ES2848705T3 - Amadoriasa modificada y método para producirla, agente para mejorar la resistencia a tensioactivos de la amadoriasa y composición para medir la HbA1c usando la misma - Google Patents

Abstract

Una amadoriasa modificada que tiene actividad residual mejorada 5 minutos después de que se añada un tensioactivo iónico en comparación con dicha amadoriasa antes de la modificación, teniendo dicha amadoriasa modificada: (I) una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 1 o 37, teniendo además dicha secuencia de aminoácidos una deleción, una inserción, una adición y/o una sustitución de uno a 15 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 1 o 37, y/o (II) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 80 % con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en el SEQ ID NO: 1, o que tiene una identidad de al menos un 90 % con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 37, en donde dicha amadoriasa modificada que tiene la secuencia de aminoácidos de (I) o (II) comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina; (ii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (iii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina; (iv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (v) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (vii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (viii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (ix) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 132 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (x) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina, metionina, lisina o arginina; (xi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (xii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (xiii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 231 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; y (xiv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 81 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; en donde, cuando la sustitución es: (i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina; (ii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (iii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina; (iv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (v) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (vii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (viii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (ix) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 132 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (x) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina, metionina, lisina o arginina; (xi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (xii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; (xiii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 231 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; o (xiv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 81 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; entonces dicha actividad residual mejorada es una actividad residual mejorada después de que se añade un tensioactivo catiónico; y en donde, cuando la sustitución es: (i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina; o (vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; entonces dicha actividad residual mejorada es una actividad residual mejorada después de que se añade un tensioactivo aniónico.

Description

DESCRIPCIÓN

Amadoriasa modificada y método para producirla, agente para mejorar la resistencia a tensioactivos de la amadoriasa y composición para medir la HbA1c usando la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a una amadoriasa con excelente resistencia a tensioactivos, que se puede usar de forma ventajosa como enzima de diagnóstico para la diabetes y en un kit para medir un marcador de diabetes, y se refiere a un gen y ADN recombinante del mismo y a un método para producir una amadoriasa con excelente resistencia a tensioactivos. La presente divulgación se refiere además a un estabilizante y/o un tampón para la amadoriasa de la presente invención y a una composición que lo contiene.

Las glucoproteínas se generan mediante enlaces covalentes no enzimáticos entre grupos aldehído en aldosas, tales como glucosa (monosacáridos que contienen potencialmente grupos aldehído y derivados de los mismos) y grupos amino en proteínas, seguidos por reordenamiento de Amadori. Ejemplos de grupos amino en proteínas incluyen grupos a-amino del extremo amino y grupos £-amino de la cadena lateral del resto de lisina en proteínas. Ejemplos de glucoproteínas conocidas generadas in vivo incluyen la glucohemoglobina resultante de la glucación de la hemoglobina y la glucoalbúmina resultante de la glucación de la albúmina en la sangre.

Entre dichas glucoproteínas generadas in vivo, la hemoglobina A1c (HbA1c) ha llamado la atención como un marcador de control glucémico significativo para el diagnóstico de pacientes diabéticos y control de afecciones en el campo del diagnóstico clínico de diabetes mellitus. El nivel de HbA1c en sangre refleja el nivel de glucosa en sangre promedio durante un período de tiempo dado en el pasado, y el valor medido del mismo sirve como indicador significativo para el diagnóstico y control de las condiciones de diabetes.

Como método para medir la HbA1c de forma rápida y sencilla, se propone un método enzimático que utiliza una amadoriasa, en el que la HbA1c se descompone con, por ejemplo, una proteasa, y se cuantifica la a-fructosil valil histidina (a continuación en el presente documento denominada "aFVH") o la a-fructosil valina (a continuación en el presente documento denominada "aFV") liberada de un extremo amino de la cadena p de la misma (véase, por ejemplo, las Bibliografías de patente 1 a 7). En realidad, el método de escisión de aFV de la HbA1c está asociado al problema de que no se pueden obtener valores de medición precisos ya que el efecto de contaminantes y similares es significativo. Para obtener valores de medición precisos, se emplea principalmente en la actualidad un método de medición de aFVH.

Una amadoriasa cataliza una reacción de oxidación del ácido iminodiacético o un derivado del mismo (también denominado "compuesto de Amadori") en presencia de oxígeno para producir ácido glioxílico o a-cetoaldehído, un aminoácido o un péptido y peróxido de hidrógeno.

Se han encontrado amadoriasas en bacterias, levaduras y hongos. En particular, las amadoriasas que tienen actividad enzimática para aFVH y/o aFV, que son útiles para la medición de HbA1c son, por ejemplo, amadoriasas procedentes del género Coniochaeta, Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia, Neocosmospora, Cryptococcus, Phaeosphaeria, Aspergillus, Emericella, Ulocladium, Penicillium, Fusarium, Achaetomiella, Achaetomium, Thielavia, Chaetomium, Gelasinospora, Microascus, Leptosphaeria, Ophiobolus, Pleospora, Coniochaetidium, Pichia, Debaryomyces, Corynebacterium, Agrobacterium, y Arthrobacter (por ejemplo, Documentos de Patente 1 y 6 a 15 y Documentos no de Patente 1 a 11). En algunos de los documentos anteriormente mencionados, la amadoriasa se conoce ocasionalmente como, por ejemplo, cetoamina oxidasa, fructosil aminoácido oxidasa, fructosil péptido oxidasa o fructosil amina oxidasa.

Con respecto a la medición de HbA1c, se sabe que las composiciones reactivas para la medición contienen cantidades excesivas de amadoriasa. Por ejemplo, cuando se mide la HbA1c a una concentración final de 0,36 pM, la amadoriasa se utiliza a una concentración de 1,4 kU/l, que es una concentración a la que se pueden hacer reaccionar 1,4 mM de un sustrato por minuto con la amadoriasa (véase Bibliografía de patente 16). La medición de HbA1c utilizando una amadoriasa se lleva a cabo actualmente usando un analizador automático tradicional. La amadoriasa y el sustrato se hacen reaccionar a menudo durante 5 minutos a 25 minutos y se someten a medición en ello. La razón para incluir cantidades excesivas de amadoriasa es permitir que la amadoriasa reaccione de forma suficiente con el sustrato durante un tiempo de medición corto como se mencionó anteriormente; y además, si una sustancia que tiene un efecto negativo en la reactividad y estabilidad de la amadoriasa está presente en la composición para la medición, se deben formular cantidades excesivas de amadoriasa como contramedida contra el efecto.

Como tratamiento previo para la medición de HbA1c en sangre total o eritrocitos mediante el uso de una amadoriasa, se lisan las células sanguíneas con un tensioactivo (véase, por ejemplo, Bibliografías de patente 2, 16 a 18). Cuando se degrada HbA1c con una proteasa, en algunos métodos se utiliza un tensioactivo como acelerante (véase, por ejemplo, Bibliografía de patente 19). Por lo tanto, los tensioactivos son indispensables cuando se mide HbA1c con una amadoriasa; sin embargo, la posibilidad de que el tensioactivo desnaturalice la amadoriasa es extremadamente alta cuando una solución de HbA1c, que se trata con un tensioactivo y una proteasa, se mezcla con una solución de amadoriasa y a continuación se inicia una reacción cuantitativa de HbA1c, así como durante el almacenamiento de una mezcla de tensioactivo-amadoriasa. Los kits de medición de HbA1c que se utilizan actualmente contienen cantidades excesivas de amadoriasa de las necesarias, y además se formulan junto con estabilizantes y son capaces de lograr una medición precisa; sin embargo, el coste del kit aumenta inevitablemente debido al uso excesivo de reactivos. Además, si es posible utilizar un tensioactivo más eficaz que los utilizados actualmente, se puede mejorar la eficacia de degradación de HbA1c con proteasa y es muy posible que se pueda mejorar la sensibilidad de medición de HbA1c. Además, los tensioactivos tienen efectos solubilizantes sobre fragmentos peptídicos insolubles procedentes de la hemoglobina y la HbA1c. Debido al efecto, el tensioactivo puede evitar la turbidez, contribuyendo así a la mejora de la precisión de la medición. Por lo tanto, con respecto a la formulación de una amadoriasa como enzima para el diagnóstico clínico de diabetes en un kit como reactivo, una propiedad deseable de la enzima es ser estable en un líquido que contiene un tensioactivo.

Aunque las condiciones de medición individuales varían; la divulgación de la estabilidad de varias amadoriasas en líquidos se puede encontrar en la bibliografía conocida en la materia: en un caso donde se añaden ácido etilendiaminotetraacético 5 mM y glicina al 3 % en una solución que contiene una amadoriasa procedente de la cepa NISL 9330 de Coniochaeta sp., se informa que una actividad residual de un 79 % se mantiene 7 días después a 30 °C (véase, por ejemplo, Bibliografía de patente 20). Además, en otro caso donde se añade L-alanina al 3 %, glicina al 3 % o sarcosina al 3 % en una solución que contiene una fructosil aminoácido oxidasa procedente de la cepa IFO-9972 de Fusarium oxysporum, se informa que el 100 % de la actividad residual se mantiene 2 días después a 37 °C (véase, por ejemplo, Bibliografía de patente 21).

Sin embargo, no se añaden tensioactivos a las soluciones anteriores que contienen proteína amadoriasa y la bibliografía no dice nada sobre los efectos reductores de los tensioactivos. Asimismo, no se han informado amadoriasas que tengan alta resistencia a tensioactivos. Por otra parte, no se han informado estabilizantes ni tampones que mantengan la actividad residual de una amadoriasa o disminuyan una reducción de la actividad residual en presencia de un tensioactivo.

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: WO 2004/104203

Documento de patente 2: WO 2005/49857

Documento de patente 3: JP 2001-95598 A

Documento de patente 4: JP H05-33997 B (1993)

Documento de patente 5: JP H11-127895 A (1999)

Documento de patente 6: WO 97/13872

Documento de patente 7: JP 2011-229526 A

Documento de patente 8: JP 2003-235585 A

Documento de patente 9: JP 2004-275013 A

Documento de patente 10: JP 2004-275063 A

Documento de patente 11: JP 2010-35469 A

Documento de patente 12: JP 2010-57474 A

Documento de patente 13: WO 2010/41715

Documento de patente 14: WO 2010/41419

Documento de patente 15: WO 2011/15325

Documento de patente 16: WO 2012/020744

Documento de patente 17: WO 2005/87946

Documento de patente 18: WO 2002/06519

Documento de patente 19: WO 2006/120976

Documento de patente 20: JP 2006-325547 A

Documento de patente 21: JP 2009-000128 A

Documentos no de Patente:

Documento no de patente 1: Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11,2003

Documento no de patente 2: Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010

Documento no de patente 3: J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006

Documento no de patente 4: Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996

Documento no de patente 5: Arch.Microbiol. 178, 344-50, 2002

Documento no de patente 6: Mar. Biotechnol. 6.625-32, 2004

Documento no de patente 7: Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 487-91,1995

Documento no de patente 8: Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-819, 2007

Documento no de patente 9: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002

Documento no de patente 10: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002

Documento no de patente 11: Biotechnol. Letters 27, 27-32, 2005

Sumario de la invención

Problema técnico

Como se describe anteriormente, las amadoriasas se han usado excesivamente en la materia para que reaccionen de forma suficiente con el sustrato durante la medición. En este caso, los presentes inventores han descubierto recientemente que un tensioactivo es un componente que afecta significativamente de forma negativa a la estabilidad de las amadoriasas. Por lo tanto, si se puede preparar una enzima que tenga una resistencia a tensioactivos más excelente que las amadoriasas convencionales, se espera que dicha enzima contribuya en gran medida a lograr la conveniencia en la distribución (circulación) de la enzima y el kit, reducir las cantidades de la amadoriasa y estabilizantes formulados en el kit, reduciendo así los costes y permitir la formulación de tensioactivos fuertes, mejorando así la sensibilidad de la medición de HbA1c. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una amadoriasa que tenga una excelente resistencia a tensioactivos en comparación con amadoriasas convencionales, así como proporcionar una composición de reactivo mediante la cual se pueda cuantificar HbA1c o un glucopéptido procedente de HbA1c incluso en presencia de un tensioactivo.

En el presente documento también se describe un estabilizante y/o un tampón que mantiene la actividad residual de la amadoriasa o disminuye la reducción de la actividad residual en presencia de un tensioactivo y una composición que contiene el mismo.

Solución del problema

En la situación actual, donde apenas se divulga la información relativa a conferir resistencia a tensioactivos a las enzimas, los presentes inventores han realizado estudios exhaustivos. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que los objetivos anteriores se pueden lograr mediante la introducción de sustituciones de restos de aminoácidos particulares en una amadoriasa procedente del género Coniochaeta y además mediante la formulación en una composición de reactivo de una amadoriasa cuya actividad se conserva incluso en presencia de un tensioactivo. Los presentes inventores descubrieron además que si se usa un estabilizante y/o tampón particular, la actividad residual de la amadoriasa se mantiene o la reducción de la actividad residual en presencia de un tensioactivo disminuye significativamente. Basándose en los hallazgos, se ha logrado la presente invención.

Más específicamente, la presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Efectos ventajosos de la invención

De acuerdo con la presente divulgación, es posible proporcionar una amadoriasa con excelente resistencia a tensioactivos que se puede utilizar de forma ventajosa como enzima de diagnóstico para la diabetes en un kit para medir un marcador de diabetes, así como un gen que codifica la amadoriasa y similares. El uso de la amadoriasa permite medir glucohemoglobina incluso en presencia de altas concentraciones de tensioactivos. Además, el uso del estabilizante y/o tampón de la presente divulgación permite conservar la actividad residual de una amadoriasa o disminuir la reducción de la actividad residual en presencia de un tensioactivo, así como medir glucohemoglobina incluso en presencia de un tensioactivo a altas concentraciones.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1-1] La Figura 1-1 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de varias amadoriasas conocidas en la materia.

[Figura 1-2] La Figura 1-2 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de varias amadoriasas conocidas en la materia.

[Figura 1-3] La Figura 1-3 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de varias amadoriasas conocidas en la materia.

[Figura 2] La Figura 2 muestra los resultados de la medición de aFVH mediante la utilización de CFP-T7 en presencia de CTAC al 0,01 % en una mezcla.

[Figura 3] La Figura 3 muestra los resultados de la medición de aFVH mediante la utilización de CFP-T7 en presencia de CTAC al 0,02 % en una mezcla.

[Figura 4] La Figura 4 muestra los resultados de la medición de aFVH mediante la utilización de CFP-D7 en presencia de CTAC al 0,02 % en una mezcla.

[Figura 5] La Figura 5 muestra los resultados de la medición de aFVH mediante la utilización de CFP-D7 en presencia de CTAC al 0,2 % en una mezcla.

Descripción de las realizaciones

La presente invención se describe a continuación en detalle.

(Amadoriasa)

La amadoriasa, que también se conoce como, por ejemplo, cetoamina oxidasa, fructosil aminoácido oxidasa, fructosil péptido oxidasa o fructosil amina oxidasa, se refiere a una enzima que cataliza una reacción de oxidación del ácido iminodiacético o un derivado del mismo (compuesto de Amadori) en presencia de oxígeno para generar ácido glioxílico o a-cetoaldehído, un aminoácido o un péptido y peróxido de hidrógeno. Las amadoriasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y se pueden obtener mediante la búsqueda de enzimas procedentes de microorganismos, animales o plantas. En cuanto a los microorganismos, se puede obtener una amadoriasa de, por ejemplo, hongos filamentosos, levaduras o bacterias.

Un aspecto de la amadoriasa de la presente divulgación se dirige a una variante de amadoriasa que tiene una resistencia mejorada a tensioactivos, que se produce a partir de una amadoriasa procedente de Coniochaeta que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en el SEQ ID NO: 1 o una amadoriasa procedente de Curvularia clavata que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 37. Ejemplos de dicha variante incluyen una amadoriasa que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia alta (por ejemplo, 70 % o superior, preferentemente 75 % o superior, preferentemente 80 % o superior, más preferentemente 85 % o superior, más preferentemente 90% o superior, más preferentemente 95 % o superior, más preferentemente 97 % o superior, lo más preferentemente 99 % o superior) con la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 37; así como una amadoriasa que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 37, en la que uno o varios aminoácidos están modificados o mutados, en otras palabras, eliminados, sustituidos, añadidos y/o insertados.

La amadoriasa de la presente divulgación puede prepararse basándose en una amadoriasa procedente de una cualquiera de las especies de organismos tales como los géneros Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia, Neocosmospora, Cryptococcus, Phaeosphaeria, Aspergillus, Emericella, Ulocladium, Penicillium, Fusarium, Achaetomiella, Achaetomium, Thielavia, Chaetomium, Gelasinospora, Microascus, Leptosphaeria, Ophiobolus, Pleospora, Coniochaetidium, Pichia, Corynebacterium, Agrobacterium y Arthrobacter. Entre éstos, es preferible una amadoriasa que tiene resistencia a tensioactivos y/o que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene alta identidad de secuencia con la que se muestra en el SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 37.

Se puede obtener una variante de amadoriasa (amadoriasa modificada) que tiene una resistencia a tensioactivos modificada mediante la sustitución, la adición o la deleción de al menos un resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de una amadoriasa.

Como sustituciones de aminoácidos que mejoran la resistencia a tensioactivos, se mencionan sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 o 3.

(1) sustitución de asparagina en la posición 262 con, por ejemplo, histidina.

(2) sustitución de valina en la posición 257 con, por ejemplo, cisteína, serina, treonina.

(3) sustitución de ácido glutámico en la posición 249 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(4) sustitución de ácido glutámico en la posición 253 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(5) sustitución de glutamina en la posición 337 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(6) sustitución de ácido glutámico en la posición 340 con, por ejemplo, prolina.

(7) sustitución de ácido aspártico en la posición 232 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(8) sustitución de ácido aspártico en la posición 129 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(9) sustitución de ácido aspártico en la posición 132 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(10) sustitución de ácido glutámico en la posición 133 con, por ejemplo, alanina, metionina, lisina, arginina.

(11) sustitución de ácido glutámico en la posición 44 con, por ejemplo, prolina.

(12) sustitución de glicina en la posición 256 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(13) sustitución de ácido glutámico en la posición 231 con, por ejemplo, lisina, arginina.

(14) sustitución de ácido glutámico en la posición 81 con, por ejemplo, lisina, arginina.

La variante de amadoriasa con resistencia mejorada a tensioactivos puede tener al menos una de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente y puede tener una pluralidad de sustituciones de aminoácidos. La variante de amadoriasa tiene, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 de las sustituciones de aminoácidos anteriores.

Entre dichas variantes, se prefieren las que tienen sustituciones de aminoácidos correspondientes a las siguientes posiciones de aminoácidos.

(11) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44 y sustitución de ácido glutámico en la posición 340, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina.

(11) -(1) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de asparagina en la posición 262 y sustitución de ácido glutámico en la posición 340, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a asparagina en la posición 262 con histidina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina.

(11) -(2) -(1) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262 y sustitución de ácido glutámico en la posición 340, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a asparagina en la posición 262 con histidina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina. (11) -(7) -(2) -(1) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262, sustitución de ácido glutámico en la posición 340 y sustitución de ácido aspártico en la posición 232, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la asparagina en la posición 262 con histidina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 232 con lisina o arginina. (11) -(3) -(2) -(1) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262, sustitución de ácido glutámico en la posición 340 y sustitución de ácido glutámico en la posición 249, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la asparagina en la posición 262 con histidina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 249 con lisina o arginina. (11) -(4) -(2) -(1) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de ácido glutámico en la posición 253, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262 y sustitución de ácido glutámico en la posición 340, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 con lisina o arginina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a asparagina en la posición 262 con histidina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina. (11) -(8) -(4) -(2) -( I) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de ácido glutámico en la posición 253, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262, sustitución de ácido glutámico en la posición 340 y sustitución de ácido aspártico en la posición 129, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 con lisina o arginina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la asparagina en la posición 262 con histidina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 129 con lisina o arginina.

( I I ) -(10) -(4) -(2) -(1) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de ácido glutámico en la posición 133, sustitución de ácido glutámico en la posición 253, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262 y sustitución de ácido glutámico en la posición 340, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 con alanina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 con lisina o arginina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a asparagina en la posición 262 con histidina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina. (11) -(10) -(4) -(2) -(1) -(5) -(6) una variante que tiene sustitución de ácido glutámico en la posición 44, sustitución de ácido glutámico en la posición 133, sustitución de ácido glutámico en la posición 253, sustitución de valina en la posición 257, sustitución de asparagina en la posición 262, sustitución de glutamina en la posición 337 con lisina y sustitución de ácido glutámico en la posición 340, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 con prolina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 con alanina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 con lisina o arginina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la valina en la posición 257 con cisteína, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la asparagina en la posición 262 con histidina, sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a glutamina en la posición 337 con lisina o arginina, y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 con prolina.

La variante de amadoriasa con excelente resistencia a tensioactivos de acuerdo con la presente invención puede tener una sustitución o sustituciones de aminoácidos como se mencionó anteriormente, que proporciona a la amadoriasa resistencia mejorada a tensioactivos, con respecto a la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1. La variante de amadoriasa resistente a tensioactivos de la presente invención puede tener además una deleción, una inserción, una adición y/o una sustitución de uno o varios aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 15 aminoácidos, de 1 a 10 aminoácidos, preferentemente de 1 a 5 aminoácidos, más preferentemente de 1 a 3 aminoácidos, De forma particular preferentemente un solo aminoácido) en las posiciones que excluyen las posiciones de los aminoácidos sustituidos. Además, la presente invención abarca una variante de amadoriasa con resistencia modificada a tensioactivos, que comprende una mutación por sustitución de aminoácidos que proporciona una resistencia mejorada a tensioactivos como se mencionó anteriormente y una mutación por sustitución de aminoácidos que proporciona propiedades mejoradas distintas de la resistencia a tensioactivos, tales como especificidad de sustrato y similares; en donde dicha variante tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de un 70 % o superior, 75 % o superior, 80 % o superior, 90 % o superior, más preferentemente 95 % o superior, más preferentemente 97 % o superior y de forma particular preferentemente 99 % o superior, con las secuencias de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 o 3, aunque excluyendo los aminoácidos de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente, y que tienen una actividad amadoriasa.

La amadoriasa que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 es una amadoriasa (CFP-T7) procedente del género Coniochaeta producida por Escherichia coli (número de depósito: FERM BP-10593) que tiene un plásmido recombinante designado como pKK223-3-CFP-T7 en el documento WO2007/125779, y esta es una amadoriasa modificada que tiene una excelente estabilidad térmica previamente encontrada por el solicitante. CFP-T7 es una variante triple obtenida mediante la introducción secuencial de mutaciones artificiales en una amadoriasa natural procedente del género Coniochaeta, en las posiciones 272, 302 y 388.

El SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de una amadoriasa procedente del género Coniochaeta obtenida mediante la introducción de una mutación para mejorar la especificidad de sustrato (E98A) divulgada en el documento WO2012/18094 y mutaciones para mejorar la estabilidad térmica (F43Y, G184D, deleción de tres restos de aminoácidos en el extremo carboxilo) divulgadas en los documentos WO 2007/125779 y WO2013/100006.

En las sustituciones de aminoácidos anteriores, las posiciones de los aminoácidos representan las posiciones en la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. En las secuencias de aminoácidos de amadoriasas procedentes de otras especies, los aminoácidos de las posiciones correspondientes a las posiciones en la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 están sustituidos. El significado de la expresión "posición(es) correspondiente(s)" se describirá más adelante.

Como sustitución de aminoácidos que mejora la resistencia a tensioactivos, se mencionan sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 37.

(i) sustitución de ácido glutámico en la posición 247, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina;

(ii) sustitución de ácido glutámico en la posición 251, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina;

(iii) sustitución de treonina en la posición 335, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina;

(iv) sustitución de ácido aspártico en la posición 230, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina;

(v) sustitución de ácido aspártico en la posición 129, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina;

(vi) sustitución de ácido aspártico en la posición 132, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina;

(vii) sustitución de ácido glutámico en la posición 133, por ejemplo, alanina, metionina, lisina, arginina;

(viii) sustitución de asparagina en la posición 254, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina; y

(ix) sustitución de ácido glutámico en la posición 229, por ejemplo, sustitución con lisina, arginina.

Una variante de amadoriasa con resistencia mejorada a tensioactivos puede tener al menos una de las sustituciones de aminoácidos anteriores o puede tener una pluralidad de sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, la variante de amadoriasa tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de las sustituciones de aminoácidos anteriores.

Entre ellas, se prefieren las variantes que tienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las siguientes posiciones de aminoácidos; más específicamente, las siguientes (i) a (iv) en la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 37:

(i) una variante que tiene sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 251 con lisina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina;

(ii) una variante que tiene sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 132 con lisina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina;

(iii) una variante que tiene sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 con alanina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina; y

(iv) una variante que tiene sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 229 con lisina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina.

(Obtención de un gen que codifica una amadoriasa)

Para obtener un gen que codifique estas amadoriasas (a continuación en el presente documento, también denominado simplemente "gen de amadoriasas"), se pueden llevar a cabo métodos de clonación de genes usados en general. Por ejemplo, el ADN cromosómico o el ARNm se puede extraer del cuerpo de hongo de microorganismo o de varias células que tienen capacidad de producir una amadoriasa mediante una técnica convencional, tal como un método descrito en "Current Protocols in Molecular Biology" (WILEY Interscience, 1989). Además, el ADNc se puede sintetizar usando ARNm como molde. Se puede preparar una biblioteca de ADN cromosómico o ADNc usando el ADN cromosómico o ADNc obtenido de dicha manera.

Posteriormente, el ADN que incluye la secuencia completa de un gen de amadoriasa diana se puede obtener mediante un método de síntesis de un ADN sonda adecuado basado en la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa mencionada anteriormente y la selección de un gen de amadoriasa de una biblioteca de ADN cromosómico o ADNc utilizando el ADN sonda. Como alternativa, se puede producir un ADN cebador adecuado basado en la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente, un ADN que incluye el fragmento del gen diana que codifica el gen de la amadoriasa que puede amplificarse utilizando una técnica de PCR adecuada, tal como el método RACE en 5' o RACE en 3', y los fragmentos de ADN resultantes pueden, entonces, unirse.

Un ejemplo preferido de un gen que codifica una amadoriasa así obtenido es un ejemplo de un gen de amadoriasa procedente del género Coniochaeta (JP 2003-235585 A) entre otros.

Dichos genes de amadoriasas se unen preferentemente a varios vectores de acuerdo con una técnica convencional desde el punto de vista de la manejabilidad. Un ejemplo puede ser el plásmido recombinante pKK223-3-CFP (JP 2003­ 235585 A) en el que se ha insertado el ADN que codifica un gen de amadoriasa procedente de la cepa NISL9330 de Coniochaeta sp. en el vector pKK223-3 (GE Healthcare).

(Vector)

Los vectores que se pueden usar en la presente invención no se limitan a los vectores plasmídicos anteriormente mencionados e incluyen, por ejemplo, cualesquiera otros vectores conocidos en la materia, tales como vectores bacteriófagos o cósmidos. Más específicamente, por ejemplo, se prefiere pBluescriptII SK+ (fabricado por Stratagene Corporation).

(Mutación del gen de amadoriasa)

La mutación de un gen de amadoriasa se puede realizar mediante cualquier método conocido dependiendo de la forma de mutación pretendida. Más específicamente, se puede utilizar un método para poner en contacto un mutágeno químico y permitir que actúe sobre un gen de amadoriasa o ADN recombinante que comprende dicho gen integrado en el mismo; un método de irradiación ultravioleta; una técnica de genomanipulación; un método para aprovechar al máximo una técnica de genomanipulación de proteínas; o varios otros métodos.

Ejemplos de mutágenos químicos usados en la mutación anteriormente mencionados incluyen hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, ácido nitroso, ácido sulfuroso, hidracina, ácido fórmico y 5-bromouracilo.

Se pueden emplear diversas condiciones para la puesta en contacto/reacciones anteriores dependiendo del tipo de fármaco que se va a usar y no está particularmente limitado cuando se puede inducir realmente una mutación deseada en un gen de amadoriasa. En general, la mutación deseada se puede inducir mediante la puesta en contacto/reacciones realizadas entre 20 °C y 80 °C durante 10 minutos o más, y preferentemente de 10 a 180 minutos, con el uso del fármaco anteriormente mencionado a la concentración de 0,5 M a 12 M. La irradiación ultravioleta también se puede realizar de acuerdo con una técnica convencional como se describe anteriormente (Gendai Kagaku, págs. 24-30, junio de 1989).

Para aprovechar las técnicas de genomanipulación de proteínas, en general, se puede utilizar una técnica conocida como mutagénesis específica de sitio. Los ejemplos incluyen el método de Kramer (Nucleic Acids Res., 12, 9441, 1984; Methods Enzymol., 154, 350, 1987; Gene, 37, 73, 1985), el método de Eckstein (Nucleic Acids Res., 13, 8749, 1985; Nucleic Acids Res., 13, 8765, 1985; Nucleic Acids Res, 14, 9679, 1986) y el método de Kunkel (Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488, 1985; Methods Enzymol., 154, 367, 1987). Como ejemplos de métodos específicos para convertir la secuencia de bases dentro del ADN, se pueden usar kits disponibles comercialmente (Transformer Mutagenesis Kit, Clonetech; EXOIII/Mung Bean Deletion Kit, Stratagene; Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene y similares).

También se puede utilizar una técnica conocida como técnica general de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (Technique, 1, 11, 1989). Además de la técnica de mutación genética convencional, mediante un método de síntesis orgánica o método de síntesis de una enzima, los genes de amadoriasa modificados de interés también pueden sintetizarse directamente.

Cuando se determinan o verifican las secuencias de nucleótidos de ADN de genes de amadoriasas obtenidas mediante los métodos anteriormente mencionados, el sistema de análisis de ADN multicapilar CEQ2000 (Beckman Coulter) y similares pueden, por ejemplo, utilizarse.

(Transformación/transducción)

Los genes de amadoriasa obtenidos como se describió anteriormente se integran en un vector tal como un vector bacteriófago, un vector cósmido, o un vector plasmídico usado en la transformación de una célula procariota o eucariota mediante una técnica convencional, y un hospedador correspondiente a cada vector se pueden transformar o transducir mediante una técnica convencional. Por ejemplo, el ADN recombinante obtenido se puede utilizar en cualquier microorganismo, por ejemplo, un microorganismo perteneciente al género Escherichia, específicamente la cepa K-12 de E. coli, preferentemente la cepa JM109 de E. coli o la cepa DH5a de E. coli (fabricada por Takara Bio Inc.) o una cepa B de E. coli, preferentemente la cepa BL21 de E. coli (fabricada por Nippon gene Inc.) y similares para transformar o transducir la misma y obtener la cepa de interés.

(Identidad de secuencias de aminoácidos)

La identidad de las secuencias de aminoácidos se puede obtener mediante cálculos basados en un programa tal como el apareamiento máximo y la homología de búsqueda de GENETYX Ver.11 (fabricado por GENETYx ) o un programa tal como el apareamiento máximo y la alineación múltiple de DNASIS Pro (fabricado por Hitachi Software).

(Determinación de la posición correspondiente al aminoácido)

Una "posición correspondiente a un aminoácido" se refiere a la posición presente en la secuencia de aminoácidos de una amadoriasa procedente de otra especie que corresponde al aminoácido en una posición particular en la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta como se muestra en el SEQ ID NO: 1.

Se puede realizar un método para identificar la "posición correspondiente a un aminoácido" mediante la comparación de secuencias de aminoácidos usando un algoritmo conocido tal como el método de Lipman-Pearson para asignar máxima identidad a restos de aminoácidos conservados presentes en la secuencia de aminoácidos de cada amadoriasa. Se pueden determinar las posiciones de los restos de aminoácidos homólogos en cada una de las secuencias de amadoriasas, independientemente de la inserción o la deleción del resto(s) de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos de las amadoriasas mediante dicho método. Se cree que los restos de aminoácidos en posiciones homólogas existen en posiciones similares en las estructuras tridimensionales, y se espera que los restos de aminoácidos en dichas posiciones homólogas ejerzan efectos similares en términos de especificidad de la amadoriasa de interés.

Las Figuras 1-1, 1-2 y 1-3 muestran las secuencias de amadoriasas procedentes de varias especies conocidas. La secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 se muestra en la etapa superior. Todas las secuencias que se muestran en la Figura 1 tienen una identidad de un 70 % o superior con la secuencia de SEQ ID NO: 1 y se alinearon con la misma basándose en un algoritmo conocido. En las Figuras, se muestran los puntos de mutación dentro de las variantes de la presente invención. A partir de las Figuras 1-1, 1-2, 1-3, se pueden reconocer las posiciones en las secuencias de aminoácidos de las amadoriasas procedentes de otras especies que corresponden al aminoácido en una posición particular en la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta. Las Figuras 1-1, 1-2 y 1-3 muestran las secuencias de aminoácidos de una amadoriasa procedente del género Coniochaeta (SEQ ID NO: 1), una amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum (SEQ ID NO: 34), una cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp. (SEQ ID NO: 35), una cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp. (SEQ ID NO: 36), una cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata (SEQ ID NO: 37), una cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta (SEQ ID NO: 38), una fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans (SEQ ID NO: 39), una fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum (SEQ ID NO: 40), una fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 41), una fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp. (SEQ ID NO: 42), y una fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum (SEQ ID NO: 43).

(Posición correspondiente al sitio de sustitución)

En la presente invención, la expresión "la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Basado en esto, utilizando el método de especificar el "resto de aminoácido en la posición correspondiente", la posición correspondiente se puede especificar con referencia a la Figura 1-1 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es lisina en la posición 44 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, prolina en la posición 44 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., prolina en la posición 44 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., prolina en la posición 44 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, prolina en la posición 44 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, leucina en la posición 44 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, prolina en la posición 44 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, prolina en la posición 43 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, prolina en la posición 44 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y prolina en la posición 44 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 81 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 81 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-1 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 81 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es asparagina en la posición 81 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido glutámico en la posición 81 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., histidina en la posición 81 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido glutámico en la posición 81 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, asparagina en la posición 81 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, asparagina en la posición 81 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, ácido glutámico en la posición 81 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, asparagina en la posición 80 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, ácido glutámico en la posición 81 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y asparagina en la posición 81 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 de la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto se puede especificar con base en la Figura 1-1, en el que se alinean secuencias de aminoácidos mediante el método anteriormente mencionado.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido glutámico en la posición 133 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido glutámico en la posición 133 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., alanina en la posición 133 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido glutámico en la posición 133 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, alanina en la posición 133 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido glutámico en la posición 133 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, ácido glutámico en la posición 131 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido glutámico en la posición 132 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, lisina en la posición 133 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido aspártico en la posición 133 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 253 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es alanina en la posición 253 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, alanina en la posición 251 de la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., ácido glutámico en la posición 253 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido glutámico en la posición 251 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, valina en la posición 253 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido glutámico en la posición 253 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, arginina en la posición 249 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, alanina en la posición 253 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, ácido glutámico en la posición 251 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y glutamina en la posición 253 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente a glicina en la posición 256 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente a la glicina en la posición 256 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente a glicina en la posición 256 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es asparagina en la posición 256 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido aspártico en la posición 254 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., glicina en la posición 256 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., asparagina en la posición 254 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, glicina en la posición 256 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido glutámico en la posición 256 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, asparagina en la posición 252 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, asparagina en la posición 256 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, asparagina en la posición 254 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido aspártico en la posición 256 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente a valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente a la valina en la posición 257 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente a valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es valina en la posición 257 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, treonina en la posición 255 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., cisteína en la posición 257 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., valina en la posición 255 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, cisteína en la posición 257 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, cisteína en la posición 257 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, serina en la posición 253 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, treonina en la posición 257 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, valina en la posición 255 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y valina en la posición 257 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente a asparagina en la posición 262 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente a la asparagina en la posición 262 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el s Eq ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente a asparagina en la posición 262 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido aspártico en la posición 262 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, asparagina en la posición 260 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., histidina en la posición 262 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., asparagina en la posición 260 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, histidina en la posición 262 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, asparagina en la posición 262 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, asparagina en la posición 258 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido aspártico en la posición 262 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, asparagina en la posición 260 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido aspártico en la posición 262 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente a glutamina en la posición 337 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente a la glutamina en la posición 337 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el s Eq ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente a glutamina en la posición 337 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es lisina en la posición 337 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, lisina en la posición 335 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., glutamina en la posición 338 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., treonina en la posición 335 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, lisina en la posición 337 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, lisina en la posición 337 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, lisina en la posición 333 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, asparagina en la posición 337 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, treonina en la posición 335 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y lisina en la posición 337 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 340 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido glutámico en la posición 340 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido glutámico en la posición 338 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., ácido glutámico en la posición 341 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido glutámico en la posición 338 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, prolina en la posición 340 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido glutámico en la posición 340 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, lisina en la posición 336 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido glutámico en la posición 340 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, ácido glutámico en la posición 338 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido glutámico en la posición 340 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido aspártico en la posición 129 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-1 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido glutámico en la posición 129 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido aspártico en la posición 129 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., ácido aspártico en la posición 129 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido aspártico en la posición 129 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, ácido aspártico en la posición 129 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, serina en la posición 129 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, ácido aspártico en la posición 127 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido glutámico en la posición 128 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, ácido aspártico en la posición 129 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido glutámico en la posición 129 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 132 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido aspártico en la posición 132 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-1 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 132 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido aspártico en la posición 132 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido aspártico en la posición 132 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., ácido aspártico en la posición 132 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido aspártico en la posición 132 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, ácido glutámico en la posición 132 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido aspártico en la posición 132 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, ácido aspártico en la posición 130 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido aspártico en la posición 131 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, ácido aspártico en la posición 132 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido aspártico en la posición 132 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 231 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 231 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 231 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido glutámico en la posición 231 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido glutámico en la posición 229 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., ácido glutámico en la posición 231 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido glutámico en la posición 229 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, ácido glutámico en la posición 231 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido glutámico en la posición 231 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, histidina en la posición 227 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido glutámico en la posición 231 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, glutamina en la posición 229 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido glutámico en la posición 231 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 232 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido aspártico en la posición 232 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 232 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es ácido aspártico en la posición 232 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, ácido aspártico en la posición 230 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., ácido glutámico en la posición 232 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido aspártico en la posición 230 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, ácido glutámico en la posición 232 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, glicina en la posición 232 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, ácido glutámico en la posición 228 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, ácido glutámico en la posición 232 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, ácido aspártico en la posición 230 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y ácido aspártico en la posición 232 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

"La posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 249 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1" se refiere a un aminoácido correspondiente al ácido glutámico en la posición 249 de una amadoriasa de SEQ ID NO: 1, cuando la secuencia de aminoácidos identificada de una amadoriasa se compara con la secuencia de aminoácidos de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta y se muestra en el SEQ ID NO: 1. Esto también se puede especificar mediante el método anteriormente mencionado con referencia a la Figura 1-2 en la que se alinean las secuencias de aminoácidos.

Más específicamente, la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 249 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 es lisina en la posición 249 en la amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum, lisina de la posición 247 en la cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp., histidina en la posición 249 en la cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp., ácido glutámico en la posición 247 en la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata, ácido glutámico en la posición 249 en la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta, ácido glutámico en la posición 249 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans, ácido glutámico en la posición 245 en la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum, alanina en la posición 249 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans, serina en la posición 247 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp., y glutamina en la posición 249 en la fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum.

(Producción de la amadoriasa de la presente invención)

Para usar una cepa que tenga la capacidad de producir una amadoriasa que tenga una excelente resistencia a detergentes obtenidos como se describió anteriormente y producir dicha amadoriasa, la cepa puede cultivarse mediante un método de cultivo sólido convencional, aunque se prefiere el cultivo líquido siempre que sea posible.

Ejemplos de medios para cultivar las cepas anteriormente mencionadas incluyen medios preparados mediante la adición de una o más sales inorgánicas, tales como cloruro de sodio, fosfato monopotásico, fosfato dipotásico, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, cloruro férrico, sulfato férrico y sulfato de manganeso, a una o más fuentes de nitrógeno, tales como un extracto de levadura, triptona, peptona, un extracto de carne, un licor de maceración de maíz y una solución de lixiviación de salvado de trigo o soja, y además añadir materiales de sacarina, vitaminas y similares, cuando sea necesario.

Por otro lado, es conveniente ajustar el pH inicial del medio entre 7 y 9.

Además, el cultivo se puede realizar en cualquier condición y, por ejemplo, el cultivo se puede realizar entre 20 °C y 42 °C, y más preferentemente a aproximadamente 30 °C durante 4 a 24 horas, y más preferentemente a aproximadamente 30 °C durante 8 a 16 horas, mediante, por ejemplo, cultivo sumergido con hileras de aireación, cultivo con agitación, o cultivo estacionario.

Tras la finalización del cultivo, las amadoriasas pueden recogerse de los productos de cultivo con medios convencionales de recogida de enzimas. Por ejemplo, una cepa puede someterse a un tratamiento de desintegración ultrasónico o un tratamiento de trituración mediante un método convencional, la enzima se puede extraer usando una enzima lítica tal como lisozima, o se puede realizar una bacteriólisis mediante agitación o todavía en reposo en presencia de tolueno para excretar la enzima del cuerpo del microorganismo. La solución se filtra o centrifuga para eliminar el contenido sólido y, según sea necesario, se elimina el ácido nucleico con la ayuda de sulfato de estreptomicina, sulfato de protamina, o sulfato de manganeso, y a este se añade sulfato de amonio, alcohol o acetona a la solución para fraccionar la solución, y a continuación se recogen los sedimentos para obtener las enzimas brutas de las amadoriasas.

La preparación de enzimas amadoriasas purificadas se puede obtener de: la enzima bruta de la amadoriasa anteriormente mencionada mediante un método seleccionado adecuadamente a partir de métodos de filtración en gel utilizando Sephadex, Superdex o Ultrogel; métodos de adsorción-elución que utilizan vehículos de intercambio iónico; métodos electroforéticos que utilizan geles de poliacrilamida, etc.; métodos de adsorción-elución que utilizan hidroxiapatita; métodos de sedimentación tales como centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa; métodos cromatográficos de afinidad; y métodos de fraccionamiento utilizando una membrana de tamiz molecular, una membrana de fibra hueca, etc. Como alternativa, los métodos anteriormente mencionados se pueden realizar adecuadamente en combinación. Por tanto, se puede obtener la amadoriasa que tiene especificidad de sustrato mejorada interés.

(Tensioactivo de la presente divulgación)

El tensioactivo de la presente divulgación no está particularmente limitado siempre que se pueda llevar a cabo un método para medir la HbA1c en presencia del tensioactivo, y se puede mencionar un tensioactivo no iónico y un tensioactivo iónico tal como un tensioactivo catiónico, un tensioactivo aniónico y un tensioactivo anfótero, y, particularmente, se prefieren un tensioactivo catiónico y un tensioactivo aniónico. La expresión tensioactivo, cuando se menciona en la presente memoria descriptiva, abarca uno o más tensioactivos a menos que se indique otra cosa.

El tensioactivo puede ser un tensioactivo que tenga una concentración micelar crítica (CMC) de 70 mM o inferior, 50 mM o inferior, 20 mM o inferior, 10 mM o inferior, 7 mM o inferior, 6 mM o inferior, 5 mM o inferior, 4,5 mM o inferior, 4 mM o inferior, 3,5 mM o inferior, 3 mM o inferior, 2,5 mM o inferior, 2 mM o inferior, 1,5 mM o inferior, 1,3 mM o inferior, o 1 mM o inferior. En una realización, la concentración micelar crítica del tensioactivo de la presente invención puede ser 0,1 mM o 0,01 mM o superior, preferentemente 50 mM o inferior, más preferentemente 20 mM o inferior, más preferentemente 10 mM o inferior, más preferentemente 7 mM o inferior, más preferentemente 6 mM o inferior, y lo más preferentemente 5 mM o inferior. La concentración micelar crítica se refiere a la concentración crítica por encima de la cual se forman micelas de un tensioactivo en una solución y por debajo de la cual no se forman micelas. En general, cuanto menor es la concentración micelar crítica, menor es la concentración de un tensioactivo que forma micelas y más fuerte es la acción del tensioactivo. Una persona experta en la materia puede determinar la concentración micelar crítica de un tensioactivo deseado mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se puede utilizar un kit disponible comercialmente, que mide una concentración micelar crítica de un tensioactivo basado en un cambio en la fluorescencia de un reactivo fluorescente que interactúa con el tensioactivo, (por ejemplo, Detergent Critical Micelle Concentration (CMC) Assay Kit fabricado por PFP Inc.).

Por ejemplo, la CMC del bromuro de octiltrimetilamonio (C8, OTAB) es aproximadamente 140 mM; la CMC del cloruro de deciltrimetilamonio (C10) es aproximadamente 65 mM; la CMC del bromuro de deciltrimetilamonio (C10) es aproximadamente 70 mM; la CMC del cloruro de dodeciltrimetilamonio (C12) es aproximadamente 20 mM; la CMC del bromuro de dodeciltrimetilamonio (C12, DTAB) es aproximadamente 16 mM; la CMC del cloruro de tetradeciltrimetilamonio (C14, TTAC) es aproximadamente 4,5 mM; la CMC del bromuro de tetradeciltrimetilamonio (C14, TTAB) es aproximadamente 5 mM; la CMC del cloruro de hexadeciltrimetilamonio (C16, CTAC) es aproximadamente 1,3 mM; la CMC del bromuro de hexadeciltrimetilamonio (C16) es aproximadamente 1 mM; la CMC del cloruro de octadeciltrimetilamonio (C18, STAC) es aproximadamente 0,3 mM; y la CMC del bromuro de octadeciltrimetilamonio (C18, STAB) es aproximadamente 0,3 mM (por ejemplo, véanse J. PHYS. COLLIDE. CHEM., 52, 130 (1948); J. PHYS. CHEM., 66, 1839 (1962); J. AM. OIL. CHEMISTS. SOC., 30, 74 (1953); J. PHARM. SCI., 54.436 (1965); KONINKI. NED. AKAD. WETEN. PROC. SER B, 58, 97 (1955); J. PHYS. CHEM., 65, 1807 (1961); J. AM. CHEM. SOC., 65, 692 (1943); J. AM. CHEM. SOC., 69, 2095 (1947); J. COLLIDE. INTERFACE. SCI., 22, 430 (1966); y J. AM. CHEM. s Oc ., 70, 3803 (1948)). Los números entre paréntesis indican el número de átomos de carbono del sustituyente más largo.

Por ejemplo, la CMC del bromuro de 1-dodecilpiridinio (C12) es aproximadamente 12 mM; la CMC del cloruro de 1-dodecilpiridinio (C12, 1-DPC) es aproximadamente 14 mM; la CMC del bromuro de 1 -tetradecilpiridinio (C14) es aproximadamente 2,9 mM; la CMC del cloruro de 1 -hexadecilpiridinio (C16, 1-CPC) es aproximadamente 0,6 mM; la CMC del bromuro de 1-hexadecilpiridinio (C16, 1-CPB) es aproximadamente 0,9 mM; la CMC del cloruro de N-cetil-4-metilpiridinio (C16, 4Me-1-CPC) es aproximadamente 1,9 mM; la CMC del bromuro de 1-octadecilpiridinio es aproximadamente 0,6 mM; y la CMC del cloruro de 1-octadecilpiridinio es aproximadamente 0.24 mM (véanse, por ejemplo, J. COLLIDE. INTERFACE. SCI., 21, 522 (1966); J. PHARM. SCI., 54, 436 (1965); TRANS. FARADAY. SOC., 62, 3244 (1966); J. AM. CHEM. SOC., 70, 3803 (1948); REV. CHIM. AC. REP. POP. ROUM., 6, 309 (1961); y J. AM. CHEM. SOC., 70, 3049 (1948)).

La CMC del cloruro de bencildodecildimetilamonio es aproximadamente 2,8 mM; la CMC del cloruro de benciltetradecildimetilamonio (C14, BDTAC) es aproximadamente 0,37 mM; y la CMC del cloruro de bencilcetildimetilamonio (C16, BCDAC) es aproximadamente 0,042 mM (véanse, por ejemplo, surfactant handbook, 131 (1960), J. COLLIDE. INTERFACE. SCI., 22, 430 (1966); y J. COLLIDE. SCI., 8, 385 (1953)).

Ejemplos del tensioactivo no iónico incluyen un éter alquílico de polioxietileno, un éster de ácido graso de sorbitano, un alquil poliglucósido, una dietanolamida de ácido graso y un alquilmonogliceriléter.

Ejemplos del tensioactivo catiónico incluyen una sal de alquiltrimetilamonio, una sal de dialquildimetilamonio, una sal de alquilbencildimetilamonio, una sal de piridinio tal como una sal de alquilpiridinio, una sal de fosfonio como una sal de alquilfosfonio, una sal de imidazolio, tal como una sal de alquilimidazolio, y una sal de isoquinolinio, tal como una sal de alquilisoquinolinio.

Ejemplos del tensioactivo catiónico de la presente invención incluyen una sal de amonio cuaternario (I), una sal de piridinio (II) y una sal de fosfonio (III) representadas por las siguientes fórmulas generales.

[Fór

[en donde, R1 a R4, que pueden ser iguales o distintos, cada uno representa un alquilo, alquenilo, arilo o bencilo de C1 a C20 sustituido o no sustituido; y Z- representa un anión monovalente].

[en donde, R5 representa un alquilo de C1 a C 20 sustituido o no sustituido; cada Ra, que pueden ser iguales o distintos, representa un átomo de hidrógeno o un alquilo, alquenilo, arilo o bencilo de C1 a C 20 sustituido o no sustituido; n representa un número entero de 1 a 5 y Z- representa un anión monovalente].

[Fór

[en donde, R6 a R9, que pueden ser iguales o distintos, cada uno representa un alquilo, alquenilo, arilo o bencilo de C1 a C20 sustituido o no sustituido; y Z- representa un anión monovalente].

Ejemplos de sal de amonio cuaternario incluyen cloruro de octiltrimetilamonio (OTAC), bromuro de octiltrimetilamonio (OTAB), cloruro de deciltrimetilamonio, bromuro de deciltrimetilamonio (DTAB), cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, cloruro de tetradeciltrimetilamonio (TTAC), bromuro de tetradeciltrimetilamonio (TTAB), cloruro de hexadeciltrimetilamonio (CTAC), bromuro de hexadeciltrimetilamonio, cloruro de octadeciltrimetilamonio, bromuro de octadeciltrimetilamonio (STAB), cloruro de eicosiltrimetilamonio, bromuro de eicosiltrimetilamonio, cloruro de bencildodecildimetilamonio, bromuro de bencildodecildimetilamonio (BDDAB), cloruro de benciltetradecildimetilamonio (BDTAC), bromuro de benciltetradecildimetilamonio, cloruro de bencilcetildimetilamonio (BCDAC), bromuro de bencilcetildimetilamonio, cloruro de dioctildimetilamonio y bromuro de dioctildimetilamonio.

Ejemplos de sal de piridinio incluyen cloruro de 1 -decilpiridinio, bromuro de 1 -decilpiridinio, cloruro de 1-dodecilpiridinio (1-DPC), bromuro de 1-dodecilpiridinio, cloruro de 1 -tetradecilpiridinio, bromuro de 1 -tetradecilpiridinio, cloruro de 1-hexadecilpiridinio (1-CPC), bromuro de 1-hexadecilpiridinio (1-CPB), cloruro de N-cetil-2-metilpiridinio, cloruro de N-cetil-3-metilpiridinio, cloruro de N-cetil-4-metilpiridinio (4Me-1-CPC), cloruro de 1 -octadecilpiridinio, bromuro de 1-octadecilpiridinio, cloruro de 1-eicosilpiridinio y bromuro de 1-eicosilpiridinio.

Ejemplos de la sal de fosfonio incluyen cloruro de tetraetilfosfonio, bromuro de tetraetilfosfonio, cloruro de tributilmetilfosfonio, bromuro de tributilmetilfosfonio, yoduro de tributilmetilfosfonio, cloruro de tetrabutilfosfonio, bromuro de tetrabutilfosfonio, cloruro de tetra-n-octilfosfonio, bromuro de tetra-n-octilfosfonio, cloruro de tributildodecilfosfonio, bromuro de tributildodecilfosfonio, cloruro de tributilhexadecilfosfonio, bromuro de tributilhexadecilfosfonio (TBCPB), cloruro de metiltrifenilfosfonio, bromuro de metiltrifenilfosfonio, yoduro de metiltrifenilfosfonio, cloruro de tetrafenilfosfonio y bromuro de tetrafenilfosfonio.

El anión Z' para emparejarse con un tensioactivo catiónico, puede, por ejemplo, ser Cl-, B r o h

Ejemplos del tensioactivo aniónico incluyen un alquilbenceno sulfonato lineal, un alquil sulfato, un alfa-olefina sulfonato, un polioxietilen alquil éter sulfato, una sal de a-sulfo éster de ácido graso y una sal de metal alcalino de un ácido graso natural. Ejemplos de dicho tensioactivo incluyen dodecilsulfato de sodio (SDS).

Ejemplos del tensioactivo anfótero incluyen un óxido de alquildimetilamina y alquilcarboxibetaína.

(Kit que contiene una amadoriasa y un tensioactivo)

También se describe un kit para medir la glucohemoglobina, que contiene una amadoriasa y un tensioactivo. El tensioactivo puede ser un tensioactivo no iónico o iónico. La amadoriasa y el tensioactivo pueden estar incluidos como una mezcla o como componentes aislados. Cuando una amadoriasa y un tensioactivo se incluyen mezclados en un kit, en general, se prefiere que el tensioactivo esté incluido en una concentración en la que la amadoriasa no esté inactivada. Cuando la amadoriasa y el tensioactivo están incluidos como componentes aislados en el kit, se puede utilizar como tensioactivo una solución madre que contenga un tensioactivo a una concentración más alta que la concentración final utilizada para la medición. Esta solución madre se diluye adecuadamente para preparar la solución que se utilizará en la medición.

El kit que contiene una amadoriasa y un tensioactivo de la presente invención puede contener además un reactivo para medir aFVH, una proteasa o peptidasa para eliminar aFVH y otros componentes, es decir, un estabilizante y una solución tampón conocidos en la materia. Las técnicas utilizadas en kits para medir aFVH se pueden utilizar de forma adecuada para producir un kit que contiene una amadoriasa de la presente invención y un tensioactivo. Más específicamente, la presente divulgación proporciona un método para producir un kit que contiene una amadoriasa y un tensioactivo que comprende la etapa de preparar una amadoriasa y un tensioactivo adecuados. En este caso, la amadoriasa y el tensioactivo se pueden preparar como una mezcla o como componentes aislados. Cuando la amadoriasa y el tensioactivo se proporcionan como componentes aislados en un kit, se pueden mezclar inmediatamente antes de la medición de aFVH

La amadoriasa contenida en el kit exhibe preferentemente una actividad residual (%) de preferentemente un 13 % o superior, más preferentemente 15% o superior, lo más preferentemente 19 % o superior, (por ejemplo, 20% o superior, 30 % o superior, 40 % o superior, 50 % o superior, 60 % o superior, 70 % o superior, 80 % o superior, 90 % o superior, 95 % o superior o 99 % o superior) 5 minutos después de añadir una solución de tensioactivo controlada para tener una concentración final, en comparación con la amadoriasa a la que no se le añade la solución de tensioactivo. La actividad residual se describirá a continuación.

La amadoriasa contenida en el kit tiene una concentración final de 110 pg/ml o inferior (por ejemplo, 100 pg/ml o inferior, 70 pg/ml o inferior, o 50 pg/ml o inferior) por tensioactivo de 0,01 % (p/v), preferentemente en el momento de la medición. El tensioactivo contenido en el kit tiene una concentración final en el momento de la medición de 0,01 % (p/v) o superior (por ejemplo, 0,02 % (p/v) o superior, 0,04 % (p/v) o superior, 0,05 % (p/v) o superior, 0,06 % (p/v) o superior, 0,07 % (p/v) o superior, 0,08 % (p/v) o superior, 0,09 % (p/v) o superior, 0,1 % (p/v) o superior, 0,15 % (p/v) o superior, 0,2% (p/v) o superior, 0,25 % (p/v) o superior, o 0,3 % (p/v) o superior). En el presente documento, la concentración final en el momento de la medición se refiere a la concentración del componente finalmente diluido y utilizado para medir la glucohemoglobina. Por consiguiente, el kit puede contener una solución madre con una concentración mayor que la concentración final en el momento de la medición.

La amadoriasa contenida en el kit puede ser una amadoriasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 37 o una variante preparada basándose en la misma con resistencia mejorada a tensioactivos. La variante puede tener una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, por ejemplo, 70 % o superior, 75 % o superior, 80 % o superior, 85 % o superior, 90 % o superior, 95 % o superior, 97 % o superior o 99 % o superior, con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 37 o una secuencia de aminoácidos preparada mediante la modificación o la alteración de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 37 o la deleción, la sustitución, la adición y/o la inserción de uno a varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos.

La amadoriasa contenida en el kit puede ser una amadoriasa de origen natural procedente del género Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia, Neocosmospora, Cryptococcus, Phaeosphaeria, Aspergillus, Emericella, Ulocladium, Penicillium, Fusarium, Achaetomiella, Achaetomium, Thielavia, Chaetomium, Gelasinospora, Microascus, Leptosphaeria, Ophiobolus, Pleospora, Coniochaetidium, Pichia, Corynebacterium, Agrobacterium y Arthrobacter o una variante de los mismos. Dicha variante puede tener una o más sustituciones de aminoácidos en la posición correspondiente a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en asparagina en la posición 262, valina en la posición 257, ácido glutámico en la posición 253, glutamina en la posición 337, ácido glutámico en la posición 340, ácido glutámico en la posición 133, ácido glutámico en la posición 44, glicina en la posición 256, ácido glutámico en la posición 81, ácido aspártico en la posición 129, ácido aspártico en la posición 132, ácido glutámico en la posición 231, ácido aspártico en la posición 232 y ácido glutámico en la posición 249 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 1 o 3. Una persona experta en la materia puede confirmar fácilmente si se puede usar o no una amadoriasa o una variante de la misma en el kit de la presente invención, más específicamente, si una amadoriasa tiene o no la resistencia deseada a tensioactivos, mediante, por ejemplo, el uso del método de ensayo descrito más adelante o el método de evaluación en el Ejemplo 7.

(Tampón)

Para el kit o composición de la presente divulgación, se puede añadir de forma adecuada un tampón o una solución tampón que tenga una capacidad tamponante dentro del intervalo de pH 5,0 a pH 10,0, preferentemente de pH 6,0 a pH 8,0, que es un intervalo en el que la amadoriasa no está inactivada. El término tampón, como se menciona en la presente memoria descriptiva, se define para incluir uno o más tampones a menos que se indique otra cosa. La expresión solución tampón se refiere a una solución que tiene una acción tamponante (capacidad tamponante) de mantener el pH de una solución dentro de un intervalo constante; mientras que el término tampón (agente tampón) se refiere a un agente que confiere acción tamponante a una solución. Un tampón, si se toma como ejemplo un ácido débil, está compuesto por un ácido débil y una sal del mismo. En este caso, la sal se denomina sal conjugada. Por ejemplo, si un tampón está compuesto por un ácido fosfórico y una sal de potasio del mismo, dado que un compuesto base es un ácido fosfórico, dicho tampón se denomina, a veces, tampón fosfato en la presente memoria descriptiva por conveniencia. La concentración de un tampón se refiere a la concentración del compuesto base, que es un total del compuesto solo que sirve como base del tampón y la forma de sal conjugada del mismo. Por ejemplo, la expresión 100 mM de tampón fosfato significa que la concentración total de ácido fosfórico, que es un total del ácido fosfórico y la sal conjugada del mismo (por ejemplo, fosfato de potasio) contenido en la solución en la concentración final, es 100 mM.

Entre los tampones (soluciones tampón), en particular, se prefieren aquellos que mantienen la actividad residual de una amadoriasa en presencia de un tensioactivo o que alivian la reducción de la actividad residual. En la presente memoria descriptiva, dicho tampón preferido puede denominarse particularmente tampón que tiene un efecto estabilizante de amadoriasa o tampón de la presente invención. Por ejemplo, HEPES no tiene un efecto estabilizante de amadoriasa sobre una amadoriasa procedente del género Coniochaeta (CFP-T7, SEQ ID NO: 1), incluso si se utiliza en una concentración de 500 mM (pH 7,0). Por tanto, HEPES no se incluye en un tampón que tenga un efecto estabilizante de amadoriasa de la presente invención. Como puede verse, no todos los tampones tienen efectos estabilizantes de amadoriasa. Por tanto, el tampón que tiene el efecto estabilizante de amadoriasa no solo mantiene el pH de una solución a un nivel constante sino que también tiene el efecto de estabilizar una amadoriasa en el pH tamponante. En el presente documento, el efecto estabilizante de amadoriasa del tampón se refiere a una acción de mantener la actividad residual de una amadoriasa en presencia de un tensioactivo, o a una acción de aliviar la reducción de la actividad residual. Dicho efecto (acción) estabilizante de amadoriasa puede evaluarse mediante la comparación de la actividad residual de la amadoriasa de una solución que no contiene ningún tampón o una solución que utiliza un tampón que no tiene efecto estabilizante de amadoriasa con la actividad residual de la amadoriasa de una solución que utiliza el tampón en la presencia de un tensioactivo.

Ejemplos del tampón (solución tampón) que se pueden utilizar en el kit (composición) incluyen un tampón borato que contiene ácido bórico y/o una sal del mismo; un tampón Tris-clorhidrato; un tampón fosfato que contiene ácido fosfórico y/o una sal del mismo tal como un tampón fosfato de potasio o un tampón fosfato de sodio; un tampón de ácido orgánico que contiene un tampón de ácido orgánico y/o una sal del mismo, tal como un tampón tricarboxilato que contiene ácido tricarboxílico (tampón) y/o una sal del mismo, un tampón citrato que contiene ácido cítrico y/o una sal del mismo; un tampón monocarboxilato que contiene un ácido monocarboxílico (tampón) y/o una sal del mismo, tal como un tampón acetato que contiene un ácido acético (tampón) y/o una sal del mismo. Ejemplos del tampón que se utilizará en, por ejemplo, el kit, incluyen tampones de Good que incluyen, por ejemplo, ACES [ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico], BES (ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico), Bicina (N,N-bis(2-hidroxietil)glicina), Bis-Tris (bis(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano), CHES (ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico), EPPS (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-propanosulfónico), HEPES (ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinetanosulfónico), HEPPSO (ácido N-(hidroxietil)piperazina-N'-2-hidroxi-propanosulfónico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), MOPSO (ácido 2-hidroxi-3-morfolinopropanosulfónico), PIPES (piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico)), POPSO (piperazina-1,4-bis(ácido 2-hidroxipropanosulfónico)), TAPS (ácido N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico), TAPSO (ácido 3-[N-tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico), TES (ácido N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico), Tricina (N-tris(hidroximetil)metilglicina) y/o sales de los mismos. Asimismo, un tampón que contiene un compuesto representado por la siguiente fórmula (IV):

[Fórmula 8]

[donde n puede ser 0, 1, 2 o 3; cada R10 independientemente representa H, OH, -CH2OH o-COOH], y/o una sal del mismo, se puede mencionar. Por otra parte, se puede mencionar un tampón a base de un ácido dicarboxílico, incluyendo un tampón ftalato que contiene ácido ftálico y/o una sal del mismo; un tampón maleato que contiene ácido maleico y/o una sal del mismo; un tampón fumarato que contiene ácido fumárico y/o una sal del mismo; un tampón glutarato que contiene ácido glutárico y/o una sal del mismo; un tampón citraconato que contiene ácido citracónico y/o una sal del mismo; un tampón mesaconato que contiene ácido mesacónico y/o una sal del mismo; un tampón malonato que contiene ácido malónico y/o una sal del mismo; un tampón tartrato que contiene ácido tartárico y/o una sal del mismo; un tampón succinato que contiene ácido succínico y/o una sal del mismo; un tampón adipato que contiene ácido adípico y/o una sal del mismo; y un tampón malato que contiene ácido málico y/o una sal del mismo. Estos, excluyendo HEPES y CHES, pueden servir como tampón que tiene el efecto estabilizante de amadoriasa. Ejemplos de un tampón preferido que tiene el efecto estabilizante de amadoriasa incluyen, pero sin limitación, un tampón fosfato, un tampón ACES, un tampón citrato, un tampón malato, un tampón acetato, un tampón maleato, un tampón citraconato, un tampón malonato, un tampón glutarato, un tampón tartrato y un tampón representado por la fórmula (IV) tal como el tampón MES, tampón MOPS y tampón MOPSO. Estos pueden usarse solos o en combinación de dos o más. El tampón que tiene el efecto estabilizante de amadoriasa se puede utilizar en combinación con una sustancia (por ejemplo, un tampón que no tiene un efecto estabilizante de amadoriasa) distinta de los tampones anteriores. Ejemplos de la sal incluyen, pero sin limitación, una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de magnesio, una sal de calcio y una sal de amonio de un compuesto base.

El tampón se puede usar en una concentración adecuada en el kit o composición. En general, la cantidad de tampón que se añadirá al kit o la composición se puede calcular en función de la concentración final en una solución de medición. En una realización, la concentración final del tampón en una solución de medición es la concentración a la que se amortigua de forma suficiente un cambio de pH que puede ocurrir en la solución de medición. En otra realización, la concentración final del tampón en una solución de medición es la concentración a la que la actividad residual de una amadoriasa en una solución que contiene un tensioactivo llega a un 20 % o superior, preferentemente 40 % o superior, preferentemente 60 % o superior, y preferentemente 80 % o superior. La concentración final del tampón puede ser, por ejemplo, 1 mM o superior, 5 mM o superior, 10 mM o superior, 20 mM o superior, por ejemplo, 50 mM o superior, 1 M o inferior, 500 mM o inferior, 400 mM o inferior, 300 mM o inferior, 200 mM o inferior, 100 mM o inferior, por ejemplo, de 1 mM a 1M, de 5 mM a 500 mM, de 10 mM a 300 mM, por ejemplo, de 50 mM a 100 mM. Cuando se usa un tampón fosfato como tampón que tiene el efecto estabilizante de amadoriasa, la concentración del mismo puede ser de 50 mM a 500 mM, por ejemplo, de 50 mM a 300 mM y preferentemente de 100 mM a 300 mM. Cuando se utiliza un tampón citrato, un tampón malato, de ácido maleico, un tampón citraconato, un tampón malonato, un tampón glutarato o tartrato como tampón, la concentración del mismo puede ser de 5 mM a 500 mM, preferentemente de 10 mM a 200 mM, por ejemplo, de 10 mM a 100 mM. Cuando se utiliza un tampón representado por la fórmula (IV), tal como el tampón MES, el tampón MOPS o el tampón MOPSO como tampón de la presente invención, la concentración del mismo puede ser de 10 mM a 500 mM, por ejemplo, de 100 mM a 500 mM, por ejemplo, de 150 mM a 300 mM. Cuando se utiliza un tampón ACES como tampón, la concentración del mismo puede ser de 200 mM a 1M, por ejemplo, de 200 mM a 500 mM. Como tampón se pueden utilizar una pluralidad de tampones en combinación. La cantidad de tampón que se utilizará en una composición, si también se añade un estabilizante a la composición, puede variar dependiendo de la cantidad de estabilizante.

(Estabilizante)

Al kit o composición se le puede añadir de forma adecuada un estabilizante, que mantiene la actividad residual de una amadoriasa o disminuye una reducción de la actividad residual en presencia de un tensioactivo. En la presente memoria descriptiva, el estabilizante se refiere a una sustancia, que mantiene la actividad residual de una amadoriasa o disminuye una reducción de la actividad residual en presencia de un tensioactivo. En la presente memoria descriptiva, el estabilizante de expresión abarca uno o más estabilizantes, a menos que se indique otra cosa. Ejemplos del estabilizante que debe contener el kit o la composición incluyen ácido fosfórico, ácido tricarboxílico (por ejemplo, ácido cítrico), ácido dicarboxílico (por ejemplo, ácido málico, ácido maleico, ácido citracónico, ácido malónico, ácido glutárico, ácido tartárico), ácido monocarboxílico (por ejemplo, ácido acético), un compuesto representado por la fórmula (IV) (por ejemplo, MES, MOPS, MOPSO), sulfato de amonio, sales de estos y cualquier combinación de los mismos.

El estabilizante se puede usar en una concentración adecuada en el kit o composición. En general, la cantidad de estabilizante que se añadirá al kit o composición se calcula basándose en la concentración final en la solución de medición. En una realización, la cantidad de estabilizante añadido es la cantidad a la que la actividad residual de una amadoriasa en una solución que contiene un tensioactivo es de un 35 % o superior, 37,5 % o superior, preferentemente 40 % o superior, 45 % o superior, 50 % o superior, 55 % o superior, preferentemente 60 % o superior, 65 % o superior, 70 % o superior, 75 % o superior, preferentemente 80 % o superior, 85 % o superior, 90 % o superior o 95 % o superior. El estabilizante se puede añadir al kit o composición de manera que la concentración final en la solución de medición sea, por ejemplo, de 0,1 mM a 100 mM, de 0,2 mM a 100 mM, de 0,5 mM a 50 mM, de 1 mM a 30 mM, de 2 mM a 30 mM, de 5 mM a 20 mM o de 10 mM a 20 mM. Si también se añade un tampón a la composición, la cantidad de estabilizante puede variar dependiendo de la cantidad de tampón. Por ejemplo, para evitar cambios de pH cuando se añade un estabilizante, el tipo y la cantidad de tampón que se va a añadir se pueden seleccionar y ajustar de forma adecuada, o se pueden ajustar de forma adecuada el pH de la solución estabilizante.

Entre los tampones, en particular, un tampón fosfato, un tampón citrato y tampón MES, cuando se utilizan en una concentración, en el que el pH de la solución se puede mantener a un nivel constante, más específicamente, por ejemplo, 100 mM para un tampón fosfato, por ejemplo, 50 mM para un tampón citrato y, por ejemplo, 150 mM para tampón MES, se observó un efecto estabilizante de amadoriasa. Sin embargo, si la concentración de ácido fosfórico y/o una sal de potasio del mismo, de ácido cítrico y/o una sal sódica del mismo o de MES y/o una sal sódica del mismo que se añaden a la composición se reducen aún más mientras se mantiene el pH de la solución dentro de un intervalo constante mediante el uso de HEPES, que no tiene efecto estabilizante de amadoriasa como tampón de pH, se observó la acción estabilizante de la actividad residual de una amadoriasa en presencia de un tensioactivo. La acción estabilizante se observó incluso a una concentración más baja que aquellas a las que el ácido fosfórico y/o una sal potásica del mismo, el ácido cítrico y/o una sal sódica del mismo y MES y/o una sal sódica del mismo ejercen eficazmente una acción tampón, más específicamente, 5 mM para ácido fosfórico, 0,5 mM para ácido cítrico y 20 mM para MES. De esto, se confirmó que el ácido fosfórico y/o una sal potásica del mismo, el ácido cítrico y/o una sal sódica del mismo y MES y/o una sal sódica del mismo tienen un efecto estabilizante para mantener la actividad de la amadoriasa además del efecto estabilizante de amadoriasa como tampón de la presente invención. Dicha acción puede denominarse en el presente documento como el efecto estabilizante de amadoriasa del estabilizante de la presente invención, por conveniencia, para distinguir esto del efecto estabilizante de amadoriasa del tampón. Por tanto, el ácido fosfórico y/o una sal potásica del mismo, el ácido cítrico y/o una sal sódica del mismo y MES y/o una sal sódica del mismo tienen el efecto estabilizante de amadoriasa del tampón de la presente invención así como el efecto estabilizante de amadoriasa del estabilizante. En otras palabras, el ácido fosfórico y/o una sal potásica del mismo, el ácido cítrico y/o una sal sódica del mismo y MES y/o una sal sódica del mismo se incluyen no sólo en el tampón sino también en el estabilizante.

Además, se observó que el ácido maleico, ácido citracónico, ácido malónico, ácido glutárico, ácido tartárico, MOPS y MOPSO que tienen efecto estabilizante de amadoriasa ejercen un efecto estabilizante de amadoriasa a concentraciones inferiores a la concentración a la que se ejerce eficazmente una acción tamponante, tales como 10 mM o 20 mM. Estos son compuestos que pueden ejercer una acción tamponante a concentraciones más altas (por ejemplo, 50 mM, 100 mM, 150 mM). Por tanto, ácido maleico, ácido citracónico, ácido malónico, ácido glutárico, ácido tartárico, MOPS, MOPSO y el compuesto representado por la fórmula (IV) también se incluyen no solo en el tampón sino también en el estabilizante.

Cuando el kit o composición comprende una amadoriasa, un tensioactivo, un estabilizante y/o un tampón, estos se pueden añadir en cualquier orden al kit o composición. Preferentemente, se añade un estabilizante y/o tampón (si están contenidos) y, a continuación, se añade un tensioactivo para aliviar la reducción de la actividad residual de la amadoriasa.

(Mejora de la resistencia a tensioactivos de una amadoriasa de la presente invención)

La amadoriasa de la presente invención obtenida por los medios anteriormente mencionados tiene una mutación en su secuencia de aminoácidos mediante, por ejemplo, modificación genética, con el resultado de que la amadoriasa tiene una resistencia mejorada a tensioactivos, en comparación con una amadoriasa antes de la modificación. Más específicamente, la actividad residual (%) de la amadoriasa modificada mejora 5 minutos después de un tratamiento particular con tensioactivo, por ejemplo, después de añadir cloruro de hexadeciltrimetilamonio al 0,01 % (p/v) (a continuación en el presente documento denominado "CTAC") a 30 °C, en las condiciones de reacción descritas en el método de medición de la actividad y el método de evaluación de la resistencia a tensioactivos en la presente memoria descriptiva, en comparación con la actividad de una amadoriasa antes de la modificación. En el presente documento, la actividad residual (%) se refiere a la relación (%) de actividad después del tratamiento con tensioactivo en relación con la actividad antes del tratamiento con tensioactivo (considerada como 100). Cuando la concentración de un tensioactivo en la presente memoria descriptiva se expresa en porcentaje, el porcentaje significa % (p/v), a menos que se indique otra cosa.

El grado de mejora de la actividad residual (%) de una amadoriasa modificada de la presente invención no está limitado; sin embargo, por ejemplo, la presente invención abarca una amadoriasa modificada que tiene una actividad residual (%) de preferentemente un 13 % o superior, más preferentemente 15 % o superior, lo más preferentemente 19 % o superior, por ejemplo, 20 % o superior, 30 % o superior, 40 % o superior, 50 % o superior, 60 % o superior, 70 % o superior, 80 % o superior, 90 % o superior, 95 % o superior o 99 % o superior cuando se mide antes y después de que se introduzca una mutación de la presente invención y se someta a un tratamiento con tensioactivo. Cuando se introducen amadoriasas antes y después de una mutación de la presente invención se someten a un tratamiento con tensioactivo y, a continuación, se comparan los valores numéricos de actividad residual (%), una amadoriasa modificada que tiene una actividad residual mejorada en un 2 % o superior, preferentemente 9 % o superior, lo más preferentemente 19 % o superior, por ejemplo, 20 % o superior, 30 % o superior, 40 % o superior, 50 % o superior, 60 % o superior, 70 % o superior, 80 % o superior, 90 % o superior, 95 % o superior o 99 % o superior, está abarcada por la presente invención.

De acuerdo con una realización, cuando se aplica un tratamiento con tensioactivo a una amadoriasa antes de que se introduzca una mutación de la presente invención, la amadoriasa puede perder completamente su actividad. En tal caso, para evaluar la mejora de la actividad residual de una amadoriasa (%) de la presente invención a la que se introduce una mutación de la presente invención, se utiliza una amadoriasa que no perderá completamente su actividad incluso mediante un tratamiento con tensioactivo y la actividad residual de una amadoriasa que sirve como referencia después de un tratamiento con tensioactivo puede compararse con la actividad residual de una amadoriasa que tiene una mutación introducida en ella después del tratamiento con tensioactivo.

En situaciones, puede ser difícil evaluar la resistencia absoluta a tensioactivos de las variantes basándose simplemente en si los valores numéricos de la actividad residual (%) y la relación de actividad residual son grandes o pequeños, ya que los resultados de la evaluación relativa pueden diferir dependiendo no solo de las condiciones de temperatura durante la medición, sino también del grado de resistencia a tensioactivos de una amadoriasa antes de la introducción de una mutación. Sin embargo, es posible evaluar absolutamente la resistencia a tensioactivos de las variantes siguiendo las condiciones de los Ejemplos de la presente invención. Además, para seleccionar fácilmente la amadoriasa de la presente invención, mediante la selección de condiciones de tratamiento con tensioactivo en las que se calcula que la actividad residual de una amadoriasa (%) antes de la introducción de una mutación es suficientemente baja, en general, el grado de mejora de la actividad residual (%) y la relación de actividad residual tienden a calcularse como altos.

Por ejemplo, cuando la amadoriasa de la presente invención, producida por la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-T7/253K) comprendida en la presente invención, se mezcla con CTAC al 0,01 % y se somete a un tratamiento a 30 °C durante 5 minutos, entonces la actividad residual de la amadoriasa, CFP-T7, antes de la introducción de la mutación de la presente invención, es de un 69,9 %; mientras, la actividad residual de la misma después de la introducción de la mutación de la presente invención es superior a un 72 %. Cuando la amadoriasa de la presente invención, producida por la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D7), se mezcla con CTAC al 0,04 % y se somete a un tratamiento a 30 °C durante 5 minutos, entonces la actividad residual de la amadoriasa, CFP-D, antes de la introducción de la mutación de la presente invención, es de un 12,7 %; mientras, la actividad residual de la misma después de la introducción de la mutación de la presente invención es superior a un 15 %. Igualmente, una amadoriasa mejorada en la resistencia a tensioactivos mejora significativamente en las propiedades de almacenamiento en, por ejemplo, productos que contienen enzimas, además, mejora la eficacia de degradación de la proteasa de HbA1c y aumenta la sensibilidad de la medición. Debido a esto, la amadoriasa es estable cuando se utiliza un tensioactivo fuerte y, por tanto, muy útil desde la perspectiva de la industria.

(Método de medición de la actividad de la amadoriasa)

La actividad de una amadoriasa se puede medir mediante varios métodos. A continuación se describe un ejemplo del método para medir la actividad de una amadoriasa como se usa en el presente documento.

(Método de medición de la actividad de la amadoriasa)

Los ejemplos de métodos principales para medir la actividad enzimática de la amadoriasa de la presente invención incluyen un método de medición de la cantidad de peróxido de hidrógeno generado por reacciones enzimáticas y un método de medición de la cantidad de oxígeno consumido en reacciones enzimáticas. A continuación se describe un ejemplo del método de medición de la cantidad de peróxido de hidrógeno.

En lo sucesivo en el presente documento, cuando se mide la actividad de una amadoriasa en la presente invención, se utiliza fructosil valina como sustrato, a menos que se especifique otra cosa. El valor de enzima se define de manera que, cuando se utiliza fructosil valina como sustrato en la medición, la cantidad de enzima que genera 1 pmol de peróxido de hidrógeno por minuto es (definida como) 1 U. Un glucoaminoácido, tal como fructosil valina, y un glucopéptido, tal como fructosil-valil histidina, se pueden sintetizar y purificar según el método de Sakaue et al. (véase, Publicación de Patente JP (Kokai) N.° 2001-95598).

A. Preparación de reactivo

(1) Reactivo 1: solución de POD-4-AA

La peroxidasa (4,0 kU, fabricada por Kikkoman Corporation) y 100 mg de 4-aminoantipirina (fabricada por Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) se disuelven en tampón fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,0) y el volumen de la solución se fija en 1 l.

(2) Reactivo 2: Solución de TOOS

TOOS (500 mg, sodio N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina, fabricado por Dojindo Laboratories) se disolvió en agua de intercambio iónico y el volumen de la solución se fijó en 100 ml.

(3) Reactivo 3: Solución de sustrato (150 mM; concentración final: 5 mM)

Se disuelve fructosil valina (417 mg) en agua de intercambio iónico y el volumen de la solución se fija en 10 ml.

B. Método de medición

Se mezclaron el reactivo 1 (2,7 ml), el reactivo 2 (100 pl) y el reactivo 3 (100 pl) y se calentaron previamente a 37 °C durante 5 minutos. A continuación, a la mezcla, se añadió una solución de enzima (100 pl) y se mezcló completamente. Posteriormente, se mide la absorbencia de la mezcla a 555 nm con un espectrofotómetro (U-3010, fabricado por Hitachi High-Technologies). La medición se realiza a 555 nm de un minuto a tres minutos y se especifica un cambio de absorbencia por minuto como valor de medición. Se prepara una solución de control de la misma manera que antes, excepto que se usa agua de intercambio iónico (100 pl) en lugar del reactivo 3 (100 pl). El número de micromoles de peróxido de hidrógeno generados por minuto a 37 °C se especifica como la unidad (U) de actividad de la solución enzimática y se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

Actividad (U/ml) = {(AAs-AA0) x 3,0 x df} (39,2 x 0,5 x 0,1)

AAs: cambio en la absorbencia de la solución de reacción por minuto

AAü: cambio en la absorbencia de la solución de control por minuto

39,2: índice de absorbencia en milimoles (mM'1-cirr1) de colorante quinoneimina generado por la reacción 0,5: número de moles de colorante quinoneimina generado por 1 mol

peróxido de hidrógeno

df: factor de dilución

(Método para medir la resistencia a tensioactivos)

Una solución de enzima bruta de amadoriasa o una muestra purificada de amadoriasa se diluye con una solución tampón MES 30 mM/Tris 21 mM (pH 6,5) para tener una concentración de aproximadamente 1,0 U/ml. A esto, se añade CTAC (por ejemplo, fabricado por Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) para obtener una concentración final de 0,01 % (p/v) o 0,04 %. La mezcla resultante se calentó a 30 °C durante 5 minutos. Después de calentar, la mezcla se diluye dos veces con un tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contiene BSA al 0,15 % para preparar una muestra. Las actividades enzimáticas de la muestra antes y después de un tratamiento con tensioactivo se miden mediante el método descrito en la Sección B anterior. Se obtiene la relación de actividad de la muestra después del tratamiento con tensioactivo en relación con la actividad de la muestra antes del tratamiento con tensioactivo (considerada como 100), es decir, la actividad residual (%). De esta forma, se evalúa la resistencia a tensioactivos.

(Método para evaluar el tampón)

En el método de medición de la resistencia a tensioactivos anterior, la actividad residual de una amadoriasa se mide mediante el uso de varios tampones en lugar de una solución tampón MES 30 mM/Tris 21 mM. De esta forma, se puede evaluar la contribución del tampón a la actividad residual de la amadoriasa. Por ejemplo, en lugar de la solución tampón MES 30 mM/Tris 21 mM (pH 6,5), por ejemplo, se puede utilizar una solución tampón fosfato (pH 7,0), una solución tampón citrato (pH 6,0), una solución tampón HEPEs (pH 7,0) o una solución tampón ACES (pH 7,0). Otras condiciones y procedimientos pueden ser los mismos que en el método de medición de la resistencia a tensioactivos anterior.

(Método para evaluar el estabilizante)

En el método de medición de la resistencia a tensioactivos anterior, se añaden varios estabilizantes y se mide la actividad residual de una amadoriasa para evaluar el efecto de los estabilizantes. Para evaluar el efecto estabilizante de amadoriasa independientemente de la contribución del compuesto (debido a la acción del tampón) a la actividad residual de la amadoriasa cuando los estabilizantes a evaluar son compuestos que también tienen una acción tamponante, se utiliza un tampón que no tiene efecto estabilizante de amadoriasa a una concentración suficiente para proporcionar una capacidad tamponante a una solución (por ejemplo, se utiliza HEPES (pH 7,0) a 500 mM); aunque al mismo tiempo, se pueden utilizar estabilizantes en concentraciones bajas insuficientes para proporcionar capacidad tamponante a la solución. La concentración suficiente para proporcionar una capacidad tamponante a una solución se refiere a la concentración a la que el pH se mantiene dentro de un intervalo predeterminado (por ejemplo, de pH 5 a 10, de pH 6 a 8) sin que el pH cambie debido a otros reactivos añadidos a la solución. Una concentración insuficiente para proporcionar una capacidad tamponante a una solución se refiere a la concentración a la que el pH cambia mediante la adición de otros reactivos a la solución y el pH cae fuera de un intervalo particular. Estas concentraciones varían según el tipo y la cantidad de otros reactivos que se añaden a una solución; sin embargo, una persona experta en la materia puede determinar de forma adecuada la concentración mediante métodos convencionales. Otras condiciones y procedimientos pueden ser los mismos que en el método de medición de la resistencia a tensioactivos anterior.

(Acción mediante uso combinado)

Para evaluar la acción estabilizante de amadoriasa de un uso combinado del tampón y el estabilizante, el estabilizante y el tampón se pueden añadir de forma adecuada mientras se ajustan las concentraciones de los mismos a una solución que contiene la amadoriasa de la presente invención y un tensioactivo, y, entonces, la actividad residual de la amadoriasa se puede medir. Otras condiciones y procedimientos pueden ser los mismos que en el método de medición de la resistencia a tensioactivos anterior.

La presente invención se describirá más específicamente a continuación con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos no pretenden limitar de ningún modo el alcance técnico de la presente invención.

[Ejemplo 1]

(Mutación(es) para mejorar la resistencia a tensioactivos)

(1) Preparación del ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7

La cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-T7), que tiene un plásmido recombinante que contiene el gen CFP-T7 (SEQ ID NO: 2) (véase la Publicación Internacional N.° WO 2007/125779), se inoculó en 2,5 ml de medio LB-amp [bactotriptón al 1 % (p/v), peptona al 0,5 % (p/v), NaCl al 0,5 % (p/v) y ampicilina 50 pg/ml] y se sometió a cultivo con agitación a 37 °C durante 20 horas y se obtuvo un producto de cultivo.

El producto de cultivo se centrifugó a 7.000 rpm durante 5 minutos para recoger las cepas. A continuación, se extrajo el plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 y se purificó a partir del mismo utilizando el kit QIAGEN tip-100 (QIAGEN), y se obtuvieron 2,5 pg de ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7.

(2) Operación de modificación dirigida al sitio del ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7

La PCR se llevó a cabo en las condiciones que se describen a continuación utilizando el ADN obtenido del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 5 y 6, y KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.).

Esto es, se mezclaron 5 pl de tampón KOD-Plus 10x, 5 pl de una mezcla de dNTP en la que cada dNTP se ajustó a 2 mM, 2 pl de solución de MgSO 25 mM4, 50 ng de ADN de pKK223-3-CFP-T7 como molde, 15 pmol de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos y 1 unidad de KOD-Plus, y se les añadió agua esterilizada para llevar la cantidad total de la solución a 50 pl. La solución de reacción preparada se sometió a incubación utilizando un termociclador (fabricado por Eppendorf Co.) a 94 °C durante 2 minutos y, a continuación, se repitió 30 veces un ciclo de 94 °C durante 15 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 6 minutos.

Una porción de la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0 % y se confirmó la amplificación específica de aproximadamente 6.000 pb de ADN. El ADN así obtenido se trató con una enzima de restricción, Dpnl (de New England Biolabs Co., Ltd.); después de escindir el ADN molde restante, se transformó JN109 de Escherichia coli con el mismo; y los transformantes resultantes se esparcieron en medio de agar LB-amp. Las colonias desarrolladas se inocularon en medio LB-amp y se sometieron a cultivo con agitación, y el ADN plasmídico se aisló de la misma manera que en (1) anterior. La secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el plásmido se determinó utilizando un sistema de análisis de ADN multicapilar, Applied Biosystems 3130 x I Genetic Analyzer (de Life Technologies Co., Ltd.); como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la asparagina en la posición 262 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con histidina (pKK223-3-CFP-T7-262H).

Posteriormente, para sustituir valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con cisteína, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un plásmido recombinante, ADN de pKK223-3-CFP-T7, como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 7 y 8, y KOD-Plus- (de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con cisteína (pKK223-3-CFP-T7-257C).

Posteriormente, para sustituir la valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con serina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 8 y 9, y KOD-Plus- (de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del a Dn que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con serina (pKK223-3-CFP-T7-257S).

Posteriormente, para sustituir la valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con treonina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 8 y 10, y KOD-Plus- (de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la valina en la posición 257 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con treonina (pKK223-3-CFP-T7-257T).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 253 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 11 y 12, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 253 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-253K).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 253 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con arginina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 12 y 13, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en el que el ácido glutámico en la posición 253 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con arginina (pKK223-3-CFP-T7-253R).

Posteriormente, para sustituir la glutamina en la posición 337 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7-H1 como molde, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 14 y 15, y KOD-Plus- (de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la glutamina en la posición 337 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-337K).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 340 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con prolina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 16 y 17, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 340 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con prolina (pKK223-3-CFP-T7-340P).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con alanina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 18 y 19, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con alanina (pKK223-3-CFP-T7-133A).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con metionina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 19 y 20, y KOD-Plus- (de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con metionina (pKK223-3-CFP-T7-133M).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7-H1 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 19 y 21, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 133 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-133K).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con prolina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 22 y 23, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con prolina (pKK223-3-CFP-T7-44P).

Posteriormente, para sustituir la glicina en la posición 256 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 8 y 24, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la glicina en la posición 256 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-256K).

Posteriormente, para sustituir la glicina en la posición 256 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con arginina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 8 y 25, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que la glicina en la posición 256 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con arginina (pKK223-3-CFP-T7-256R).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 81 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 26 y 27, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 81 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-81K).

Posteriormente, para sustituir el ácido aspártico en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 46 y 47, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido aspártico en la posición 129 en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-129K).

Posteriormente, para sustituir el ácido aspártico en la posición 132 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 19 y 48, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido aspártico en la posición 132 en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-132K).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 231 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 49 y 50, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la asparagina en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 231 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-231K).

Posteriormente, para sustituir el ácido aspártico en la posición 232 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 50 y 51, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica una amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido aspártico en la posición 232 en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-232K).

Posteriormente, para sustituir el ácido glutámico en la posición 249 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 con lisina, se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las descritas anteriormente utilizando un ADN del plásmido recombinante pKK223-3-CFP-T7 como molde, los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 52 y 53, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante que codifica una amadoriasa modificada en la que el ácido glutámico en la posición 249 en la secuencia de aminoácidos descrita en el SEQ ID NO: 1 se sustituyó con lisina (pKK223-3-CFP-T7-249K).

(3) Producción de diversas amadoriasas modificadas

La cepa JM109 de Escherichia coli que contenía cada uno de los plásmidos recombinantes anteriores obtenidos mediante los procedimientos anteriores se cultivó a 30 °C durante 16 horas en 3 ml de medio LB-amp que contenía IPTG 0,1 mM. A continuación, los cuerpos bacterianos de cada cepa se lavaron con una solución tampón fosfato 0,01 M (pH 7,0), se desintegraron ultrasónicamente y se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 minutos, y se prepararon 1,5 ml de cada solución de enzima bruta.

(4) Evaluación de la resistencia a tensioactivos de varias amadoriasas modificadas

Usando cada solución de enzima bruta así preparada como muestra, la concentración final de CTAC se fijó en 0,01 % para evaluar la resistencia a tensioactivos de cada una de las amadoriasas modificadas de acuerdo con el método de medición anterior para la resistencia a tensioactivos. Los resultados se muestran en la Tabla 1-1. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad. En la Tabla 1-1, CFP-T7 indica una amadoriasa procedente de la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-T7). Dado que se utilizó CFP-T7 como amadoriasa procedente de la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-T7) como la enzima en la que se introdujeron las mutaciones, los puntos de mutación ya introducidos en CFP-T7 no se incluyen en la descripción de la "Mutación de aminoácidos" descrita en la tabla.

T l 1-11

Como se muestra en la Tabla 1-1, la actividad residual de CFP-T7 fue de un 69,9 % en las condiciones de este Ejemplo. Por el contrario, la actividad residual se incrementó a un 72 % o más (79 % o más en casos notables y 89 % o más en casos más notables) en las 15 variantes obtenidas mediante la introducción de mutación específica de sitio, es decir, amadoriasas en cada una de las cuales la asparagina en la posición 262 en CFP-T7 está mutada a histidina, valina en la posición 257 a cisteína, serina o treonina, ácido glutámico en la posición 253 a lisina o arginina, glutamina en la posición 337 a lisina, ácido glutámico en la posición 340 a prolina, ácido glutámico en la posición 44 a prolina, ácido glutámico en la posición 133 a alanina, metionina o lisina, glicina en la posición 256 a lisina o arginina, ácido glutámico en la posición 81 a lisina, ácido aspártico en la posición 129 a lisina, ácido aspártico en la posición 132 a lisina, ácido glutámico en la posición 231 a lisina, ácido aspártico en la posición 232 a lisina, o ácido glutámico en la posición 249 a lisina. Por tanto, se confirma que cada uno de estos puntos de mutación es un punto de mutación para mejorar la resistencia a tensioactivos de una amadoriasa.

Se observó que la sustitución del aminoácido en cada una de las posiciones 253 y 256 en CFP-T7 con cada uno de los restos de aminoácidos básicos lisina y arginina mejoraba la resistencia a tensioactivos. Por tanto, se cree que la sustitución del aminoácido en cada una de las posiciones 81, 129, 132, 133, 231,232, 249 y 337 con arginina, que es un resto de aminoácido básico, mejorará la resistencia a tensioactivos, como es el caso con lisina.

(5) CcFX procedente de Curvularia clavata

El SEQ ID NO: 37 es la secuencia de aminoácidos de una cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata (en lo sucesivo en el presente documento denominada CcFX) (Publicación internacional n.° WO 2004/104203). Se obtuvo un gen (SEQ iD NO: 55) que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 mediante la síntesis total del ADNc mediante PCR de un fragmento génico como método convencional (el codón de parada TAA está contenido). En este momento, se añadieron un sitio EcoRI y un sitio HindlII al extremo 5' y al extremo 3' del SEQ ID NO: 55, respectivamente. Se confirmó que la secuencia de aminoácidos de longitud completa deducida basándose en la secuencia génica clonada era coherente con la secuencia de CcFX en la Figura 1. Posteriormente, para expresar el gen de SEQ ID NO: 55 obtenido en Escherichia coli, se realizaron los siguientes procedimientos. El gen totalmente sintetizado anteriormente se trató primero con dos enzimas de restricción para el sitio EcoRI y el sitio HindIII (de Takara Bio Inc.) y se insertó en el sitio EcoRI-HindIII del vector pKK-223-3 (de GE Healthcare Co., Ltd.) para proporcionar un plásmido recombinante, pKK223-3-CcFX. Este plásmido se transformó en la cepa JM109 de Escherichia coli en las mismas condiciones que las descritas anteriormente para proporcionar la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CcFX).

A continuación, se introdujeron en CcFX mutaciones para mejorar la resistencia a tensioactivos. Más específicamente, se introdujo la mutación en las posiciones 129, 132, 133, 229, 230, 247, 251, 254 y 335 en CcFX como posiciones correspondientes a las posiciones 129, 132, 133, 231, 232, 249, 253, 256 y 337 en la amadoriasa procedente del género Coniochaeta (CFP-T7).

Usando un plásmido recombinante que contiene el gen CcFX (SEQ ID NO: 55) como plásmido de partida, se produjeron diversas variantes como en los procedimientos descritos en (1) y (2) anteriormente en la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CcFX) que tiene el plásmido. Las secuencias de los cebadores utilizados para la introducción de la mutación son las que se muestran en los SEQ ID NO: 56 a 74. A continuación, se produjeron amadoriasas modificadas mediante el procedimiento descrito en (3) anterior. Posteriormente, se evaluó la resistencia a tensioactivos de las amadoriasas modificadas de acuerdo con el método de medición de resistencia a tensioactivos descrito en (4), aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivos en las que las amadoriasas se diluyeron cada una en una solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) y se mezclaron con CTAC al 0,01 %. Los resultados se muestran en la Tabla 1-2. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

T l 1~21

Como se muestra en la Tabla 1-2, la actividad residual de CcFX fue 27,4 % en las condiciones de este Ejemplo. Por el contrario, la actividad residual se incrementó a un 34 % o más (56 % o más en casos notables y 64 % o más en casos más notables) en las 12 amadoriasas variantes obtenidas mediante la introducción de mutación específica de sitio.

Como anteriormente, cuando la mutación confirmada para mejorar la resistencia a tensioactivos para CFP-T7 se introdujo en las posiciones correspondientes en CcFX, se confirmaron mejoras similares de la resistencia a tensioactivos como se describió anteriormente. Por tanto, el efecto de la introducción de estas mutaciones no se limita a las amadoriasas procedentes de una especie específica y la introducción también tiene el efecto de mejorar la resistencia a tensioactivos de varias amadoriasas mediante la introducción de la mutación en las posiciones correspondientes.

Por otro lado, la amadoriasa procedente del género Coniochaeta tiene aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata. Por tanto, las amadoriasas procedentes de otras especies que tienen un 80 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con la amadoriasa procedente del género Coniochaeta o cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata se cree que tienen una resistencia mejorada (potenciada) a tensioactivos mediante la introducción de mutaciones en posiciones correspondientes a las posiciones anteriores.

Se observó que la sustitución del aminoácido en cada una de las posiciones 251 y 335 en CcFX con lisina o arginina mejora la resistencia a tensioactivos. De estos resultados, se cree que la resistencia a tensioactivos mejora mediante la sustitución del aminoácido en cada una de las posiciones 81, 129, 132, 133, 229, 230, 247, 251,254 y 335 en CcFX con lisina o arginina, que son restos de aminoácidos básicos. Lo mismo se aplica a varias otras amadoriasas.

Se observó que la sustitución del aminoácido en la posición 133 en CFP-T7 con alanina o metionina o la sustitución del aminoácido en la posición 133 en CcFX con alanina mejora la resistencia a tensioactivos. De estos resultados, se cree que la resistencia a tensioactivos mejora mediante la sustitución del aminoácido en cada una de las posiciones 133 en CFP-T7 y la posición 133 en CcFX por alanina, metionina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano o prolina como resto de aminoácido hidrófobo. Lo mismo se aplica a varias otras amadoriasas.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que el mecanismo por el cual la amadoriasa variante de la presente invención se vuelve resistente a un tensioactivo, por ejemplo, es el siguiente. Esto es, se considera que la sustitución de un aminoácido ácido en una amadoriasa con un aminoácido hidrófobo o un aminoácido básico reduce la afinidad entre la amadoriasa y un tensioactivo catiónico y protege a la amadoriasa de la acción desnaturalizante del tensioactivo. En particular, la introducción de lisina o arginina, que son restos de aminoácidos básicos, se considera que hace que el resto de aminoácido básico repela un tensioactivo catiónico para proteger aún más a una amadoriasa de la acción desnaturalizante de un tensioactivo.

Estos puntos de mutación de la presente invención no solo son eficaces en una sola mutación, sino también se espera que contribuyan a crear variantes que tengan ventajas prácticas mediante la combinación con varias mutaciones conocidas o la combinación de las mutaciones de la presente invención entre sí.

[Ejemplo 2]

(Acumulación de mutación para mejorar la resistencia a tensioactivos)

Basado en los hallazgos de mutaciones para mejorar la resistencia a tensioactivos obtenidos en el Ejemplo 1, se analizaron múltiples variantes (una variante doble, una variante triple, una variante cuádruple, una variante quíntuple, una variante séxtuple, o una variante séptuple) para combinar y acumular estas mutaciones con el fin de obtener una amadoriasa que tenga una resistencia adicional a tensioactivos aumentada.

El SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de una amadoriasa procedente del género Coniochaeta en la que se introdujeron una mutación para mejorar la especificidad de sustrato (E98A) y mutaciones para mejorar la estabilidad térmica (F43Y, G184D, deleción de 3 restos de aminoácidos carboxi-terminales) (en lo sucesivo en el presente documento indicado con "CFP-D"), y está codificada por el gen de SEQ ID NO: 4. Las mutaciones para mejorar la resistencia a tensioactivos se acumularon utilizando ADN plasmídico en el que se insertó el gen CFP-D en el vector pKK223-3 como molde. Se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que las de (2) anterior utilizando los oligonucleótidos sintéticos de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 16, 17, 18, 19, 23, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 46, 47, 50, 51, 52 y 54, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de la cepa JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento.

Estos procedimientos proporcionaron pKK223-3-CFP-D1 como una variante (mutante) en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina; pKK223-3-CFP-D2 como una variante doble en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina y el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina; pKK223-3-CFP-D3 como una variante triple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, la asparagina en la posición 262 se sustituyó con histidina y el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina: pKK223-3CFP-D4 como una variante cuádruple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina de la posición 262 se sustituyó con histidina y el ácido glutámico de la posición 340 se sustituyó con prolina; pKK223-3-CFP-D4/232K como una variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina en la posición 262 se sustituyó con histidina, el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina y la asparagina en la posición 232 se sustituyó con lisina; pKK223-3-CFP-D4/249K como una variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina en la posición 262 se sustituyó con histidina, el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina y el ácido glutámico en la posición 249 se sustituyó con lisina; pKK223-3-CFP-D5 como una variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina de la posición 262 se sustituyó con histidina y el ácido glutámico de la posición 340 se sustituyó con prolina; pKK223-3-CFP-D5/129K como una variante séxtuple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina en la posición 262 se sustituyó con histidina, el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina y el ácido aspártico en la posición 129 se sustituyó con lisina; un pKK223-3-CFP-D6 como una variante séxtuple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, el ácido glutámico en la posición 133 se sustituyó con alanina, el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina de la posición 262 se sustituyó con histidina y el ácido glutámico de la posición 340 se sustituyó con prolina; y pKK223-3-CFP-D7 como una variante séptuple en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina, el ácido glutámico en la posición 133 se sustituyó con alanina, el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina, la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína, la asparagina en la posición 262 se sustituyó con histidina, la glutamina en la posición 337 se sustituyó con lisina y el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina.

A continuación, la cepa JM109 de Escherichia coli se transformó en las mismas condiciones que las descritas anteriormente y se obtuvieron la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D1), la cepa j M109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D2), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D3), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D4), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D4/232K), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D4/249K), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D5), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D5/129K), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D6), y la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D7).

Las cepas de Escherichia coli que tienen la capacidad de producir amadoriasas modificadas obtenidas como se describió anteriormente, es decir, la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-T7), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D1), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D2), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D3), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D4), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D4/232K), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D4/249K), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D5), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D5/129K), la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D6), y la cepa JM109 de Escherichia coli (pKK223-3-CFP-D7), se cultivaron mediante el método anterior para preparar 1,5 ml de una solución de enzima bruta de cada una de las amadoriasas modificadas. Usando las soluciones de enzima bruta resultantes como muestras, se evaluó la resistencia a tensioactivos de las amadoriasas modificadas de acuerdo con el método de medición de resistencia a tensioactivos descrito en (4) anterior, aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivos más rigurosas en las que el tratamiento se alteró para mezclarlo con CTAC al 0,04 %. Los resultados se muestran en la Tabla 2-1. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

T l 2-11

(continuación)

Como se muestra en la Tabla 2-1, la actividad residual de CFP-T7 fue simplemente de un 2,27 % en las condiciones de este Ejemplo. Se confirmó que las amadoriasas convencionales prácticamente perdieron casi toda su actividad en condiciones tan duras.

Por el contrario, todas las variantes múltiples preparadas mediante las diversas combinaciones de las mutaciones individuales identificadas en el Ejemplo 1 tenían actividades residuales significativamente mejoradas. En particular, la actividad residual de la variante doble en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina y el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina fue de un 37,1 % y mejoró en comparación con la de CFP-T7. La actividad residual de la variante triple en la que la asparagina en la posición 262 se sustituyó por histidina además de la mutación previa fue de un 51,4 % y mejoró aún más en comparación con la de CFP-T7. La actividad residual de la variante cuádruple en la que la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína además de la mutación anterior fue de un 60,7 % y mejoró significativamente en comparación con la de CFP-T7. La actividad residual de la variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina además de la mutación anterior fue de un 95,6 %; la actividad residual de la variante séxtuple en la que el ácido glutámico en la posición 133 se sustituyó con alanina además de la mutación anterior fue de un 99,2 %; la actividad residual de la variante séptuple en la que la glutamina en la posición 337 se sustituyó con lisina además de la mutación previa fue del 100 % y mejoró significativamente en comparación con CFP-T7, y casi no hubo inactivación de la amadoriasa debido a CTAC. La actividad residual de la variante quíntuple en la que el ácido aspártico en la posición 232 en la variante cuádruple CFP-D4 se sustituyó adicionalmente con lisina fue de un 66,2 %; la actividad residual de la variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 249 en la variante cuádruple CFP-D4 se sustituyó con lisina fue de un 91,0 %; la actividad residual de la variante séxtuple en la que el ácido aspártico en la posición 129 en la variante quíntuple CFP-D5 se sustituyó con lisina fue de un 98,1 % y mejoró significativamente en comparación con la de CFP-T7, y casi no hubo inactivación de la amadoriasa debido a CTAC.

Además, cada vez que se acumularon mutaciones en CFP-D, la resistencia a tensioactivos de la variante múltiple adicional resultante mejoraba gradualmente, demostrando que los puntos de mutación de la presente invención identificados en el Ejemplo 1 podrían combinarse de forma adecuada para producir una amadoriasa que tenga además una excelente resistencia a tensioactivos.

A continuación, las mutaciones para mejorar la resistencia a tensioactivos se acumularon usando un ADN plasmídico en el que se insertó el gen CcFX en el vector pKK223-3 como molde. Los procedimientos se llevaron a cabo como se describió anteriormente, excepto por el hecho de que se usó el gen CcFX en lugar del gen CFP-D. Se llevó a cabo una reacción de PCR en las mismas condiciones que en (2) anterior utilizando oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID NO: 72 y 73, y KOD-Plus-(de Toyobo Co., Ltd.) y se realizó la transformación de la cepa JM109 de Escherichia coli y la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la amadoriasa en el ADN plasmídico transportado en colonias en crecimiento.

Estos procedimientos proporcionaron pKK223-3-CcFX/132K/335K como variante en la que el ácido aspártico en la posición 132 se sustituyó con lisina y la treonina en la posición 335 se sustituyó con lisina; pKK223-3-CcFX/133A/335K como variante en la que el ácido glutámico en la posición 133 se sustituyó con alanina y la treonina en la posición 335 se sustituyó con lisina; pKK223-3-CcFX/229K/335K como variante en la que el ácido glutámico en la posición 229 se sustituyó con lisina y la treonina en la posición 335 se sustituyó con lisina; y pKK223-3-CcFX/251K/335K como variante en la que el ácido glutámico en la posición 251 se sustituyó con lisina y la treonina en la posición 335 se sustituyó con lisina. A continuación, la cepa JM109 de Escherichia coli se transformó en las mismas condiciones que las descritas anteriormente; las cepas transformantes resultantes se cultivaron mediante el método anterior; y se prepararon 1,5 ml de cada una de las soluciones enzimáticas brutas de las amadoriasas modificadas. Usando las soluciones de enzima bruta resultantes como muestras, se evaluó la resistencia a tensioactivos de las amadoriasas modificadas de acuerdo con el método de medición de resistencia a tensioactivos descrito en (4), aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivos en las que las amadoriasas se diluyeron cada una en una solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) y se mezclaron con CTAC al 0,01 %. Los resultados se muestran en la Tabla 2-2. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

T l 2-21

Tal como se muestra en las Tablas 1-2 y 2-2, la actividad residual de CcFX fue 27,4 % en las condiciones de este Ejemplo, mientras que todas las variantes dobles preparadas mediante la combinación de las mutaciones únicas identificadas en el Ejemplo 1 tenían actividades residuales significativamente mejoradas. La resistencia a tensioactivos de las variantes dobles de CcFX también mejoró en comparación con la de las variantes simples de CcFX en la Tabla 1-2, confirmando también que, independientemente del tipo de enzima amadoriasa, se acumuló el efecto de la mutación.

[Ejemplo 3-1]

(Evaluación del tensioactivo TTAC)

Se usó cloruro de tetradeciltrimetilamonio (en lo sucesivo en el presente documento indicado con "TTAC") en lugar del tensioactivo CTAC usado en el Ejemplo 2 para evaluar la estabilidad de CFP-D. Se evaluó la resistencia a tensioactivos de varias amadoriasas modificadas de acuerdo con un método de medición de resistencia a tensioactivos de acuerdo con el Ejemplo 1, aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivo en las que las amadoriasas se diluyeron cada una en una solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) y se mezclaron con TTAC al 0,04 %. Los resultados se muestran en la Tabla 3-1. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

-

(continuación)

Como se muestra en la Tabla 3-1, la actividad residual de CFP-D fue de un 29,2 % en las condiciones de este Ejemplo. Por el contrario, todas las múltiples variantes preparadas en el Ejemplo 2 tenían actividades residuales significativamente mejoradas. Más específicamente, la actividad residual de la variante doble en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina y el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina fue de un 69,9 % y mejoró en comparación con la de CFP-D. La actividad residual de la variante triple en la que la asparagina en la posición 262 se sustituyó con histidina además de la mutación anterior fue de un 85,3 % y mejoró aún más en comparación con la de CFP-D. La actividad residual de la variante cuádruple en la que la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína además de la mutación previa fue de un 91,1 % y mejoró significativamente en comparación con la de CFP-D. La actividad residual de la variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina además de la mutación anterior fue de un 94,9 %; la actividad residual de la variante séxtuple en la que el ácido glutámico en la posición 133 se sustituyó con alanina además de la mutación anterior fue de un 96,4 %; y la actividad residual de la variante séptuple en la que la glutamina en la posición 337 se sustituyó con lisina además de la mutación previa fue del 100 % y mejoró significativamente en comparación con CFP-D, y casi no hubo inactivación de la amadoriasa debido a TTAC.

Por tanto, se demostró que estas sustituciones de aminoácidos mejoran la resistencia de las amadoriasas a TTAC.

[Ejemplo 3-2]

(Purificación de CFP-T7, CFP-D2 y CFP-D7)

Las soluciones de enzimas brutas preparadas utilizando las enzimas brutas CFP-T7, CFP-D2 y CFP-D7 obtenidas en los Ejemplos 1 y 2 se adsorbieron cada una en 4 ml de resina Q Sepharose Fast Flow (de GE Healthcare Co., Ltd.) equilibrada en una solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 8,0); a continuación, se lavó la resina con 80 ml de la misma solución tampón; la proteína adsorbida a la resina se eluyó posteriormente usando una solución tampón fosfato de potasio 20 mM que contenía NaCl 100 mM (pH 8,0); y se recuperó una fracción que mostraba actividad amadoriasa.

Las fracciones obtenidas que presentaban actividad amadoriasa se concentraron utilizando Amicon Ultra-15, 30K NMWL (de Millipore Co., Ltd.). A continuación, los concentrados se aplicaron a HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (de GE Healthcare Co., Ltd.) equilibrado en una solución tampón fosfato de potasio 20 mM que contenía NaCl 150 mM (pH 7,0) para eluir con la misma solución tampón para recuperar las fracciones que mostraban actividad amadoriasa para proporcionar preparaciones purificadas de amadoriasas de tipo silvestre y modificadas. El análisis de SDS-PAGE confirmó que las preparaciones purificadas resultantes se habían purificado en bandas únicas.

(Evaluación de varios tensioactivos)

Usando varios tensioactivos, se avaluó la estabilidad de las enzimas purificadas CFP-T7, CFP-D2 y CFP-D7 obtenidas como se describe anteriormente. Se evaluó la resistencia a tensioactivos de las amadoriasas modificadas de acuerdo con un método de medición de resistencia a tensioactivos de acuerdo con el Ejemplo 1, aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivos en las que las amadoriasas se diluyeron cada una en una solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) y se mezclaron con cualquiera de las diversas concentraciones de los tensioactivos. Los resultados se muestran en la Tabla 3-2. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

T l -21

Como se muestra en la Tabla 3-2, la actividad de CFP-T7 antes de introducir la mutación se redujo dramáticamente por la mayoría de los tensioactivos, excepto cuando se utilizaron OTAB y OTAC como tensioactivos. Por el contrario, la variante doble CFP-D2 tenía una resistencia a tensioactivos más excelente para todos los tipos de tensioactivos analizados que la CFP-T7. La variante séptuple CFP-D7 también tuvo una resistencia a tensioactivos más excelente para todos los tipos de tensioactivos analizados que CFT-T7, y, en la mayoría de los casos, tenía una resistencia a tensioactivos mejorada en comparación con la de la variante doble CFP-D2.

Como se muestra en la Tabla 3-2, cuando se utilizaron como tensioactivos OTAB (C8), DTAB (C12), TTAB (C14) y STAB (C18) con cadenas de carbono de diferente longitud, tanto D2 como D7 tenían una resistencia a tensioactivos mejorada. Por lo tanto, se cree que lo mismo se aplica a los tensioactivos, como el bromuro de deciltrimetilamonio, cuya cadena de carbono tiene 1o átomos de carbono, y el bromuro de hexadeciltrimetilamonio, cuya cadena de carbono tiene 16 átomos de carbono. Lo mismo se aplica también a OTAC (C8), TTAC (C14), CTAC (C16) y STAC (C18) como cloruros correspondientes a los bromuros, y se cree que las amadoriasas de la presente invención tienen resistencia al cloruro de deciltrimetilamonio, cuya cadena de carbono tiene 10 átomos de carbono, y al cloruro de dodeciltrimetilamonio, cuya cadena de carbono tiene 12 átomos de carbono.

Como se muestra en la Tabla 3-2, tanto D2 como D7 tenían resistencia a tensioactivos, si el contraión (Z) era un ion cloruro o un ion bromuro.

Como se muestra en la Tabla 3-2, tanto D2 como D7 tenían resistencia no solo a tensioactivos con iones amonio sino también a tensioactivos con iones piridinio y a tensioactivos con iones fosfonio, mostrando que la resistencia a tensioactivos era frente a tensioactivos catiónicos.

Resumiendo los resultados anteriores, se demostró que la amadoriasa resistente a tensioactivos de la presente invención tiene un amplio espectro de resistencia a tensioactivos independientemente del tipo de contraión de un tensioactivo, independientemente de la longitud de la cadena e independientemente de la estructura básica de un tensioactivo catiónico.

El resumen de los nombres y estructuras de los tensioactivos utilizados es el siguiente.

T l - 1

[Ejemplo 4]

(Evaluación del tensioactivo SDS)

Se avaluó la estabilidad de CFP-D usando dodecilsulfato de sodio (en lo sucesivo en el presente documento indicado con "SDS") en lugar del tensioactivo CTAC usado en el Ejemplo 2. Se evaluó a resistencia a tensioactivos de las amadoriasas modificadas de acuerdo con un método de medición de resistencia a tensioactivos de acuerdo con el Ejemplo 1, aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivos en las que las amadoriasas se diluyeron cada una en una solución tampón MES 30 mM/Tris 21 mM (pH 6,5) y se mezclaron con SDS al 0,04 %. Los resultados se muestran en la Tabla 4. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

Como se muestra en la Tabla 4, la actividad residual de CFP-T7 fue de un 2,76 % en las condiciones de este Ejemplo.

Por el contrario, todas las múltiples variantes preparadas en el Ejemplo 2 tenían actividades residuales significativamente mejoradas. Más específicamente, la actividad residual de la variante doble en la que el ácido glutámico en la posición 44 se sustituyó con prolina y el ácido glutámico en la posición 340 se sustituyó con prolina fue de un 19,2 % y mejoró en comparación con la de CFP-T7. La actividad residual de la variante triple en la que la asparagina en la posición 262 se sustituyó por histidina además de la mutación previa fue de un 11,3 % y mejoró aún más en comparación con la de CFP-T7. La actividad residual de la variante cuádruple en la que la valina en la posición 257 se sustituyó con cisteína además de la mutación anterior fue de un 17,1 % y mejoró en comparación con la de CFP-T7. La actividad residual de la variante quíntuple en la que el ácido glutámico en la posición 253 se sustituyó con lisina además de la mutación anterior fue de un 5,07 %; la actividad residual de la variante séxtuple en la que el ácido glutámico en la posición 133 se sustituyó con alanina además de la mutación anterior fue de un 3,62 %; la actividad residual de la variante séptuple en la que la glutamina en la posición 337 se sustituyó con lisina además de la mutación anterior fue de un 3,92 % y mejoró en comparación con CFP-T7.

Por tanto, se demostró que estas sustituciones de aminoácidos mejoran la resistencia de las amadoriasas a SDS.

[Ejemplo 5]

(Medición de muestra de fructosil péptido en mezcla de tensioactivo)

La enzima purificada de CFP-T7 y CFP-D7 obtenida en el Ejemplo 3-2 se usó para medir una muestra como se muestra a continuación. Los valores de actividad de CFP-T7 y CFP-D7 se determinaron usando (reactivo 1) ajustado a pH 7,0 con aFVH a una concentración final de 5 mM como sustrato de acuerdo con el método para medir la actividad de amadoriasa.

(11) Preparación de la muestra de fructosil péptido

(Reactivo 4) Se disolvió aFVH (125 mg) en agua de intercambio iónico, se fijó el volumen de la solución en 10 ml y de ese modo se obtuvo una solución de sustrato 30 mM. Además, el resultante se diluyó a 1/714 con una solución de CTAC para proporcionar una solución de aFVH 42 pM/CTAC de 0 % a 0,2 %.

(12) Medición de la muestra de fructosil péptido

(Reactivo 5)

(N-(Carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina de sodio DA-64 0,21 mM, de Wako Pure Chemical Industries Ltd.

Solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0)

(Reactivo 6)

6,7 U/ml de CFP-T7 o CFP-D7

19 U/ml de peroxidasa (de Kikkoman Corporation)

Solución tampón fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0)

Se añadió (Reactivo 6) (50 pl) a una solución mixta de 135 pl de (reactivo 5) calentado a 37 °C durante 5 minutos antes y 25 pl de la muestra preparada en (11) anteriormente para iniciar la reacción y se midió la absorbencia a una longitud de onda de 751 nm después de la reacción a 37 °C durante 5 minutos utilizando un analizador automático, Bio Majesty JCA-BM1650 (de JEOL Ltd.). La absorbencia (blanco de reactivos) a una longitud de onda de 751 nm medida mediante una operación similar para el (reactivo 4) preparado usando agua de intercambio iónico en lugar de la solución de sustrato se usó como control para calcular la cantidad de cambio en la absorbencia (diferencia) cuando se midió cada muestra, usando la siguiente ecuación. La concentración final de un sustrato colorimétrico, DA-64, fue 0,15 mM; la concentración final de aFVH en el caso de la presencia de un sustrato fue de 5 pM; y la longitud (trayectoria óptica) de la celda utilizada para la medición de la absorbencia fue de 1 cm.

Cantidad de cambio en la absorbencia = AAes - AeO

AAes: absorbencia después de un lapso de 5 minutos desde el inicio de la reacción

Ae0: absorbencia después de un lapso de 5 minutos desde el inicio de la reacción cuando se añadió la solución de control

Se calculó la cantidad de cambio en la absorbencia cuando se usaron aFVH/CTAC al 0 % a 0,2 % como muestras. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

T l 1

Como se muestra en la Tabla 5, en las condiciones de este Ejemplo, la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0 % fue de 0,150 y la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0,005 % fue de 0,111. Además, la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0,01 % fue 0,077; la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0,02 % fue 0,031; y la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0,04 % disminuyó a 0,005, mostrando que una mayor concentración de CTAC disminuyó la cantidad de cambio en la absorbencia.

Por el contrario, la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-D7 en la mezcla de CTAC al 0,02 % fue de 0,140 y la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-D7 en la mezcla de CTAC al 0,2 % fue de 0,069. Esto es, considerando que la mezcla de más CTAC disminuyó la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7, suprimió una disminución en la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-D7; la presencia de CTAC al 0,1 % o más hizo constante la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-D7. La disminución en la cantidad de cambio en la absorbencia fue grande hasta que la concentración de CTAC alcanzó 1,3 mM (0,04 %) como concentración micelar crítica de la misma; sin embargo, la concentración que excede la concentración micelar crítica disminuyó un cambio en el efecto de la amadoriasa. Por tanto, se encontró que CFP-D7 estaba presente de manera estable en la mezcla de una alta concentración de CTAC, permitiendo la medición de aFVH.

[Ejemplo 6]

(Cuantificación de muestra de fructosil péptido en mezcla de tensioactivo)

Usando las enzimas purificadas de CFP-T7 y CFP-D7, se comparó la linealidad de los valores de medición de aFVH en el intervalo de 0,5 a 3 pM en la mezcla de CTAC. Para CFP-T7, se midió la cantidad de cambio en la absorbencia como en el Ejemplo 5 en condiciones de mezcla de CTAC al 0,01 % o al 0,02 % y además usando aFVH a 4,2 pM, 8,4 pM, 13 pM, 17 pM, 21 pM o 25 pM, es decir, a una concentración final de 0,5 pM, 1,0 pM, 1,5 pM, 2,0 pM, 2,5 pM o 3,0 pM para calcular un coeficiente de correlación. Asimismo, para CFP-D7, se midió la cantidad de cambio en la absorbencia como en el Ejemplo 5 en condiciones de mezcla de CTAC al 0,02 % o al 0,2 % y usando las mismas concentraciones de aFVH para calcular un coeficiente de correlación. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y los datos de correlación se muestran en las Figuras 2, 3, 4 y 5. La Figura 2 muestra los resultados de la medición de aFVH usando CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0,01 %; La Figura 3 muestra los resultados de la medición de aFVH usando CFP-T7 en la mezcla de CTAC al 0,02 %; La Figura 4 muestra los resultados de la medición de aFVH usando CFP-D7 en la mezcla de CTAC al 0,02 %; y la Figura 5 muestra los resultados de la medición de aFVH usando CFP-D7 en la mezcla de CTAC al 0,2 %.

Como se muestra en la Tabla 6, en las condiciones de este Ejemplo, el coeficiente de correlación de aFVH 0,5 pM a 3,0 pM para CFP-T7 fue tan alto como 0,924 en la mezcla de CTAc al 0,01 % pero tan bajo como 0,625 en la mezcla de CTAC al 0,02 %. Por el contrario, cuando se utilizó CFP-D7, el coeficiente de correlación de aFVH 0,5 pM a 3,0 pM indicó una linealidad tan alta como 0,965 incluso en la mezcla de CTAC al 0,2 %.

De acuerdo con las instrucciones de uso de HbA1c (de Ark Ray Inc.) establecida como un kit de medición de HbA1c para un método enzimático, se hace reaccionar una muestra de sangre total en un estado diluido a 1/416 con una amadoriasa. Por ejemplo, cuando la HbA1c con un valor de NGSP es de un 6,5 %, la concentración total de Hb es de 141 a 150 g/l, y la muestra de sangre se mide mediante una dilución de 1/416, la concentración de aFVH escindida por proteasa es de 0,50 a 0,53 pM. El límite real del valor de HbA1c para el diagnóstico de diabetes es de un 6,5 % (NGSP). Por tanto, CFP-D7 se puede usar suficientemente en la medición real de HbA1c, y se puede decir que se puede usar en combinación con, por ejemplo, CTAC para aumentar la sensibilidad de la medición.

[Ejemplo 7]

(Evaluación de la resistencia a tensioactivos de varias amadoriasas)

Para proporcionar una composición para medir la glucohemoglobina, que contiene una amadoriasa capaz de mantener la actividad incluso en presencia de un tensioactivo, preferentemente un tensioactivo iónico, se modificó una amadoriasa procedente del género Coniochaeta como se describió anteriormente para mejorar la resistencia a tensioactivos de la misma. No se sabe si la HbA1c se puede medir o no en presencia de un tensioactivo iónico para una amadoriasa distinta de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta. Por consiguiente, la medición de aFVH se intentó mediante la combinación de una fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum o una cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta con un tensioactivo iónico.

1. Producción y purificación de fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum

El SEQ ID NO: 40 muestra la secuencia de aminoácidos de fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum (en lo sucesivo en el presente documento, "PnFX") (véase Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010). El gen (SEQ ID NO: 44) que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 40 se obtuvo mediante síntesis total de ADNc mediante una técnica convencional de PCR de un fragmento de gen. Se añadieron el sitio Ndel y el SamHI al extremo 5' y al extremo 3' del SEQ ID NO: 40, respectivamente. Además, se confirmó que la secuencia de aminoácidos de longitud completa que se deduce basándose en la secuencia del gen clonado es coherente con la secuencia de PnFX como se muestra en la Figura 1. Posteriormente, para expresar el gen mostrado en el SEQ ID NO: 44 en E. coli, se realizaron los siguientes procedimientos. El gen completamente sintetizado anteriormente se trató con dos tipos de enzimas de restricción, NdeI y SamHI (fabricadas por Takara Bio Inc.) y se insertó en el sitio Ndel-BamHI del vector pET-22b(+) (fabricado por Novagen, Inc.). Por tanto, se obtuvo el plásmido recombinante pET22b-PnFX. Las cepas de BL21 de E. coli (DE3) se transformaron en las condiciones descritas anteriormente para obtener una cepa de E. coli (DE3) (pET22b-PnFX).

Las cepas de BL21 de E. coli (DE3) (pET22b-PnFX) capaces de producir PnFX obtenido de la manera descrita anteriormente se inocularon en medios LB-amp complementados con IPTG (concentración final: 0,1 mM) y se cultivaron en el mismo a 25 °C durante 16 horas. Las cepas cultivadas resultantes se lavaron con un tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 8,0), las cepas lavadas se suspendieron en el mismo tampón, la suspensión resultante se desintegró ultrasónicamente y el resultante se centrifugó a 20.000x g durante 10 minutos para preparar una solución de enzima bruta.

La solución de enzima bruta preparada que contenía PnFX se purificó de acuerdo con el método descrito en el documento que no de patente (Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010). Más específicamente, la solución de enzima bruta se fraccionó con sulfato de amonio, se dializó frente a un tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 8,0), se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico (se usó Q Sepharose Fast Flow en el Ejemplo 2) y, a continuación, se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (se usó HiLoad 26/600 Sueprdex 200 en el Ejemplo 2). La fracción obtenida se analizó mediante SDS-PAGE para confirmar que la fracción estaba suficientemente purificada, de modo que no estuvieran presentes otras proteínas contaminantes. La fracción se designó como una muestra purificada de PnFX.

2. Producción y purificación de cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta

El SEQ ID NO: 38 es la secuencia de aminoácidos de una cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta (NvFX), y la actividad de NvFX se ha identificado mediante la expresión de un plásmido recombinante, pET22b-NvFX, en el que se inserta el gen (SEQ ID NO: 45) que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, en Escherichia coli (véase la Publicación Internacional N.° WO 2012/18094). La cepa BL21 de Escherichia coli (DE3) se transformó como en el Ejemplo 1, y la cepa BL21 de Escherichia coli (DE3) (pET22b-NvFX) obtenida se usó y se cultivó mediante el método anterior y se preparó una solución de enzima bruta de NvFX.

La solución de enzima bruta preparada se dejó adsorber en resina Q Sepharose Fast Flow (fabricada por GE Healthcare) equilibrada con un tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 8,0), la resina se lavó con un tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 20 mM, y la NvFX adsorbida a la resina se eluyó a continuación y se recogió con la ayuda de un tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM.

La solución de enzima bruta obtenida de NvFX se aplicó a una columna HiLoad 26/60 Superdex 200 equilibrada en una solución tampón MES-NaOH 20 mM que contenía NaCl 150 mM (pH 7,0) para eluir NvFX con la misma solución tampón para recuperar una fracción que mostraba actividad fructosil aminoácido oxidasa (actividad amadoriasa). La fracción resultante se analizó mediante SDS-PAGE para confirmar que la fracción estaba suficientemente purificada, de modo que no estaban presentes otras proteínas contaminantes en la misma, y se utilizó como preparación purificada de NvFX.

Las preparaciones purificadas de amadoriasas obtenidas como se describe anteriormente se usaron como muestras para medir aFVH en la mezcla de CTAC usando PnFX y NvFX como en el Ejemplo 5. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

T l 71

Como se muestra en la Tabla 7, en las condiciones de este Ejemplo, la cantidad de cambio en la absorbencia de PnFX en la mezcla de CTAC al 0 % fue 0,173 y la cantidad de cambio en la absorbencia en la mezcla de CTAC a un 0,01 % fue de 0,115. La cantidad de cambio en la absorbencia de PnFX en la mezcla de CTAC al 0,02 % fue 0,084, mientras que la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de la misma fue de 0,031; y la cantidad de cambio en la absorbencia de PnFX en la mezcla de CTAC al 0,04 % fue 0,026, mientras que la cantidad de cambio en la absorbencia de CFP-T7 en la mezcla de la misma fue 0,005. Por tanto, PnFX es capaz de medir aFVH como sustrato bajo en la mezcla de CTAC a una concentración tan alta como 0,02 % o más.

Para NvFX, la absorbencia se incrementó en la mezcla de CTAC al 0,02 % o menos; sin embargo, aFVH no se pudo medir con precisión ya que la influencia de la aparición de turbidez aumentó la absorbencia incluso en el blanco usando agua de intercambio iónico en lugar de sustrato.

[Ejemplo 8]

(Evaluación de la resistencia a tensioactivos de la amadoriasa en presencia de cualquiera de los agentes tamponantes) Se estudió si la resistencia a tensioactivos de una amadoriasa aumenta o no cuando se usa un agente tamponante distinto de un agente tamponante MES 30 mM/Tris 21 mM (pH 6,5). Usando CFP-T7 purificado como se describe anteriormente como muestra, la concentración final de CTAC se fijó en 0,01 % para evaluar la resistencia al tensioactivo de CFP-T7 de acuerdo con el método de medición de resistencia a tensioactivos en el Ejemplo 1 en presencia de cualquiera de varios agentes tamponantes, específicamente un agente tamponante de fosfato que contiene ácido fosfórico y fosfato de potasio (pH 7,0), un agente tamponante de citrato que contiene ácido cítrico y citrato de sodio (pH 6,0), un agente tamponante MES que contiene MES y su sal sódica (pH 7,0), un agente tamponante HEPES que contiene HEPES y su sal sódica (pH 7,0), y un agente tamponante ACES que contiene ACES y su sal sódica (pH 7,0), en lugar del agente tamponante MES 30 mM/Tris 21 mM (pH 6,5). Los resultados se muestran en la Tabla 8. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

Como se muestra en la Tabla 8, en las condiciones de este Ejemplo, se demostró que la resistencia a tensioactivos de CFP-T7 mejoraba de una manera dependiente de la concentración de un agente tamponante en presencia del agente tamponante de fosfato, el agente tamponante MES o el agente tamponante ACES. El agente tamponante de citrato fue particularmente útil ya que la inactivación debida al tensioactivo no se produjo ni siquiera a 10 mM de este agente. No se observó el efecto de mantener la actividad de la amadoriasa para el agente tamponante HEPES. Sorprendentemente, los resultados anteriores muestran que el agente tamponante de fosfato, el agente tamponante de citrato, el agente tamponante MES y el agente tamponante ACES tienen el efecto de mejorar la resistencia a tensioactivos de la amadoriasa.

[Ejemplo 9]

(Evaluación de la resistencia a tensioactivos de la amadoriasa durante la adición de cada estabilizante)

Se estudió si la adición de alguno de los diversos estabilizantes mejoraba o no la resistencia a tensioactivos de una amadoriasa. Se usó como estabilizante ácido fosfórico, un ácido tricarboxílico (por ejemplo, ácido cítrico), un ácido dicarboxílico (por ejemplo, ácido málico, ácido maleico, ácido citracónico, ácido malónico, ácido glutárico o ácido tartárico), un ácido monocarboxílico (por ejemplo, ácido acético), MES, MOPS, MOPSO o sulfato de amonio. Como Ejemplo comparativo, se utilizó CHES. Para evitar cambios en el pH cuando se añadió el estabilizante, se utilizó HEPES 500 mM (pH 7,0) como solución tampón; Se usó como muestra CFP-T7 purificada como se describió anteriormente; la concentración final de CTAC se fijó en 0,01 %; y se añadió adicionalmente cualquiera de los estabilizantes para evaluar la resistencia a tensioactivos de CFP-T7 de acuerdo con el método de medición de resistencia a tensioactivos del Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Tablas 9-1 y 9-2. Usando un agente tamponante HEPES 500 mM (pH 7,0) y CFP-D2 purificado como se describe anteriormente como muestra, se añadió adicionalmente cualquiera de los estabilizantes y se evaluó la resistencia a tensioactivos de CFP-D2 de acuerdo con el método de medición de resistencia a tensioactivos del Ejemplo 1, aunque en condiciones de tratamiento con tensioactivo más duras en las que la concentración final de CTAC se fijó en 0,08 % y la temperatura de tratamiento a 37 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 9-3. Se confirmó que el pH en realidad indicaba 7,0 cuando se añadió el estabilizante. Por otro lado, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

-

-

(continuación)

T l - 1

Las tablas 9-1 y 9-2 demostraron que en las condiciones de este Ejemplo, la adición de ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido maleico, ácido citracónico, ácido malónico, ácido glutárico, ácido tartárico, ácido acético, MES, MOPS, MOPSO, o sulfato de amonio como estabilizante, mejoró la resistencia a tensioactivos de CFP-T7 de una manera dependiente de la concentración del estabilizante. En particular, se encontró que el ácido cítrico es capaz de mejorar la resistencia a tensioactivos de CFP-T7 incluso cuando se añade en una cantidad mínima de 0,2 mM. Como se muestra en la Tabla 9-3, la adición de ácido fosfórico, ácido málico o MOPS como estabilizante mejoró significativamente la resistencia a tensioactivos de la enzima CFP-D2 purificada en comparación con cuando el estabilizante está ausente. No se sabía que la estabilidad de una amadoriasa frente a un tensioactivo puede mejorarse mediante varios compuestos y esto fue sorprendente. En particular, CHES que tiene la siguiente estructura:

[Fórmula 9]

no tuvo ninguna acción estabilizante, mientras que los compuestos incluidos en la fórmula (IV)

[Fórmula 10]

[en donde, n puede ser 0, 1, 2 o 3; cada R10 representa independientemente H, OH,-CH2OH o-COOH], cuyas estructuras son muy análogas a la estructura anterior, MES (n = 1 y R10 representa H), MOPS (n = 2 y cada R10 representa H), MOPSO (n = 2 y cada uno de la pluralidad de R10 representa OH o H), sorprendentemente, tuvieron una acción estabilizante de amadoriasa. Los resultados anteriores muestran que el ácido fosfórico, los ácidos tricarboxílicos, los ácidos dicarboxílicos, los ácidos monocarboxílicos y compuestos representados por la fórmula (IV), tales como MES, MOPS y MOPSO, tienen el efecto de mejorar la resistencia a tensioactivos de una amadoriasa. Además, se observó resistencia a tensioactivos mejorada con respecto a CFP-T7, la amadoriasa a la que no se introdujo la mutación de la presente invención, así como con respecto a CFP-D2, la amadoriasa a la que se introdujo la mutación de la presente invención.

La combinación de los resultados de las Tablas 8 y 9 muestra que la acción estabilizante de amadoriasa del estabilizante es una acción diferente de la acción estabilizante de amadoriasa del agente tamponante. Más específicamente, se confirmó a partir de la Tabla 8 que el uso de MES a una concentración de 50 mM como agente tamponante dio como resultado una actividad residual de amadoriasa CFP-T7 de un 14,3 %, que el uso del mismo a una concentración de 100 mM dio como resultado una actividad residual de la enzima de un 17,6 %, y el uso del mismo a una concentración de 150 mM dio como resultado una actividad residual de la enzima de un 62,9 %. Por el contrario, se confirmó a partir de la Tabla 9 que el uso de MES a una concentración de 10 mM como estabilizante mientras se usaba HEPES (pH 7,0) simplemente como un agente tamponante de pH que no tiene acción estabilizante de amadoriasa dio como resultado una actividad residual de amadoriasa CFP-T7 de un 19,5 % y el uso de MES a una concentración de 20 mM dio como resultado una actividad residual de la enzima de un 54,1 %. En otras palabras, MES exhibió una acción estabilizante de amadoriasa a una concentración tan baja como 20 mM incapaz de ejercer de forma suficiente una capacidad tamponante, y la actividad residual confirmada de la amadoriasa superó sorprendentemente la actividad residual (Tabla 8, 17,6 %) cuando se utilizó MES a una concentración de 100 mM como agente tamponante. Por tanto, la acción estabilizante de amadoriasa del estabilizante es una acción estabilizante diferente de la acción estabilizante de amadoriasa del agente tamponante. Lo mismo se aplica al ácido fosfórico y al ácido cítrico. Se cree que lo mismo se aplica a los ácidos dicarboxílicos, MOPS y MOPSO que exhiben una acción estabilizante ya que estos también pueden usarse como agentes tamponantes.

(Evaluación de la resistencia a tensioactivos de PnFX durante la adición de cada estabilizante)

Se estudió si los estabilizantes anteriores tenían o no un efecto potenciador de la resistencia a tensioactivos sobre las amadoriasas distintas de la amadoriasa procedente del género Coniochaeta, por ejemplo, PnFX. Se utilizaron como estabilizantes los mismos estabilizantes que los descritos anteriormente; se utilizó HEPES 300 mM (pH 7,0) como agente tamponante para evitar un cambio en el pH cuando se añadió cada estabilizante; se utilizó como muestra PnFX purificado como se describió anteriormente; la concentración final de CTAC se fijó en 0,04 %; y se evaluó la resistencia a tensioactivos de PnFX como se describió anteriormente. Se confirmó que el pH en realidad indicaba 7,0 cuando se añadió un estabilizante. Los resultados se muestran en la Tabla 10. A este respecto, se confirmó que cuando se volvió a medir la actividad de la muestra calentada 30 minutos después de una dilución a la mitad en una solución de BSA, no hubo cambios en el valor de la actividad.

Como se muestra en la Tabla 10, en las condiciones de este Ejemplo, la adición de ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido acético, MES, o sulfato de amonio, tuvo un efecto de mejora de la resistencia a tensioactivos en PnFX como con CFP-T7. Por tanto, el ácido fosfórico, los ácidos tricarboxílicos, los ácidos dicarboxílicos, los ácidos monocarboxílicos, MES y el sulfato de amonio son útiles como estabilizantes para mejorar la resistencia a tensioactivos de una amplia variedad de amadoriasas. Dado que CFP-T7 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de un 75 % con PnFX, se puede decir que las amadoriasas que tienen un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con CFP-T7 tienen el efecto anterior.

Texto independiente del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1. Secuencia de aminoácidos de CFP-T7

SEQ ID NO: 2. Secuencia génica para CFP-T7

SEQ ID NO: 3. Secuencia de aminoácidos de CFP-D

SEQ ID NO: 4. Secuencia génica para CFP-D

SEQ ID NO: 5. Cebador directo para la introducción de N262H

SEQ ID NO: 6. Cebador inverso para la introducción de N262X

SEQ ID NO: 7. Cebador directo para la introducción de V257C

SEQ ID NO: 8. Cebador inverso para la introducción de V257X

SEQ ID NO: 9. Cebador directo para la introducción de V257S

SEQ ID NO: 10. Cebador directo para la introducción de V257T

SEQ ID NO: 11. Cebador directo para la introducción de E253K

SEQ ID NO: 12. Cebador inverso para la introducción de E253X

SEQ ID NO: 13. Cebador directo para la introducción de E253R

SEQ ID NO: 14. Cebador directo para la introducción de Q337K

SEQ ID NO: 15. Cebador inverso para la introducción de Q337X

SEQ ID NO: 16. Cebador directo para la introducción de E340P

SEQ ID NO: 17. Cebador inverso para la introducción de E340X

SEQ ID NO: 18. Cebador directo para la introducción de E133A

SEQ ID NO: 19. Cebador inverso para la introducción de E133X

SEQ ID NO: 20. Cebador directo para la introducción de E133M

SEQ ID NO: 21. Cebador directo para la introducción de E133K

SEQ ID NO: 22. Cebador directo para la introducción de E44P

SEQ ID NO: 23. Cebador inverso para la introducción de E44X

SEQ ID NO: 24. Cebador directo para la introducción de G256K

SEQ ID NO: 25. Cebador directo para la introducción de G256R

SEQ ID NO: 26. Cebador directo para la introducción de E81K

SEQ ID NO: 27. Cebador inverso para la introducción de E81X

SEQ ID NO: 28. Cebador directo para la introducción de F43Y/E44P

SEQ ID NO: 29. Cebador inverso para la introducción de V257X/N262H

SEQ ID NO: 30. Cebador directo para la introducción de E253K/V257C

SEQ ID NO: 31. Cebador inverso para la introducción de E253X/V257C/N262H

SEQ ID NO: 32. Cebador directo para la introducción de Q337K/E340P

SEQ ID NO: 33. Cebador inverso para la introducción de Q337X/E340P

SEQ ID NO: 34. Amadoriasa procedente de Eupenicillium terrenum

SEQ ID NO: 35. Cetoamina oxidasa procedente de Pyrenochaeta sp.

SEQ ID NO: 36. Cetoamina oxidasa procedente de Arthrinium sp.

SEQ ID NO: 37. Cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata

SEQ ID NO: 38. Cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta

SEQ ID NO: 39. Fructosil aminoácido oxidasa procedente de Cryptococcus neoformans SEQ ID NO: 40. Fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum SEQ ID NO: 41. Fructosil aminoácido oxidasa procedente de Aspergillus nidulans SEQ ID NO: 42. Fructosil aminoácido oxidasa procedente de Ulocladium sp.

SEQ ID NO: 43. Fructosil aminoácido oxidasa procedente de Penicillium crysogenum SEQ ID NO: 44. Gen de la fructosil péptido oxidasa procedente de Phaeosphaeria nodorum SEQ ID NO: 45. Gen de la cetoamina oxidasa procedente de Neocosmospora vasinfecta SEQ ID NO: 46. Cebador directo para la introducción de D129K

SEQ ID NO: 47. Cebador inverso para la introducción de D129K

SEQ ID NO: 48. Cebador directo para la introducción de D132K

SEQ ID NO: 49. Cebador directo para la introducción de E231K

SEQ ID NO: 50. Cebador inverso para la introducción de E231X

SEQ ID NO: 51. Cebador directo para la introducción de D232K

SEQ ID NO: 52. Cebador directo para la introducción de E249K

SEQ ID NO: 53. Cebador inverso para la introducción de E249K

SEQ ID NO: 54. Cebador inverso para la introducción de E249K/V257C

SEQ ID NO: 55. Gen de la cetoamina oxidasa procedente de Curvularia clavata SEQ ID NO: 56. Cebador directo para la introducción de D129K en CcFX

SEQ ID NO: 57. Cebador inverso para la introducción de D129K en CcFX

SEQ ID NO: 58. Cebador directo para la introducción de D132K en CcFX

SEQ ID NO: 59. Cebador directo para la introducción de E133K en CcFX

SEQ ID NO: 60. Cebador directo para la introducción de E133A en CcFX

SEQ ID NO: 61. Cebador inverso para la introducción de E133X en CcFX

SEQ ID NO: 62. Cebador directo para la introducción de E229K en CcFX

SEQ ID NO: 63. Cebador directo para la introducción de D230K en CcFX

SEQ ID NO: 64. Cebador inverso para la introducción de D230X en CcFX

SEQ ID NO: 65. Cebador directo para la introducción de E247K en CcFX

SEQ ID NO: 66. Cebador inverso para la introducción de E247K en CcFX

SEQ ID NO: 67. Cebador directo para la introducción de E251K en CcFX

SEQ ID NO: 68. Cebador inverso para la introducción de E251X en CcFX

SEQ ID NO: 69. Cebador directo para la introducción de E251R en CcFX

SEQ ID NO: 70. Cebador directo para la introducción de N254K en CcFX

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una amadoriasa modificada que tiene actividad residual mejorada 5 minutos después de que se añada un tensioactivo iónico en comparación con dicha amadoriasa antes de la modificación, teniendo dicha amadoriasa modificada:

(I) una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 1 o 37, teniendo además dicha secuencia de aminoácidos una deleción, una inserción, una adición y/o una sustitución de uno a 15 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 1 o 37, y/o

(II) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 80 % con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en el SEQ ID NO: 1, o que tiene una identidad de al menos un 90 % con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 37,

en donde dicha amadoriasa modificada que tiene la secuencia de aminoácidos de (I) o (II) comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina;

(ii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(iii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina; (iv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(v) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (vii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(viii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(ix) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 132 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(x) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina, metionina, lisina o arginina;

(xi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (xii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(xiii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 231 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; y

(xiv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 81 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

en donde, cuando la sustitución es:

(i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina;

(ii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(iii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina; (iv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(v) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (vii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(viii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(ix) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 132 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(x) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina, metionina, lisina o arginina;

(xi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (xii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(xiii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 231 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; o

(xiv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 81 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o

arginina;

entonces dicha actividad residual mejorada es una actividad residual mejorada después de que se añade un

tensioactivo catiónico; y en donde, cuando la sustitución es:

(i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína,

serina o treonina; o

(vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina;

entonces dicha actividad residual mejorada es una actividad residual mejorada después de que se añade un

tensioactivo aniónico.

2. La amadoriasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la amadoriasa modificada comprende

sustitución de restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los siguientes (i) a (ix):

(i) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina;

(ii) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina, y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina;

(iii) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cisteína,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con h sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con p (iv) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cisteína,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina, y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina;

(v) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cist sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histi sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina, y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina;

(vi) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cisteína,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con h sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con p (vii) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cist sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histi sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina, y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina;

(viii) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cisteína,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina, y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; y

(ix) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO: 1 con cisteína,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina,

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina, y

sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina.

3. La amadoriasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos de la secuencia de

aminoácidos tal como se muestra en el SEQ ID NO: 37 tienen al menos una de las sustituciones de las siguientes (i)

a (ix):

(i) el ácido glutámico en la posición 251 está sustituido con lisina o arginina;

(ii) la treonina en la posición 335 está sustituida con lisina o arginina;

(iii) el ácido glutámico en la posición 247 está sustituido con lisina o arginina;

(iv) el ácido aspártico en la posición 230 está sustituido con lisina o arginina;

(v) el ácido aspártico en la posición 129 está sustituido con lisina o arginina;

(vi) el ácido aspártico en la posición 132 está sustituido con lisina o arginina;

(vii) el ácido glutámico en la posición 133 está sustituido con alanina, metionina, lisina o arginina;

(viii) la asparagina en la posición 254 está sustituida con lisina o arginina; y

(ix) el ácido glutámico en la posición 229 está sustituido con lisina o arginina.

4. La amadoriasa modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 3, en donde la secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 37 tiene sustitución de restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en las siguientes (i) a (iv):

(i) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 251 con lisina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina;

(ii) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido aspártico en la posición 132 con lisina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina;

(iii) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 133 con alanina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina; y (iv) sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente al ácido glutámico en la posición 229 con lisina y sustitución de un aminoácido en la posición correspondiente a treonina en la posición 335 con lisina.

5. Un gen de amadoriasa que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector recombinante que comprende el gen de amadoriasa de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora que comprende el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un método para producir una amadoriasa que comprende las siguientes etapas:

(i) cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7;

(ii) expresar un gen de amadoriasa contenido en la célula hospedadora; y

(iii) aislar la amadoriasa a partir de un producto de cultivo.

9. Uso de una composición para medir la glucohemoglobina, comprendiendo dicha composición la amadoriasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o más tensioactivos iónicos.

10. Un método para medir glucohemoglobina que comprende usar una composición que comprende uno o más tensioactivos iónicos y una amadoriasa, en donde la amadoriasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 70 % con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 40; y

(I) tiene una actividad residual de un 15 % o más 5 minutos después de que se añada un tensioactivo iónico en comparación con un caso de referencia donde no se añade tensioactivo (100 %), y/o

(II) muestra una diferencia de 0,006 o más entre la absorbencia a 751 nm después de añadir un sustrato colorimétrico de sodio N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)-difenilamina (DA-64) y se hace reaccionar durante 5 minutos, y la absorbencia a 751 nm 5 minutos después de añadir una solución de control que contiene agua de intercambio iónico en lugar de una solución de glucoaminoácidos o una solución de glucopéptidos, en presencia de una concentración final al 0,04 % de tensioactivo iónico,

en donde, cuando la amadoriasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 70 % con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en los SEQ ID NO: 1,3 o 37, entonces la amadoriasa comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina;

(ii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(iii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina; (iv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(v) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (vii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(viii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(ix) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 132 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(x) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina, metionina, lisina o arginina;

(xi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (xii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(xiii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 231 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; y

(xiv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 81 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

en donde, cuando el tensioactivo iónico es un tensioactivo catiónico, la sustitución es:

(i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina;

(ii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 253 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(iii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 262 en el SEQ ID NO: 1 con histidina; (iv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 337 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(v) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 249 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (vii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 232 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(viii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 129 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(ix) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 132 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(x) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 133 en el SEQ ID NO: 1 con alanina, metionina, lisina o arginina;

(xi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en el SEQ ID NO: 1 con prolina; (xii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 256 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

(xiii) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 231 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina; o

(xiv) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 81 en el SEQ ID NO: 1 con lisina o arginina;

entonces dicha actividad residual mejorada es una actividad residual mejorada después de que se añade un tensioactivo catiónico; y en donde, cuando el tensioactivo iónico es un tensioactivo aniónico, la sustitución es:

(i) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 257 en el SEQ ID NO; 1 con cisteína, serina o treonina; o

(vi) sustitución del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 340 en el SEQ ID NO: 1 con prolina.