CN103080308B - 底物特异性得到改变的阿马多里酶 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供对果糖基缬氨酰基组氨酸的底物特异性高的阿马多里酶。本发明是在与选自来自锥毛壳(Coniochaeta)属的阿马多里酶的98位、259位、154位、125位、261位、263位、106位、103位、355位、96位、66位、67位、70位、100位、110位、113位、114位和156位中的氨基酸对应的位置具有1个或更多的氨基酸残基的取代的阿马多里酶,根据本发明,即便是在ε-果糖基赖氨酸的存在下,也能够正确测定来自糖化血红蛋白的β链氨基末端的α-果糖基缬氨酰基组氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及底物特异性得到改变的阿马多里酶、其基因和重组体DNA、以及底物特异性得到改变的阿马多里酶的制造方法。
背景技术
糖化蛋白质是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶方式形成共价键并进行阿马多里重排而生成的。作为蛋白质的氨基,可举出氨基末端的α氨基、蛋白质中的赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为在生物体内产生的糖化蛋白质,已知血液中的血红蛋白被糖化而成的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化而成的糖化白蛋白等。
这些在生物体内产生的糖化蛋白质中,在糖尿病的临床诊断领域中,作为用于糖尿病患者的诊断、症状管理的重要的血糖对照标记,糖化血红蛋白(HbA1c)受到关注。血液中的HbA1c浓度反映过去的一定期间的平均血糖值,其测定值在糖尿病症状的诊断、管理中成为重要的指标。
作为迅速且简便地测定该HbA1c的方法,提出了使用阿马多里酶的酶方法,即,将HbA1c用蛋白酶等分解,对从其β链氨基末端游离的α-果糖基缬氨酰基组氨酸(以下表示为αFVH)、或α-果糖基缬氨酸(以下表示为αFV)进行定量的方法(例如,参照专利文献1~6)。实际上,从HbA1c切出αFV的方法被认为夹杂物等带来的影响大,特别是现在测定αFVH的方法成为主流。
阿马多里酶催化如下反应:在氧存在的条件下,将亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“阿马多里化合物”)氧化,生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽、以及过氧化氢。
就阿马多里酶而言,从细菌、酵母、真菌中发现,而作为特别是对HbA1c的测定有用的具有对αFVH和/或αFV的酶活性的阿马多里酶,例如报告了来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、节菱孢(Arthrinium)属、弯孢(Curvularia)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属的阿马多里酶(例如,参照专利文献1、7~11,非专利文献1~4)。应予说明,上述报告例中,根据文献不同,阿马多里酶有时也被记载为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等表达。
利用酶方法的HbA1c的测定中,作为阿马多里酶的性质要求严格的底物特异性。例如,如上所述,通过将游离的αFVH进行定量而实施HbA1c的测定时,优选使用对于在样品中以游离状态存在的、和/或在使用了蛋白酶等的HbA1c的处理工序中游离的除了αFVH以外的糖化蛋白质氨基酸、糖化蛋白质肽难以作用的阿马多里酶。特别是,已知血红蛋白分子中所含的赖氨酸残基侧链的ε位的氨基受到糖化,启示来自该受到糖化的赖氨酸残基的ε位氨基被糖化的ε-果糖基赖氨酸(以下表示为εFK)通过蛋白酶处理等而被游离(例如,参照非专利文献5)。因此,强烈期望难以对可成为测定误差的原因物质的εFK进行作用的、底物特异性高的阿马多里酶。另一方面,以往已知的阿马多里酶的大部分不能说对εFK的反应性充分低。
作为通常的技术,已知为了改变酶的底物特异性,对编码酶的DNA加入变异,对酶的氨基酸导入取代,选拔具备目标底物特异性的酶的方法。另外,在同源性高的酶中,在已知通过氨基酸取代而提高底物特异性这样的例子的情况下,也可以基于该信息来预想底物特异性的提高。
实际上,关于来自棒弯孢(Curvularia clavata)YH923的酮胺氧化酶以及来自侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)474的酮胺氧化酶,示出了通过取代多个氨基酸而提高了对αFVH的底物特异性的改变型酮胺氧化酶(参照专利文献1)。例如,在来自棒弯孢YH923的酮胺氧化酶中,通过将58位的异亮氨酸取代为缬氨酸、将62位的精氨酸取代为组氨酸、将330位的苯丙氨酸取代为亮氨酸,从而对ε-果糖基-(α-苄氧基羰基赖氨酸)(以下表示为εFZK)的酶活性除以对αFVH的酶活性而导出的活性比εFZK/αFVH显示出从0.95向0.025减少。
但是,就在上述文献中被用于评价改变型酮胺氧化酶的底物特异性的εFZK而言,与在将糖化血红蛋白用蛋白酶进行处理的工序中实际产生的εFK相比,在分子量、结构方面是相当不同的化合物。因此,难以根据对εFZK的反应性减少而说明对可成为实际测定误差的原因物质的εFK的反应性减少。另外,也没有记载使用上述文献中的改变型酮胺氧化酶来确认对εFK的反应性的减少的内容。
除此以外,还报告了通过对来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)A89的果糖基氨基酸氧化酶导入氨基酸取代来改变底物特异性,从而新赋予了对αFVH的反应性的改变型果糖基氨基酸氧化酶(例如,参照专利文献10)。例如,显示了将来自构巢曲霉A89的果糖基氨基酸氧化酶的59位的丝氨酸取代为甘氨酸、且将65位的赖氨酸取代为甘氨酸,或将109位的赖氨酸取代为谷氨酰胺,从而对αFVH新赋予酶活性。但是,并没有记载该氨基酸取代有助于对εFK的反应性的减少。
另外,除此以外,还报告了通过对来自构巢曲霉A89的果糖基氨基酸氧化酶导入氨基酸取代来改变底物特异性,从而使对εFK的酶活性除以对αFV的酶活性而得到的活性比εFK/αFV减少的改变型果糖基氨基酸氧化酶(例如,参照专利文献12)。但是,对于该改变酶的对αFVH的酶活性没有任何提及。
即,就包括天然型或变异型阿马多里酶在内的对εFK的酶活性除以对αFVH的酶活性而导出的活性比εFK/αFVH低和/或εFK/αFV低的阿马多里酶的例子而言,迄今为止仅有极少报告,依然要求能够实现精度高的HbA1c的测定的、对εFK的反应性充分低的阿马多里酶。
专利文献1:国际公开第2004/104203号
专利文献2:国际公开第2005/49857号
专利文献3:日本特开2001-95598号公报
专利文献4:日本特公平05-33997号公报
专利文献5:日本特开平11-127895号公报
专利文献6:国际公开第97/13872号
专利文献7:日本特开2003-235585号公报
专利文献8:日本特开2004-275013号公报
专利文献9:日本特开2004-275063号公报
专利文献10:日本特开2010-35469号公报
专利文献11:日本特开2010-57474号公报
专利文献12:日本特开2010-104278号公报
非专利文献
非专利文献1:Biochem.Biophys.Res.Commun.311,104-11,2003
非专利文献2:Biotechnol.Bioeng.106,358-66,2010
非专利文献3:J.Biosci.Bioeng.102,241-3,2006
非专利文献4:Eur.J.Biochem.242,499-505,1996
非专利文献5:J.Biol.Chem.279,27613-20,2004
发明内容
本发明所要解决的课题是提供对εFK的反应性低,具体而言,εFK/αFVH低、和/或εFK/αFV低的阿马多里酶。
本发明的发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究,结果发现通过将来自锥毛壳属的阿马多里酶中的特定氨基酸残基取代为特定氨基酸残基,能够解决上述课题,从而完成了本发明。
即,本发明如下。
(1)一种阿马多里酶,具有以下(a)和/或(b)的性质:
(a)具有在序列号1所示的氨基酸序列进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加、和/或取代的氨基酸序列,与具有序列号1所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少。
(b)具有在序列号1所示的氨基酸序列进行了1个或多个氨基酸的缺失、插入、添加、和/或取代的氨基酸序列,与具有序列号1所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。
(2)一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号1所示的氨基酸序列与选自以下(c)至(s)中的氨基酸对应的位置具有1个或更多的氨基酸残基的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。
(c)98位的谷氨酸
(d)259位的缬氨酸
(e)154位的丝氨酸
(f)125位的组氨酸
(g)261位的酪氨酸
(h)263位的甘氨酸
(i)106位的天冬氨酸
(j)103位的甘氨酸
(k)355位的丙氨酸
(l)96位的天冬氨酸
(s)66位的赖氨酸或/和67位的缬氨酸
(m)70位的谷氨酰胺
(o)100位的苏氨酸
(p)110位的谷氨酰胺
(q)113位的丙氨酸
(r)114位的亮氨酸
(s)156位的天冬氨酸
(3)一种阿马多里酶,其特征在于,序列号1所示的氨基酸序列的氨基酸的与选自以下(t)至(aj)中的1个或更多的氨基酸对应的位置的氨基酸被取代为以下(t)至(aj)的各项中记载的取代后的氨基酸残基,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少:
(t)98位的谷氨酸被脯氨酸以外的氨基酸、即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸所取代;
(u)259位的缬氨酸被丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸所取代;
(v)154位的丝氨酸被甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸所取代;
(w)125位的组氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代;
(x)261位的酪氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸所取代;
(y)263位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代;
(z)106位的天冬氨酸被分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺所取代;
(aa)103位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸所取代;
(ab)355位的丙氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代;
(ac)96位的天冬氨酸被丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸所取代;
(ad)66位的赖氨酸被甘氨酸或/和67位的缬氨酸被脯氨酸所取代;
(ae)70位的谷氨酰胺被脯氨酸所取代;
(af)100位的苏氨酸被精氨酸所取代;
(ag)110位的谷氨酰胺被丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代;
(ah)113位的丙氨酸被谷氨酸、赖氨酸所取代;
(ai)114位的亮氨酸被赖氨酸、精氨酸所取代;
(aj)156位的天冬氨酸被天冬酰胺所取代。
(4)根据上述(3)所述的阿马多里酶,其中,在序列号1所示的氨基酸序列中具有选自以下(ba)至(be)中的氨基酸残基的取代:
(ba)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;
(bb)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺;
(bc)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸;
(bd)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;
(be)与110位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。
(5)一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号272所示的氨基酸序列中具有与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的取代、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸向天冬酰胺的取代、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,且与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。
(6)一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号241所示的氨基酸序列中具有选自以下(ca)至(cc)中的氨基酸残基的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,且与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少:
(ca)与98位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与110位的赖氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;
(cb)与98位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;
(cc)与110位的赖氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。
(7)一种阿马多里酶基因,编码上述(1)~(6)中任一项所述的氨基酸序列。
(8)一种重组载体,包含上述(7)所述的阿马多里酶基因。
(9)一种宿主细胞,包含上述(8)所述的重组载体。
(10)一种制造阿马多里酶的方法,包括以下工序:
(ak)培养上述(6)所述的宿主细胞的工序;
(al)使宿主细胞所含的阿马多里酶基因表达的工序;以及
(am)从培养物分离阿马多里酶的工序。
(11)一种用于测定糖化血红蛋白的试剂盒,其中,包含上述(1)~(6)中任一项所述的阿马多里酶。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-176967号以及2010-213070号的说明书和/或附图中记载的内容。
根据本发明,能够提供可作为糖尿病的诊断用酶、另外能够被有效地用于糖尿病标记物测定试剂盒的底物特异性优异的阿马多里酶,具体而言,能够提供εFK/αFVH低、和/或εFK/αFV低的阿马多里酶。
附图说明
图1是例示各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列中的同源性的图。
图2是表示利用本发明的阿马多里酶的αFVH定量性的图表。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
(阿马多里酶)
阿马多里酶也被称为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶,是指在氧存在的条件下,催化将亚氨基二乙酸或其衍生物(阿马多里化合物)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽、以及过氧化氢的反应的酶。阿马多里酶在自然界广泛分布,可通过探索微生物、动物或植物起源的酶而获得。在微生物中,例如,可由丝状菌、酵母或细菌等获得。
本发明的阿马多里酶是基于具有序列号1所示的氨基酸序列的来自锥毛壳属的阿马多里酶而制作的、底物特异性得到改变的阿马多里酶的改变体。作为这样的变异体的例子,可举出具有与序列号1具有高的序列同源性(例如,75%以上,优选为80%以上,更优选为85%以上,进一步优选为90%以上,进一步优选为95%以上,进一步优选为97%以上,最优选为99%以上)的氨基酸序列的阿马多里酶,以及具有在序列号1的氨基酸序列中,1个至多个氨基酸被改变或变异、或缺失、取代、添加和/或插入而得的氨基酸序列的阿马多里酶。应予说明,只要是满足与专利请求保护范围中记载的底物特异性和/或氨基酸序列相关的条件,也可以是基于来自例如正青霉属、节菱孢属、弯孢属、小球腔菌属、新赤壳菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、棘壳孢属、曲霉属、隐球菌属、暗球腔菌属、细基格孢属、或青霉属这样的其它生物种类的阿马多里酶而制作的。
底物特异性得到改变的阿马多里酶的改变体可通过在阿马多里酶的氨基酸序列中至少取代1个氨基酸残基而获得。
作为带来底物特异性的改变的氨基酸的取代,可举出与序列号1所示的氨基酸序列中的以下位置的氨基酸对应的位置的氨基酸的取代。
(1)98位的谷氨酸的取代,例如,被取代为脯氨酸以外的氨基酸,即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
(2)259位的缬氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸。
(3)154位的丝氨酸的取代,例如,被取代为甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸。
(4)125位的组氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸。
(5)261位的酪氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸。
(6)263位的甘氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
(7)106位的天冬氨酸的取代,例如,被取代为分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺。
(8)103位的甘氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
(9)355位的丙氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
(10)96位的天冬氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸。
(11)66位的赖氨酸的取代,例如,被取代为甘氨酸。
(12)67位的缬氨酸的取代,例如,被取代为脯氨酸。
(13)70位的谷氨酰胺的取代,例如,被取代为脯氨酸。
(14)100位的苏氨酸的取代,例如,被取代为精氨酸。
(15)110位的谷氨酰胺的取代,例如,被取代为丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸。
(16)113位的丙氨酸的取代,例如,被取代为谷氨酸、赖氨酸。
(17)114位的亮氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸。
(18)156位的天冬氨酸的取代,例如,被取代为天冬酰胺。
底物特异性得到改变的阿马多里酶的变异体只要至少具有1个上述氨基酸取代即可,也可以具有多个氨基酸取代。例如,具有上述氨基酸取代中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个。
其中,优选具有与以下氨基酸的位置对应的氨基酸的取代的变异体。在本发明中,例如,将第110位的谷氨酰胺(Q)被取代为精氨酸(R)的变异表示为Q110R。
66位的赖氨酸和67位的缬氨酸的取代,例如,具有K66G和V67P的变异体。
66位的赖氨酸、67位的缬氨酸和98位的谷氨酸的取代,例如,具有K66G、V67P和E98A的变异体。
66位的赖氨酸、67位的缬氨酸和110位的谷氨酰胺的取代,例如,具有K66G、V67P和Q110R的变异体。
98位的谷氨酸和110位的谷氨酰胺的取代,例如,具有E98A和Q110R的变异体。
110位的谷氨酰胺和125位的组氨酸的取代,例如,具有Q110R和H125Q的变异体。
110位的谷氨酰胺和154位的丝氨酸的取代,例如,具有Q110R和S154G或S154N的变异体。
110位的谷氨酰胺和355位的丙氨酸的取代,例如,具有Q110R和A355K的变异体。
98位的谷氨酸和103位的甘氨酸的取代,例如,具有E98A和G103R的变异体。
98位的谷氨酸和154位的丝氨酸的取代,例如,具有E98A或E98R和S154N的变异体。
110位的谷氨酰胺和154位的丝氨酸的取代,例如,具有Q110R和S154C的变异体。
98位的谷氨酸、106位的天冬氨酸和154位的丝氨酸的取代,例如,具有E98A、D106S和S154N的变异体。
98位的谷氨酸、110位的谷氨酰胺和154位的丝氨酸的取代,例如,具有E98A、Q110R和S154N的变异体。
110位的谷氨酰胺、125位的组氨酸和154位的丝氨酸的取代,例如,具有Q110R、H125Q和S154N的变异体。
98位的谷氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有E98Q和V259A、E98Q和V259C、E98H和V259A、E98H和V259C、E98R和V259C、E98A和V259C的变异体。
98位的谷氨酸和263位的甘氨酸的取代,例如,具有E98A和G263R的变异体。
110位的谷氨酰胺和259位的缬氨酸的取代,例如,具有Q110R和V259A的变异体。
154位的丝氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有S154D和V259A的变异体。
98位的谷氨酸、154位的丝氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有E98A、S154N和V259C的变异体。
110位的谷氨酰胺、154位的丝氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有Q110R、S154N和V259A的变异体。
在这些氨基酸取代的组合中,优选以下(ba)~(be)中的任一组合。
(ba)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。
(bb)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺。
(bc)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。
(bd)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。
(be)与110位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。
本发明的底物特异性得到改变的阿马多里酶变异体包含由如下的氨基酸序列构成、具有阿马多里酶活性且底物特异性得到改变的阿马多里酶变异体,所述氨基酸序列在序列号1所示的氨基酸序列中具有带来上述底物特异性的改变的氨基酸的取代,在这些取代氨基酸以外的位置,进一步缺失、插入、添加和/或取代有1个或多个(例如1~10个、优选为1~5个、进一步优选为1~3个、特别优选为1个)氨基酸。进而,包含由如下的氨基酸序列构成、具有阿马多里酶活性且底物特异性得到改变的阿马多里酶变异体,所述氨基酸序列具有带来上述底物特异性的改变的氨基酸的取代变异、使耐热性提高的氨基酸的取代变异,相对于序列号1所示的氨基酸序列中的将该取代了的氨基酸以外的氨基酸排除的部分的氨基酸序列,具有90%以上、进一步优选为95%以上、进一步优选为97%以上、特别优选为99%以上的氨基酸序列同源性。
在上述氨基酸取代中,氨基酸的位置表示序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置,在来自其它生物种类的阿马多里酶的氨基酸序列中,与序列号1所示的氨基酸序列中的位置对应的位置的氨基酸被取代。对于“对应位置”的含义在后叙述。
(编码阿马多里酶的基因的取得)
为了得到编码这些阿马多里酶的本发明的基因(以下,仅称为“阿马多里酶基因”),通常使用一般使用的基因的克隆方法。例如,可以由具有阿马多里酶生产能力的微生物菌体、各种细胞,利用常规方法,例如Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)记载的方法,提取染色体DNA或mRNA。进而,可以将mRNA作为模板来合成cDNA。使用这样得到的染色体DNA或cDNA,能够制作染色体DNA或cDNA的文库。
接下来,基于上述阿马多里酶的氨基酸序列,合成适当的探针DNA,利用其从染色体DNA或cDNA的文库中选拔阿马多里酶基因的方法、或者基于上述氨基酸序列,制作适当的引物DNA,通过5’RACE法、3’RACE法等适当的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction、PCR法)来扩增包含编码阿马多里酶的目标基因片段的DNA,使这些DNA片段连结,能够得到包含目标阿马多里酶基因的全长的DNA。
作为这样得到的编码阿马多里酶的基因的优选的一个例子,可举出来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(专利文献7)。
从操作方面考虑,优选这些阿马多里酶基因按照常规方法与各种载体连结。例如,由包含对来自锥毛壳属NISL9330株的阿马多里酶基因进行编码的DNA的重组体质粒pKK223-3-CFP(专利文献7),通过用QIAGEN(QIAGEN公司制),能够提取、纯化对阿马多里酶基因进行编码的DNA。
(载体)
作为能够在本发明中使用的载体,不限于上述质粒,可以使用除此以外的例如噬菌体、粘粒等本领域技术人员公知的任意载体。具体而言,例如,优选pBluescriptII SK+(STRATAGENE公司制)等。
(阿马多里酶基因的变异处理)
阿马多里酶基因的变异处理可以用与意图的变异形态相应的公知的任意方法来进行。即,可以广泛使用使阿马多里酶基因或整合了该基因的重组体DNA与成为变异原的药剂接触·作用的方法;紫外线照射法;基因工程学手段;或运用蛋白质工程学手段的方法等。
作为成为在上述变异处理中使用的变异原的药剂,例如,可举出羟基胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼、甲酸、或5-溴尿嘧啶等。
该接触·作用的各种条件可以采用与所使用的药剂的种类等相应的条件,只要是在现实中能够在阿马多里酶基因中引起所期望的变异就没有特别限定。通常,优选在0.5~12M的上述药剂浓度中,在20~80℃的反应温度下接触·作用10分钟以上、优选为10~180分钟,从而能够引起所期望的变异。在进行紫外线照射的情况下,也可以如上所述根据常规方法来进行(现代化学,024~30,1989年6月号)。
作为运用蛋白质工程学手段的方法,一般可以使用作为位点特异性突变(Site-Specific Mutagenesis)而已知的手段。例如,可举出Kramer法(Nucleic Acids Res.,12,9441(1984):Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679(1986))、Kunkel法(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.,82,488(1985):Methods Enzymol.,154,367(1987))等。
另外,也可以使用作为一般的PCR法而已知的手段(Technique,1,11(1989)参照)。应予说明,除了上述基因改变法以外,也可以通过有机合成法或酶合成法来直接合成所期望的改变阿马多里酶基因。
在进行由上述方法得到的阿马多里酶基因的DNA碱基序列的确定或确认的情况下,例如,可以通过使用多毛细管DNA解析系统CEQ2000(Beckman Coulter公司制)等来进行。
(转化·转导)
可以将上述得到的阿马多里酶基因利用常规方法导入噬菌体、粘粒、或者被用于原核细胞或真核细胞的转化的质粒等载体中,将与各个载体对应的宿主利用常规方法进行转化或转导。例如,使用例如得到的重组体DNA,将作为宿主的属于埃希氏菌属的微生物,例如大肠杆菌K-12株、优选为大肠杆菌JM109株、大肠杆菌DH5α株(同为TakaraBio公司制)等进行转化或转导至它们中,得到各种菌株。
(氨基酸序列的同源性)
氨基酸序列的同源性可以利用GENETYX-Mac(SoftwareDevelopment公司制)的最大匹配、同源性检索等程序,或DNASIS Pro(Hitachi Soft制)的最大匹配、多序列比对等程序来进行计算。
(与氨基酸对应的位置的确定)
“与氨基酸对应的位置”是指与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列的特定位置的氨基酸对应的来自其它生物种类的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。
作为确定“与氨基酸对应的位置”的方法,可以如下进行:使用例如Lipman-Pearson法等公知的算法来比较氨基酸序列,对各阿马多里酶的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基赋予最大的同源性。通过将阿马多里酶的氨基酸序列用这种方法进行排列,可以不管氨基酸序列中存在的插入、缺失,都能够确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列中的序列中位置。认为相同位置是在三维结构中存在于同一位置,关于作为对象的阿马多里酶的特异性功能,能够推定具有类似效果。图1中表示来自各种生物种类的阿马多里酶的序列的比对。由图1可知与来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列的特定位置的氨基酸对应的来自其它生物种类的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。图1中表示来自锥毛壳属的阿马多里酶、来自土正青霉(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶、来自棘壳孢属(Pyrenochaeta sp.)的酮胺氧化酶、来自节菱孢属(Arthrinium sp.)的酮胺氧化酶、来自棒弯孢(Curvularia clavata)的酮胺氧化酶、来自侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)的酮胺氧化酶、来自新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的果糖基氨基酸氧化酶、来自颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基肽氧化酶、来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的果糖基氨基酸氧化酶、来自细基格孢属(Ulocladium sp.)的果糖基氨基酸氧化酶和来自微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶的氨基酸序列。
应予说明,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的66位的赖氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为66位的甘氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为66位的赖氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为66位的脯氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为66位的赖氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为66位的赖氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的脯氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为66位的脯氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为65位的赖氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的赖氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的甘氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的67位的缬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的67位的缬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为67位的脯氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为67位的缬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为67位的缬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的脯氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为67位的缬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为67位的脯氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的70位的谷氨酰胺对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的70位的谷氨酰胺对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为70位的谷氨酰胺,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为69位的谷氨酰胺,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为70位的谷氨酰胺。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的96位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为96位的天冬氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为95位的天冬氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为96位的天冬氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的98位的谷氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为98位的丝氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为98位的丙氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为98位的谷氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为98位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为98位的谷氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为98位的丙氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为98位的丙氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为97位的丝氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为98位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为98位的丝氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的100位的苏氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为100位的丝氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为100位的甘氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为100位的苏氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为100位的甘氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为100位的丝氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为100位的苏氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为100位的甘氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为99位的苏氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为100位的甘氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为100位的丝氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸对应的位置”是指将将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的103位的甘氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为103位的甘氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为103位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为103位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为102位的甘氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为103位的甘氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为103位的甘氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的106位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为106位的天冬酰胺,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为106位的丙氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为106位的甘氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为106位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为105位的甘氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为106位的丝氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的110位的谷氨酰胺对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为110位的赖氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为110位的丙氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为110位的谷氨酰胺,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为110位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为110位的谷氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为110位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为110位的甘氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为109位的赖氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为110位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为110位的赖氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的113位的丙氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为113位的苏氨酸、来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为113位的苏氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为113位的苏氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为113位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为113位的赖氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的丙氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为113位的丙氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为112位的丝氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的天冬氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的114位的亮氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为114位的亮氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为114位的异亮氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为114位的亮氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的亮氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为114位的亮氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为114位的亮氨酸。
另外,“与序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为125位的天冬酰胺,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为125位的天冬酰胺,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为125位的苏氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为125位的苏氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为125位的组氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为125位的组氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为123位的天冬酰胺,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为124位的天冬酰胺,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为125位的苏氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为125位的天冬酰胺。
另外,“与序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的154位的丝氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为154位的半胱氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为154位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为152位的丝氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为153位的半胱氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为154位的丝氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为154位的半胱氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的156位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的156位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为156位的天冬氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为156位的谷氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为154位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为155位的天冬氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为156位的天冬氨酸。
另外,“与序列号1记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的259位的缬氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为259位的缬氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为257位的缬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为259位的缬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为257位的缬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为259位的缬氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的缬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为255位的缬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的缬氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为257位的缬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的缬氨酸。
另外,“与序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的261位的酪氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为261位的酪氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为259位的酪氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为261位的酪氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为259位的酪氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为261位的酪氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的酪氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为257位的酪氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的酪氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的酪氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的酪氨酸。
另外,在本发明中,“与序列号1记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的263位的甘氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为263位的甘氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为261位的甘氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为263位的甘氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为261位的甘氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为263位的甘氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为263位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为259位的甘氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为263位的甘氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的甘氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为263位的甘氨酸。
另外,“与序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号1的阿马多里酶的355位的丙氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。
即,来自土正青霉的阿马多里酶中为355位的丙氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为353位的丙氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为356位的丙氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为353位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为355位的丝氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为355位的丙氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为351位的丙氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为355位的丙氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为353位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为355位的丙氨酸。
(本发明的阿马多里酶的生产)
使用具有上述得到的底物特异性得到改善的阿马多里酶的生产能力的菌株生产该阿马多里酶时,可以将该菌株用通常的固体培养法来进行培养,但优选尽可能采用液体培养法来进行培养。
另外,作为培养上述菌株的培养基,例如可以使用如下得到的培养基,即,在酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆或小麦麸的浸出液等1种以上的氮源中添加氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等无机盐类中的1种以上,另外根据需要而适当添加糖质原料、维生素等。
应予说明,培养基的初始pH优选调整为pH7~9。
优选如下实施培养,即,利用通气搅拌式深部培养、振荡培养、静置培养等在20~42℃的培养温度、优选为37℃左右的培养温度下实施4~24小时,进一步优选在37℃左右的培养温度下实施4~8小时。
培养结束后,由该培养物采集阿马多里酶时可以使用通常的酶采取手段。例如,可利用常规方法将菌体进行超声波破坏处理、磨碎处理等,或溶菌酶等溶解酶提取本酶,或在甲苯等存在的条件下振荡或放置而进行溶菌,使本酶排出到菌体外。然后,将该溶液进行过滤、离心分离等而除去固态部分,根据需要利用链霉素硫酸盐、鱼精蛋白硫酸盐、或硫酸锰等除去核酸后,向其中添加硫酸铵、醇、丙酮等而分离,采集沉淀物,得到阿马多里酶的粗酶。
为了由上述阿马多里酶的粗酶进一步得到阿马多里酶纯化酶标准品,例如可以将使用葡聚糖凝胶、Superdex或Ultrogel等的凝胶过滤法;使用离子交换体的吸附溶出法;使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法;使用羟基磷灰石的吸附溶出法;蔗糖密度梯度离心法等沉降法;亲和层析法;使用分子筛膜或中空丝膜等的分离法等进行适当选择,或将它们组合而实施,从而能够得到纯化的阿马多里酶酶标准品。这样能够得到所期望的底物特异性得到改善的阿马多里酶。
(本发明的阿马多里酶中的对εFK的反应性的降低)
用上述手段得到的本发明的阿马多里酶的特征是通过基因改变等,在其氨基酸序列产生变异,结果与改变前的阿马多里酶相比较,提高了底物特异性。具体而言,其特征是与改变前的阿马多里酶相比较,“对εFK的反应性”相对于“对αFVH的反应性”的比例、或者“对εFK的反应性”相对于“对αFV的反应性”的比例减少。或者,其特征是与改变前的阿马多里酶相比较,“对εFK的反应性”相对于“对αFVH的反应性”的比例、以及“对εFK的反应性”相对于“对αFV的反应性”的比例均减少。
在糖化血红蛋白的测定中,对εFK的反应性高可成为测定误差的原因,因此对εFK的反应性的比例越低越好。具体而言,优选本发明的阿马多里酶中的显示对εFK的反应性相对于对αFVH的反应性的比例的εFK/αFVH相对于改变前减少10%以上、优选为20%以上、更优选为30%以上、进一步优选为40%以上。
另外,优选本发明的阿马多里酶中的显示对εFK的反应性相对于对αFV的反应性的比例的εFK/αFV相对于改变前减少10%以上、优选为20%以上、更优选为30%以上、进一步优选为40%以下。
对εFK的反应性相对于对αFVH的反应性的比例、或者对εFK的反应性相对于对αFV的反应性的比例能够用公知的阿马多里酶的测定法,在任意条件下测定,并与改变前的阿马多里酶进行比较。例如,可通过求出pH7.0时,添加5mM的εFK而测定的活性除以添加5mM的αFVH而测定的活性的比率,从而算出对εFK的反应性相对于对αFVH的反应性的比例,将其以改变前的情形与改变后的情形进行比较。另外,例如,可通过求出pH7.0时,添加5mM的εFK而测定的活性除以添加5mM的αFV而测定的活性的比率,从而算出对εFK的反应性相对于对αFV的反应性的比例,用将其比较改变前的情形与改变后的情形进行比较。
作为与改变前相比底物特异性提高的本发明的阿马多里酶的一个例子,例如可举出由大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-Y261W)株生产的阿马多里酶。这样的底物特异性得到改善的阿马多里酶能够良好地减少将εFK作为噪声而测量到的程度,仅测定属于来自HbA1c的β链氨基末端的糖化蛋白质氨基酸的αFVH、或属于来自HbA1c的β链氨基末端的糖化蛋白质氨基酸的αFV,因此能够进行精度高的测定,在产业利用上非常有利。
(阿马多里酶活性的测定方法)
作为阿马多里酶的活性的测定方法,可以使用各种方法,作为一个例子,下面,对本发明中使用的阿马多里酶活性的测定方法进行说明。
作为本发明中的阿马多里酶的酶活性的测定方法,可举出测定由酶反应而生成的过氧化氢量的方法、测定由酶反应而消耗的氧量的方法等作为主要测定方法。下面,作为一个例子,示出测定过氧化氢量的方法。
对于本发明中的阿马多里酶的活性测定,除非另有说明,将αFVH、或εFK、或αFV用作底物。应予说明,就酶效价而言,将αFVH、或εFK、或αFV作为底物来进行测定时,将1分钟生成1μmol过氧化氢的酶量定义为1U。
εFK等的糖化蛋白质氨基酸、以及αFVH等的糖化蛋白质肽例如可以使用基于阪上等的方法而合成、纯化的产物(参照日本特开2001-95598号公报)。
A.:试剂的制备
(1)试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液
将5.0kU的过氧化酶(KIKKOMAN公司制)、100mg的4-氨基安替比林(东京化成公司制)溶解于0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0或pH7.5或pH8.0),定容至1000ml。
(2)试剂2:TOOS溶液
将500mg的TOOS(同仁化学研究所制)溶解于离子交换水,定容至100ml。
(3)试剂3:底物溶液(150mM;终浓度5mM)
将αFVH625mg、或εFK462mg或αFV419mg溶解于离子交换水,定容至10ml。
B:活性测定法
将2.7ml的试剂1、100μl的试剂2和100μl的酶液混合,在37℃下预加热5分钟。然后,加入100μl的试剂3,充分混合后,利用分光光度计(U-3010A,Hitachi High Technologies公司制)测定555nm下的吸光度。测定值为555nm下的1分钟后至2分钟后的每1分钟的吸光度变化。应予说明,对照液除了代替100μl的试剂3而加入100μl的离子交换水以外与上述相同。使用将其预先制作的过氧化氢的标准溶液来代替试剂3,另外,代替酶液,使用离子交换水,从而准备调查了与其生成色素量的关系的图表。利用该图表,计算37℃下、每1分钟生成的过氧化氢的微摩尔数,将该数值作为酶液中的活性单位。
以下,通过实施例进一步具体说明本发明。但是,本发明的技术范围不限于这些例子。
实施例1
(1)重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA的制备
将具有来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(序列号2)的重组体质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株(参照国际公开第2007/125779号)接种于3ml的LB-amp培养基[1%(w/v)BACTO胰蛋白胨、0.5%(w/v)蛋白胨、0.5%(w/v)NaCl、50μg/ml氨苄青霉素],在37℃下振荡培养16小时,得到培养物。
将该培养物以10000×g离心分离1分钟,从而进行集菌而得到菌体。使用质粒提取试剂盒(GenElute Plasmid Mini-Prep Kit,Sigma-Aldrich公司制),由该菌体提取并纯化重组体质粒pKK223-3-CFP-T7,得到2.5μg的重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA。
(2)重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA的部位特异性改变操作
将得到的重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号3、4的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),用以下条件进行PCR反应。
即,加入10×KOD-Plus-缓冲液5μl、以dNTP成为各2mM的方式制备的dNTPs混合溶液5μl、25mM的MgSO4溶液2μl、成为模板的pKK223-3-CFP-T7DNA50ng、上述合成寡核苷酸各15pmol、1个单位的KOD-Plus-,利用灭菌水使总量为50μl。将制备的反应液利用热循环仪(Eppendorf公司制)在94℃下孵育2分钟,接着,将“94℃、15秒”-“50℃、30秒”-“68℃、6分钟”的循环重复进行30次。
将反应液的一部分用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,确认了约6000bp的DNA被特异性地扩增。将这样得到的DNA用限制性内切酶DpnI(New England Biolabs公司制)处理,将残存的模板DNA切断后,转化大肠杆菌JM109,展开于LB-amp琼脂培养基。将生长的菌落接种于LB-amp培养基进行振荡培养,用与上述(1)相同的方法分离质粒DNA。对该质粒中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列利用Multi CapillaryDNA解析系统CEQ2000(Beckman Coulter公司制)进行确定,得到对序列号1记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸被取代为甘氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-K66G)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的67位的缬氨酸取代为脯氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号5、6的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对编码序列号1记载的氨基酸序列的67位的缬氨酸被取代为脯氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-V67P)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸取代为甘氨酸、并将67位的缬氨酸取代为脯氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号7、8的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对编码序列号1记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸被取代为甘氨酸、且67位的缬氨酸被取代为脯氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-K66GV67P)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的70位的谷氨酰胺取代为脯氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号9、10的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对编码序列号1记载的氨基酸序列的70位的谷氨酰胺被取代为脯氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-Q70P)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号11、12的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-D96A)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为谷氨酰胺,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号13、14的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸被取代为谷氨酰胺的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-E98Q)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸取代为精氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号15、16的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸被取代为精氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-T100R)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸取代为精氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号17、18的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸被取代为精氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-G103R)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号19、20的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-D106A)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺取代为丙氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号21、22的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-Q110A)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸取代为谷氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号23、24的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸被取代为谷氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-A113E)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸取代为赖氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号25、26的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸被取代为赖氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-L114K)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸取代为谷氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号27、28的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸被取代为谷氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-H125E)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸取代为谷氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号29、30的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸被取代为谷氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-S154E)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的156位的天冬氨酸取代为天冬酰胺,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号31、32的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的156位的天冬氨酸被取代为天冬酰胺的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-D156N)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号33、34的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFPT7-V259A)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号35、36的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-Y261A)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸取代为精氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号37、38的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸被取代为精氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-G263R)。
接着,为了将序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸取代为赖氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号39、40的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸被取代为赖氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-A355K)。
(3)各种改变型阿马多里酶的生产
将保持由上述步骤得到的上述重组体质粒的各个大肠杆菌JM109株在添加有0.1mM的IPTG的LB-amp培养基3ml中于30℃培养16小时。将得到的各培养菌体用20mM的HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)清洗后,悬浮于上述缓冲液中并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,制备了用于确认底物特异性的酶液0.6ml。
(4)εFK/αFVH、εFK/αFV的测定
使用上述酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性。另外,为了比较,对于由大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株生产的改变前的阿马多里酶也进行同样的测定。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。
其结果是,由上述酶活性测定的结果得到的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株所生产的改变前的阿马多里酶的εFK/αFVH为0.316,εFK/αFV为0.093。
与此相对,将通过导入部位特异性变异而制作的改变后的各种阿马多里酶的εFK/αFVH、εFK/αFV、以及改变前的阿马多里酶的εFK/αFVH、εFK/αFV的值为100%时的改变后的阿马多里酶的εFK/αFVH、εFK/αFV的比率如表1所示。
表1
即,如表1所示,可知在上述全部的改变型阿马多里酶中,底物特异性得以改善。
实施例2
(96位的天冬氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表2所示的合成寡核苷酸(序列号41~46)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表2。
表2
如表2所示,将序列号1记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸取代为丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、组氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例3
(98位的谷氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表3所示的合成寡核苷酸(序列号47~82)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),,在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表3。
表3
如表3所示,将序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为脯氨酸以外的其它氨基酸,即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。应予说明,将序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为脯氨酸时,未看到酶的表达。
实施例4
(103位的甘氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表4所示的合成寡核苷酸(序列号83、84、255、256)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表4。
表4
如表4所示,将序列号1记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸取代为精氨酸、赖氨酸、组氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例5
(106位的天冬氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表5所示的合成寡核苷酸(序列号85~100)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表5。
表5
如表5所示,将序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸取代为分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例6
(110位的谷氨酰胺的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表6所示的合成寡核苷酸(序列号101~118)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表6。
表6
如表6所示,将序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺取代为丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,将110位的谷氨酰胺取代为丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。可知上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。另一方面,将序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺取代为谷氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH、εFK/αFV均高于改变前的值0.316、0.093。
实施例7
(113位的丙氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表7所示的合成寡核苷酸(序列号119、120)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸被赖氨酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将这样得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B.活性测定法所示的方法测定对αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表7。
表7
如表7所示,将序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸取代为谷氨酸、赖氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均低于改变前的值0.316,上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例8
(114位的亮氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表8所示的合成寡核苷酸(序列号121~124)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将这样得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B.活性测定法所示的方法测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表8。
表8
如表8所示,将序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸取代为赖氨酸、精氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。另一方面,将序列号1记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸取代为谷氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH高于改变前的值0.316。
实施例9
(125位的组氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表9所示的合成寡核苷酸(序列号125~134、257~260)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将这样得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B.活性测定法所示的方法测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表9。
表9
如表9所示,将序列号1记载的氨基酸序列的125位的组氨酸取代为谷氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,将125位的组氨酸取代为天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例10
(154位的丝氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表10所示的合成寡核苷酸(序列号135~150)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将这样得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B.活性测定法所示的方法测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表10。
表10
如表10所示,将序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸取代为谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、半胱氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。另一方面,将序列号1记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸取代为丙氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH与改变前的值0.316大致相同,没有发现降低。
实施例11
(259位的缬氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表11所示的合成寡核苷酸(序列号151~154)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表11。
表11
如表11所示,将序列号1记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸取代为丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例12
(261位的酪氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表12所示的合成寡核苷酸(序列号155~162)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将这样得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B.活性测定法所示的方法测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表12。
表12
如表12所示,将序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸取代为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,将261位的酪氨酸取代为苯丙氨酸、色氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例13
(263位的甘氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表13所示的合成寡核苷酸(序列号163、164、261~266)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表13。
表13
如表13所示,将序列号1记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸取代为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例14
(355位的丙氨酸的点变异试验)
将对底物特异性的提高效果高的序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸取代为其它氨基酸,尝试底物特异性优异的改变型阿马多里酶的探索。将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用表14所示的合成寡核苷酸(序列号165~168、267~270)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到生产序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸被各种氨基酸所取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将这样得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B.活性测定法所示的方法测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表14。
表14
如表14所示,将序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均为比改变前的值0.316低的值,另外,将355位的丙氨酸取代为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFV均为比改变前的值0.093低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例15
(对底物特异性改善有效的变异的蓄积)
将表15所示的各种重组体质粒DNA作为模板,使用合成寡核苷酸(序列号7、8、17、18、39、40、51、52、55、56、87、88、115、116、131、132、135、136、139、140)、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述(2)相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109株的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到在序列号1记载的氨基酸序列中导入了表15中的“氨基酸变异”栏中记载的多个氨基酸取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表15。
表15
对于导入了表15所示的多重氨基酸取代的改变型阿马多里酶而言,与单独导入了各氨基酸取代的情况相比,εFK/αFVH、εFK/αFV均为低值。因此,明确了通过将对序列号1所示的阿马多里酶的底物特异性改善有效的单一变异进行组合,能够预计进一步的底物特异性的改善。
实施例16
(对底物特异性改善有效的变异的蓄积)
将表16所示的使用质粒L和S用限制性内切酶KpnI和HindIII进行双重消化,分别利用琼脂糖凝胶电泳由使用的质粒L分离约5.3kbp的DNA片段、由使用的质粒S分离约0.8kbp的DNA片段后,利用NucleoSpin Extract II(Macherey-Nagel公司制)从凝胶中提取并纯化各DNA片段。接着,将两个DNA片段利用Ligation high Ver.2(东阳纺织公司制)进行连结,利用连结的质粒DNA转化大肠杆菌JM109株,进行生长菌落的保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到序列号1记载的氨基酸序列中导入了表16中的“氨基酸变异”栏中记载的多个氨基酸取代的改变型阿马多里酶的大肠杆菌JM109株。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述(3)记载的方法培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表16。
表16
对于导入了表16中的多重氨基酸取代的改变型阿马多里酶而言,与单独导入了各氨基酸取代的情况相比,εFK/αFVH、εFK/αFV均为低值。因此,明确了通过将对序列号1所示的阿马多里酶的底物特异性改善有效的单一变异进行组合,能够预计进一步的底物特异性的改善。
实施例17
(改变型阿马多里酶的生产和纯化)
将生产野生型阿马多里酶和如上述得到的改变型阿马多里酶的转化体、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-Q110R)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-Q110K)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-Y261F)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-Y261W)、大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-E98A/V259C)和大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-E98A/S154N/V259C)接种于添加了0.1mM的IPTG的LB-amp培养基40ml,在30℃下培养16小时。将得到的各培养菌体用20mM的HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)进行清洗后,在上述缓冲液中悬浮菌体并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,制备了粗酶液8ml。
使制备的粗酶液吸附于用20mM HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的4ml的Q Sepharose Fast Flow树脂(GE Healthcare公司制),接着用80ml的上述缓冲液清洗树脂,接着用含有100mM NaCl的20mMHEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)使吸附于树脂的蛋白质溶出,回收显示阿马多里酶活性的组分。
将得到的显示阿马多里酶活性的组分用Amicon Ultra-15、30KNMWL(Millipore公司制)进行浓缩。然后,在用含有150mM NaCl的20mM HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/60Superdex200pg(GE Healthcare公司制)中应用,使其在上述缓冲液中溶出,回收显示阿马多里酶活性的组分,得到野生型和改变型阿马多里酶的纯化标准品。得到的纯化标准品通过利用SDS-PAGE的分析,确认纯化至单一的条带。
使用得到的野生型和改变型阿马多里酶的纯化标准品,测定将αFVH、εFK、αFV作为底物时的酶活性。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表17、表18。应予说明,用于比活性的算出的蛋白质浓度是通过基于Bradford法的比色定量法、或利用280nm下的吸光度的紫外吸收法来进行测定。由利用各定量法测定的蛋白质浓度算出的比活性分别用U/mg、U/A280表示。
表17
表18
如表17所示,将序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺取代为精氨酸、赖氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均显示比改变前的值0.310低的值,另外,将110位的谷氨酰胺取代为精氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFV显示比改变前的值0.092低的值。另外,如表18所示,将序列号1记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸取代为苯丙氨酸、或色氨酸的改变型的阿马多里酶,将序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为丙氨酸、且将259位的缬氨酸取代为半胱氨酸的改变型的阿马多里酶,以及将序列号1记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为丙氨酸、且将154位的丝氨酸取代为天冬酰胺、且将259位的缬氨酸取代为半胱氨酸的改变型的阿马多里酶的εFK/αFVH均显示比改变前的值0.310低的值,另外,εFK/αFV显示比改变前的值0.092低的值。上述氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
另外,使用野生型和各改变型阿马多里酶的纯化标准品测定酶活性而算出的εFK/αFVH、εFK/αFV的值与使用野生型和各改变型阿马多里酶的粗酶液测定酶活性而算出的εFK/αFVH、εFK/αFV的值之间没有发现大的背离。因此,如果使用了改变型阿马多里酶的粗酶液的酶活性的测定中看到了底物特异性的改善,则可以视为在使用了改变型阿马多里酶的纯化酶标准品的酶活性的测定中也能看到底物特异性的改善。
实施例18
(利用改变型阿马多里酶的αFVH的定量)
接着,对用改变型阿马多里酶对通过蛋白酶等从HbA1c的β链氨基末端游离的αFVH进行定量时,共存的εFK对测定值带来的影响进行评价。
C.:试剂的制备
(4)试剂4:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液
将7.5kU的过氧化酶(KIKKOMAN公司制)、150mg的4-氨基安替比林(东京化成公司制)溶解于0.15M的磷酸钾缓冲液(pH6.5),定容至1000ml。
(5)试剂5:TOOS溶液
将500mg的TOOS(同仁化学研究所制)溶解于离子交换水,定容至100ml。
(6)试剂6:阿马多里酶溶液
将纯化的序列号1记载的阿马多里酶、以及将序列号1记载的阿马多里酶的98位的谷氨酸取代为丙氨酸、且将154位的丝氨酸取代为天冬酰胺、且将259位的缬氨酸取代为半胱氨酸的改变型的阿马多里酶(序列号271)用0.01M的磷酸钾缓冲液(pH6.5)进行稀释,分别制备成为1.0U/ml、2.3U/ml。
(7)试剂7:αFVH溶液
将αFVH625mg溶解于离子交换水,并定容至10ml,从而制备了150mM的αFVH溶液。接着,将150mM的αFVH溶液利用离子交换水进行稀释,制备了90μM、180μM、270μM、360μM、450μM的αFVH溶液。
(8)试剂8:血液模型试样
将通过将εFK462mg溶解于离子交换水并定容至10ml而制备的150mM的εFK溶液和(7)中制备的150mM的αFVH溶液用离子交换水稀释,制备了以下4种血液模型溶液。
8-1.215μMαFVH
8-2.215μMαFVH、215μMεFK
8-3.215μMαFVH、1075μMεFK
8-4.215μMαFVH、2150μMεFK
应予说明,在血红蛋白浓度15g/dL、HbA1c6.1%(JDS值,相当于NGSP值6.5%,相当于IFCC值46.5mmol/mol)的血液中,若使血红蛋白的分子量为65kDa,则从HbA1c的β链氨基末端游离的αFVH的浓度为215μM。
(利用改变型阿马多里酶的αFVH的定量性的确认)
将1.8ml的试剂4、100μl的试剂5和100μl的试剂6混和,在37℃下预加热5分钟。然后,加入1000μl的在37℃下预加热5分钟的试剂7并充分混合后,利用分光光度计(U-3010A,Hitachi High Technologies公司制)测定555nm下的吸光度,算出其每1分钟的吸光度变化量(ΔA555)。应予说明,对照液除了代替1000μl的试剂7而加入1000μl的离子交换水以外,与上述相同。将结果示于图2。由图2可知,αFVH浓度与吸光度变化量(ΔA555)的相关关系成立。因此,确认了序列号1记载的阿马多里酶和序列号271记载的改变型阿马多里酶均能够在90μM至450μM的范围用于αFVH的定量。
(利用改变型阿马多里酶的血液模型试样的定量)
将1.8ml的试剂4、100μl的试剂5和100μl的试剂6混和,在37℃下预加热5分钟。然后,加入1000μl的在37℃预加热5分钟的试剂8-1至8-4中的任一种并充分混合后,利用分光光度计(U-3010A、HitachiHigh Technologies公司制)测定555nm下的吸光度,算出其每1分钟的吸光度变化量(ΔA555)。应予说明,对照液除了代替1000μl的试剂8-1至8-4而加入1000μl的离子交换水以外,与上述相同。将结果示于表19。由表19可知,使用序列号1记载的阿马多里酶的情况下,若αFVH与同浓度的εFK共存,则其测定值与本来的测定值相比较,看到了近乎3%的背离,若αFVH的5倍、10倍浓度的εFK共存,则其测定值与本来的测定值相比较,看到了8%、17%的背离。与此相对,在使用了序列号271记载的改变型阿马多里酶的情况下,即便是αFVH的同浓度、5倍浓度的εFK共存,与本来的测定值的背离为近乎1%,另外,即便αFVH的10倍浓度的εFK共存,与本来的测定值的背离为近乎2%。因此,如果使用序列号271记载的改变型阿马多里酶,则即便是εFK共存的试样,也能够正确地仅定量αFVH。
表19
实施例19
(来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因的克隆以及在大肠杆菌中的表达)
(a)从构巢曲霉FGSC A26株中提取总RNA
将构巢曲霉FGSC A26株在液体培养基(0.4%酵母提取物、1.0%麦芽提取物、0.1%胰蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、2.0%葡萄糖、pH6.5)中于30℃培养24小时。培养后,将回收的菌体用液氮粉碎,使用ISOGEN(NIPPON GENE公司制)按照附属的方案制备总RNA。另外,将制备的总RNA用DNaseI(Invitrogen公司制)进行处理,从而防止DNA的混入。
(b)来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶cDNA的克隆
使用得到的总RNA1μg,利用PrimeScript RT-PCR试剂盒(TakaraBio公司制),按照附属的方案进行RT-PCR。此时,在逆转录反应中使用试剂盒附属的Oligo dT引物,在其后的PCR反应中使用了序列号169、170所示的合成寡核苷酸。其结果是,约1300bp的cDNA片段特异性地扩增。接着,对该扩增的cDNA片段进行序列解析,结果得知为由序列号171所示的1317bp构成的碱基序列。另外,由序列号171预测的氨基酸序列(序列号172)与图1的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶的序列一致。
(c)来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的表达
接着,为了使来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶在大肠杆菌中进行表达,进行以下步骤。首先,由于上述克隆而得到的cDNA片段分别在5′末端与3′末端具有来自序列号169、170所示的合成核苷酸的NdeI位点与BamHI位点,所以将克隆而得到的cDNA片段用NdeI与BamHI(Takara Bio公司制)的2种限制性内切酶进行处理,并插入于pET-22b(+)载体(Novagen公司制)的NdeI-BamHI位点,从而取得了重组体质粒pET22b-AnFX′。
接着,为了对来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶赋予果糖基肽氧化酶活性,将重组体质粒pET22b-AnFX′作为模板,使用序列号173、174的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,取得了对序列号172记载的氨基酸序列的59位的丝氨酸被取代为甘氨酸的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-AnFX)。然后,通过将该得到的重组体质粒pET22b-AnFX转化到大肠杆菌BL21(DE3)株(NIPPON GENE公司制),取得了产生来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶的大肠杆菌。
将上述得到的产生来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV的酶活性,结果为2.2U/ml。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。
实施例20
(向来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因导入点变异)
以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―AnFX作为模板,使用序列号175、176的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号172记载的氨基酸序列的153位的半胱氨酸被取代为天冬氨酸的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-AnFX-C153D)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―AnFX作为模板,使用序列号177、178和179、180的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号172记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸被分别取代为丙氨酸、半胱氨酸的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-AnFX-V259A、pET22b-AnFX-V259C)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-AnFX作为模板,使用序列号181、182和183、184的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号172记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸分别取代为赖氨酸、精氨酸的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-AnFX-G263K、pET22b-AnFX-G263R)。
实施例21
(导入了点变异的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶的底物特异性改善效果的评价)
将分别保持上述得到的重组体质粒pET22b-AnFX、pET22b-AnFX-C153D、pET22b-AnFX-V259A、pET22b-AnFX-V259C、pET22b-AnFX-G263K、pET22b-AnFX-G263R的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法测定对αFV、αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。将结果示于表20。
表20
如表20所示,通过将序列号172记载的氨基酸序列的153位的半胱氨酸取代为天冬氨酸、将259位的缬氨酸取代为丙氨酸或半胱氨酸、将263位的甘氨酸取代为赖氨酸或精氨酸,从而来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶的εFK/αFVH和εFK/αFV均为比取代前低的值。因此,可知这些氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例22
(来自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的果糖基氨基酸氧化酶基因的克隆以及在大肠杆菌中的表达)
(a)从产黄青霉NBRC9251株提取总RNA
将产黄青霉NBRC9251株在液体培养基(0.4%酵母提取物、1.0%麦芽提取物、0.1%胰蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、2.0%葡萄糖、pH6.5)中于30℃培养24小时,用与上述相同的步骤制备总RNA。
(b)来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶cDNA的克隆
使用得到的总RNA1μg,与上述同样进行RT-PCR。此时,在逆转录反应中,使用试剂盒附属的Oligo dT引物,在其后的PCR反应中使用序列号185、186所示的合成寡核苷酸。其结果是,约1300bp的cDNA片段特异性地扩增。接着,对该扩增的cDNA片段进行序列解析,结果得知为由序列号187所示的1317bp构成的碱基序列。另外,由序列号187预测的氨基酸序列(序列号188)与图1中记载的微紫青霉菌的序列的第69位的亮氨酸被取代为色氨酸、第142位的苏氨酸被取代为丙氨酸的氨基酸序列一致。
(c)来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的表达
接着,为了使来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶在大肠杆菌中表达,进行以下步骤。首先,由于上述克隆而得到的cDNA片段分别在5′末端与3′末端具有来自序列号185、186所示的合成核苷酸的NdeI位点与BamHI位点,所以将克隆而得到的cDNA片段用NdeI与BamHI(Takara Bio公司制)这2种限制性内切酶进行处理,插入于pET-22b(+)载体(Novagen公司制)的NdeI-BamHI位点,从而取得了重组体质粒pET22b-PcFX′。
接着,为了对来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶赋予果糖基肽氧化酶活性,将重组体质粒pET22b-PcFX′作为模板,使用序列号189、190的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,取得了对序列号188记载的氨基酸序列的60位的丝氨酸被取代为甘氨酸的来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-PcFX)。然后,通过将该得到的重组体质粒pET22b-PcFX转化到大肠杆菌BL21(DE3),取得了产生来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶的大肠杆菌。
将上述得到的产生来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体利用BugBuster Protein Extraction Reagent(Novagen公司制)进行溶菌后,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV的酶活性,结果为0.090U/ml。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。
实施例23
(向来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶基因导入点变异)
以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―PcFX作为模板,使用序列号191、192的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号188记载的氨基酸序列的110位的赖氨酸被取代为精氨酸的来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-PcFX-K110R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―PcFX作为模板,使用序列号193、194的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号188记载的氨基酸序列的154位的半胱氨酸被取代为天冬氨酸的来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-PcFX-C154D)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-PcFX作为模板,使用序列号195、196的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号188记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸被取代为赖氨酸的来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-PcFX-G263K)。
实施例24
(导入了点变异的来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶的特性评价)
将分别保持上述得到的重组体质粒pET22b-PcFX、pET22b-PcFX-K110R、pET22b-PcFX-C154D、pET22b-PcFX-G263K的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了Overnight Express AutoinductionSystem1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体用BugBuster Protein ExtractionReagent(Novagen公司制)进行溶菌后,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV、αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。将结果示于表21。
表21
如表21所示,通过将序列号188记载的氨基酸序列的110位的赖氨酸取代为精氨酸、将154位的半胱氨酸取代为天冬氨酸,从而来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶的εFK/αFVH和εFK/αFV均为比取代前低的值。另外,通过将序列号188记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸取代为赖氨酸,从而来自产黄青霉的果糖基氨基酸氧化酶的εFK/αFVH均为比取代前低的值。因此,可知这些氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例25
(来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的表达)
基于已知的果糖基氨基酸氧化酶的氨基酸序列,对由基因组数据库(http://www.genome.jp/tools/blast/)检索的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(Cryptococcus neoformans B-3501A:GENE ID:4934641 CNBB5450hypothetical protein)尝试使从C末端除去了34个氨基酸的、由序列号197所示的443个氨基酸在大肠杆菌进行表达。因此,通过利用作为常规方法的基因片段的PCR的全合成来将cDNA进行全合成,从而取得编码序列号197的氨基酸序列且为了用于大肠杆菌表达而将密码子最优化的由序列号198所示的1332bp的基因(包含终止密码子TGA)。此时,在序列号1的5′末端、3′末端分别附加有NdeI位点和BamHI位点。另外,确认了由克隆的基因序列预测的氨基酸序列与图1的从来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶的C末端除去了34个氨基酸的序列一致。
接着,为了使取得的序列号198的基因在大肠杆菌中表达,进行以下步骤。首先,将上述全合成的基因用NdeI和BamHI(Takara Bio公司制)这2种限制性内切酶进行处理,插入于pET-22b(+)Vector(Novagen公司制)的NdeI-BamHI位点,从而取得重组体质粒pET22b-CnFX并转化到大肠杆菌BL21(DE3)。接着,将保持重组体质粒pET22b-CnFX的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了OvernightExpress Autoinduction System1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV的酶活性,结果分别为2.2U/ml。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。
实施例26
(向来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶基因导入点变异)
以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―CnFX作为模板,使用序列号199、200的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号197记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸被取代为精氨酸的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-CnFX-T100R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―CnFX作为模板,使用序列号201、202的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号197记载的氨基酸序列的110位的丝氨酸被取代为精氨酸的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-CnFX-S110R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―CnFX作为模板,使用序列号203、204的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号197记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸被取代为天冬酰胺的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-CnFX-S154N)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-CnFX作为模板,使用序列号205、206和207、208的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号197记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸被分别取代为丙氨酸、半胱氨酸的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-CnFX-V259A、pET22b-CnFX-V259C)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-CnFX作为模板,使用序列号209、210和211、212的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号197记载的氨基酸序列的263位的丝氨酸被分别取代为赖氨酸、精氨酸的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-CnFX-S263K、pET22b-CnFX-S263R)。
实施例27
(导入了点变异的来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶的特性评价)
将分别保持上述得到的重组体质粒pET22b-CnFX-T100R、pET22b-CnFX-S110R、pET22b-CnFX-S154N、pET22b-CnFX-V259A、pET22b-CnFX-V259C、pET22b-CnFX-S263K、pET22b-CnFX-S263R的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了Overnight Express AutoinductionSystem1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV、αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。将结果示于表22。
表22
如表22所示,通过将序列号197记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸取代为精氨酸、将110位的丝氨酸取代为精氨酸、将154位的丝氨酸取代为天冬酰胺、将259位的缬氨酸取代为丙氨酸或半胱氨酸、将263位的丝氨酸取代为赖氨酸或精氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶的εFK/αFVH和εFK/αFV均为比取代前低的值。因此,可知这些氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例28
(来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的大肠杆菌中的表达)
尝试使来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶在大肠杆菌中表达。将已经清楚的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的氨基酸序列示于序列号213(参照专利文献1)。通过利用作为常规方法的基因片段的PCR的全合成来将cDNA进行全合成,从而取得编码该序列号213所示的441氨基酸、且为了用于大肠杆菌表达而将密码子最优化的由序列号214所示的1326bp的基因(包含终止密码子TGA)。此时,在序列号1的5′末端、3′末端分别附加有NdeI位点和BamHI位点。另外,确认了由克隆的基因序列预测的氨基酸序列全长与图1的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的序列一致。
接着,为了使取得的序列号214的基因在大肠杆菌中表达,进行以下步骤。首先,将上述全合成的基因用NdeI和BamHI(Takara Bio公司制)这2种限制性内切酶进行处理,插入于pET-22b(+)Vector(Novagen公司制)的NdeI-BamHI位点,从而取得了重组体质粒pET22b-NvFX,转化到大肠杆菌BL21(DE3)。接着,将保持该重组体质粒pET22b-NvFX的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了OvernightExpress Autoinduction System1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV的酶活性,结果为19.3U/ml。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。
实施例29
(向来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因导入点变异)
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-NvFX作为模板,使用序列号215、216和217、218和219、220和221、222的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码果糖基氨基酸氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸被分别取代为谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-E98Q、pET22b-NvFX-E98H、pET22b-NvFX-E98K、pET22b-NvFX-E98R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―NvFX作为模板,使用序列号223、224的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码酮胺氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸被取代为精氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-G103R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―NvFX作为模板,使用序列号225、226的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码酮胺氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的110位的谷氨酸被取代为精氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-E110R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b―NvFX作为模板,使用序列号227、228和229、230的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码酮胺氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸被分别取代为天冬酰胺、天冬氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-S154N、pET22b-NvFX-S154D)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-NvFX作为模板,使用序列号231、232和233、234的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码酮胺氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸被分别取代为丙氨酸、半胱氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-V259A、pET22b-NvFX-V259C)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-NvFX作为模板,使用序列号235、236和237、238的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码酮胺氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸被分别取代为赖氨酸、精氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-G263K、pET22b-NvFX-G263R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pET22b-NvFX作为模板,使用序列号239、240的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌BL21(DE3)的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码酮胺氧化酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号213记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸被取代为甘氨酸、67位的缬氨酸被取代为脯氨酸的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因进行编码的重组体质粒(pET22b-NvFX-K66GV67P)。
实施例30
(导入了点变异的来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的特性评价)
将分别保持上述得到的重组体质粒pET22b-NvFX-E98Q、pET22b-NvFX-E98H、pET22b-NvFX-E98K、pET22b-NvFX-E98R、pET22b-NvFX-E110R、pET22b-NvFX-S154N、pET22b-NvFX-S154D、pET22b-NvFX-V259A、pET22b-NvFX-V259C、pET22b-NvFX-G263K、pET22b-NvFX-G263R、pET22b-NvFX-K66GV67P的大肠杆菌BL21(DE3)在加入了Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司制)的试剂的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV、αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH7.5的试剂1。将结果示于表23。
表23
如表23所示,通过将序列号213记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为谷氨酰胺或组氨酸或赖氨酸或精氨酸、将103位的甘氨酸取代为精氨酸、将110位的谷氨酸取代为精氨酸、将154位的丝氨酸取代为天冬酰胺或天冬氨酸、将259位的缬氨酸取代为丙氨酸或半胱氨酸、将263位的甘氨酸取代为赖氨酸或精氨酸,从而来自侵管新赤壳菌的果糖基氨基酸氧化酶的εFK/αFVH和εFK/αFV均为比取代前低的值。另外,通过将66位的赖氨酸取代为甘氨酸、且将67位的缬氨酸取代为脯氨酸,从而来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的εFK/αFVH为比取代前低的值。因此,可知这些氨基酸取代对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作是有效的取代。
实施例31
(向来自土正青霉(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶基因导入点变异)
序列号241是导入了热稳定性提高型变异(G184D、N272D、H388Y)的来自土正青霉的阿马多里酶的氨基酸序列,使插入了编码序列号241的氨基酸序列的基因(序列号242)的重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5在大肠杆菌中进行表达,从而确认了来自土正青霉的阿马多里酶的活性(参照国际公开第2007/125779号)。
为了向来自土正青霉的阿马多里酶导入底物特异性提高型变异,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5作为模板,使用序列号243、244的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的98位的丝氨酸被取代为丙氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-S98A)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5作为模板,使用序列号245、246的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的110位的赖氨酸被取代为精氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-K110R)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5作为模板,使用序列号249、250和251、252的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸分别取代为丙氨酸、半胱氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-V259A、pUTE100K′-EFP-T5-V259C)。
接着,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5作为模板,使用序列号253、254的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸被取代为赖氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-G263K)。
实施例32
(导入了点变异的来自土正青霉的阿马多里酶的底物特异性改善效果的评价)
将分别保持上述得到的重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5-S98A、pUTE100K′-EFP-T5-K110R、pUTE100K′-EFP-T5-V259A、pUTE100K′-EFP-T5-V259C、pUTE100K′-EFP-T5-G263K的大肠杆菌DH5α株在添加有0.1M的IPTG的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)中进行超声波破碎处理,以20000×g进行10分钟离心分离,从而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV、αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH8.0的试剂1。将活性测定结果示于表24。
表24
如表24所示,通过将序列号241记载的氨基酸序列的98位的丝氨酸取代为丙氨酸、将110位的赖氨酸取代为精氨酸、将259位的缬氨酸取代为丙氨酸或半胱氨酸、将263位的甘氨酸取代为赖氨酸,从而来自土正青霉的阿马多里酶的εFK/αFVH和εFK/αFV均为比取代前低的值。因此,可知这些氨基酸取代是对底物特异性得到改善的阿马多里酶的制作有效的取代。
实施例33
(来自土正青霉的阿马多里酶基因的底物特性提高型多重变异体的制作)
通过制作来自土正青霉的阿马多里酶基因的底物特异性提高型多重变异体,尝试了使对εFK的反应性显著降低的阿马多里酶的开发。
将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5-V259C作为模板,使用序列号243、244的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的98位的丝氨酸被取代为丙氨酸、259位的缬氨酸被取代为半胱氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-S98A/V259C)。
同样地,以导入用于提高底物特异性的点变异为目的,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5-K110R作为模板,使用序列号247、248的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的110位的赖氨酸被取代为精氨酸、154位的半胱氨酸被取代为天冬酰胺的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-K110R/C154N)。
同样地,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5-V259C作为模板,使用序列号245、246的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的110位的赖氨酸取代为精氨酸、259位的缬氨酸被取代为半胱氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-K110R/V259C)。
同样地,将重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5-S98A-V259C作为模板,使用序列号245、246的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌DH5α的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号241记载的氨基酸序列的98位的丝氨酸被取代为丙氨酸、110位的赖氨酸被取代为精氨酸、259位的缬氨酸被取代为半胱氨酸的来自土正青霉的阿马多里酶基因进行编码的重组体质粒(pUTE100K′-EFP-T5-S98A/K110R/V259C)。
实施例34
(向来自土正青霉的阿马多里酶基因导入底物特性提高型多重变异带来的底物特异性改善效果的评价)
将分别保持上述得到的重组体质粒pUTE100K′-EFP-T5-S98A/V259C、pUTE100K′-EFP-T5-K110R/C154N、pUTE100K′-EFP-T5-K110R/V259C、pUTE100K′-EFP-T5-S98A/K110R/V259C的大肠杆菌DH5α株在添加有0.1M的IPTG的LB-amp培养基中于30℃振荡培养18小时。将得到的各培养菌体悬浮于10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)并进行超声波破碎处理,以20000×g离心分离10分钟而得到粗酶液。使用该粗酶液,利用上述B:活性测定法,测定对αFV、αFVH和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。其中,此时的活性测定的试剂1使用了调整为pH8.0的试剂1。将活性测定结果示于表25。
表25
如表25所示,可知对于导入了多重氨基酸取代的来自土正青霉的阿马多里酶而言,与单独导入了各氨基酸取代的情况相比,εFK/αFVH、εFK/αFV均成为进一步低的值,对εFK的反应性显著降低。
实施例35
(重组体质粒pKK223-3-CFP-T9DNA的制备)
序列号272是导入了热稳定性提高型变异(G184D、F265L、N272D、H302R、H388Y)的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列,由序列号273的基因进行编码。
将具有来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(序列号273)的重组体质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T9)株(国际公开第2007/125779号参照)与[实施例1]记载的方法同样地进行培养,将培养物以10000×g离心分离1分钟,从而集菌,得到菌体。使用质粒提取试剂盒(GenElutePlasmid Mini-Prep Kit,Sigma-Aldrich公司制),由该菌体将重组体质粒pKK223-3-CFP-T9提取并纯化,得到2.5μg的重组体质粒pKK223-3-CFP-T9DNA。
(重组体质粒pKK223-3-CFP-T9DNA的部位特异性改变操作)
为了将序列号272记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为丙氨酸、将154位的丝氨酸取代为天冬酰胺、将259位的缬氨酸取代为半胱氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T9DNA作为模板,使用序列号55、56的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与[实施例1]所述的条件相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对98位的谷氨酸被丙氨酸所取代的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T9-E98A)。
与上述同样进行,将pKK223-3-CFP-T9-E98A DNA作为模板,使用序列号139、140的合成寡核苷酸,得到对98位的谷氨酸被取代为丙氨酸、154位的丝氨酸被取代为天冬酰胺的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T9-E98A/S154N)。
进而,与上述同样进行,将pKK223-3-CFP-T9-E98A/S154N DNA作为模板,使用序列号151、152的合成寡核苷酸,得到对98位的谷氨酸被取代为丙氨酸、154位的丝氨酸被取代为天冬酰胺、259位的缬氨酸被取代为半胱氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T9-E98A/S154N/V259C)。
将上述得到的具有改变型阿马多里酶生产能力的大肠杆菌JM109株用上述[实施例1](3)记载的方法进行培养,制备了各种改变型阿马多里酶的粗酶液0.6ml。
对于这样制备的酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对αFVH、αFV和εFK的酶活性,算出εFK/αFVH和εFK/αFV。应予说明,活性测定中使用了调整为pH7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。将结果示于表26。
表26
对于导入了表26中的多重氨基酸取代的改变型阿马多里酶而言,与变异导入以前相比,εFK/αFVH、εFK/αFV均为极低的值。因而,明确了通过使对序列号1所示的阿马多里酶的底物特异性改善有效的单一变异蓄积在序列号272所示的阿马多里酶中,也能预计到极大的底物特异性的改善。
Claims (8)
1.一种底物特异性得到改变的阿马多里酶,其特征在于,序列号1所示的氨基酸序列的氨基酸的与选自以下(t)的氨基酸对应的位置的氨基酸被取代为以下(t)中记载的取代后的氨基酸残基,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少:
(t)98位的谷氨酸被脯氨酸以外的氨基酸,即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸所取代。
2.根据权利要求1所述的阿马多里酶,其特征在于,进一步地,序列号1所示的氨基酸序列的氨基酸的与选自以下(u)至(aj)中的1个或2个的氨基酸对应的位置的氨基酸被取代为以下(u)至(aj)的各项中记载的取代后的氨基酸残基,
(u)259位的缬氨酸被丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸所取代;
(v)154位的丝氨酸被甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸所取代;
(w)125位的组氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代;
(x)261位的酪氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸所取代;
(y)263位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代;
(z)106位的天冬氨酸被分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺所取代;
(aa)103位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸所取代;
(ab)355位的丙氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代;
(ac)96位的天冬氨酸被丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸所取代;
(ad)66位的赖氨酸被甘氨酸或/和67位的缬氨酸被脯氨酸所取代;
(ae)70位的谷氨酰胺被脯氨酸所取代;
(af)100位的苏氨酸被精氨酸所取代;
(ag)110位的谷氨酰胺被丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代;
(ah)113位的丙氨酸被谷氨酸、赖氨酸所取代;
(ai)114位的亮氨酸被赖氨酸、精氨酸所取代;
(aj)156位的天冬氨酸被天冬酰胺所取代。
3.根据权利要求1或2所述的底物特异性得到改变的阿马多里酶,其中,在序列号1所示的氨基酸序列中,氨基酸残基的取代选自以下(ba)至(bd):
(ba)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;
(bb)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺;
(bc)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸;
(bd)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。
4.一种阿马多里酶基因,编码权利要求1~3中任一项所述的氨基酸序列。
5.一种重组载体,包含权利要求4所述的阿马多里酶基因。
6.一种宿主细胞,包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种制造阿马多里酶的方法,包括以下工序:
(ak)培养权利要求6所述的宿主细胞的工序;
(al)使宿主细胞所含的阿马多里酶基因表达的工序;以及
(am)从培养物分离阿马多里酶的工序。
8.一种用于测定糖化血红蛋白的试剂盒,其中,包含权利要求1~3中任一项所述的阿马多里酶。
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