)、ＫＣｌ(０.５g／ｌ)、ＭｇＳＯ4(０.５g／ｌ)、
ＣａＣｌ2(０.０２g／ｌ)およびフルクトシルバリン(２
g／ｌ)］。この振盪フラスコ培養を楕円浸透機上３０℃
で４日間インキュベートした。この期間の後、３５００
rpm１５分間の遠心分離によって細胞を収集した。この
細胞を０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で洗浄し、前と
同様に再度遠心分離した。次に、得られた細胞ペレット
を０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)に懸濁することによ
って、その体積を最初の収集体積の２０％とした。目的
の酵素はこの生物の細胞内に存在するので、この細胞懸
濁液の各２０mlをそれぞれ１５分間超音波処理すること
により、この酵素を溶液中に放出させた。次に超音波処
理物を３５００rpmで３０分間遠心分離することによ
り、細胞デブリス(残骸)を除去した。得られた酵素溶液
を０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)３ｌ(２回交換)に対
して４℃で２０時間透析した。
【００３３】この調製物の活性をモデル基質ＢＡＤＦを
用いて検定した。検定混合物を以下のように調製した： ２００μl 酵素調製物 ４０μl 西洋ワサビペルオキシダーゼ(１.４５mg／ml) ６０μl フェノール(５.５mg／ml) ６０μl ４-アミノフェナゾン(２mg／ml) ４２０μl ０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ７.９)。
用いて検定した。検定混合物を以下のように調製した： ２００μl 酵素調製物 ４０μl 西洋ワサビペルオキシダーゼ(１.４５mg／ml) ６０μl フェノール(５.５mg／ml) ６０μl ４-アミノフェナゾン(２mg／ml) ４２０μl ０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ７.９)。
【００３４】この混合物を１mlキュベット中３７℃で予
備インキュベートし、吸光度の変化を５０５nmで追跡す
ることによって対照速度(対照系の速度)を測定した。次
に１２０μlのＢＡＤＦ(３mg／ml)をこのキュベットに
加え、ケトアミンオキシダーゼ活性を測定した。(活性
１単位を、３７℃で１分間に１μmolのＢＡＤＦの酸化
をもたらす酵素量と定義する。）この方法によって、こ
の調製物のケトアミンオキシダーゼ活性が３０Ｕ／ｌで
あることがわかった。
備インキュベートし、吸光度の変化を５０５nmで追跡す
ることによって対照速度(対照系の速度)を測定した。次
に１２０μlのＢＡＤＦ(３mg／ml)をこのキュベットに
加え、ケトアミンオキシダーゼ活性を測定した。(活性
１単位を、３７℃で１分間に１μmolのＢＡＤＦの酸化
をもたらす酵素量と定義する。）この方法によって、こ
の調製物のケトアミンオキシダーゼ活性が３０Ｕ／ｌで
あることがわかった。
【００３５】実施例２ トリプトン-大豆培地 ５０mlを含有する２５０ml振盪フ
ラスコにアクレモニウム種(ＩＭＩ３５３４３７)の培養
から得た細胞を接種した。この振盪フラスコを楕円浸透
機上３０℃で２４時間インキュベートした。次にこの培
養の１５mlを滅菌トリプトン-大豆培地 １.５ｌを含有
する２ｌ撹拌発酵器に無菌条件下で接種した。この発酵
器に滅菌フィルターを通してＢＡＤＦ溶液 ３５０mg／l
を加えた。この培地を１０００rpmで撹拌し、培養を通
して１ｌ／分の空気を散布した。発酵の間、温度を２８
℃に維持した。
ラスコにアクレモニウム種(ＩＭＩ３５３４３７)の培養
から得た細胞を接種した。この振盪フラスコを楕円浸透
機上３０℃で２４時間インキュベートした。次にこの培
養の１５mlを滅菌トリプトン-大豆培地 １.５ｌを含有
する２ｌ撹拌発酵器に無菌条件下で接種した。この発酵
器に滅菌フィルターを通してＢＡＤＦ溶液 ３５０mg／l
を加えた。この培地を１０００rpmで撹拌し、培養を通
して１ｌ／分の空気を散布した。発酵の間、温度を２８
℃に維持した。
【００３６】９６時間後、培養ブロスの４７０nmでの吸
光度が１２〜１５光学密度単位に達し、発酵器の内容物
を７０００rpm１５分間の遠心分離により収集した。得
られた細胞ペレットを０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)
で洗浄した後、同緩衝液 ２５０mlに再懸濁した。２５
分間の超音波処理によって細胞を溶解し、細胞デブリス
を７０００rpm２０分間の遠心分離によって除去した。
その上清酵素溶液を上記のリン酸緩衝液(５ｌｘ２)に対
して透析した。実施例１に記述した検定法を用いること
によって、この調製物が１０Ｕ／ｌのケトアミンオキシ
ダーゼを含有することがわかった。
光度が１２〜１５光学密度単位に達し、発酵器の内容物
を７０００rpm１５分間の遠心分離により収集した。得
られた細胞ペレットを０.１M リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)
で洗浄した後、同緩衝液 ２５０mlに再懸濁した。２５
分間の超音波処理によって細胞を溶解し、細胞デブリス
を７０００rpm２０分間の遠心分離によって除去した。
その上清酵素溶液を上記のリン酸緩衝液(５ｌｘ２)に対
して透析した。実施例１に記述した検定法を用いること
によって、この調製物が１０Ｕ／ｌのケトアミンオキシ
ダーゼを含有することがわかった。
【００３７】実施例３ 麦芽エキスブロス ５０mlを含有する２５０ml振盪フラ
スコにデカリオマイセス・バンリジアエ変種バンリジア
エ(ＮＣＹＣ２３８６)の培養から得た細胞を接種した。
この振盪フラスコを滅菌麦芽エキスブロス １.５ｌの入
った撹拌発酵器に滅菌条件下で接種した。誘導物質とし
てＢＡＤＦ ０.５g／ｌをこの発酵器に滅菌フィルター
を通して加えた。この培地を１０００rpmで撹拌し、培
養を通して１ｌ／分の空気を散布した。この発酵の間、
温度を２８℃に維持し、ｐＨを６.０に制御した。
スコにデカリオマイセス・バンリジアエ変種バンリジア
エ(ＮＣＹＣ２３８６)の培養から得た細胞を接種した。
この振盪フラスコを滅菌麦芽エキスブロス １.５ｌの入
った撹拌発酵器に滅菌条件下で接種した。誘導物質とし
てＢＡＤＦ ０.５g／ｌをこの発酵器に滅菌フィルター
を通して加えた。この培地を１０００rpmで撹拌し、培
養を通して１ｌ／分の空気を散布した。この発酵の間、
温度を２８℃に維持し、ｐＨを６.０に制御した。
【００３８】２４時間後、遠心分離によって細胞を収集
し、５０mM リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)でその細胞を洗浄
し、次いで遠心分離することによって再度集めた。その
細胞ペレットを体積が２５０mlになるように同緩衝液に
再懸濁し、そのスラリー(泥状物)を超音波処理すること
により細胞を溶解した。
し、５０mM リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)でその細胞を洗浄
し、次いで遠心分離することによって再度集めた。その
細胞ペレットを体積が２５０mlになるように同緩衝液に
再懸濁し、そのスラリー(泥状物)を超音波処理すること
により細胞を溶解した。
【００３９】凝集剤“マグナフロック(Magnafloc)ＬＴ
３１"(０.１％)をこの懸濁液に加え、細胞デブリスを遠
心分離によって除去した。固形硫酸アンモニウムを４０
％飽和になるように添加することによって、この溶液の
硫酸アンモニウム前方分画を行った。これによって生成
した沈澱を遠心分離で除去して捨てた。硫酸アンモニウ
ム濃度を６５％飽和に上げることによって後方分画を行
い、その沈澱を回収した。この沈澱を２０mM ピペラジ
ン緩衝液(ｐＨ５.５) ５０mlに再懸濁し、この溶液をア
ミコンセントリプレップ３０モジュールで、０.１mM Ｅ
ＤＴＡ、０.１mM ＰＭＳＦおよび０.２mM ベンズアミジ
ンを含有する同緩衝液に対してダイアフィルトレーショ
ンした。ダイアフィルトレーションの後、この溶液を３
０００rpmで２０分間遠心分離することによって沈澱を
除去した。その上清の６mlを、あらかじめ２０mM ピペ
ラジン(ｐＨ５.５)緩衝液で平衡化しておいたファルマ
シアＭono Ｓ ＨＲ５／５カラムに充填し、非勾配系溶
出液１５カラム体積によってケトアミンオキシダーゼ酵
素をこのカラムから溶出させた。ケトアミンオキシダー
ゼを含有する画分を集めることによって、０.８Ｕ／ml
ケトアミンオキシダーゼおよび８３μg／ml タンパク質
を含有する調製物を得た。
３１"(０.１％)をこの懸濁液に加え、細胞デブリスを遠
心分離によって除去した。固形硫酸アンモニウムを４０
％飽和になるように添加することによって、この溶液の
硫酸アンモニウム前方分画を行った。これによって生成
した沈澱を遠心分離で除去して捨てた。硫酸アンモニウ
ム濃度を６５％飽和に上げることによって後方分画を行
い、その沈澱を回収した。この沈澱を２０mM ピペラジ
ン緩衝液(ｐＨ５.５) ５０mlに再懸濁し、この溶液をア
ミコンセントリプレップ３０モジュールで、０.１mM Ｅ
ＤＴＡ、０.１mM ＰＭＳＦおよび０.２mM ベンズアミジ
ンを含有する同緩衝液に対してダイアフィルトレーショ
ンした。ダイアフィルトレーションの後、この溶液を３
０００rpmで２０分間遠心分離することによって沈澱を
除去した。その上清の６mlを、あらかじめ２０mM ピペ
ラジン(ｐＨ５.５)緩衝液で平衡化しておいたファルマ
シアＭono Ｓ ＨＲ５／５カラムに充填し、非勾配系溶
出液１５カラム体積によってケトアミンオキシダーゼ酵
素をこのカラムから溶出させた。ケトアミンオキシダー
ゼを含有する画分を集めることによって、０.８Ｕ／ml
ケトアミンオキシダーゼおよび８３μg／ml タンパク質
を含有する調製物を得た。
【００４０】この方法で調製した酵素のＫｍをＢＡＤＦ
に関して決定し、８０μMであることがわかった。添付
の図４および図５は上記の方法で調製したケトアミンオ
キシダーゼのｐＨ／活性およびｐＨ／安定性の特性図を
示している。活性に関する至適ｐＨは７.０〜８.５の範
囲であり、一方、本酵素は５〜７.５の範囲で最も安定
である。
に関して決定し、８０μMであることがわかった。添付
の図４および図５は上記の方法で調製したケトアミンオ
キシダーゼのｐＨ／活性およびｐＨ／安定性の特性図を
示している。活性に関する至適ｐＨは７.０〜８.５の範
囲であり、一方、本酵素は５〜７.５の範囲で最も安定
である。
【００４１】実施例４ １５０mM 塩化ナトリウムを含有する５０mM リン酸緩衝
液(ｐＨ７.４) ８０mlにシグマ・ヒトアルブミン ４gお
よびグルコース ５gを溶解した。この混合物を滅菌フラ
スコ中に滅菌濾過し、３７℃で２１日間インキュベート
した。この期間の後、この溶液を５０mM トリス-塩酸緩
衝液(ｐＨ７.９)に対して透析し、次いで３５００rpmで
２０分間遠心分離することにより沈澱をすべて除去し
た。次に、ロッシュ・ＮＢＴ検定法を用いてこの溶液を
検定し、この溶液が３８８０μmol／ｌのフルクトサミ
ンを含有することがわかった。
液(ｐＨ７.４) ８０mlにシグマ・ヒトアルブミン ４gお
よびグルコース ５gを溶解した。この混合物を滅菌フラ
スコ中に滅菌濾過し、３７℃で２１日間インキュベート
した。この期間の後、この溶液を５０mM トリス-塩酸緩
衝液(ｐＨ７.９)に対して透析し、次いで３５００rpmで
２０分間遠心分離することにより沈澱をすべて除去し
た。次に、ロッシュ・ＮＢＴ検定法を用いてこの溶液を
検定し、この溶液が３８８０μmol／ｌのフルクトサミ
ンを含有することがわかった。
【００４２】この溶液の一部を５０mM トリス-塩酸緩衝
液(ｐＨ７.９)で希釈することにより、フルクトサミン
濃度が０〜１９４０μmol／ｌの範囲で変化する一連の
試料を作成した。各フルクトサミン希釈液について、予
備処理インキュベーション混合物を次のように調製し
た。 １９０μl フルクトサミン溶液 ２０μl ジェンザイム・プロテイナーゼＫ(６mg／ml) ２０μl シグマ・プロナーゼＥ(６mg／ml) ２０μl ＳＤＳ(１.２５％)
液(ｐＨ７.９)で希釈することにより、フルクトサミン
濃度が０〜１９４０μmol／ｌの範囲で変化する一連の
試料を作成した。各フルクトサミン希釈液について、予
備処理インキュベーション混合物を次のように調製し
た。 １９０μl フルクトサミン溶液 ２０μl ジェンザイム・プロテイナーゼＫ(６mg／ml) ２０μl シグマ・プロナーゼＥ(６mg／ml) ２０μl ＳＤＳ(１.２５％)
【００４３】これらの混合物を５５℃で３０分間インキ
ュベートした。この期間の後、各予備処理チューブから
一部を取り出し、以下に記載する微量滴定プレート検定
混合物に加えた： ２５μl 消化試料 ２０μl ４-アミノフェナゾン溶液(２mg／ｌ) ２０μl ＴＯＯＳ溶液(１５.５mg／ml) １０μl シグマ・西洋ワサビペルオキシダーゼ(１.４
５mg／ml) １５０μl ５０mM トリス-塩酸緩衝液(ｐＨ７.９)
ュベートした。この期間の後、各予備処理チューブから
一部を取り出し、以下に記載する微量滴定プレート検定
混合物に加えた： ２５μl 消化試料 ２０μl ４-アミノフェナゾン溶液(２mg／ｌ) ２０μl ＴＯＯＳ溶液(１５.５mg／ml) １０μl シグマ・西洋ワサビペルオキシダーゼ(１.４
５mg／ml) １５０μl ５０mM トリス-塩酸緩衝液(ｐＨ７.９)
【００４４】各フルクトサミン濃度について１対の検定
を行った。
を行った。
【００４５】この微量検定プレートを３７℃でインキュ
ベートし、実施例３に記述したように調製した活性１Ｕ
／mlのケトアミンオキシダーゼ溶液 ２５μlを各検定ウ
ェルに加えた。各ウェルについて、反応の初速度を５６
０ｎｍの吸光度上昇によって５分間測定した。反応の初
速度とフルクトサミン濃度との関係を添付の図６に示
す。
ベートし、実施例３に記述したように調製した活性１Ｕ
／mlのケトアミンオキシダーゼ溶液 ２５μlを各検定ウ
ェルに加えた。各ウェルについて、反応の初速度を５６
０ｎｍの吸光度上昇によって５分間測定した。反応の初
速度とフルクトサミン濃度との関係を添付の図６に示
す。
【００４６】実施例５ 上記の微量滴定プレート反応混合物を３７℃で２０分間
インキュベートすることによってこのケトアミンオキシ
ダーゼ検定反応を完結させたことを除いて、実施例４に
記述した操作を繰り返した。この期間の後、各ウェルの
吸光度を５６０nmで測定した。この方法で得られる平均
吸光度とフルクトサミン濃度との関係を添付の図７に示
す。
インキュベートすることによってこのケトアミンオキシ
ダーゼ検定反応を完結させたことを除いて、実施例４に
記述した操作を繰り返した。この期間の後、各ウェルの
吸光度を５６０nmで測定した。この方法で得られる平均
吸光度とフルクトサミン濃度との関係を添付の図７に示
す。
【図１】 グルコースとタンパク質の反応によってフル
クトサミンが生成する過程を表す。
クトサミンが生成する過程を表す。
【図２】 本明細書に挙げた２種のモデル標的分子フル
クトシルバリンおよびブチルアミノデオキシフルクトー
スの構造式。
クトシルバリンおよびブチルアミノデオキシフルクトー
スの構造式。
【図３】 ケトアミンオキシダーゼが触媒するフルクト
シルバリンの酸化反応式。
シルバリンの酸化反応式。
【図４】 ケトオキシダーゼの至適ｐＨ特性図。
【図５】 ケトオキシダーゼのｐＨ安定性特性図。
【図６】 速度検定法に関するフルクトサミン標準曲
線。
線。
【図７】 終点検定法に関するフルクトサミン標準曲
線。
線。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 ジョン・エイ・パワー イギリス、イングランド、ティエヌ15・ ０ディジー、ケント、セブンオークス、 シール、チャイルズブリッジ・ウェイ、 “アイビー・バンク" (72)発明者 ジョン・エイ・ラブレディ イギリス、イングランド、エムイー14・ ４エイアール、ケント、メイドストー ン、ベアーステッド、ミン・クレセント 24番 (56)参考文献 特開 平２−195900（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−268178（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−155780（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/26 - 1/37 C12N 9/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】 試料をプロテアーゼで処理し、真菌属フ
サリウムまたはアクレモニウムから得られるケトアミン
オキシダーゼ含有物で、そのプロテアーゼ処理試料を処
理し、その反応生成物を測定することを特徴とする、試
料中の非酵素的グリコシル化タンパク質の測定法。 - 【請求項２】 プロテアーゼがプロテイナーゼＫ、プロ
ナーゼＥ、アナナイン、サーモリシン、ズブチリシンお
よびウシ膵臓プロテアーゼ類から選択される請求項１の
測定法。 - 【請求項３】 プロテアーゼ処理を界面活性剤の存在下
で実施する請求項１または請求項２の測定法。 - 【請求項４】 界面活性剤が、ＳＤＳ、ポリオキシエチ
レン（３５）ラウリルエーテルまたはポリオキシエチレ
ン（２０）ソルビタンモノラウレートである請求項３の
測定法。 - 【請求項５】 反応生成物がトリンダー反応を用いて測
定される過酸化水素である請求項１から請求項４までの
いずれかの測定法。 - 【請求項６】 プロテアーゼと、真菌属フサリウムまた
はアクレモニウムから得られるケトアミンオキシダーゼ
含有物を含有することを特徴とする、試料中の非酵素的
グリコシル化タンパク質測定用キット。 - 【請求項７】 非酵素的グリコシル化タンパク質の糖部
分の１位の炭素原子の酸化反応を触媒し、その結果とし
てアミン結合の加水分解的破壊によるアミノ酸からの糖
オソンおよび過酸化水素の放出をもたらすことを特徴と
し、真菌属フサリウムまたはアクレモニウムから得られ
るケトアミンオキシダーゼ含有物。 - 【請求項８】 非酵素的グリコシル化タンパク質の糖部
分の１位の炭素原子の酸化反応を触媒し、その結果とし
てアミン結合の加水分解的破壊によるアミノ酸からの糖
オソンおよび過酸化水素の放出をもたらすことを特徴と
し、真菌属フサリウムまたはアクレモニウムから得られ
るケトアミンオキシダーゼ含有物の生産法であって、以
下の工程： （ａ）真菌属フサリウムまたはアクレモニウムから選択
される微生物を含む細胞培養培地を調製すること； （ｂ）モデル基質を、該微生物のための単独の窒素源と
してその培地に加えること； （ｃ）該培地からケトアミンオキシダーゼ含有物を得る
ことを含んでなることを特徴とする生産法。 - 【請求項９】 モデル基質がブチルアミノデオキシフル
クトースである請求項８の生産法。
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|---|---|---|---|
| GB919116315A GB9116315D0 (en) | 1991-07-29 | 1991-07-29 | Assay |
| GB9116315 | 1991-07-29 |
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|---|---|---|---|
| JP4202229A Division JP3034698B2 (ja) | 1991-07-29 | 1992-07-29 | 非酵素的グリコシル化タンパク質の検定法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11127895A JPH11127895A (ja) | 1999-05-18 |
| JP3068061B2 true JP3068061B2 (ja) | 2000-07-24 |
Family
ID=10699146
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4202229A Expired - Lifetime JP3034698B2 (ja) | 1991-07-29 | 1992-07-29 | 非酵素的グリコシル化タンパク質の検定法 |
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|---|---|---|---|
| JP4202229A Expired - Lifetime JP3034698B2 (ja) | 1991-07-29 | 1992-07-29 | 非酵素的グリコシル化タンパク質の検定法 |
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| AU (1) | AU655646B2 (ja) |
| CA (1) | CA2074772C (ja) |
| DE (1) | DE69211439T2 (ja) |
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| ES (1) | ES2088549T3 (ja) |
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| IE (1) | IE75365B1 (ja) |
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| US5792623A (en) * | 1992-04-06 | 1998-08-11 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent |
| EP0678576B1 (en) * | 1994-03-03 | 2001-01-03 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| DE4425162A1 (de) * | 1994-07-18 | 1996-01-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von glykierten Proteinen |
| US5712138A (en) * | 1994-10-05 | 1998-01-27 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase |
| EP0823943B1 (en) * | 1995-05-05 | 1999-07-28 | Genzyme Limited | Determination of glycated proteins |
| US5712167A (en) * | 1995-07-19 | 1998-01-27 | Kyoto Dai-Ichi Kagaku Co., Ltd. | Method of measuring Amadori compound by light scattering |
| WO1997013872A1 (fr) * | 1995-10-12 | 1997-04-17 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Procede pour doser les composes d'amadori |
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| WO1997020039A1 (fr) * | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Oxydase de fructosylaminoacides, son procede d'obtention, et methode d'essai des composes d'amadori utilisant ladite oxydase |
| WO1997021818A1 (fr) * | 1995-12-14 | 1997-06-19 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Nouvelle oxydase d'acide amine fructosyle provenant d'un champignon du genre penicillium |
| WO1998048043A1 (fr) * | 1997-04-24 | 1998-10-29 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Procede de dosage enzymatique d'une proteine de saccharification |
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