KR20130105614A - 기질 특이성이 개변된 아마드리아제 - Google Patents

기질 특이성이 개변된 아마드리아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프룩토실 바릴-히스티딘(fructosyl valyl-histidine)에 대한 기질 특이성이 높은 아마드리아제(amadoriase)의 제공을 목적으로 한다. 본 발명은 코니오카에타(Coniochaeta) 속 유래의 아마드리아제의 98 위치, 259 위치, 154 위치, 125 위치, 261 위치, 263 위치, 106 위치, 103 위치, 355 위치, 96 위치, 66 위치, 67 위치, 70 위치, 100 위치, 110 위치, 113 위치, 114 위치, 및 156 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지는 아마드리아제이며, 본 발명에 의해서, ε-프룩토실 라이신(ε-fructosyl lysine)의 존재하에서도, 당화 헤모글로빈(glycosylated hemoglobin)의 β-사슬 아미노 말단에 유래하는 α-프룩토실 바릴-히스티딘(α-fructosyl valyl-histidine)을 정확하게 측정할 수 있다.

Description

기질 특이성이 개변된 아마드리아제{Amadoriase having altered substrate specificity}
본 발명은 기질 특이성이 개변된 아마드리아제, 그 유전자 및 재조합 DNA 및 기질 특이성이 개변된 아마드리아제의 제조 방법에 관한 것이다.
당화 단백질은 글루코스(glucose) 등의 알도스(aldose)(알데하이드(aldehyde)기를 잠재적으로 가지는 단당 및 그 유도체)의 알데하이드기와 단백질의 아미노기가 비효소적으로 공유결합을 형성하여 아마드리(amadori) 전이하는 것으로 생성하는 것이다. 상기 단백질의 아미노기는 아미노 말단의 α아미노기, 단백질중의 라이신 잔기 측쇄의 ε아미노기를 들 수 있다. 생체 내에서 생기는 당화 단백질로서는 혈액중의 헤모글로빈이 당화된 당화 헤모글로빈, 알부민이 당화된 당화 알부민 등이 알려져 있다. 이들 생체 내에서 생기는 당화 단백질 중에서도, 당뇨병의 임상 진단 분야에 있고, 당뇨병 환자의 진단이나 증상 관리를 위해 중요한 혈당 조절 마커로서 당화 헤모글로빈(HbA1c)이 주목받고 있다. 혈액중의 HbA1c 농도는 과거의 일정기간의 평균 혈당치를 반영하고 있어서 그 측정치는 당뇨병의 증상의 진단이나 관리에 있어 중요한 지표가 되고 있다. 상기 HbA1c를 신속하고 간편하게 측정하는 방법으로서 아마드리아제(amadoriase)를 이용하는 효소적 방법, 즉, HbA1c를 프로테아제(protease)등으로 분해하여, β-사슬 아미노 말단에서 유리시킨 α-프룩토실 바릴-히스티딘(α-fructosyl valyl-histidine)(이하, αFVH로 나타낸다), 또는 α-프룩토실 발린(α-fructosyl valine)(이하, αFV로 나타낸다)을 정량하는 방법이 제안되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 1 내지 특허문헌 6 참조.). 실제로는, HbA1c로부터 αFV를 잘라내는 방법은 협잡물 등에 의한 영향이 크다고 생각되어 특히 현재는 αFVH를 측정하는 방법이 주류를 이루고 있다.
아마드리아제는 산소의 존재하에서 이미노 2 초산(iminodiacetic acid) 또는 그 유도체(아마드리(amadori) 화합물이라고도 한다)를 산화하고, 글리옥실산(glyoxylic acid) 또는 α-케토 알데하이드(α-keto aldehyde), 아미노산 또는 펩티드 및 과산화 수소를 생성하는 반응을 촉매 한다. 상기 아마드리아제는 세균, 효모, 진균류로부터 검출되고 있지만, 특히 HbA1c의 측정에 유용하다. αFVH 및/또는 αFV에 대한 효소 활성을 가지는 아마드리아제는, 예를 들면, 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 아르트리니움(Arthrinium) 속, 커블라리아(Curularia) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 오피오볼루스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 클립토코카스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 울로크라디움(Ulocladium) 속 및 페니실리움(Penicillium) 속 유래의 아마드리아제가 보고되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 1, 7 내지 11, 비특허 문헌 1 내지 4 참조.). 또한, 상기 보고된 예시들에서 상기 아마드리아제는, 선행 문헌에 따라서 케토아민 옥시다제(ketoamine oxidase)나 프룩토실 아미노산 옥시다제(fructosyl amino acid oxidase), 프룩토실 펩티드 옥시다제(fructosyl peptide oxidase), 프룩토실 아민 옥시다제(fructosyl amine oxidase) 등의 표현으로 기재되어 있는 경우도 있다. 효소적 방법에 따르는 HbA1c의 측정에 대해서는 아마드리아제의 성질로서 엄밀한 기질 특이성이 요구된다. 예를 들면, 앞서 서술한 바와 같이, 유리된 αFVH를 정량함으로써 HbA1c의 측정을 실시하는 경우에는, 검사대상 물체 중에 유리 상태로 존재하는 및/또는 프로테아제등을 이용한 HbA1c의 처리 공정에 있어 유리된 αFVH 이외의 당화 아미노산이나 당화 펩티드에는 작용하기 어려운 아마드리아제를 이용하는 것이 바람직하다. 특히, 헤모글로빈 분자중에 포함되는 라이신(lysine) 잔기 측쇄의 ε위치의 아미노기는 당화를 받는 것이 알려져 있고, 상기 당화를 받은 라이신 잔기(lysine residue)로 유래하는 ε위치의 아미노기가 당화된 ε-프룩토실 라이신(ε-fructosyl lysine)(이하, εFK와 나타낸다)이 프로테아제 처리등에 의해서 유리되는 것을 시사하고 있다(예를 들면, 비특허 문헌 5 참조.). 그 때문에, 측정 오차의 원인 물질이 될 수 있는 εFK에 대해 작용하기 어려운 기질 특이성의 높은 아마드리아제가 매우 바람직하다. 한편, 종래 공지된 아마드리아제 대부분은 εFK로의 반응성이 충분히 낮은 것이라고는 할 수 없다.
일반적인 기술로서 효소의 기질 특이성을 개변하기 위해서 효소를 코딩하는 DNA에 변이를 가하여 효소의 아미노산에 치환을 도입하고, 얻고자 하는 기질 특이성을 갖춘 효소를 선발하는 방법이 알려져 있다. 또한, 상동성이 높은 효소에 대하여아미노산 치환에 의해서 기질 특이성을 높였다고 하는 예가 이미 공지된 경우에는, 그 정보를 기초로 기질 특이성의 향상을 예상하는 것이 가능하다. 실제로, 커블라리아 클라바타(Curvularia clavata) YH923 유래의 케토아민 옥시다제 및 네오코스모스포라 바신펙타(Neocosmospora vasinfecta) 474 유래의 케토아민 옥시다제에 대해서 몇 개의 아미노산을 치환하는 것에 의한, αFVH에 대한 기질 특이성이 향상한 개변형 케토아민 옥시다제를 나타내고 있다(특허 문헌 1 참조.). 예를 들면, 커블라리아 클라바타 YH923 유래의 케토아민 옥시다제에 대해서는, 58 위치의 이소루신(isoleucine)을 발린(valine)으로, 62 위치의 아르기닌(arginine)을 히스티딘(histidine)으로, 330 위치의 페닐 알라닌(phenylalanine)을 루신(leucine)으로 치환하는 것으로, ε-프룩토실(fructosyl)-(α-벤질옥시카보닐라이신)(benzyloxycarbonyl lysine))(이하, εFZK로 나타낸다)에 대한 효소 활성을 αFVH에 대한 효소 활성으로 나누어 도출한 활성비 εFZK/αFVH가 0.95에서 0.025로 감소하는 것이 나타나고 있다.
그러나, 상기 문헌에서 개변형 케토아민 옥시다제의 기질 특이성의 평가에 이용되고 있는 εFZK는, 당화 헤모글로빈을 프로테아제로 처리하는 공정에 대해 실제로 생기는 εFK란, 분자량이나 구조의 부분에서도 상당히 다른 화합물이다. 때문에, εFZK에 대한 반응성이 감소하고 있는 것으로, 실제 측정 오차의 원인 물질이 될 수 있는 εFK에 대한 반응성이 감소했다고는 하기 어렵다. 또한, 상기 문헌 중의 개변형 케토아민 옥시다제를 이용하여 εFK에 대한 반응성의 감소함을 확인하고 있는 취지의 기재도 없다. 그 외에도, 아스페르길루스 니드랑스(Aspergillus nidulans) A89 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제(fructosyl amino acid oxidase)에 아미노산 치환을 도입하여 기질 특이성을 개변하는 것으로써, αFVH에 대한 반응성을 새롭게 부여한 개변형 프룩토실 아미노산 옥시다제가 보고되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 10 참조.). 예를 들면, 아스페르길루스 니드랑스 A89 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제의, 59 위치의 세린(serine)을 글리신(glycine)으로, 또한, 65 위치의 라이신(lysine)을 글리신으로, 또는 109 위치의 라이신을 글루타민(glutamine)에 치환하는 것으로써, 새로운 αFVH에 대한 효소 활성이 부여되는 것을 나타내고 있다. 그렇지만, 해당 아미노산 치환이 εFK에 대한 반응성의 감소에 기여한다라는 기재는 없다. 나아가, 그 밖에도, 아스페르길루스 니드랑스 A89 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에 아미노산 치환을 도입하여 기질 특이성을 개변하는 것으로, εFK에 대한 효소 활성을 αFV에 대한 효소 활성으로 나누어 도출한 활성비 εFK/αFV를 감소시킨 개변형 프룩토실 아미노산 옥시다제가 보고되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 12 참조.). 그렇지만, 이 개변 효소의 αFVH에 대한 효소 활성에 대해서는 아무런 언급되어 있지 않다. 즉, 천연형 혹은 변이형 아마드리아제를 포함하여 εFK에 대한 효소 활성을 αFVH에 대한 효소 활성으로 나누어 도출한 활성비 εFK/αFVH가 낮은, 및/또는 εFK/αFV가 낮은 아마드리아제의 예는, 지금까지 극히 소수가 보고되고 있는 것에 지나지 않아, 정밀도가 높은 HbA1c의 측정을 실현할 수 있는 εFK에 대한 반응성이 충분히 낮은 아마드리아제가 여전히 요구되고 있다.
[특허 문헌 1] 국제 공개 제 2004/104203호. [특허 문헌 2] 국제 공개 제 2005/49857호. [특허 문헌 3] 특개 2001-95598호 공보. [특허 문헌 4] 특공평 05-33997호 공보. [특허 문헌 5] 특개평 11-127895호 공보. [특허 문헌 6] 국제 공개 제 97/13872호. [특허 문헌 7] 특개 2003-235585호 공보. [특허 문헌 8] 특개 2004-275013호 공보. [특허 문헌 9] 특개 2004-275063호 공보. [특허 문헌 10] 특개 2010-35469호 공보. [특허 문헌 11] 특개 2010-57474호 공보. [특허 문헌 12] 특개 2010-104278호 공보.
[비특허 문헌 1] Biochem.　Biophys.　Res.　Commun.　311,　104-11,　2003 [비특허 문헌 2] Biotechnol.　Bioeng.　106,　358-66,　2010 [비특허 문헌 3] J.　Biosci.　Bioeng.　102,　241-3,　2006 [비특허 문헌 4] Eur.　J.　Biochem.　242,　499-505,　1996 [비특허 문헌 5] J.　Biol.　Chem.　279,　27613-20,　2004
본 발명이 해결하려고 하는 과제는 εFK에 대한 반응성, 구체적으로는, εFK/αFVH가 낮은, 및/또는 εFK/αFV가 낮은 아마드리아제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제 해결을 위해서 열심히 연구를 거듭한 결과, 코니오카에타(Coniochaeta) 속 유래의 아마드리아제(amadoriase)에 있어서 특정의 아미노산 잔기를 특정의 아미노산 잔기로 치환하는 것으로 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성했다.
따라서, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 하기의 (a) 및/또는 (b)의 성질을 가지는 아마드리아제(amadoriase):
(a) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 하나 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 및/또는 치환이 이루어진 아미노산 서열을 가지고, 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴-히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있다.
(b) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 하나 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 및/또는 치환이 이루어진 아미노산 서열을 가지고, 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 아마드리아제와 비교하여 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있다.
(2) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 하기 (c)로부터 (s)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지며, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴-히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는지 및/또는 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제.
(c) 98 위치의 글루타민산.
(d) 259 위치의 발린.
(e) 154 위치의 세린.
(f) 125 위치의 히스티딘.
(g) 261 위치의 타이로신.
(h) 263 위치의 글리신.
(i) 106 위치의 아스파라긴산.
(j) 103 위치의 글리신.
(k) 355 위치의 알라닌.
(l) 96 위치의 아스파라긴산.
(s) 66 위치의 라이신 또는/및 67 위치의 발린.
(m) 70 위치의 글루타민.
(o) 100 위치의 스레오닌.
(p) 110 위치의 글루타민.
(q) 113 위치의 알라닌.
(r) 114 위치의 루신.
(s) 156 위치의 아스파라긴산.
(3) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 아미노산 하기 (t)로부터 (aj)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 또는 그 이상의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산이, 하기 (t)로부터 (aj)의 각각에 기재되는 치환 후의 아미노산 잔기로 치환되고 있어 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴-히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는지, 및/또는 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교하여, α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제:
(t) 98 위치의 글루타민산이 프롤린 이외의 아미노산, 즉 글루타민, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌, 시스테인, 세린, 스레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 페닐 알라닌, 타이로신, 트립토판으로 치환;
(u) 259 위치의 발린이 알라닌, 시스테인, 세린으로 치환;
(v) 154 위치의 세린이 글리신, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 글루타민산, 히스티딘, 시스테인으로 치환;
(w) 125 위치의 히스티딘이 알라닌, 루신, 페닐 알라닌, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 라이신, 아르기닌으로 치환;
(x) 261 위치의 타이로신이 알라닌, 로이신, 페닐 알라닌, 트립토판, 라이신으로 치환;
(y) 263 위치의 글리신이 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로 치환;
(z) 106 위치의 아스파라긴산이, 아스파라긴산보다 분자량이 작은 아미노산, 즉 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 스레오닌, 시스테인, 루신, 이소루신, 아스파라긴으로 치환;
(aa) 103 위치의 글리신이 라이신, 아르기닌, 히스티딘으로 치환;
(ab) 355 위치의 알라닌이 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로 치환;
(ac) 96 위치의 아스파라긴산이 알라닌, 아스파라긴, 히스티딘, 세린으로 치환;
(ad) 66 위치의 라이신이 글리신 또는/및 67 위치의 발린이 프롤린으로 치환;
(ae) 70 위치의 글루타민이 프롤린으로 치환;
(af) 100 위치의 스레오닌이 아르기닌으로 치환;
(ag) 110 위치의 글루타민이 알라닌, 루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌으로 치환;
(ah) 113 위치의 알라닌이 글루타민산, 라이신으로 치환;
(ai) 114 위치의 루신이 라이신, 아르기닌으로 치환;
(aj) 156 위치의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환.
(4) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 대하고, 하기의 (ba)로부터 (be)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 치환을 가지는 상기(3)에 기재한 아마드리아제:
(ba) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환;
(bb) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환;
(bc) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 글루타민으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환;
(bd) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환;
(be) 110 위치의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환.
(5) 서열 번호 272로 기재되는 아미노산 서열에 대하여 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환을 가지고, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서, α-프룩토실 바릴-히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있고, 또한 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교하여 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제.
(6) 서열 번호 241로 기재되는 아미노산 서열에 대하여 하기의 (ca)로부터 (cc)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 치환을 가지고 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교하여 α-프룩토실 바릴-히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있어, 또한 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제:
(ca) 98 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환, 110 위치의 라이신에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환;
(cb) 98 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환;
(cc) 110 위치의 라이신에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환.
(7) 상기 (1) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 아마드리아제 유전자.
(8) 상기 (7)에 기재된 아마드리아제 유전자를 포함한 재조합 벡터.
(9) 상기 (8)에 기재된 재조합 벡터를 포함한 숙주 세포(host cell).
(10) 아마드리아제를 제조하는 방법이며, 하기의 단계을 포함한 방법:
(ak) 상기 (6) 기재의 숙주 세포를 배양하는 단계;
(al) 숙주 세포에 포함되는 아마드리아제 유전자를 발현시키는 단계; 및
(am) 배양물로부터 아마드리아제를 단리하는 단계.
(11) 상기 (1) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 아마드리아제를 포함하는 당화 헤모글로빈의 측정에 이용하기 위한 키트.
본 명세서는 본 출원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제 2010-176967호 및제 2010-213070호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면, 당뇨병의 진단용 효소로서 또는 당뇨병 마커의 측정 키트에 유용하게 이용될 수 있는 기질 특이성이 뛰어난 아마드리아제, 구체적으로는, εFK/αFVH가 낮은, 및/또는 εFK/αFV가 낮은 아마드리아제를 제공할 수 있다.
도 1은 각종 공지의 아마드리아제의 아미노산 서열에서의 상동성을 예시하는 도이다.
도 2는 본 발명의 아마드리아제에 의한 αFVH의 정량성을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
( 아마드리아제 )
아마드리아제(amadoriase)는 케토아민 옥시다제(ketoamine oxidase), 프룩토실 아미노산 옥시다제(fructosyl amino acid oxidase), 프룩토실 펩티드 옥시다제(fructosyl peptide oxidase), 프룩토실 아민 옥시다제(fructosyl amine oxidase)라고도 하며 산소의 존재하에서, 이미노 2 초산(iminodiacetic acid) 또는 그 유도체(아마드리(amadori) 화합물)를 산화하고, 글리옥실산(glyoxylic acid) 또는 α-케토 알데하이드(α-keto aldehyde), 아미노산 또는 펩티드 및 과산화 수소를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 말한다. 아마드리아제는 자연계에 넓게 분포하고 있어, 미생물이나, 동물 또는 식물 기원의 효소를 탐색하는 것으로 얻을 수 있다. 미생물에 있어서, 예를 들면, 사상균, 효모, 또는 세균등으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 아마드리아제는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 코니오카에타(Coniochaeta) 속 유래의 아마드리아제에 근거하여 제작된 기질 특이성이 개변된 아마드리아제의 개변체이다. 이러한 변이체의 예로는, 서열 번호 1로 높은 서열 동일성(예를 들면, 75% 이상, 바람직하게는, 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 한층 더 바람직하게는 95% 이상, 한층 더 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상)을 가지는 아미노산 서열을 가지는 아마드리아제 및 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 1개에서 몇 개의 아미노산이 개변 또는 변이, 또는, 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 가지는 아마드리아제를 들 수 있다. 또한, 청구의 범위에 기재된 기질 특이성 및/또는 아미노산 서열에 관한 조건을 만족하는한, 예를 들면, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 아르트리니움(Arthrinium) 속, 커블라리아(Curularia) 속, 레프트스페리아(Leptosphaeria) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 오피오볼루스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 클립토코카스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 울로크라디움(Ulocladium) 속 또는 페니실리움(Penicillium) 속과 같은 다른 생물종에 유래하는 아마드리아제에 근거하여 제작된 것이라도 좋다.
기질 특이성이 개변된 아마드리아제의 개변체는 아마드리아제의 아미노산 서열에 대해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 치환하는 것에 의해서 얻을 수 있다. 기질 특이성의 개변을 가져오는 아미노산의 치환으로서 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서의 하기의 위치의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다.
(1) 98 위치의 글루타민산의 치환, 예를 들면, 프롤린 이외의 아미노산, 즉 글루타민, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌, 시스테인, 세린, 스레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 페닐 알라닌, 타이로신, 트립토판으로의 치환.
(2) 259 위치의 발린의 치환, 예를 들면, 알라닌, 시스테인, 세린으로의 치환.
(3) 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, 글리신, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 글루타민산, 히스티딘, 시스테인으로의 치환.
(4) 125 위치의 히스티딘의 치환, 예를 들면, 알라닌, 루신, 페닐 알라닌, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 라이신, 아르기닌으로의 치환.
(5) 261 위치의 타이로신의 치환, 예를 들면, 알라닌, 루신, 페닐 알라닌, 트립토판, 라이신으로의 치환.
(6) 263 위치의 글리신의 치환, 예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로의 치환.
(7) 106 위치의 아스파라긴산의 치환, 예를 들면, 아스파라긴산보다 분자량이 작은 아미노산, 즉 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 스레오닌, 시스테인, 루신, 이소루신, 아스파라긴으로의 치환.
(8) 103 위치의 글리신의 치환, 예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘으로의 치환.
(9) 355 위치의 알라닌의 치환, 예를 들면 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로의 치환.
(10) 96 위치의 아스파라긴산으로의 치환, 예를 들면, 알라닌, 아스파라긴, 히스티딘, 세린으로의 치환.
(11) 66 위치의 라이신의 치환, 예를 들면, 글리신으로의 치환.
(12) 67 위치의 발린의 치환, 예를 들면, 프롤린으로의 치환.
(13) 70 위치의 글루타민의 치환, 예를 들면, 프롤린으로의 치환.
(14) 100 위치의 스레오닌의 치환, 예를 들면, 아르기닌으로의 치환.
(15) 110 위치의 글루타민의 치환, 예를 들면, 알라닌, 루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌으로의 치환.
(16) 113 위치의 알라닌의 치환, 예를 들면, 글루타민산, 라이신으로의 치환.
(17) 114 위치의 루신의 치환, 예를 들면, 라이신, 아르기닌으로의 치환.
(18) 156 위치의 아스파라긴산의 치환, 예를 들면, 아스파라긴으로의 치환.
기질 특이성이 개변한 아마드리아제의 변이체는 상기 아미노산 치환을 적어도 1개를 가지고 있으면 좋고, 복수의 아미노산 치환을 가지고 있어도 좋다. 예를 들면, 상기 아미노산 치환의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18을 가지고 있다. 그 중에서도, 하기의 아미노산의 위치에 대응하는 아미노산의 치환을 가지고 있는 변이체가 바람직하다. 본 발명에 있어서, 예를 들면, 제 110 위치의 글루타민(Q)이 아르기닌(R)으로 치환된 변이를 Q110R로 나타낸다.
66 위치의 라이신 및 67 위치의 발린의 치환, 예를 들면, K66G 및 V67P를 가지는 변이체.
66 위치의 라이신, 67 위치의 발린 및 98 위치의 글루타민산의 치환, 예를 들면, K66G, V67P 및 E98A을 가지는 변이체.
66 위치의 라이신, 67 위치의 발린 및 110 위치의 글루타민의 치환, 예를 들면, K66G, V67P 및 Q110R를 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산 및 110 위치의 글루타민의 치환, 예를 들면, E98A 및Q110R을 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민 및 125 위치의 히스티딘의 치환, 예를 들면, Q110R 및 H125Q를 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민 및 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, Q110R 및 S154G 또는 S154N을 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민 및 355 위치의 알라닌의 치환, 예를 들면, Q110R 및A355K를 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산 및 103 위치의 글리신의 치환, 예를 들면, E98A및G103R을 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산 및 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, E98A 또는E98R 및 S154N을 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민 및 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, Q110R 및S154C를 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산, 106 위치의 아스파라긴산 및 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, E98A, D106S 및 S154N을 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산, 110 위치의 글루타민 및 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, E98A, Q110R 및 S154N을 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민, 125 위치의 히스티딘 및 154 위치의 세린의 치환, 예를 들면, Q110R, H125Q 및 S154N을 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산 및 259 위치의 발린의 치환, 예를 들면, E98Q 및 V259A, E98Q 및 V259C , E98H 및 V259A, E98H 및 V259C, E98R 및 V259C, E98A 및 V259C를 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산 및 263 위치의 글리신의 치환, 예를 들면, E98A 및 G263R을 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민 및 259 위치의 발린의 치환, 예를 들면, Q110R 및 V259A를 가지는 변이체.
154 위치의 세린 및 259 위치의 발린의 치환, 예를 들면, S154D 및 V259A를 가지는 변이체.
98 위치의 글루타민산, 154 위치의 세린 및 259 위치의 발린의 치환, 예를 들면, E98A, S154N 및 V259C를 가지는 변이체.
110 위치의 글루타민, 154 위치의 세린 및 259 위치의 발린의 치환, 예를 들면, Q110R, S154N 및 V259A를 가지는 변이체.
이러한 아미노산 치환의 조합 중에서도 하기의 (ba) ~ (be)의 몇 개의 조합이 바람직하다.
(ba) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환.
(bb) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환.
(bc) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 글루타민으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환.
(bd) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환.
(be) 110 위치의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환.
본 발명의 기질 특이성이 개변된 아마드리아제 변이체는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 대하여 상기의 기질 특이성의 개변을 가져오는 아미노산의 치환을 가지고, 그러한 치환 아미노산 이외의 위치에서 한층 더 1개 또는 몇 개(예를 들면 1~10개, 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열로부터 구성되어, 아마드리아제 활성을 가지는 기질 특이성이 개변된 아마드리아제 변이체를 포함한다. 게다가 상기의 기질 특이성의 개변을 가져오는 아미노산의 치환 변이, 내열성을 향상시키는 아미노산의 치환 변이를 가지고, 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 치환한 아미노산 이외의 아미노산을 제외한 부분의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 한층 더 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 구성되어, 아마드리아제 활성을 가지고 기질 특이성이 개변된 아마드리아제 변이체를 포함한다.
상기 아미노산 치환에 대하여 아미노산의 위치는 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 나타내고 있지만, 다른 생물종 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열에 대하여 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 치환되고 있다. 대응하는 위치의 의미에 대해서는 나중에 설명한다.
( 아마드리아제를 코드(code)하는 유전자의 취득)
이러한 아마드리아제를 코드하는 본 발명의 유전자(이하, 간단히 아마드리아제 유전자라고 한다)를 얻으려면, 통상 일반적으로 이용되고 있는 유전자의 클로닝 방법이 이용된다. 예를 들면, 아마드리아제 생산능을 가지는 미생물 균체나 여러 가지의 세포로부터 상법(常法), 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 1989)에 기재된 방법에 의하여 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 나악 mRNA를 주형으로서 cDNA를 합성할 수 있다. 이와 같이 수득한 염색체 DNA 또는 cDNA를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.
그 다음에, 상기 아마드리아제의 아미노산 서열에 근거하여 적당한 프로브(probe) DNA를 합성하고, 이것을 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 아마드리아제 유전자를 선발하는 방법, 또는, 상기 아미노산 서열에 근거하여 적당한 프라이머 DNA를 제작하고, 5' RACE(rapid amplification of cDNA ends)법이나 3' RACE법 등의 적당한 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR법)에 의하여 아마드리아제를 코드하는 목적의 유전자 단편을 포함한 DNA를 증폭시켜, 상기 증폭된 DNA 단편을 연결시키고 목적 아마드리아제 유전자의 전체 길이를 포함한 DNA를 얻을 수 있다.
이와 같이 수득된 아마드리아제를 코드하는 유전자가 바람직한 일례로서 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제 유전자(특허 문헌 7)를 들 수 있다.
이러한 아마드리아제 유전자는 상기 방법대로 각종 벡터에 연결되고 있는 것이, 취급상 바람직하다. 예를 들면, Coniochaeta sp. NISL 9330 균주 유래의 아마드리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함한 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP(특허 문헌 7)로부터, QIAGEN(퀴아젠 사제)를 이용하는 것으로, 아마드리아제 유전자를 코드하는 DNA를 추출, 정제하여 얻을 수 있다.
(벡터)
본 발명에 있어서 이용할 수 있는 벡터로서는 상기 플라스미드(plasmid)로 한정되지 않고, 그 이외의, 예를 들면, 박테리오파지(bacteriophage), 코스미드(cosmid) 등의 당업자에게 공지의 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, pBluescriptIISK(스트라타젠 사제) 등이 바람직하다.
( 아마드리아제 유전자의 변이 처리)
아마드리아제 유전자의 변이 처리는 계획하는 변이 형태에 맞춘 공지의 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 즉, 아마드리아제 유전자 또는 해당 유전자가 편입된 재조합 DNA와 변이원이 되는 약제를 접촉 및 작용시키는 방법;자외선 조사법, 유전자 공학적 방법 또는 단백질 공학적 방법을 구사하는 방법 등을 넓게 이용할 수 있다.
상기 변이 처리에 이용되는 변이원이 되는 약제로는, 예를 들면, 히드록실 아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), 아초산(nitrous acid), 아황산(sulfurous acid), 하이드라진(hydrazine), 포름산(formic acid), 또는 5-브로모우라실(bromouracil)등을 들 수 있다.
이러한 접촉 및 작용의 제조건은 이용하는 약제의 종류 등에 따른 조건을 뽑는 것이 가능하고, 현실로 원하는 변이를 아마드리아제 유전자에 대해 야기할 수 있는 한 특히 한정되지 않는다. 통상, 바람직하게는 0.5~12 M의 상기 약제 농도에 대하여 20~80℃의 반응 온도하에서 10분간 이상, 바람직하게는 10~180분간 접촉 및 작용시키는 것으로, 원하는 변이를 야기할 수 있다. 자외선 조사를 실시하는 경우에 있어서도 상기와 같이 상법(常法)에 따라 실시할 수 있다(현대 화학, 024~30, 1989년 6월호).
단백질 공학적 방법을 구사하는 방법으로는, 일반적으로, 부위-특이적 돌연변이(Site-Specific Mutagenesis)로 알려진 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, Kramer법(Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984) Methods Enzymol., 154, 350 (1987) Gene, 37, 73 (1985)), Eckstein법(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985) Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985) Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)), Kunkel법(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A., 82, 488 (1985) Methods Enzymol., 154, 367 (1987)) 등을 들 수 있다.
또한, 일반적인 PCR법으로서 알려진 방법을 이용할 수도 있다(Technique, 1, 11 (1989) 참조). 나아가 상기 유전자 개변법 외에, 유기 합성법 또는 효소 합성법으로 직접 원하는 개변 아마드리아제 유전자를 합성할 수도 있다.
상기 방법에 의해 얻을 수 있는 아마드리아제 유전자의 DNA 염기 서열의 결정 또는 확인을 실시하는 경우, 예를 들면, 멀티-케필러리(Multi-Capillary) DNA 분석 시스템 CEQ2000(beckman coulter 사제) 등을 이용하는 것으로 실시할 수 있다.
(형질 전환·형질 도입)
상기에서 설명한 바와 같이 수득한 아마드리아제 유전자를 상기 방법에 의해서 박테리오파지, 코스미드, 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 형질 전환에 이용되는 플라스미드(plasmid)등의 벡터에 편입하여, 각각의 벡터에 대응하는 숙주를 상법(常法)에 의해서 형질 전환 또는 형질 도입할 수 있다. 예를 들면, 숙주로서 에쉬리시아(Escherichia) 속에 속하는 미생물, 예를 들면 수득한 재조합 DNA를 이용하여 예를 들면, 대장균 K-12 균주, 바람직하게는 대장균 JM109 균주, 대장균 DH5α 균주(모두 다카라 바이오 사제) 등을 형질 전환 또는 그것들에 형질 도입해 각각의 균주를 얻는다.
(아미노산 서열의 상동성 )
아미노산 서열의 상동성은, GENETYX-Mac(Software Devlopment 사제)의 맥시멈 매칭(Maximum matching)이나 서치호모로지(search homology) 등의 프로그램, 또는 DNASIS Pro(히타치 소프트 사)의 맥시멈 매칭이나 멀티플 얼라이먼트(multiful alignment) 등의 프로그램에 의해 계산할 수 있다.
(아미노산에 대응하는 위치의 특정)
아미노산에 대응하는 위치란, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열의 특정의 위치의 아미노산에 대응하는 다른 생물종 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열에 있어서의 위치를 말한다.
아미노산에 대응하는 위치를 특정하는 방법으로서, 예를 들면 리프만-퍼슨법등의 공지의 알고리즘을 이용해 아미노산 서열을 비교하여 각 아마드리아제의 아미노산 서열 중에 존재하는 보존된 아미노산 잔기에 최대의 상동성을 부여하는 것에 의해 실시할 수 있다. 아마드리아제의 아미노산 서열을 이러한 방법으로 정렬시키는 것으로써, 아미노산 서열 중에 어떤한 삽입, 결실과 관계없이, 상동 아미노산 잔기의 각 아마드리아제 서열에서의 서열 중의 위치를 결정하는 것이 가능하다. 상동 위치는 삼차원 구조 중에서 같은 위치에 존재한다고 생각할 수 있어 대상이 되는 아마드리아제의 특이적 기능에 관해서 유사한 효과를 가지는 것을 추정할 수 있다. 도 1에 여러 가지의 생물종 유래의 아마드리아제 서열의 정렬(alignment)을 나타낸다. 도 1에서 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열의 특정의 위치의 아미노산에 대응하는 다른 생물종 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 알 수 있다. 도 1에는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제, 유페니실리움 테레눔(Eupenicillium terrenum) 유래의 아마드리아제, 피레노카에타 서브틸러스(Pyrenochaeta sp.) 유래의 케토아민 옥시다제, 아르시니움 서브틸러스(Arthrinium sp.) 유래의 케토아민 옥시다제, 커블라리아 클라바타(Curvularia clavata) 유래의 케토아민 옥시다제, 네오코스모포라 바신펙타(Neocosmospora vasinfecta) 유래의 케토아민 옥시다제, 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제, 패오스페리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum) 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제, 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제, 울로크라디움 서브틸러스(Ulocladium sp.) 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제 및 페니실리움 잔티넬룸(Penicillium janthinellum) 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제의 아미노산 서열이 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 66 위치의 라이신에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 66 위치의 라이신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 66 위치의 글리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 66 위치의 라이신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 66 위치의 프롤린, Curvularia clavata 유래의 케트아민 옥시다제에서는 66 위치의 라이신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 66 위치의 라이신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 66 위치의 프롤린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 66 위치의 프롤린, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 65 위치의 라이신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 66 위치의 라이신, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 66 위치의 글리신이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 67 위치의 발린에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 67 위치의 발린에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 67 위치의 프롤린, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 66 위치의 프롤린, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 67 위치의 발린, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 67 위치의 프롤린이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 70 위치의 글루타민에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 70 위치의 글루타민에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 70 위치의 글루타민, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 69 위치의 글루타민, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 70 위치의 글루타민이다.
또한, 본 발명에 있어서 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 96 위치의 아스파라긴산에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 96 위치의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Phaeosphaeria nodorum유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 95 위치의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 96 위치의 아스파라긴산이다.
또한, 본 발명에 있어서 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치란, 정확한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 98 위치의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 98 위치의 세린, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 98 위치의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 98 위치의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 98 위치의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 98 위치의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 98 위치의 알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 98 위치의 알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 97 위치의 세린, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 98 위치의 알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 98 위치의 세린이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 100 위치의 스레오닌에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 100 위치의 스레오닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 100 위치의 세린, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 100 위치의 글리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 100 위치의 스레오닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 100 위치의 글리신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 100 위치의 세린, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 100 위치의 스레오닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 100 위치의 글리신, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 99 위치의 스레오닌, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 100 위치의 글리신, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 100 위치의 세린이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 103 위치의 글리신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 103 위치의 글리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 103 위치의 글리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 103 위치의 글리신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 103 위치의 글리신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 103 위치의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 103 위치의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 103 위치의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 102 위치의 글리신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 103 위치의 글리신, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 103 위치의 글리신이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 106 위치의 아스파라긴산에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 106 위치의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 106 위치의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 106 위치의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 106 위치의 알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 106 위치의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 106 위치의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 106 위치의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 106 위치의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 105 위치의 글리신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 106 위치의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 106 위치의 세린이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 110 위치의 글루타민에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 110 위치의 라이신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 110 위치의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 110 위치의 글루타민, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 110 위치의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 110 위치의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 110 위치의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 110 위치의 글리신, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 109 위치의 라이신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 110 위치의 알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 110 위치의 라이신이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 113 위치의 알라닌에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 113 위치의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 113 위치의 스레오닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 113 위치의 스레오닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 113 위치의 스레오닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 113 위치의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 113 위치의 라이신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 113 위치의 알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 113 위치의 알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 112 위치의 세린, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 113 위치의 알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 113 위치의 아스파라긴산이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 114 위치의 루신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 114 위치의 루신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 114 위치의 루신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 114 위치의 루신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 114 위치의 루신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 114 위치의 루신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 114 위치의 이소루신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 114 위치의 루신, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 113 위치의 루신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 114 위치의 루신, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 114 위치의 루신이다.
또한, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시키는 것으로써 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 125 위치의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 125 위치의 아스파라긴, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 125 위치의 스레오닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 125 위치의 스레오닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 125 위치의 히스티딘, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 125 위치의 히스티딘, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 123 위치의 아스파라긴, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 124 위치의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 125 위치의 스레오닌, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 125 위치의 아스파라긴이다.
또한, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 154 위치의 세린에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시키는 것으로써 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 154 위치의 시스테인, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 154 위치의 세린, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 154 위치의 세린, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 154 위치의 세린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 154 위치의 세린, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 154 위치의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 152 위치의 세린, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 153 위치의 시스테인, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 154 위치의 세린, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 154 위치의 시스테인이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 156 위치의 아스파라긴산에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 156 위치의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 156 위치의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 156 위치의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 156 위치의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 156 위치의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 156 위치의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 156 위치의 아스파라긴산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 154 위치의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 155 위치의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 156 위치의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 156 위치의 아스파라긴산이다.
또한, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 259 위치의 발린에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시키는 것으로써 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 259 위치의 발린, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 257 위치의 발린, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 259 위치의 발린, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 257 위치의 발린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 259 위치의 발린, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 259 위치의 발린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 255 위치의 발린, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 259 위치의 발린, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 257 위치의 발린, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 259 위치의 발린이다.
또한, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 261 위치의 타이로신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시키는 것으로 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 261 위치의 타이로신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 259 위치의 타이로신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 261 위치의 타이로신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 259 위치의 타이로신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 261 위치의 타이로신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 261 위치의 타이로신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 257 위치의 타이로신, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 261 위치의 타이로신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 259 위치의 타이로신, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 261 위치의 타이로신이다.
또한, 본 발명에 있어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 263 위치의 글리신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것에 의하여 상기의 대응하는 위치의 아미노산을 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 263 위치의 글리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 261 위치의 글리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 263 위치의 글리신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 261 위치의 글리신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 263 위치의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 263 위치의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 259 위치의 글리신, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 263 위치의 글리신, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 261 위치의 글리신, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 263 위치의 글리신이다.
또한, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 355 위치의 알라닌에 대응하는 위치란, 확정한 아마드리아제의 아미노산 서열을, 서열 번호 1로 기재되는 코니오카에타 속 유래의 아마드리아제의 아미노산 서열과 비교했을 경우, 서열 번호 1의 아마드리아제의 355 위치의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기의 방법으로 아미노산 서열을 정렬시키는 것으로 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마드리아제에서는 355 위치의 알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 353 위치의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다제에서는 356 위치의 알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다제에서는 353 위치의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다제에서는 355 위치의 세린, Cryptococcus neoformans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 355 위치의 알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프룩토실 펩티드 옥시다제에서는 351 위치의 알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 355 위치의 알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 353 위치의 알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프룩토실 아미노산 옥시다제에서는 355 위치의 알라닌이다.
(본 발명의 아마드리아제의 생산)
상기와 같이 얻을 수 있는 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 생산능을 가지는 균주를 이용하여 해당 아마드리아제를 생산하는데, 상기 균주를 통상의 고체 배양법으로 배양해도 되지만, 가능한 액체 배양법을 사용하여 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 균주를 배양하는 배양 배지로는 예를 들면, 효모 엑기스, 트립톤(tryptone), 펩톤(peptone), 고기 엑기스(beef extract), 콘 스팁 리커(Corn Steep Liquor) 또는 대두 또는 밀겨의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에, 염화 나트륨, 인산 2 수소 칼륨, 인산수소 2 칼륨, 황산마그네슘, 염화 마그네슘, 염화 제 2철, 황산 제 2철 또는 황산 망간등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고 추가로 필요에 따라 당질 원료, 비타민등을 적절히 첨가한 것을 이용한다. 또한, 배지의 초발 pH는 pH7~9로 조정하는 것이 적당하다.
상기 배양은 20~42℃의 배양 온도, 바람직하게는 37℃ 전후의 배양 온도로 4~24시간, 더 바람직하게는 37℃ 전후의 배양 온도로 4~8시간, 환기 교반 심부배양, 진탕배양, 정치배양 등으로 실시하는 것이 바람직하다.
상기 배양 종료후, 상기 배양물로 아마드리아제를 채취하는데, 통상의 효소 채취 수단을 이용해 얻을 수 있다. 예를 들면, 상법(常法)에 의한 균체를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나, 또는 리소자임(lysozyme) 등의 용균효소를 이용하여 본 효소를 추출하거나 또는 톨루엔(toluene) 등의 존재하에서 진탕 또는 방치하고 용균을 실시하여 본 효소를 균체 외로 배출시킬 수 있다. 그리고, 상기 용액을 여과, 원심분리 등을 실시하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염(streptomycin sulfate), 프로타민 황산염(protamine sulfate), 또는 황산 망간(manganese(II) sulfate)등에 의해 핵산을 제거한 후, 이것에 황안(硫安), 알코올, 아세톤등을 첨가하여 분획하고 침전물을 채취하여 아마드리아제의 조효소(crude enzyme)를 얻는다.
상기 아마드리아제의 조효소(crude enzyme) 보다 더 아마드리아제 정제 효소표본을 얻으려면, 예를 들면, 세파덱스(sephadex), 슈퍼덱스(superdex) 또는 울트로겔(ultrogel)등을 이용하는 겔 여과법이온 교환체를 이용하는 흡착용출법;폴리-아크릴아미드 겔(poly-acrylamide gel) 등을 이용하는 전기 영동법; 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite)를 이용하는 흡착용출법; 자당 밀도 구배 원심법 등의 침강법; 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)법; 분자 체의 막 (molecular sieve membrane) 또는 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나 또는 이것들을 조합하여 실시함으로써, 정제된 아마드리아제 효소표본을 얻을 수 있다. 상기와 같이 하여, 얻고자 하는 기질 특이성이 개선된 아마드리아제를 얻을 수 있다.
(본 발명의 아마드리아제에서의 ε FK 에 대한 반응성의 저하)
상기와 같은 수단으로 얻을 수 있는 본 발명의 아마드리아제는 유전자 개변 등에 의해서 그 아미노산 서열에 변이를 일으킨 결과, 개변 전의 것과 비교해 기질 특이성이 향상된 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 개변 전의 것과 비교해서 「αFVH에 대한 반응성」에 대한 「εFK에 대한 반응성」의 비율, 또는 「αFV에 대한 반응성」에 대한 「εFK에 대한 반응성」의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 한다. 또는, 개변 전의 것과 비교해서 「αFVH에 대한 반응성」에 대한 「εFK에 대한 반응성」의 비율, 및 「αFV에 대한 반응성」에 대한 「εFK에 대한 반응성」의 비율이 모두 감소하고 있는 것을 특징으로 한다.
당화 헤모글로빈의 측정에 있어서, εFK에 대해 반응성이 높은 것은 측정 오차의 원인이 될 수 있기 때문에 εFK에 대한 반응성의 비율은 낮으면 낮을수록 바람직하다. 구체적으로는, 본 발명의 아마드리아제에 있어서, αFVH에 대한 반응성에 대해서 εFK에 대한 반응성의 비율을 나타내는 εFK/αFVH는, 개변전에 비해서 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더 바람직하게는 40% 이상 감소하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 아마드리아제에 있어서, αFV에 대해 반응성에 대한 εFK에 대한 반응성의 비율을 나타내는 εFK/αFV는, 개변 전에 비해서 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더 바람직하게는 40% 이하 감소하고 있는 것이 바람직하다.
αFVH에 대한 반응성에 대해 εFK에 대한 반응성의 비율, 또는 αFV에 대한 반응성에 대해 εFK에 대한 반응성의 비율은 공지의 아마드리아제의 측정법을 이용하고, 임의의 조건하에서 측정하여 개변 전의 것과 비교할 수 있다. 예를 들면, pH7.0으로서, 5 mM의 εFK를 첨가하여 측정한 활성을, 5 mM의 αFVH를 첨가하여 측정한 활성으로 나눈 비율을 구하여, αFVH에 대한 반응성에 대해 εFK에 대한 반응성의 비율을 산출하여 이것을 개변 전의 것과 개변 후의 것으로 비교할 수 있다. 또한, 예를 들면, pH7.0으로, 5 mM의 εFK를 첨가해 측정한 활성을 5 mM의 αFV를 첨가해 측정한 활성으로 나눈 비율을 구하여, αFV에 대한 반응성에 대해 εFK에 대한 반응성의 비율을 산출하여 이것을 개변 전의 것과 개변 후의 것으로 비교할 수 있다.
개변 전의 것과 비교하여 기질 특이성이 향상되고 있는 본 발명의 아마드리아제의 하나의 예로서, 예를 들면, 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-Y261W) 균주에 의해 생산되는 아마드리아제를 들 수 있다. 이러한 기질 특이성이 개선된 아마드리아제는 εFK를 노이즈로서 측정하는 정도가 양호하게 감소되어 HbA1c의 β-사슬 아미노 말단 유래의 당화 아미노산인 αFVH, 또는 HbA1c의 β-사슬 아미노 말단 유래의 당화 아미노산인 αFV만을 측정하는 것이 가능해지기 때문에 정밀도가 높은 측정을 실시할 수 있고 산업 이용상 매우 유리하다.
( 아마드리아제 활성의 측정 방법)
아마드리아제의 활성의 측정 방법으로는, 여러 가지의 방법을 이용할 수 있지만, 하나의 예로서 하기에 본 발명에서 이용하는 아마드리아제 활성의 측정 방법에 대해 설명한다.
본 발명에서의 아마드리아제의 효소 활성의 측정 방법으로는 효소의 반응에 의해 생성되는 과산화 수소량을 측정하는 방법이나 효소 반응에 의해 소비되는 산소량을 측정하는 방법 등이 주된 측정 방법으로 들 수 있다. 하기에, 하나의 예로서 과산화 수소량을 측정하는 방법에 대해 나타낸다.
본 발명에 있어서의 아마드리아제의 활성 측정에는 한정하지 않는 한, αFVH, 또는 εFK, 또는 αFV를 기질로서 이용한다. 또한, 효소 역가는 αFVH 또는 εFK, 또는 αFV를 기질로서 측정했을 때, 1분 동안에 1 μmol의 과산화 수소를 생성하는 효소량을 1 U라고 정의한다.
εFK 등의 당화 아미노산 및 αFVH등의 당화 펩티드는 예를 들면, 사카가미 등의 방법에 근거해 합성, 정제한 것을 이용할 수 있다(특개 2001-95598호 공보 참조).
A. 시약의 제조
(1) 시약 1 : 퍼옥시다제(peroxidase), 4-아미노안티피린(aminoantipyrine) 용액
5.0 kU의 퍼옥시다제(키코만 사제), 100 mg의 4-아미노안티피린(도쿄 카세이 사제)을 0.1 M의 인산칼륨 완충액(pH7.0 또는 pH7.5 또는 pH8.0)에 용해하여 1000 ㎖로 정용한다.
(2) 시약 2 : TOOS(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-Toluidine) 용액
500 mg의 TOOS(도진 화학 연구소 사제)를 이온 교환수에 용해하여 100 ㎖로 정용한다.
(3) 시약 3 : 기질 용액(150 mM;최종농도 5 mM)
αFVH 625 mg, 또는 εFK 462 mg 또는 αFV 419 mg를 이온 교환수에 용해하여 10 ㎖㎖로 정용한다.
B. 활성 측정법
2.7 ㎖의 시약 1, 100 ㎕의 시약 2, 및 100 ㎕의 효소액을 혼합하여 37℃로 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 100 ㎕ 더해 잘 혼합한 후, 분광 광도계(U-3010 A, 히타치 하이테크놀로지 사제)로 555 nm에 있어서의 흡광도를 측정한다. 측정치는 555 nm에서의 1 분 후에서 2 분 후의 1분당 흡광도 변화이다. 또한, 대조액은 100 ㎕의 시약 3 대신에 100 ㎕의 이온 교환수를 추가하는 것이외에는 상기와 동일하게 한 것이다. 상기 용액을 미리 제작해 둔 과산화 수소의 표준 용액을 시약 3 대신에, 또한, 효소액 대신에 이온 교환수를 이용하여 그 생성 색소량과의 관계를 조사한 그래프를 준비한다. 이 그래프를 이용하여 37℃, 1분 당 생성되는 과산화 수소의 마이크로 몰수를 계산하여 이 수치를 효소액중의 활성 단위로 한다.
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 한층 더 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명의 기술적 범위는 하기의 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
(1) 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223 -3- CFP - T7DNA 의 제조
코니오카에타(Coniochaeta) 속 유래 아마드리아제 유전자(서열 번호 2)의 재조합 플라스미드(plasmid)를 가지는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7) 균주(국제 공개 제 2007/125779호 참조)을, 3 ㎖의 LB-amp 배지 1%(w/v) 박토트립톤(bacto tryptone), 0.5%(w/v) 펩톤(peptone), 0.5%(w/v) NaCl, 50 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)에 접종 하고, 37℃으로 16시간 진탕배양하여 배양물을 얻었다. 이 배양물을 10,000 ×g로, 1분간 원심분리하는 것으로써 집균하여 균체를 얻었다. 이 균체로부터 진일루트 플라스미드 미니 프렙 키트(GenElute Plasmid Mini-Prep Kit)(시그마 알드리치 사제)를 이용해 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7를 추출하여 정제하고, 2.5 ㎍의 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 얻었다.
(2) 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223 -3- CFP - T7DNA 의 부위 특이적 개변 조작
상기 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로서 서열 번호 3, 4의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용하여 하기의 조건으로 PCR 반응을 실시했다.
즉, 10× KOD-Plus-완충액을 5 ㎕, dNTP가 각 2 mM가 되도록 제조된 dNTPs 혼합 용액을 5 ㎕, 25 mM의 MgSO4 용액을 2 ㎕, 주형이 되는 pKK223-3-CFP-T7DNA를 50 ng, 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 각각 15 pmol, KOD-Plus-를 1 Unit 더하고, 멸균수로 전량을 50 ㎕하여 제조한 반응액을 서멀 사이클러(thermal cycler)(에펜도르프 사제)를 이용하고, 94℃로 2분간 인큐베이트 하고, 계속해서, 「94℃, 15초」-「50℃, 30초」-「68℃, 6분」의 사이클을 30회 반복했다.
반응액의 일부를 1.0 % 아가로스겔로 전기영동 하고, 약 6,000 bp의 DNA가 특이적으로 증폭되고 있는 것을 확인했다. 이렇게 수득한 DNA를 제한 효소 DpnI(NewEngland Biolabs 사제)로 처리하여, 잔존하고 있는 주형 DNA를 절단 한 후, 대장균 JM109를 형질 전환하여 LB-amp 한천 배지에 도말했다. 생육한 콜로니를 LB-amp 배지에 접종해서 진탕 배양하여, 상기(1)와 같은 방법으로 플라스미드(plasmid) DNA를 단리했다. 플라스미드(plasmid)중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열을, 멀티-케필러리 DNA 해석 시스템 CEQ2000(베크만쿨터 사제)를 이용해서 결정하여, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 66 위치의 라이신이 글리신으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-K66G)를 얻었다.
계속해서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 67 위치의 발린을 프롤린으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 5, 6의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 67 위치의 발린이 프롤린으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-V67P)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 66 위치의 라이신을 글리신으로, 또한, 67 위치의 발린을 프롤린으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 7, 8의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 66 위치의 라이신이 글리신으로, 또한, 67 위치의 발린이 프롤린으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-K66GV67P)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 70 위치의 글루타민을 프롤린으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 9, 10의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 70 위치의 글루타민이 프롤린으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-Q70P)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 96 위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 11, 12의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 96 위치의 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-D96A)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 글루타민으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 13, 14의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산이 글루타민으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-E98Q)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 100 위치의 스레오닌을 아르기닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 15, 16의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 100 위치의 스레오닌이 아르기닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-T100R)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신을 아르기닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 17, 18의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신이 아르기닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-G103R)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 106 위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 19, 20의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 106 위치의 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-D106A)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민을 알라닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 21, 22의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민이 알라닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-Q110A)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 113 위치의 알라닌을 글루타민산으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 23, 24의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 113 위치의 알라닌이 글루타민산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-A113E)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신을 라이신으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 25, 26의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신이 라이신으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-L114K)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘을 글루타민산으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 27, 28의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘이 글루타민산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-H125E)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린을 글루타민산으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 29, 30의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린이 글루타민산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-S154E)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 156 위치의 아스파라긴산을 아스파라긴으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 31, 32의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 156 위치의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-D156N)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린을 알라닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 33, 34의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린이 알라닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFPT7-V259A)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신을 알라닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 35, 36의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신이 알라닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-Y261A)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신을 아르기닌으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 37, 38의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신이 아르기닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-G263R)를 얻었다.
이어서, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 355 위치의 알라닌을 라이신으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 서열 번호 39, 40의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 355 위치의 알라닌이 라이신으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T7-A355K)를 얻었다.
(3) 각종 개변형 아마드리아제의 생산
상기의 순서로 수득한 상기 재조합 플라스미드(plasmid)를 유지하는 각각의 대장균 JM109 균주를 0.1 mM의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3 ㎖에, 30℃으로 16시간 배양했다. 수득한 각 배양균체를 20 mM의 HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)으로 세정한 후, 상기 완충액에 현탁하여 초음파 파쇄처리를 실시하여, 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여, 기질 특이성 확인을 위한 효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
(4)ε FK /α FVH , ε FK /α FV 의 측정
상기 설명의 효소액을 이용하여, 상기의 B:활성 측정법으로 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정했다. 또한, 비교를 위해서, 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7) 균주로부터 생산한 개변 전의 아마드리아제에 대해서도 같은 측정을 실시했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다.
그 결과, 상기 설명의 효소 활성 측정의 결과로부터 수득한 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7) 균주에 의해서 생산되는 개변 전 아마드리아제의 εFK/αFVH는 0.316이며, εFK/αFV는 0.093이었다.
이것에 대하여 부위 특이적 변이 도입에 의해 제작한 개변 후의 각종의 아마드리아제의 εFK/αFVH, εFK/αFV, 및 개변 전 아마드리아제의 εFK/αFVH, εFK/αFV의 값을 100%로 했을 때의 개변 후 아마드리아제의 εFK/αFVH, εFK/αFV의 비율은, [표 1]로 나타냈다.
Figure pct00001
즉, [표 1]에 기재된 바와 같이, 이들 모든 개변형 아마드리아제에 대해서, 기질 특이성이 개선되고 있는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 2>
(96 위치의 아스파라긴산의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 96 위치의 아스파라긴산을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 표 2에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 41~46), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 96 위치의 아스파라긴산이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 2]에 나타냈다.
Figure pct00002
[표 2]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 96 위치의 아스파라긴산을 알라닌, 세린, 아스파라긴, 히스티딘으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 3>
(98 위치의 글루타민산의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 3]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 47~82), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조 효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 3]에 나타냈다.
Figure pct00003
[표 3]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 프롤린 이외의 다른 아미노산, 즉 글루타민, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌, 시스테인, 세린, 스레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 페닐 알라닌, 타이로신, 트립토판으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.또한, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 프롤린으로 치환했을 경우, 효소의 발현이 보이지 않게 되었다.
< 실시예 4>
(103 위치의 글리신의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 4]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 83, 84, 255, 256), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 4]에 나타낸다.
Figure pct00004
[표 4]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신을 아르기닌, 라이신, 히스티딘으로 치환한 개변형의 아마드리아제의, εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두, 개 변전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 5>
(106 위치의 아스파라긴산의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 106 위치의 아스파라긴산을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 5]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 85~100), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 106 위치의 아스파라긴산이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조 효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 5]에 나타낸다.
Figure pct00005
[표 5]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 106 위치의 아스파라긴산을 아스파라긴산보다 분자량이 작은 아미노산, 즉 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 스레오닌, 시스테인, 루신, 이소루신, 아스파라긴으로 치환한 개변형의 아마드리아제의, εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 6>
(110 위치의 글루타민의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 6]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 101~118), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 해 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 6]에 나타낸다.
Figure pct00006
[표 6]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민을 알라닌, 루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, 110 위치의 글루타민을 알라닌, 페닐 알라닌, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환인 것을 알 수 있었다. 한편, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민을 글루타민산으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH, εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.316, 0.093보다 높아졌다.
< 실시예 7>
(113 위치의 알라닌의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 113 위치의 알라닌을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 7]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 119, 120), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 113 위치의 알라닌이 라이신으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
이렇게 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양해 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 7]에 나타낸다.
Figure pct00007
[표 7]에 나타냈듯이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 113 위치의 알라닌을 글루타민산, 라이신으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮고, 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 8>
(114 위치의 루신의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 8]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 121~124), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
이렇게 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양해 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 8]에 나타낸다.
Figure pct00008
[표 8]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신을 라이신, 아르기닌으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다. 한편, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 114 위치의 루신을 글루타민산으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는, 개변 전의 값인 0.316보다 높아졌다.
< 실시예 9>
(125 위치의 히스티딘의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 9]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 125~134, 257~260), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
이렇게 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양해 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 9]에 나타낸다.
Figure pct00009
[표 9]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 125 위치의 히스티딘을 글루타민산, 아스파라긴, 라이신, 알라닌, 글루타민, 아르기닌, 루신, 페닐 알라닌, 타이로신으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, 125 위치의 히스티딘을 아스파라긴, 라이신, 글루타민, 아르기닌, 루신, 페닐 알라닌, 타이로신으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFV는 모두 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 10>
(154 위치의 세린의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 10]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 135~150), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
이렇게 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양해 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 10]에 나타낸다.
Figure pct00010
[표 10]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린을 글루타민산, 글리신, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 히스티딘, 시스테인으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다. 한편, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린을 알라닌으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 개변 전의 값인 0.316과 거의 같아, 저하가 보이지 않았다.
< 실시예 11>
(259 위치의 발린의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 11]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 151~154), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조 효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 11]에 나타낸다.
Figure pct00011
[표 11]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린을 알라닌, 시스테인, 세린으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, εFK/αFV는 모두 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 12>
(261 위치의 타이로신의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 12]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 155~162), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
이렇게 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양해 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 12]에 나타낸다.
Figure pct00012
[표 12]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신을 알라닌, 루신, 페닐 알라닌, 트립토판, 라이신으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는, 모두 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, 261 위치의 타이로신을 페닐 알라닌, 트립토판으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFV는, 모두 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 13>
(263 위치의 글리신의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로 하여 [표 13]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 163, 164, 261~266), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B활성 측정법으로 나타낸 방법에 의하여 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 13]에 나타낸다.
Figure pct00013
[표 13]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신을 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는 모두, 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되어, 또한, εFK/αFV는 모두, 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 14>
(355 위치의 알라닌의 점변이 시험)
기질 특이성의 향상에 효과가 높은 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 355 위치의 알라닌을 다른 아미노산으로 치환하여 기질 특이성이 뛰어난 개변형 아마드리아제의 탐색을 시도했다. 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T7DNA를 주형으로서 [표 14]에 나타낸 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 165~168, 267~270), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 355 위치의 알라닌이 각종 아미노산으로 치환된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
이렇게 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양해 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 14]에 나타냈다.
Figure pct00014
[표 14]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 355 위치의 알라닌을 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는, 모두 개변 전의 값인 0.316보다 낮은 값이 되었고, 또한, 355 위치의 알라닌을 라이신, 아르기닌, 글루타민산으로 치환한 개변형의 아마드리아제의, εFK/αFV는, 모두 개변 전의 값인 0.093보다 낮은 값이 되었다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
< 실시예 15>
(기질 특이성 개선에 유효한 변이의 축적)
[표 15]에 나타낸 각종 재조합 플라스미드(plasmid) DNA를 주형으로 하여 합성 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 7, 8, 17, 18, 39, 40, 51, 52, 55, 56, 87, 88, 115, 116, 131, 132, 135, 136, 139, 140), KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기 (2)와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109 균주의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열에 표 15중의 아미노산 변이의 란에 기재한 복수의 아미노산 치환이 도입된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 15]에 나타낸다.
Figure pct00015
[표 15]에 나타낸 다중 아미노산 치환이 도입된 개변형 아마드리아제에서는 εFK/αFVH, εFK/αFV는 모두 각 아미노산 치환을 단독으로 도입했을 경우와 비교해 낮은 값이 되었다. 그러므로, 서열 번호 1에 나타낸 아마드리아제의 기질 특이성 개선에 효과적인 단일 변이를 조합하는 것으로, 한층 더 기질 특이성의 개선을 기대할 수 있는 것이 분명해졌다.
< 실시예 16>
(기질 특이성 개선에 유효한 변이의 축적)
[표 16]에 나타낸 사용 플라스미드(plasmid) L 및 S를 제한 효소 KpnI및 HindⅢ로 이중 소화하여 사용 플라스미드(plasmid) L로부터 약 5.3 kbp의 DNA 단편을, 사용 플라스미드(plasmid) S로부터 약 0.8 kbp의 DNA 단편을 각각 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리한 후, Nucleo Spin Extract Ⅱ(Macherey-Nagel 사wp)로 겔에서 각 DNA 단편을 추출, 정제했다. 이어서, 양DNA 단편을 Ligation high Ver.2(토요 방적 사제)를 이용해 연결하여 연결한 플라스미드(plasmid) DNA를 이용해 대장균 JM109 균주를 형질 전환하고 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열에 [표 16] 안의 아미노산 변이 란에 기재한 복수의 아미노산 치환이 도입된 개변형 아마드리아제를 생산하는 대장균 JM109 균주를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법에 나타낸 방법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 16]에 나타낸다.
Figure pct00016
[표 16]중의 다중 아미노산 치환이 도입된 개변형 아마드리아제에서는 εFK/αFVH, εFK/αFV는 모두 각 아미노산 치환을 단독으로 도입했을 경우와 비교해 낮은 값이 되었다. 고로, 서열 번호 1에 나타낸 아마드리아제의 기질 특이성 개선에 효과적인 단일 변이를 조합하는 것으로, 한층 더 기질 특이성의 개선을 기대할 수 있는 것이 분명해졌다.
< 실시예 17>
( 개변형 아마드리아제의 생산 및 정제)
야생형 아마드리아제 및 상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제를 생산하는 형질 전환체, 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-Q110R), 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-Q110K), 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-Y261F), 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-Y261W), 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-E98A/V259C), 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-E98A/S154N/V259C)를, 0.1 mM의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 40 ㎖에 식균 하여 30℃로 16시간 배양했다. 수득한 각 배양균체를 20 mM의 HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)으로 세정한 후, 상기 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액 8 ㎖를 제조했다.
제조한 조효소액을 20 mM HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)으로 평형화한 4 ㎖의 Q-Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어 사제)에 흡착시켜, 다음에 80 ㎖의 상기 완충액으로 수지를 세정하여, 이어서, 100 mM NaCl를 포함한 20 mM HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)으로 수지에 흡착된 단백질을 용출하여 아마드리아제 활성을 나타내는 분획을 회수했다.
수득한 아마드리아제 활성을 나타내는 분획을, Amicon Ultra-15,30KNMWL(밀리포어 사제)로 농축했다. 그 후, 150 mM NaCl을 포함한 20 mM HEPES-NaOH 완충(pH7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/60 Superdex 200 pg(GE 헬스케어 사제)에 어플라이 하여 상기 완충액으로 용출하고, 아마드리아제 활성을 나타내는 분획을 회수하여 야생형 및 개변형 아마드리아제의 정제표본을 얻었다. 수득한 정제표본은 SDS-PAGE에 의한 분석에 의하여 단일 밴드수준까지 정제 되어 있는 것을 확인했다.
수득한 야생형 및 개변형 아마드리아제의 정제표본을 이용하여 αFVH, εFK, αFV를 기질로 했을 때의 효소 활성을 측정했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 17], [표 18]에 나타낸다. 나아가, 비활성의 산출에 이용한 단백질 농도는 Bradford법에 근거하는 비색 정량법, 또는 280 nm에서의 흡광도를 이용한 자외 흡수법으로 측정했다. 각 정량법에 의해 측정한 단백질 농도로부터 산출한 비활성은 각각 U/mg, U/A280 으로 나타냈다.
Figure pct00017
Figure pct00018
[표 17]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민을 아르기닌, 라이신으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는, 모두 개변 전의 값인 0.310보다 낮은 값을 나타냈고, 또한, 110 위치의 글루타민을 아르기닌으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFV는 개변 전의 값인 0.092보다 낮은 값을 나타냈다. 또한, [표 18]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 261 위치의 타이로신을 페닐 알라닌, 또는 트립토판으로 치환한 개변형의 아마드리아제, 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 알라닌으로, 한편 259 위치의 발린을 시스테인으로 치환한 개변형의 아마드리아제, 및 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 알라닌으로, 또한, 154 위치의 세린을 아스파라긴으로, 또한, 259 위치의 발린을 시스테인으로 치환한 개변형의 아마드리아제의 εFK/αFVH는, 모두 개변 전의 값인 0.310보다 낮은 값을 나타냈고, 또한, εFK/αFV는 개변 전의 값인 0.092보다 낮은 값을 나타냈다. 상기 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환이었다.
또한, 야생형 및 각 개변형 아마드리아제의 정제표품을 이용해 효소 활성을 측정하여 산출한 εFK/αFVH, εFK/αFV의 값은, 야생형 및 각 개변형 아마드리아제의 조효소액을 이용해 효소 활성을 측정해 산출한 εFK/αFVH, εFK/αFV의 값과 큰 차이는 보이지 않았다. 따라서, 개변형 아마드리아제의 조효소액을 이용해 효소 활성의 측정에 대해 기질 특이성의 개선이 인정되면, 개변형 아마드리아제의 정제 효소표본을 이용한 효소 활성의 측정에 대해서도 기질 특이성의 개선이 인정된다고 보는 것이 가능하다.
< 실시예 18>
( 개변형 아마드리아제에 의한α FVH 의 정량)
다음으로, 개변형 아마드리아제를 이용해 HbA1c의 β-사슬 아미노 말단에서(보다) 프로테아제등에 의해 유리되는αFVH를 정량할 때에, 공존하는εFK가 측정값에 주는 영향에 대해 평가했다.
C. 시약의 제조
(4) 시약 4: 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액
7.5 kU의 퍼옥시다제(키코만 사제), 150 mg의 4-아미노안티피린(도쿄 카세이 사제)을 0.15 M의 인산칼륨 완충액(pH6.5)에 용해하여 1000 ㎖로 정용한다.
(5) 시약 5: TOOS 용액
500 mg의 TOOS(도진 화학 연구소제)를 이온 교환수에 용해하여 100 ㎖로 정용한다.
(6) 시약 6: 아마드리아제 용액
정제한 서열 번호 1로 기재된 아마드리아제 및 서열 번호 1로 기재된 아마드리아제의 98 위치의 글루타민산을 알라닌으로, 또한, 154 위치의 세린을 아스파라긴으로, 한편 259 위치의 발린을 시스테인으로 치환한 개변형의 아마드리아제(서열 번호 271)를 0.01 M의 인산칼륨 완충액(pH6.5)로 희석하여 각각 1.0 U/㎖, 2.3 U/㎖가 되도록 제조했다.
(7) 시약 7: αFVH 용액
αFVH 625 mg를 이온 교환수에 용해하여 10 ㎖로 정용하여, 150 mM의 αFVH 용액을 제조했다. 이어서, 150 mM의 αFVH 용액을 이온 교환수로 정용하는 것으로, 90 M, 180 M, 270 M, 360 M, 450 M의 αFVH 용액을 제조했다.
(8) 시약 8: 혈액 모델 시료
εFK462 mg를 이온 교환수에 용해하여 10 ㎖에 희석하는 것으로 제조한 150 mM의 εFK 용액과 상기 (7)로 제조한 150 mM의 αFVH 용액을 이온 교환수로 희석하여 이하의 4 종류의 혈액 모델 용액을 제조했다.
8-1. 215 μM αFVH
8-2. 215 μM αFVH, 215 μM εFK
8-3. 215 μM αFVH, 1075 μM εFK
8-4. 215 μM αFVH, 2150 μM εFK
또한, 헤모글로빈 농도 15 g/dL, HbA1c 6.1%(JDS치, NGSP치 6.5%상당, IFCC치 46.5 mmol/mol 상당)의 혈액에서는, 헤모글로빈의 분자량을 65 kDa로 하면, HbA1c의 β-사슬 아미노 말단으로부터 유리되는 αFVH의 농도는 215 μM가 된다.
( 개변형 아마드리아제에 의한α FVH 의 정량성의 확인)
1.8 ㎖의 시약 4, 100 ㎕의 시약 5 및 100 ㎕의 시약 6을 혼합하여 37℃로 5분간 예비 가온한다. 그 후, 37℃로 5분간 예비 가온해 둔 시약 7을 1000 ㎕ 더해 잘 혼합한 후, 분광 광도계(U-3010 A, 히타치 하이테크놀로지 사제)로 555 nm에서의 흡광도를 측정하여 그 1분간 당의 흡광도 변화량(ΔA555)을 산출했다. 또한, 대조액은, 1000 ㎕의 시약 7 대신에 1000 ㎕의 이온 교환수를 추가하는 이외는 상기와 같게 한 것이다. 결과를 [도 2]에 나타냈다. [도 2]에 분명하게 나타낸 바와 같이, αFVH 농도와 흡광도 변화량(ΔA555)에는 상관관계가 성립했다. 따라서, 서열 번호 1로 기재된 아마드리아제 및 서열 번호 271로 기재된 개변형 아마드리아제는 모두, 90 μM에서 450 μM의 범위에서αFVH의 정량에 이용할 수 있는 것을 확인했다.
( 개변형 아마드리아제에 의한 혈액 모델 시료의 정량)
1.8 ㎖의 시약 4, 100 ㎕의 시약 5 및 100 ㎕의 시약 6을 혼합하여 37℃로 5분간 예비 가온한다. 그 후, 37℃로 5분간 예비 가온해 둔 시약 8-1에서 8-4의 어느 하나를 1000 ㎕를 더해 잘 혼합한 후, 분광 광도계(U-3010 A, 히타치 하이테크놀로지 사제)로 555 nm에서의 흡광도를 측정하여 1분 당의 흡광도 변화량(ΔA555)을 산출했다. 또한, 대조액은, 1000 ㎕의 시약 8-1 ~ 8-4 대신에 1000 ㎕의 이온 교환수를 추가하는 이외는 상기와 같게 한 것이다. 결과를 [표 19]에 나타냈다. [표 19]에 분명하게 나타낸 바와 같이, 서열 번호 1로 기재된 아마드리아제를 이용했을 경우, αFVH와 같은 농도의 εFK가 공존하면, 그 측정치는 본래의 측정치와 비교해 3% 미만의 차이를 보였고, αFVH의 5배, 10배 농도의 εFK가 공존하면, 그 측정치는 본래의 측정치와 비교하여 8%, 17%의 차이를 보였다. 그에 대하여 서열 번호 271로 기재된 개변형 아마드리아제를 이용했을 경우에는 αFVH의 같은 농도, 5배 농도의 εFK가 공존해도, 본래의 측정치와의 차이는 1% 미만이며, 또한,αFVH의 10배 농도의εFK가 공존해도, 본래의 측정치와의 차이는 2% 미만이다. 따라서, 서열 번호 271로 기재된 개변형 아마드리아제를 이용하면, εFK가 공존하고 있는 시료에서도 정확하게 αFVH만을 정량하는 것이 가능하다.
Figure pct00019
< 실시예 19>
(아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자의 클로닝 및 대장균으로의 발현)
(a) 아스페르길루스 니드랑스 FGSC A26 균주로부터의 전체 RNA의 추출
아스페르길루스 니드랑스 FGSC A26 균주를, 액체 배지(0.4% 이스트 익스트랙트(yeast extract), 1.0% 맬트 익스트랙트(malt extract), 0.1% 트립톤, 0.1% 인산 2 수소 1 칼륨, 0.05% 황산마그네슘, 2.0% 글루코오스, pH6.5)에서, 30℃로 24시간 배양했다. 배양 후, 회수한 균체를 액체 질소로 분쇄하여 ISOGEN(니뽄 진 사베)를 이용해 부속의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 제조했다. 또한, 제조한 전체 RNA를 DNaseI(인비트로젠 사제)로 처리함으로써, DNA의 혼입을 막았다.
(b) 아스페르길루스니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 cDNA의 클로닝
수득한 전체 RNA 1 ㎍를 이용하여, Prime Script RT-PCR Kit(다카라 바이오 사제)로 부속의 프로토콜에 따라서 RT-PCR를 실시했다. 이 때, 역전사 반응에서는 Kit 부속의 Oligo dT Primer를 이용하고 그 후의 PCR 반응에서는 서열 번호 169, 170로 기재된 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용했다. 그 결과, 약 1,300 bp의 cDNA 단편이 특이적으로 증폭했다. 다음으로, 상기 증폭한 cDNA 단편에 대해 서열 해석을 실시한 결과, 서열 번호 171로 기재된 1,317 bp로 구성되는 염기 서열인 것을 알 수 있었다. 또한, 서열 번호 171에서 예상되는 아미노산 서열(서열 번호 172)은 도 1의 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 서열과 일치했다.
(c) 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 대장균에서의 발현
이서서, 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제를 대장균으로 발현시키기 위해서, 이하의 순서를 실시했다. 우선, 상기 클로닝 한 cDNA 단편은 서열 번호 169, 170으로 기재된 합성 뉴클레오티드 유래의 NdeI 사이트와 BamHI 사이트를 각각 5'말단과 3'말단에 가지고 있기 때문에, 클로닝 한 cDNA 단편을 NdeI와 BamHI(다카라 바이오 사제)의 2 종류의 제한 효소로 처리하여 pET-22 b(+) Vector(노바젠 사제)의 NdeI-BamHI 사이트에 삽입하는 것으로, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX를 취득했다.
다음으로, 아스페르길루스니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제에 프룩토실 펩티드 옥시다제 활성을 부여하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX를 주형으로 하고, 서열 번호 173, 174의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 172로 기재된 아미노산 서열의 59 위치의 세린이 글리신으로 치환된 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-AnFX)를 취득했다. 그리고, 상기 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX를 대장균 BL21(DE3) 균주(니뽄 진 사제)로 형질 전환하여, 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제를 생산하는 대장균을 취득했다.
상기로 수득한 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제를 생산하는 대장균 BL21(DE3)를, Over night Express Autoinduction System 1(노바젠 사제)의 시약을 더한 LB-amp 배지에서 30℃로 18시간 진탕 배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파 파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법에 의하여 αFV에 대한 효소 활성을 측정했는데, 2.2 U/㎖였다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다.
< 실시예 20>
(아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자으의 점변이 도입)
기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX를 주형으로 하고, 서열 번호 175, 176의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 172로 기재된 아미노산 서열의 153 위치의 시스테인이 아스파라긴산으로 치환된 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-AnFX-C153D)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX를 주형으로 하고, 서열 번호 177, 178및 179, 180의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 172로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린이 각각 알라닌, 시스테인으로 치환된 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-AnFX-V259A, pET22b-AnFX-V259C)를 얻었다.
이서서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX를 주형으로 하고, 서열 번호 181, 182및 183, 184의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 172로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신이 각각 라이신, 아르기닌으로 치환된 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-AnFX-G263K, pET22b-AnFX-G263R)를 얻었다.
< 실시예 21>
( 점변이를 도입한 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 기질 특이성 개선 효과의 평가)
상기로 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-AnFX, pET22b-AnFX-C153D, pET22b-AnFX-V259A, pET22b-AnFX-V259C, pET22b-AnFX-G263K, pET22b-AnFX-G263R를 각각 유지하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Auto induction System 1(노바젠 사제)의 시약을 추가한 LB-amp 배지에 있어 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파 파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하여, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV, αFVH 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다. 결과를 [표 20]에 나타낸다.
Figure pct00020
[표 20]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 172로 기재된 아미노산 서열의 153 위치의 시스테인을 아스파라긴산으로, 259 위치의 발린을 알라닌 또는 시스테인으로, 263 위치의 글리신을 라이신 또는 아르기닌으로 치환하는 것으로써, 아스페르길루스 니드랑스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 εFK/αFVH 및 εFK/αFV는 모두 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 따라서, 이것들 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환인 것을 알 수 있었다.
< 실시예 22>
( 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자의 클로닝 및 대장균으로의 발현)
(a) 페니실리움 크리소게니움 NBRC9251 균주로부터의 전체 RNA의 추출
페니실리움 크리소게니움 NBRC9251 균주를, 액체 배지(0.4% 이스트 익스트랙트, 1.0% 맬트 익스트랙트, 0.1% 트립톤, 0.1% 인산 2 수소 1 칼륨, 0.05% 황산마그네슘, 2.0% 글루코오스, pH6.5)에서, 30℃으로 24시간 배양하여 상기와 동일한 순서로 전체 RNA를 제조했다.
(b) 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 cDNA의 클로닝
수득한 전체 RNA 1 ㎍를 이용하여, 상기와 같게 해 RT-PCR를 실시했다. 이 때, 역전사 반응에서는 Kit 부속의 Oligo dT Primer를 이용하고 그 후의 PCR 반응에서는 서열 번호 185, 186로 기재된 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용했다. 그 결과, 약 1,300 bp의 cDNA 단편이 특이적으로 증폭했다. 다음으로, 상기 증폭한 cDNA 단편에 대해 서열 해석을 실시한 결과, 서열 번호 187로 기재된 1,317 bp로 구성되는 염기 서열인 것을 알 수 있었다. 또한, 서열 번호 187로 예상되는 아미노산 서열(서열 번호 188)은, 도 1로 기재된 페실시리움 얀시넬리움의 서열의 69번째의 루신이 트립토판으로, 142번째의 스레오닌이 알라닌으로 치환된 것과 일치하고 있었다.
(c) 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 대장균으로의 발현
이어서, 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제를 대장균으로 발현시키기 위해서, 이하의 순서를 실시했다. 우선, 상기로 클로닝 해 온 cDNA 단편은 서열 번호 185, 186로 기재된 합성 뉴클레오티드 유래의 NdeI 사이트와 BamHI 사이트를 각각 5'말단과 3'말단에 가지고 있기 때문에, 클로닝 한 cDNA 단편을 NdeI와 BamHI(다카라 바이오 사제)의 2 종류의 제한 효소로 처리하여 pET-22 b(+) Vector(노바젠 사제)의 NdeI-BamHI 사이트에 삽입하는 것으로, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX'를 취득했다.
다음에, 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제에 프룩토실 펩티드 옥시다제 활성을 부여하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX를 주형으로 하여, 서열 번호 189, 190의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 188로 기재된 아미노산 서열의 60 위치의 세린이 글리신으로 치환된 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-PcFX)를 취득했다. 그리고, 이 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX를 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하는 것으로, 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제를 생산하는 대장균을 취득했다.
상기로 수득한 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제를 생산하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Auto induction System 1(노바젠 사)의 시약을 더한 LB-amp 배지에 있어 30℃으로 18시간 진탕 배양했다. 수득한 각 배양균체를 버그 부스터 단백질 추출 반응물(Bug Buster Protein Extraction Reagent)(노바젠 사)를 이용해 용균 한 후, 20,000 ×g로 10분간 원심분리하는 것으로 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV에 대한 효소 활성을 측정했는데, 0.090 U/㎖였다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다.
< 실시예 23>
( 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자으로의 점변이 도입)
기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX를 주형으로 하고, 서열 번호 191, 192의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 188로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 라이신이 아르기닌으로 치환된 페니시리움크리소게남 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-PcFX-K110R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX를 주형으로 하고, 서열 번호 193, 194의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 188로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 시스테인이 아스파라긴산으로 치환된 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-PcFX-C154D)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX를 주형으로 하여, 서열 번호 195, 196의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 188로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신이 라이신으로 치환된 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-PcFX-G263K)를 얻었다.
< 실시예 24>
( 점변이를 도입한 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 특성 평가)
상기로 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-PcFX, pET22b-PcFX-K110R, pET22b-PcFX-C154D, pET22b-PcFX-G263K를 각각 유지하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Autoinduction System 1(노바젠 사제)의 시약을 추가한 LB-amp 배지에 있어 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 Bug Buster Protein Extraction Reagent(노바젠 사)를 이용해 용균 한 후, 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV, αFVH 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다. 결과를 [표 21]에 나타냈다.
Figure pct00021
[표 21]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 188로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 라이신을 아르기닌으로, 154 위치의 시스테인을 아스파라긴산으로 치환하는 것으로써, 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 εFK/αFVH 및 εFK/αFV는 모두 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 또한, 서열 번호 188로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신을 라이신으로 치환하는 것으로써, 페니실리움 크리소게니움 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 εFK/αFVH는 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 따라서, 이들 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환인 것을 알 수 있었다.
< 실시예 25>
( 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 대장균으로의 발현)
기존의 프룩토실 아미노산 옥시다제의 아미노산 서열을 기초로, 게놈 데이타베이스(http://www.genome.jp/tools/blast/)에서 검색한 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제(Cryptococcus neoformans B-3501A: GENE ID : 4934641 CNBB5450 hypothetical protein)에 대해서, C말단으로부터 34 아미노산을 제외한, 서열 번호 197으로 기재된 443 아미노산을 대장균으로 발현시키는 것을 시도했다. 거기서, 서열 번호 197의 아미노산 서열을 코드하고 또한, 대장균 발현용으로 코돈을 최적화한, 서열 번호 198으로 기제된 1,332 bp의 유전자(종지 코돈 TGA를 포함한다)를, 정법인 유전자 단편의 PCR에 의한 전(全)합성으로 cDNA를 전합성하여 취득했다. 이 때, 서열 번호 1의 5'말단, 3'말단에는 각각 NdeI 사이트와 BamHI 사이트를 부가했다. 또한, 클로닝 한 유전자 서열로부터 예상되는 아미노산 서열은 도 1의 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 C말단으로부터 34 아미노산을 제외한 서열과 일치하고 있는 것을 확인했다.
이어서, 취득한 서열 번호 198의 유전자를 대장균으로 발현시키기 위해서, 이하의 순서를 실시했다. 우선, 상기로 전합성한 유전자를 NdeI와 BamHI(다카라 바이오 사제)의 2 종류의 제한 효소로 처리하고 pET-22 b(+) Vector(노바젠 사제)의 NdeI-BamHI 사이트에 삽입하는 것으로, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX를 취득하고 대장균 BL21(DE3)로 형질전환했다. 다음으로, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX를 유지하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Autoinduction System 1(노바젠 사제)의 시약을 추가한 LB-amp 배지서 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파 파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV에 대한 효소 활성을 측정했는데, 각각 2.2 U/㎖였다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다.
< 실시예 26>
( 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자의 점변이 도입)
기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX를 주형으로 하여, 서열 번호 199, 200의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 197로 기재된 아미노산 서열의 100 위치의 스레오닌이 아르기닌으로 치환된 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-CnFX-T100R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX를 주형으로 하여, 서열 번호 201, 202의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제))를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 197로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 세린이 아르기닌으로 치환된 클립트 코카스네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-CnFX-S110R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22bCnFX를 주형으로 하여, 서열 번호 203, 204의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 197로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린이 아스파라긴으로 치환된 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-CnFX-S154N)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX를 주형으로 하여, 서열 번호 205, 206및 207, 208의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 197로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린이 각각 알라닌, 시스테인으로 치환된 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-CnFX-V259A, pET22b-CnFX-V259C)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX를 주형으로 하고, 서열 번호 209, 210및 211, 212의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 197로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 세린이 각각 라이신, 아르기닌으로 치환된 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-CnFX-S263K, pET22b-CnFX-S263R)를 얻었다.
< 실시예 27>
( 점변이를 도입한 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 특성 평가)
상기로 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-CnFX-T100R, pET22b-CnFX-S110R, pET22b-CnFX-S154N, pET22b-CnFX-V259A, pET22b-CnFX-V259C, pET22b-CnFX-S263K, pET22b-CnFX-S263R를 각각 유지하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Autoinduction System 1(노바젠 사제)의 시약을 추가한 LB-amp 배지서 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV, αFVH 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및εFK/αFV를 산출했다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다. 결과를 [표 22]에 나타낸다.
Figure pct00022
[표 22]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 197로 기재된 아미노산 서열의 100 위치의 스레오닌을 아르기닌으로, 110 위치의 세린을 아르기닌으로, 154 위치의 세린을 아스파라긴으로, 259 위치의 발린을 알라닌 또는 시스테인으로, 263 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환하는 것으로써, 크립토코쿠스 네오포르만스 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 εFK/αFVH 및 εFK/αFV는 모두 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 따라서, 이들 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환인 것을 알 수 있었다.
< 실시예 28>
( 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제의 대장균에서의 발현)
네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제를 대장균으로 발현시키는 것을 시도했다. 벌써 밝혀지고 있는 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제의 아미노산 서열을 서열 번호 213으로 나타냈다(특허 문헌 1 참조). 이 서열 번호 213으로 기재된 441 아미노산을 코드하고, 또한, 대장균 발현용으로 코돈을 최적화한, 서열 번호 214로 기재된 1,326 bp의 유전자(종지 코돈 TGA를 포함한다)를 정법인 유전자 단편의 PCR에 의한 전합성에 의해 cDNA를 전합성하여 취득했다. 이 때, 서열 번호 1의 5'말단, 3'말단에는 각각 NdeI 사이트와 BamHI 사이트를 부가했다. 또한, 클로닝 한 유전자 서열로부터 예상되는 아미노산 서열 전체 길이는 도 1의 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제의 서열과 일치하고 있는 것을 확인했다.
이어서, 취득한 서열 번호 214의 유전자를 대장균으로 발현시키기 위해서, 이하의 순서를 실시했다. 우선, 상기로 전합성한 유전자를 NdeI와 BamHI(다카라 바이오 사)의 2 종류의 제한 효소로 처리하여 pET-22b(+) Vector(노바젠 사)의 NdeI-BamHI 사이트에 삽입하는 것으로, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NvFX를 취득하여 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환했다. 다음에, 이 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NvFX를 유지하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Autoinduction System 1(노바젠 사제)의 시약을 추가한 LB-amp 배지에서 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV에 대한 효소 활성을 측정했는데, 19.3 U/㎖였다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다.
< 실시예 29>
( 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자으로의 점변이 도입)
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NFX를 주형으로 하여, 서열 번호 215, 216 및 217, 218 및 219, 220 및 221, 222의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 프룩토실 아미노산 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산이 각각 글루타민, 히스티딘, 라이신, 아르기닌으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-E98Q, pET22b-NvFX-E98H, pET22b-NvFX-E98K, pET22b-NvFX-E98R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NFX를 주형으로 하고, 서열 번호 223, 224의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 케토아민 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 103 위치의 글리신이 아르기닌으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-G103R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NFvX를 주형으로 하고, 서열 번호 225, 226의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 케토아민 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 글루타민산이 아르기닌으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-E110R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NvFX를 주형으로 하여, 서열 번호 227, 228및 229, 230의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 케토아민 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 154 위치의 세린이 각각 아스파라긴, 아스파라긴산으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-S154N, pET22b-NvFX-S154D)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NvFX를 주형으로 하여, 서열 번호 231, 232 및 233, 234의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 케토아민 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린이 각각 알라닌, 시스테인으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-V259A, pET22b-NvFX-V259C)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NvFX를 주형으로 하여, 서열 번호 235, 236 및 237, 238의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 케토아민 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신이 각각 라이신, 아르기닌으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-G263K, pET22b-NvFX-G263R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NvFX를 주형으로 하여, 서열 번호 239, 240의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 케토아민 옥시다제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 66 위치의 라이신이 글리신에, 67 위치의 발린이 프롤린으로 치환된 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pET22b-NvFX-K66GV67P)를 얻었다.
< 실시예 30>
( 점변이를 도입한 네오코스모스포라 바신펙타 유래 케토아민 옥시다제의 특성 평가)
상기로 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pET22b-NFX-E98Q, pET22b-NFX-E98H, pET22b-NFX-E98K, pET22b-NFX-E98R, pET22b-NFX-E110R, pET22b-NFX-S154N, pET22b-NFX-S154D, pET22b-NFX-V259A, pET22b-NFX-V259C, pET22b-NFX-G263K, pET22b-NFX-G263R, pET22b-NFX-K66GV67P를 각각 유지하는 대장균 BL21(DE3)를, Overnight Express Autoinduction System 1(노바젠 사제)의 시약을 추가한 LB-amp 배지에서 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)에 희석하여 초음파 파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV,αFVH 및εFK에 대한 효소 활성을 측정하여εFK/αFVH 및εFK/αFV를 산출했다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH7.5로 조정한 것을 사용했다. 결과를 [표 23]에 나타냈다.
Figure pct00023
[표 23]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 213으로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 글루타민 또는 히스티딘 또는 라이신 또는 아르기닌으로, 103 위치의 글리신을 아르기닌으로, 110 위치의 글루타민산을 아르기닌으로, 154 위치의 세린을 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로, 259 위치의 발린을 알라닌 또는 시스테인으로, 263 위치의 글리신을 라이신 또는 아르기닌으로 치환하는 것으로써, 네오코스모스포라 바신펙타 유래 프룩토실 아미노산 옥시다제의 εFK/αFVH 및 εFK/αFV는 모두 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 또한, 66 위치의 라이신을 글리신으로, 또한, 67 위치의 발린을 프롤린으로 치환하는 것으로써, 네오코스모스포라바신페크타 유래 케토아민 옥시다제의 εFK/αFVH는 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 따라서, 이들 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환인 것을 알 수 있었다.
< 실시예 31>
( 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자으로의 점변이 도입)
서열 번호 241은 열안정성 향상형 변이(G184D, N272D, H388Y)를 도입한 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제의 아미노산 서열이며, 서열 번호 241의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 242)를 삽입한 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5를 대장균으로 발현시키는 것으로써, 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제의 활성이 확인되고 있다(국제 공개 제 2007/125779호 참조).
유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제에 기질 특이성 향상형 변이를 도입하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하여, 서열 번호 243, 244의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 세린이 알라닌으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-S98A)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하여, 서열 번호 245, 246의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 라이신이 아르기닌으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-K110R)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하고, 서열 번호 249, 250 및 251, 252의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 259 위치의 발린이 각각 알라닌, 시스테인으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-V259A, pUTE100K'-EFP-T5-V259C)를 얻었다.
이어서, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하여, 서열 번호 253, 254의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 263 위치의 글리신이 라이신으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-G263K)를 얻었다.
< 실시예 32>
( 점변이를 도입한 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제의 기질 특이성 개선 효과의 평가)
상기로 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5-S98A, pUTE100K'-EFP-T5-K110R, pUTE100K'-EFP-T5-V259A, pUTE100K'-EFP-T5-V259C, pUTE100K'-EFP-T5-G263K를 각각 유지하는 대장균 DH5α 균주를, 0.1 M의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에서 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 린 산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV, αFVH 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH8.0으로 조정한 것을 사용했다. 활성 측정 결과를 [표 24]에 나타낸다.
Figure pct00024
[표 24]에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 세린을 알라닌으로, 110 위치의 라이신을 아르기닌으로, 259 위치의 발린을 알라닌 또는 시스테인으로, 263 위치의 글리신을 라이신으로 치환하는 것으로써, 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제의 εFK/αFVH 및 εFK/αFV는 모두 치환 전보다 낮은 값이 되었다. 따라서, 이들 아미노산 치환은 기질 특이성이 개선된 아마드리아제의 제작에 유효한 치환인 것을 알 수 있었다.
< 실시예 33>
(유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자의 기질 특성 향상형 다중 변이체 의 제작)
유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자의 기질 특이성 향상형 다중 변이체를 제작하는 것으로, εFK로의 반응성을 현저하게 저하시킨 아마드리아제의 개발을 시도했다.
재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5-V259C를 주형으로 하고, 서열 번호 243, 244의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 세린이 알라닌으로, 259 위치의 발린이 시스테인으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-S98A/V259C)를 얻었다.
이와 같이 하여, 기질 특이성을 향상시키기 위한 점변이를 도입하는 것을 목적으로 하고, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5-K110R를 주형으로 하고, 서열 번호 247, 248의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 라이신이 아르기닌으로, 154 위치의 시스테인이 아스파라긴으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-K110R/C154N)를 얻었다.
이와 같이 하여, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5-V259C를 주형으로 하고, 서열 번호 245, 246의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 110 위치의 라이신이 아르기닌으로, 259 위치의 발린이 시스테인으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-K110R/V259C)를 얻었다.
이와 같이 하여, 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5-S98A-V259C를 주형으로 하고, 서열 번호 245, 246의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용해 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 DH5α의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 세린이 알라닌으로, 110 위치의 라이신이 아르기닌으로, 259 위치의 발린이 시스테인으로 치환된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pUTE100K'-EFP-T5-S98A/K110R/V259C)를 얻었다.
< 실시예 34>
(유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제 유전자으로의 기질 특성 향상형 다중 변이의 도입에 의한 기질 특이성 개선 효과의 평가)
상기로 수득한 재조합 플라스미드(plasmid) pUTE100K'-EFP-T5-S98A/V259C, pUTE100K'-EFP-T5-K110R/C154N, pUTE100K'-EFP-T5-K110R/V259C, pUTE100K'-EFP-T5-S98A/K110R/V259C를 각각 유지하는 대장균 DH5α 균주를, 0.1 M의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에서 30℃로 18시간 진탕배양했다. 수득한 각 배양균체를 10 mM의 인산칼륨 완충액(pH7.5)로 현탁하여 초음파파쇄처리를 실시하고 20,000 ×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다. 이 조효소액을 이용하고, 상기의 B:활성 측정법으로 αFV, αFVH 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 다만, 이 때의 활성 측정의 시약 1은 pH8.0으로에 조정한 것을 사용했다. 활성 측정 결과를 [표 25]에 나타낸다.
Figure pct00025
[표 25]에 나타낸 바와 같이, 다중 아미노산 치환이 도입된 유페니실리움 테레니움 유래 아마드리아제에서는, εFK/αFVH, εFK/αFV는 모두 각 아미노산 치환을 단독으로 도입했을 경우와 비교해 더 낮은 값이 되었고, εFK으로의 반응성이 현저하게 저하하는 것이 분명해졌다.
<실시예 35>
(재조합 플라스미드( plasmid ) pKK223 -3- CFP - T9 DNA 의 제조)
서열 번호 272는 열안정성 향상형 변이(G184D, F265L, N272D, H302R, H388Y)를 도입한 코니오카에타 속 유래 아마드리아제의 아미노산 서열이며, 서열 번호 273의 유전자에 코드되고 있다.
코니오카에타 속 유래 아마드리아제 유전자(서열 번호 273)의 재조합 플라스미드(plasmid)를 가지는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T9) 균주(국제 공개 제 2007/125779호 참조)를 <실시예 1>에 기재된 방법과 동일하게 배양하여, 배양물을 10,000 ×g로, 1분간 원심분리하여 집균하고 균체를 얻었다. 상기 균체로부터, Gen Elute Plasmid Mini-Prep Kit(시그마 알드리치 사제)를 이용해 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T9를 추출해 정제하여 2.5 ㎍의 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T9 DNA를 얻었다.
(재조합 플라스미드( plasmid ) pKK223 -3- CFP - T9 DNA 의 부위 특이적 개변 조작)
서열 번호 272로 기재된 아미노산 서열의 98 위치의 글루타민산을 알라닌으로, 154 위치의 세린을 아스파라긴으로, 259 위치의 발린을 시스테인으로 치환하기 위해서, 재조합 플라스미드(plasmid) pKK223-3-CFP-T9 DNA를 주형으로하여 서열 번호 55, 56의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적 사제)를 이용하여 <실시예 1>에 기재된 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 유지하는 플라스미드(plasmid) DNA중의 아마드리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 실시했다. 그 결과, 98 위치의 글루타민산이 알라닌으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T9-E98A)를 얻었다.
상기와 동일하게 하여, pKK223-3-CFP-T9-E98A DNA를 주형으로 하여 서열 번호 139, 140의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하고, 98 위치의 글루타민산이 알라닌으로, 154 위치의 세린이 아스파라긴으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T9-E98A/S154N)를 얻었다.
상기와 동일하게 하여, pKK223-3-CFP-T9-E98A/S154N DNA를 주형으로 하여 서열 번호 151, 152의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여, 98 위치의 글루타민산이 알라닌으로, 154 위치의 세린이 아스파라긴으로, 259 위치의 발린이 시스테인으로 치환된 개변형 아마드리아제를 코드하는 재조합 플라스미드(plasmid)(pKK223-3-CFP-T9-E98A/S154N/V259C)를 얻었다.
상기와 같이 수득한 개변형 아마드리아제 생산능을 가지는 대장균 JM109 균주를, 상기 <실시예 1>의 (3)에 기재된 방법으로 배양하고, 각종 개변형 아마드리아제의 조효소액 0.6 ㎖를 제조했다.
이와 같이 제조한 효소액에 대해 상기 B:활성 측정법으로 αFVH, αFV 및 εFK에 대한 효소 활성을 측정하여 εFK/αFVH 및 εFK/αFV를 산출했다. 또한, 활성 측정에는 pH7.0으로 조정한 시약 1:퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 용액을 이용했다. 결과를 [표 26]에 나타낸다.
Figure pct00026
[표 26] 중의 다중 아미노산 치환이 도입된 개변형 아마드리아제에서는 εFK/αFVH, εFK/αFV는 모두 변이 도입 이전과 비교해 매우 낮은 값이 되었다. 따라서, 서열 번호 1로 기재된 아마드리아제의 기질 특이성 개선에 효과적인 단일 변이를 서열 번호 272로 기재된 아마드리아제에 축적시키는 것에 의해서도 매우 큰 기질 특이성의 개선을 기대할 수 있는 것이 분명해졌다.
<110> KIKKOMAN CORPORATION <120> Amadoriase with altered substrate specificity <130> 12fpi-12-08 <150> JP 2010-176967 <151> 2010-08-06 <150> JP 2010-213070 <151> 2010-09-24 <160> 282 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 1 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Gln Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Gly 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Gln Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys Tyr Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Pro Lys Leu 435 <210> 2 <211> 1314 <212> DNA <213> Coniochaeta sp. <400> 2 atgacgtcga atcgtgcaga tacaagggtg attgtcgtcg gtggcggagg aacgattggt 60 tcctcgacag cgctgcatct tgtgaggagt ggttatgctc ccgcaaatat cacggtcttg 120 gacacatttg agattccatc ggctcaatca gccggccatg atctcaacaa gatcatggga 180 atacgactgc gcaacaaggt ggacctgcaa atgagtctag aggctagaca gatgtggaag 240 gaggatgagt tattccagcc cttctttcac aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgaggacct gaaaaagcag taccaggcac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga 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<220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 gactgcgcaa cggcgtggac ctgcaaatga g 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 tgcaggtcca cgccgttgcg cagtcgtatt c 31 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 tgcgcaacaa gccggacctg caaatgag 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 tttgcaggtc cggcttgttg cgcagtcg 28 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 gactgcgcaa cggcccggac ctgcaaatg 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 tttgcaggtc cgggccgttg cgcagtcg 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 9 aaggtggacc tgccaatgag tctagag 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 10 tctagactca ttggcaggtc caccttg 27 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 11 ggcagaatgg cctgcgaaca cac 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 12 gtgttcgcag gccattctgc cg 22 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 13 agaatggact gccaacacac gcctgag 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 14 tcaggcgtgt gttggcagtc cattctg 27 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 15 actgcgaaca ccgtcctgag ggtatc 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 16 ataccctcag gacggtgttc gcagtc 26 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 17 acacgcctga gcgtatcgag gacctg 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 18 aggtcctcga tacgctcagg cgtgtg 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 19 agggtatcga ggccctgaaa aagcag 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 20 tgctttttca gggcctcgat accctc 26 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 21 acctgaaaaa ggcgtaccag gcactgcac 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 22 agtgcctggt acgccttttt caggtcctc 29 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 23 aaaaagcagt accaggaact gcacgatgcc g 31 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 24 ggcatcgtgc agttcctggt actgcttttt c 31 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 25 agtaccaggc aaagcacgat gccggtgcg 29 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 26 gcaccggcat cgtgctttgc ctggtactg 29 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 27 tggagaagac tgaagcctgg ttggac 26 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 28 tccaaccagg cttcagtctt ctccag 26 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 29 aaagcaatat gggaacaaga tggcggc 27 <210> 30 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Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 123 agtaccaggc agagcacgat gccggtgcg 29 <210> 124 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 124 gcaccggcat cgtgctctgc ctggtactg 29 <210> 125 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 125 tggagaagac taatgcctgg ttggac 26 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 126 tccaaccagg cattagtctt ctccag 26 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 127 tggagaagac taaagcctgg ttggac 26 <210> 128 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 128 tccaaccagg ctttagtctt ctccag 26 <210> 129 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 129 tggagaagac tgctgcctgg 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tggctcattc gcgagaaagc aca 33 <210> 186 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 186 aaaaaaggat cctcagagct tcgcatcatg cttcca 36 <210> 187 <211> 1314 <212> DNA <213> Penicillium chrysogenum <400> 187 atggctcatt cgcgagaaag cacaaagatt gtcattgtcg ggggaggtgg cacaatggga 60 tcttcaaccg cgctacacct gatacgctct ggatacaccc cgtcaaacat caccgtcctt 120 gatgtatacc caattccatc cttgcaatcc gcaggatatg atcttaacaa gatcatgagc 180 atccgattac gcaacgggcc tgactggcaa ctttccctgg aggctctcga tatgtggaaa 240 aacgatccgt tgttcaagcc tttctttcac aacgttggca tgctagactg ttcatcgtca 300 caagagggta ttgcaagcct tcgacggaag caccaagacc tcatagacgc gaatatcgga 360 ctagagaaga cgaatatctg gttagagagt gaagatgata ttctggcaaa agccccgcac 420 ttcgcgcggg aacagatcaa ggggtggaag ggcttgtttt gcggcgatgg aggatggctt 480 gctgcagcca aggccatcaa tgcgatcgga acctttctaa aaagtcaagg cgtcaagttc 540 ggatttggaa gtgccgggac tttcaagcga cctttgtttg ctccagatgg ggcgacatgc 600 agcggtgttg agacagtaga tggaacaaaa tacttcgccg acaaggtggt tttggccgct 660 ggtgcttgga gttcgacgtt agtagatttg gaggaccaat gtgtttcgaa ggcctgggtc 720 ttcgctcata tccaactcac gccccaagaa tcggcccagt acaaggacgt gcccgtagta 780 tacgacggtg attatggctt tttcttcgag cccaacgaac acggagtaat caaagtctgc 840 gatgagttcc ccgggttctc ccgcttcaag ctgcatcaac cttacggtgc cacctctcct 900 aagcttatat ccgttcctcg atcacacgcc aagcatccca ccgataccta cccagattct 960 tctgaagaga ccattcgaaa agcgattgcg aggtttatgc cacgcttcaa ggataaggag 1020 ctttttaata ggagcatgtg ctggtgcacc gatactgctg atgccaactt gttgatctgc 1080 gagcacccca agtggaagaa ctttatcttg gccacaggag acagcggcca tagtttcaag 1140 gttttgccca atataggaaa acatgtcgtt gagttgatag aaggacgcct accacaagac 1200 ctggctggtg cgtggagatg gagaccaggg ggagatgccc ttaagtccaa acgcagtgct 1260 ccggcaaagg accttgctga aatgccgggc tggaagcatg atgcgaagct ctga 1314 <210> 188 <211> 437 <212> PRT <213> Penicillium chrysogenum <400> 188 Met Ala His Ser Arg Glu Ser Thr Lys Ile Val Ile Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile 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agcgtcaagg cgttcgcttc 540 ggttttggcg gtgccggtag ttttaaacgc ccgctgttcg cagatgacgg caccacgtgt 600 atcggtgtcg aaaccgtgga tggcacgcag tatcatgcgg acaaagtggt tctggctgca 660 ggtgcttggt caccggcgct ggtcgatctg gaagaacagt gctgttcgaa agcctgggtg 720 tacgcacaca tgcaactgac cccggaagaa gccgcagttt ataaaggctg cccggtcgtg 780 taccacggcg atgtcggctt tttctttgaa ccgaacgaaa atggcgttat taaagtctgt 840 gacgaattcc cgggttttac gcgtttcaaa cagcatcaac cgtatggtgc cccggcaccg 900 aaacctgtga gtgttccgcg ctcccatgcg aaacacccga ccgatacgta cccggacgct 960 tcagaagaat cgatcaaacg tgccgtgagt acctttctgc cgcgcttcaa agataaaccg 1020 ctgtttaacc gtgcactgtg ctggtgtacc gatacggccg actccgcact gctgatttgc 1080 gaacacccgc gctggaaaaa ttttatcctg gcgaccggcg atagcggtca ttctttcaaa 1140 ctgctgccga ttatcggcaa acacgttgtc gaactggttg aaggtcgtct ggcggatgac 1200 ctggctgaag cgtggcgttg gcgtccgggt cagggtgatg cacgtaaaag cattcgcgct 1260 gcgccggcga aagacctggc ggatatgccg ggctggaaac acgaccaaga ctcggaatca 1320 cgctga 1326 <210> 215 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial 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241 Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln 65 70 75 80 Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu 115 120 125 Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu 130 135 140 Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Asp Ala Gly Thr Phe Gln Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Ala Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ile Gly Leu Glu Thr Thr Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Phe 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Sequence <400> 264 aagccaaatt catcattata cacaac 26 <210> 265 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 265 ttgtgtataa tgaagaattt ggcttc 26 <210> 266 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 266 aagccaaatt cttcattata cacaac 26 <210> 267 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 267 agacactgcg gacgatgctc tcttgatgtg 30 <210> 268 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 268 acatcaagag agcatcgtcc gcagtgtctg 30 <210> 269 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 269 agacactgcg gacgaagctc tcttgatgtg 30 <210> 270 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 270 acatcaagag agcttcgtcc gcagtgtctg 30 <210> 271 <211> 437 <212> PRT 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cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aacttggctt cttcttcgaa cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 274 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 274 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr 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His Thr Phe Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gly 370 375 380 Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Thr Leu Ala Asp Asp Leu Ala 385 390 395 400 His Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Thr Gly Asp Ala Leu Lys Ser Arg 405 410 415 Arg Ala Ala Arg Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Asn His 420 425 430 Asp Gly Glu Ala Pro Arg Ala Lys Leu 435 440 <210> 282 <211> 437 <212> PRT <213> Penicillium janthinellum <400> 282 Met Ala His Ser Arg Glu Ser Thr Lys Ile Val Ile Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Pro Ile Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Met Ser Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Leu Asp Met Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Met Leu Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ile Ala Ser Leu Arg Arg Lys His Gln 100 105 110 Asp Leu Ile Asp Ala Asn Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Ile Trp Leu 115 120 125 Glu Ser Glu Asp Asp Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Arg Glu 130 135 140 Gln Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Thr Phe Leu Lys Ser Gln 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Ser Ala Gly Thr Phe Lys Arg Pro Leu 180 185 190 Phe Ala Pro Asp Gly Ala Thr Cys Ser Gly Val Glu Thr Val Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Phe Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Gln Glu Ser Ala Gln Tyr Lys Asp 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu His Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Leu His Gln Pro Tyr Gly Ala Thr Ser Pro Lys Leu Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ser 305 310 315 320 Ser Glu Glu Thr Ile Arg Lys Ala Ile Ala Arg Phe Met Pro Arg Phe 325 330 335 Lys Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ser Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Val Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Gln Asp 385 390 395 400 Leu Ala Gly Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Lys Arg Ser Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Glu Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Ala Lys Leu 435

Claims (11)

  1. 하기의 (a) 및/또는 (b)의 성질을 가지는 아마드리아제(amadoriase)：
    (a) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 1개 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 및/또는 치환이 이루어진 아미노산 서열을 가지고, 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 아마드리아제와 비교해서, α-프룩토실 바릴 히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소;
    (b) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 1개 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 및/또는 치환이 이루어진 아미노산 배열을 가지고, 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 아마드리아제와 비교해서, α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소.
  2. 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 하기 (c) ~ (s)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서, 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지고, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴 히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는지, 및/또는 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제:
    (c) 98 위치의 글루타민산
    (d) 259 위치의 발린
    (e) 154 위치의 세린
    (f) 125 위치의 히스티딘
    (g) 261 위치의 타이로신
    (h) 263 위치의 글리신
    (i) 106 위치의 아스파라긴산
    (j) 103 위치의 글리신
    (k) 355 위치의 알라닌
    (l) 96 위치의 아스파라긴산
    (s) 66 위치의 라이신 또는/및 67 위치의 발린
    (m) 70 위치의 글루타민
    (o) 100 위치의 스레오닌
    (p) 110 위치의 글루타민
    (q) 113 위치의 알라닌
    (r) 114 위치의 루신
    (s) 156 위치의 아스파라긴산
  3. 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열의 아미노산의 하기 (t) ~ (aj)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 또는 그 이상의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산이, 하기 (t) ~ (aj)의 각각에 기재되는 치환 후의 아미노산 잔기로 치환되고 있고, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴 히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는지, 및/또는 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제：
    (t) 98 위치의 글루타민산이 프롤린 이외의 아미노산, 즉, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 글리신, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌, 시스테인, 세린, 스레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 페닐 알라닌, 타이로신, 트립토판으로 치환；
    (u) 259 위치의 발린이 알라닌, 시스테인, 세린으로 치환；
    (ｖ) 154 위치의 세린이 글리신, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산, 글루타민산, 히스티딘, 시스테인으로 치환；
    (w) 125 위치의 히스티딘이 알라닌, 루신, 페닐 알라닌, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 라이신, 아르기닌으로 치환;
    (x) 261 위치의 타이로신이 알라닌, 루신, 페닐 알라닌, 트립토판, 라이신으로 치환；
    (y) 263 위치의 글리신이 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로 치환；
    (z) 106 위치의 아스파라긴산이, 아스파라긴산보다도 분자량이 작은 아미노산, 즉, 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 스레오닌, 시스테인, 루신, 이소루신, 아스파라긴으로 치환；
    (aa) 103 위치의 글리신이 라이신, 아르기닌, 히스티딘으로 치환；
    (ab) 355 위치의 알라닌이 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴산, 글루타민산으로 치환；
    (ac) 96 위치의 아스파라긴산이 알라닌, 아스파라긴, 히스티딘, 세린으로 치환；
    (ad) 66 위치의 라이신이 글리신 또는/및 67 위치의 발린이 프롤린으로 치환；
    (ae) 70 위치의 글루타민이 프롤린으로 치환；
    (af) 100 위치의 스레오닌이 아르기닌으로 치환；
    (ag) 110 위치의 글루타민이 알라닌, 루신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 트립토판, 아스파라긴, 히스티딘, 라이신, 아르기닌으로 치환；
    (ah) 113 위치의 알라닌이 글루타민산, 라이신으로 치환；
    (ai) 114 위치의 루신이 라이신, 아르기닌으로 치환；
    (aj) 156 위치의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환.
  4. 서열 번호 1로 기재된 아미노산 서열에 대해서, 이하의 (ba) ~ (be)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산잔기의 치환을 가지는, 청구항 3 기재의 아마드리아제：
    (ba) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환；
    (bb) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환；
    (bc) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 글루타민으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환；
    (bd) 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환；
    (be) 110 위치의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259위의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌에의 치환.
  5. 서열 번호 272로 기재된 아미노산 서열에 대하여 98 위치의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환, 154 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 아스파라긴으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환을 가지고, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴 히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있고, 또한, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-플룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제.
  6. 서열 번호 241로 기재된 아미노산 서열에 대해서 하기의 (ca) ~ (cc)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산잔기의 치환을 가지고, 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서 α-프룩토실 바릴 히스티딘에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소 있고, 한편 상기 치환을 실시하기 전의 아마드리아제와 비교해서, α-프룩토실 발린에 대한 반응성에 대하여 ε-프룩토실 라이신에 대한 반응성의 비율이 감소하고 있는 것을 특징으로 하는 아마드리아제：
    (ca) 98 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환, 110 위치의 라이신에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환；
    (cb) 98 위치의 세린에 대응하는 위치의 아미노산의 알라닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환；
    (cc) 110 위치의 라이신에 대응하는 위치의 아미노산의 아르기닌으로의 치환 및 259 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 아마드리아제 유전자.
  8. 청구항 7에 기재된 아마드리아제 유전자를 포함한 재조합 벡터.
  9. 청구항 8에 기재된 재조합 벡터를 포함한 숙주 세포.
  10. 하기의 단계를 포함하는 아마드리아제를 제조방법：
    (ak) 청구항 9에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계；
    (al) 숙주 세포에 포함되는 아마드리아제 유전자를 발현시키는 단계；및
    (am) 배양물로부터 아마드리아제를 단리하는 단계.
  11. 청구항 1 내지 청구항 6의 어느 하나에 기재된 아마드리아제를 포함하는 당화 헤모글로빈의 측정에 이용하기 위한 키트.

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