WO2013162035A1 - フルクトシルヘキサペプチドに作用する改変型アマドリアーゼ - Google Patents

フルクトシルヘキサペプチドに作用する改変型アマドリアーゼ Download PDF

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WO2013162035A1
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seq
amino acid
amadoriase
acid sequence
αf6p
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敦 一柳
陽介 鉞
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キッコーマン株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • G01N2333/90672—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general

Definitions

  • the present invention relates to amadoriase that acts on fructosyl hexapeptide, its gene and recombinant DNA, and a method for producing amadoriase with modified substrate specificity.
  • Glycated proteins are produced by non-enzymatic covalent bond formation between the aldehyde group of aldoses (monosaccharides and derivatives thereof that potentially have aldehyde groups) such as glucose, and Amadori transfer It is.
  • aldehyde group of aldoses monosaccharides and derivatives thereof that potentially have aldehyde groups
  • Amadori transfer It is.
  • the amino group of a protein include an ⁇ -amino group at the amino terminus and an ⁇ -amino group of a lysine residue side chain in the protein.
  • Known glycated proteins generated in vivo include glycated hemoglobin in which hemoglobin in blood is glycated, glycated albumin in which albumin is glycated, and the like.
  • HbA1c hemoglobin A1c
  • ⁇ -chain a protein in which glucose is bound to the ⁇ -amino group of Val (valine) at the N-terminus (amino terminus) of the hemoglobin “ ⁇ -chain”. Since the HbA1c concentration in blood reflects the average blood glucose level over a certain period in the past, the value of HbA1c is an important index in the diagnosis and management of diabetes symptoms.
  • Amadoriase catalyzes a reaction that oxidizes iminodiacetic acid or its derivative (also called “Amadori compound”) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or ⁇ -ketoaldehyde, an amino acid or peptide, and hydrogen peroxide. It is a general term for enzymes to be used. Amadoriase is known as a useful enzyme for measuring HbA1c by an enzymatic method.
  • Amadoriase has been found in bacteria, yeasts and fungi so far, for example, the genus Coniochaeta, Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia , Neocosmospora genus, Cryptococcus genus, Phaeosphaeria genus, Aspergillus genus, Emericella genus, Ulocladium genus, Penicillium F arium ), Achaetomiella, Achaetomium, Thielavia, Chaetomium, Gerasinospora, Microascus, Leptosphaeria, Ophiobolus, Pleospora, Conioketidium (Conio Amadoriases from the genera chaetidium, Pichia, Debaryomyces, Corynebacterium, Agrobacterium, Arthrobacter have been reported (for example, (See Patent Documents 1, 6 to 15 and Non-Patent Document
  • amadoriase may be described by expressions such as ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, and fructosylamine oxidase depending on the literature.
  • HbA1c As a method for measuring HbA1c quickly and simply using various amadoriases as described above, HbA1c is decomposed with a cleavage enzyme such as protease, and a specific measurement substance is released from the ⁇ -chain amino terminus of HbA1c.
  • a cleavage enzyme such as protease
  • ⁇ -fructosylvalylhistidine hereinafter referred to as ⁇ FVH
  • ⁇ FVH ⁇ -fructosylvalylhistidine
  • ⁇ -fructosyl valine hereinafter referred to as ⁇ FV
  • ⁇ FV ⁇ -fructosyl valine
  • ⁇ -fructosyl hexapeptide comprising 6 amino acids including glycated ⁇ -chain amino-terminal valine.
  • ⁇ F6P rilhistidyl leucylthreonylprolyl glutamic acid
  • the HbA1c measurement method defined by IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
  • ⁇ F6P is HPLC-CE (HPLC
  • HPLC-CE HPLC
  • the HbA1c value is determined by measurement using capillary electrophoresis) or HPLC-MS (HPLC-mass spectrometry) (see Non-Patent Document 10).
  • Glu-C protease which is a cleaving enzyme, is allowed to act on HbA1c to cleave out ⁇ F6P from the ⁇ -chain amino terminus of HbA1c (see Non-Patent Document 10). Even when Glu-C protease is allowed to act on ⁇ F6P, ⁇ -fructosyl amino acid and ⁇ -fructosyl dipeptide are hardly cleaved (see Patent Document 16). Therefore, glycation occurs when HbA1c is cleaved with Glu-C protease.
  • amadoriases that can act on ⁇ F6P disclosed so far include amadoriases derived from ginger family plants (see Patent Document 17), amadoriases derived from Aspergillus oryzae (see Patent Document 18), and amadoriases derived from Phaeosphaeria nodorum (see Patent Documents 15 and 19). )
  • a fructosyl peptide oxidase derived from a ginger family plant was first reported as an amadoriase that acts on ⁇ F6P (see Patent Document 17).
  • this enzyme since it takes a long time of about 16 hours to detect ⁇ F6P using the crude enzyme solution, it cannot be said to be a practical F6P oxidase.
  • this enzyme since this enzyme is unpurified and is of plant origin, it is expected to have various technical problems when applied to mass production processes of general enzymes using genetically modified microorganisms. There has been no report that the enzyme has been purified or mass-produced for practical use.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an amadoriase that has a high reactivity with ⁇ F6P and that allows the ⁇ F6P excised from HbA1c to be quantified satisfactorily.
  • amadoriase derived from the genus Coniochaeta amadoriase derived from the genus Phaeosphaeria, amadoriase derived from the genus Neocosmospora, amadoriase derived from the genus Aspergillus, amadoriase derived from the genus Cryptococcus, It has been found that the same problem can be solved by introducing a similar amino acid substitution at a position corresponding to a position in the amadoriase derived from the genus Coniochaeta for amadoriase derived from the genus Curvularia and amadoriase from the genus Eupenicillium. completed.
  • the present inventors have established a quantitative measurement method for ⁇ F6P and further a quantitative measurement method for HbA1c using an amadoriase mutant that has acquired reactivity to ⁇ F6P, and completed the present invention.
  • the present invention relates to the following.
  • An amadoriase selected from the group consisting of: (i) When the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid at the position corresponding to position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is alanine or aspartic acid, and ⁇ -fruct An amadoriase having activity against tosylhexapeptide ( ⁇ F6P), (ii) in the amadoriase of (i), consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids at positions other than the position corresponding to position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added an amadoriase having activity against ⁇ F6P, (iii) In the amadoriase of (i), the amino acid at the position corresponding to position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is alanine or aspartic acid, and the full-length amino
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, or SEQ ID NO: 123
  • the amadoriase according to any one of [1] to [8], which has an amino acid sequence has an amino acid substitution defined in any one of the above [1] to [8], and has activity against ⁇ F6P.
  • the amadoriase is genus Coniochaeta, Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Currvularia, Neocosmospora, Neocosmospora, Cryptoococcus
  • the amadoriase according to any one of [1] to [9], which is derived from the genus es), the genus Corynebacterium, the genus Agrobacterium, or
  • amadoriase selected from the group consisting of: (i) an amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153 or SEQ ID NO: 155, (ii) in the amadoriase of (i), consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids at positions other than the position corresponding to position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added an amadoriase having activity against ⁇ F6P, (iii) In the amadoriase of (i), the full-length amino acid sequence of the amadoriase has 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, or SEQ ID NO: 155, and Ranks-32, 36-41, 49-52, 54-58, 63-65, 73-75, 84-86, 88-90, 120-122, 145-150,
  • amadoriase selected from the group consisting of: (i) Amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161 or SEQ ID NO: 163, (ii) From the amino acid sequence in which one or several amino acids in the position other than the positions corresponding to positions 62 and 110 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added in the amadoriase of (i) above And an amadoriase having activity against ⁇ F6P, (iii) In the amadoriase of (i), the full-length amino acid sequence of the amadoriase has 70% or more sequence identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, or SEQ ID NO: 163 10th to 32nd, 36th to 41st, 49th to 52th, 54th to 58th, 63th to
  • amadoriase selected from the group consisting of: (i) Amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173, (ii) In the amadoriase of (i), one or several amino acids at positions other than the positions corresponding to positions 62, 110, 106, or 113 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted or missing.
  • amadoriase consisting of a lost or added amino acid sequence and having activity against ⁇ F6P
  • the full-length amino acid sequence of the amadoriase is SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171 or SEQ ID NO: 173 It has a sequence identity of 70% or more with the sequence, and positions 10 to 32, 36 to 41, 49 to 52, 54 to 58, 63 to 65, 63 to 65, 73 to 75, 84 of SEQ ID NO: 1.
  • amadoriase selected from the group consisting of: (i) Amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 175 or SEQ ID NO: 189, (ii) In the amadoriase of (i), one or several amino acids at positions other than the positions corresponding to positions 62, 110, 106 and 113 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or deleted An amadoriase comprising an added amino acid sequence and having activity against ⁇ F6P, (iii) In the amadoriase of (i), the full-length amino acid sequence of the amadoriase has 70% or more sequence identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 175, or SEQ ID NO: 189 10th to 32nd, 36th to 41st, 49th to 52th, 54th to 58th,
  • An amadoriase selected from the group consisting of: (i) an amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 177 or SEQ ID NO: 179, (ii) In the amadoriase of (i), one or several amino acids at positions other than the positions corresponding to positions 62, 63, 106, 110 and 113 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, An amadoriase consisting of a deleted or added amino acid sequence and having activity against ⁇ F6P, (iii) In the amadoriase of (i), the full-length amino acid sequence of the amadoriase has 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 177 or SEQ ID NO: 179, and positions 10 to 32 of SEQ ID NO: 1 36-41, 49-52, 54-58, 63-65, 73-75, 84-86, 88-90, 120-122, 145-150, 156
  • amadoriase selected from the group consisting of: (i) an amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187 or SEQ ID NO: 191, (ii) In the amadoriase of (i), other than the positions corresponding to positions 62, 63, 106, 110, and 113, and positions 102, 355, or 419 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amadoriase comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids at the position are substituted, deleted or added, and having activity against ⁇ F6P;
  • the full-length amino acid sequence of the amadoriase is 70% or more identical to any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, or SEQ ID NO: 191 10 to 32, 36 to 41, 49 to 52, 54 to 58, 63 to 65, 73 to 75, 73 to 75, 84 to 86, 88 to 90 of SEQ ID NO: 1.
  • amadoriase having 95% or more sequence identity between an amino acid sequence in a homology region consisting of a sequence and an amino acid sequence in a homology region at a corresponding position of the amadoriase, and having activity against ⁇ F6P.
  • amadoriase selected from the group consisting of: (i) an amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 141 or 185, (ii) In the amadoriase of (i), 1 or a number at a position other than the positions corresponding to positions 62, 63, 102, 106, 110, 113, and 355 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amadoriase having an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted or added, and having activity against ⁇ F6P, (iii)
  • the full-length amino acid sequence of the amadoriase has 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141 or 185, and positions 10 to 32 of SEQ ID NO: 1 36-41, 49-52, 54-58, 63-65, 73-75, 84-86, 88-90, 120-122, 145-150, 156-162 164-170, 180-182, 202-205, 207-211, 214-224, 227-230, 236-241, 243-248, 258-261, 266-268 270-273, 275-287, 295-297, 306-308, 310-316, 324-329, 332-334, 341-344, 346-
  • the amino acid sequence in the homology region consisting of the amino acid sequence of positions 55, 357-363,
  • amino acid sequence of Amadoriase When the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to the amino acid position selected from the group consisting of (a) to (h) below.
  • the amadoriase amino acid sequence has one or more amino acid residue substitutions, and compared to amadoriase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, -Amadoriase with an increased reactivity to fructosyl hexapeptide.
  • amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the amino acids at one or more positions selected from the group consisting of the following (a) to (h) of the amino acids described in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid at the position corresponding to is substituted with a substituted amino acid residue described in each of the following, and compared with amadoriase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the reaction to ⁇ -fructosylvalylhistidine Amadoriase with an improved ratio of reactivity to ⁇ -fructosylhexapeptide to sex.
  • amino acid sequence of Amadoriase When the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the amino acid residue described in SEQ ID NO: 1 has a substitution of an amino acid residue selected from the group consisting of (p) to (u) below, An amadoriase having an improved ratio of reactivity to ⁇ -fructosyl hexapeptide with respect to reactivity to ⁇ -fructosylvalylhistidine as compared to amadoriase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of Amadoriase When the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40, the amino acid sequence described in (v) below in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 Amadoriase having an improved ratio of reactivity to ⁇ -fructosyl hexapeptide to reactivity to ⁇ -fructosylvalylhistidine as compared to amadoriase having
  • a host cell comprising the recombinant vector according to [24].
  • a method for producing amadoriase comprising the following steps: (I) culturing the host cell according to [25] under conditions capable of expressing amadoriase protein, and (ii) isolating amadoriase from the culture or culture medium.
  • kits for use in the measurement of HbA1c comprising the amadoriase according to any one of [1] to [22].
  • a method for measuring HbA1c comprising the following steps: (i) treating a sample containing HbA1c with a protease and / or peptidase to liberate ⁇ F6P from the ⁇ -chain amino terminus of HbA1c; and (ii) A step of allowing the amadoriase according to any one of [1] to [22] to act on the liberated HbA1c-derived ⁇ F6P, and measuring a product or a consumer due to the action of the amadoriase on the HbA1c-derived ⁇ F6P.
  • the present invention also provides an amadoriase selected from the group consisting of:
  • amino acid sequence in the region has a sequence identity of 90%, preferably 95%, more preferably 98% or more, and ⁇ F6P Amadoriase having activity against.
  • the amino acid at the position corresponding to position 110 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is leucine or tyrosine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 106 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be alanine, lysine or arginine, and the amino acid at the position corresponding to position 113 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is also lysine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 63 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be alanine or histidine, and further the position corresponding to position 102 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid may be lysine and the sequence
  • the amino acid at the position corresponding to position 355 in the amino acid sequence shown in No. 1 may be serine, the amino acid at the position corresponding to position 419 in the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 1 is lysine, and has an activity against ⁇ F6P. It can be an amadoriase.
  • amadoriase capable of quantifying ⁇ F6P excised from HbA1c quickly, simply, accurately and satisfactorily. If such an amadoriase is used, based on the same principle as the existing practical standard method, it is possible to provide a measurement method and measurement kit based on the enzyme method of HbA1c which is superior in correlation with the practical standard method.
  • FIG. 1st figure illustrates the identity in the amino acid sequence of various well-known amadoriases.
  • Co, Et, Py, Ar, Cc, and Nv, Cn, Pn, An, En, Ul, and Pj were aligned.
  • FIG. 1-1 It is a continuation of FIG. 1-2.
  • FIG. 1-3 This is continued from FIG.
  • 2nd figure which illustrates the identity in the amino acid sequence of various well-known amadoriases, and a similar amino acid.
  • Co, Cn, Pn, An, En, Ul, and Pj Co, Et, Py, Ar, Cc, and Nv were aligned. This is continued from FIG. 2-1.
  • FIG. 2-2 This is continued from FIG. 2-3. It is a continuation of FIG. It is a figure which illustrates the identity in the amino acid sequence of 17 types of amadoriases. This is continued from FIG. 3-1. This is a continuation of FIG. This is continued from FIG. 3-3. This is continued from Figure 3-4. It is a figure which illustrates the same amino acid and the similar amino acid in the amino acid sequence of 17 types of amadoriase. This is continued from FIG. 4-1. This is continued from Fig. 4-2. This is a continuation of FIG. 4-3. This is a continuation of FIG. 4-4. It is a figure which shows the quantitative measurement of (alpha) F6P using the CFP-T7 variant of this invention. It is a figure which shows the result of a comparative example. It is a figure which shows the quantitative measurement of HbA1c using the CFP-T7 variant of this invention. It is a figure which shows the result of a comparative example.
  • the glycated protein in the present invention refers to a non-enzymatically glycated protein.
  • Glycated proteins exist both inside and outside the body. Examples of existing glycated proteins include glycated hemoglobin and glycated albumin in blood. Among glycated hemoglobins, the ⁇ -chain amino terminal valine of hemoglobin is glycated. Glycated hemoglobin is particularly referred to as hemoglobin A1c (HbA1c). Examples that exist outside the living body include foods and drinks such as liquid seasonings in which proteins, peptides and sugars coexist, and infusions.
  • the fructosyl peptide in the present invention refers to a non-enzymatically glycated peptide derived from a glycated protein, and a peptide obtained by non-enzymatic glycation directly or resulting from degradation of a glycated protein by a protease or the like. Is included.
  • examples of the amino group on the peptide side subjected to glycation include an ⁇ -amino group at the amino terminus, and an ⁇ -amino group on the side chain of a lysine residue inside the peptide.
  • ⁇ -glycated peptide ⁇ -fructosyl peptide
  • the ⁇ -fructosyl peptide is formed by liberation from a glycated protein in which the N-terminal ⁇ -amino acid is glycated by some means, for example, limited degradation with a protease.
  • the glycated protein to be identified is hemoglobin A1c (HbA1c)
  • the corresponding ⁇ -fructosyl peptide refers to a glycated peptide that is cleaved from the glycated N-terminus.
  • HbA1c refers to a glycated peptide that is excised from the glycated N-terminus of the hemoglobin ⁇ chain.
  • the measurement substance on which the amadoriase of the present invention acts is ⁇ -fructosyl hexapeptide ( ⁇ F6P).
  • ⁇ F6P ⁇ -fructosyl hexapeptide
  • the corresponding substance is specifically ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolylglutamic acid.
  • Amadoriase is also referred to as ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, or fructosylamine oxidase. It refers to an enzyme that catalyzes a reaction that produces ketoaldehyde, amino acids or peptides, and hydrogen peroxide.
  • Amadoriase is widely distributed in nature and can be obtained by searching for microorganisms, enzymes of animal or plant origin. The microorganism can be obtained from, for example, filamentous fungi, yeast, or bacteria.
  • the amadoriase of the present invention is characterized by having high reactivity with ⁇ F6P.
  • amadoriase variant The present invention relates to ⁇ F6P produced based on wild-type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 54, or SEQ ID NO: 62, or SEQ ID NO: 89, or SEQ ID NO: 99.
  • a modified variant of amadoriase having a modified substrate specificity is provided.
  • a variant is used interchangeably with a variant, and means that a part of the amino acids is substituted, deleted or added when the amino acid sequence of amadoriase is compared with the wild-type sequence. The addition here includes insertion.
  • the present invention further relates to ⁇ F6P based on a wild type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 145 or SEQ ID NO: 149.
  • a wild type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 145 or SEQ ID NO: 149.
  • variants of amadoriase with altered substrate specificity that are highly reactive towards.
  • a modified form of amadoriase having a high substrate specificity and a high reactivity to ⁇ F6P is obtained. be able to.
  • the amadoriase of the present invention is an amadoriase having a modified substrate specificity that is highly reactive to ⁇ F6P and is based on an amadoriase derived from the genus Coniochaeta having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a variant.
  • variants include SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155 (single variant), SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, and SEQ ID NO: 163 (double variant).
  • variants are SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155 (single variant), SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, and SEQ ID NO: 163 (double variant), SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173 (triple mutant), SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 189 (four Heavy mutant), SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179 (quint mutant), SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191 (hexa mutant), SEQ ID NO: 141 or sequence In the amino acid sequence of No.
  • one or several amino acids are modified or mutated, deleted, substituted, added and / or It can be exemplified amadoriase to have inserted amino acid sequence, and having activity against Arufaefu6P.
  • the term “one or several amino acids” means 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4 amino acid sequences with a total length exceeding 400 amino acids. More preferably, it refers to 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids.
  • one or several amino acids are 1 to 10, preferably 1 to 7, preferably 1 to 5, preferably 1 to 4, More preferably, it refers to 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids.
  • one or several amino acids are 1 to 5, preferably 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • An amino acid refer to one or two amino acids when referring to a sequence having a total length of less than 40 amino acids.
  • variants examples include 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156 (single variant), SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, and SEQ ID NO: 164 (double variant), sequence SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174 (triple mutant), SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 190 (quadruple) Mutant), SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180 (quint mutant), SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192 (hexa mutant), SEQ ID NO: 142 or SEQ ID NO: Is encoded by a sequence complementary to the nucleot
  • hybridization solution 50% formamide, 6-10 ⁇ SSC (0.15-1.5M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)), and incubation at about 42 ° C. to about 50 ° C., followed by about 65 ° C. to about 70 ° C. using 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS The conditions for washing can be mentioned.
  • mutant of the present invention is, for example, Eupenicillium, Pyrenecata, Arsulium, Carbraria, Neocosmosspora as long as the conditions relating to substrate specificity and / or amino acid sequence described in the claims are satisfied.
  • Cryptococcus spp. Feosferia spp.
  • Produced based on amadoriase derived from other species such as Pleospora, Conioketidium, Pichia, Corynebacterium, Agrobacterium, or Arthrobacter.
  • a variant based on Coniochaeta sp. NISL 9330-derived amadoriase may have one or more amino acid substitutions at the following positions.
  • one or more amino acid substitutions used in connection with an amadoriase variant refers to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 amino acid substitutions.
  • the one or more amino acid substitutions are 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7 amino acid substitutions.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine or alanine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 106 is replaced with alanine, lysine or arginine.
  • glutamine at position 110 is replaced with leucine or tyrosine.
  • alanine at position 113 is substituted with lysine or arginine.
  • alanine at position 355 is substituted with serine.
  • alanine at position 419 may be substituted with lysine.
  • a variant based on Phaeosphaeria nodorum-derived amadoriase may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Serine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Glycine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 351 (H) Serine at position 416
  • the serine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • the lysine at position 102 may not be substituted.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • glycine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 351 is substituted with serine.
  • serine at position 416 may be substituted with lysine.
  • Neocosmospora vasinfecta derived amadoriase may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Glycine at position 106 (e) Glutamic acid at position 110 (f) Lysine at position 113 (g) Serine at position 355 ( h) Alanine at position 420
  • arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • glycine at position 106 is replaced with lysine.
  • glutamic acid at position 110 is replaced with leucine.
  • the lysine at position 113 may not be substituted.
  • the serine at position 355 may not be substituted.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • a variant based on an amadoriase from Aspergillus nidulans may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 61 (b) Leucine at position 62 (c) Glutamic acid at position 101 (d) Glycine at position 105 (e) Lysine at position 109 (f) Serine at position 112 (g) Alanine at position 355 ( h) Alanine at position 420
  • arginine at position 61 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 62 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 101 is substituted with lysine.
  • glycine at position 105 is substituted with lysine.
  • the lysine at position 109 is replaced with leucine.
  • serine at position 112 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • a variant based on an amadoriase from Eupenicillium terrenum may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Asparagine at position 106 (e) Lysine at position 110 (f) Threonine at position 113 (g) Alanine at position 355 ( h) Glycine at position 419
  • arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • asparagine at position 106 is replaced with lysine.
  • lysine at position 110 is replaced with leucine.
  • threonine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • glycine at position 419 may be substituted with lysine.
  • a variant based on fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 89 or 149) from Cryptococcus neoformans may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Isoleucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Serine at position 106 (e) Serine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 355 ( h) Alanine at position 420
  • arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • (b) isoleucine at position 63 is replaced with histidine.
  • (c) glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • serine at position 106 is substituted with lysine.
  • serine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) from Pyrenochaeta sp. May have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Threonine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Alanine at position 418 In the ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) derived from Pyrenochaeta sp., Preferably (a) arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • lysine at position 102 may not be substituted.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the threonine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine.
  • alanine at position 418 may be substituted with lysine.
  • a variant based on a ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 115) from Arthrinium sp. May have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Alanine at position 106 (e) Glutamine at position 110 (f) Threonine at position 113 (g) Alanine at position 356 ( h) Alanine at position 421
  • (b) leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • lysine at position 102 may not be substituted.
  • alanine at position 106 is substituted with lysine.
  • glutamine at position 110 is replaced with leucine.
  • the threonine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 356 is substituted with serine.
  • alanine at position 421 may be substituted with lysine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117) from Curvularia clavata may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Alanine at position 418
  • arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine. In some cases (h) alanine at position 418 may be substituted with lysine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (Cc95FX, SEQ ID NO: 99) with 95% amino acid sequence identity with the ketoamine oxidase from Curvularia clavata has one or more amino acid substitutions at the following positions: Can have: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Serine at position 418
  • the ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 99) having 95% amino acid sequence identity with the ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata SEQ ID NO: 117
  • arginine at position 62 is Substitution with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine. In some cases, (h) serine at position 418 may be substituted with lysine.
  • Variants based on fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 119) from Emericella nidulans may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 61 (b) Leucine at position 62 (c) Glutamic acid at position 101 (d) Lysine at position 105 (e) Arginine at position 109 (f) Serine at position 112 (g) Alanine at position 355 ( h) Alanine at position 420
  • arginine at position 61 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 62 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 101 is substituted with lysine.
  • lysine at position 105 may not be substituted.
  • arginine at position 109 is replaced with leucine.
  • serine at position 112 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • a variant based on fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 121) from Ulocladium sp. May have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Alanine at position 418 In the fructosyl amino acid oxidase derived from Ulocladium sp. (SEQ ID NO: 121), preferably (a) arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • lysine at position 102 may not be substituted.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine.
  • alanine at position 418 may be substituted with lysine.
  • a variant based on fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 123) from Penicillium janthinellum may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Serine at position 106 (e) Lysine at position 110 (f) Aspartic acid at position 113 (g) Alanine at position 355 (H) Serine at position 419
  • arginine at position 62 is substituted with alanine or aspartic acid.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • serine at position 106 is substituted with lysine.
  • the lysine at position 110 is replaced with leucine.
  • the aspartic acid at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • serine at position 419 may be substituted with lysine.
  • Amadoriase mutants or variants of the present invention include wild type amadoriases that exhibit little or no activity against ⁇ F6P, such as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62.
  • the wild type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149 is excluded.
  • wild-type amadoriase that exhibits little or no activity against ⁇ F6P is excluded.
  • amadoriase gene In order to obtain the gene of the present invention encoding these amadoriases (hereinafter also simply referred to as “amadoriase gene”), generally used gene cloning methods are used. For example, chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microbial cells having the ability to produce amadoriase and various cells by a conventional method, for example, the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Furthermore, cDNA can be synthesized using mRNA as a template. A chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a suitable probe DNA is synthesized, and using this, a method for selecting the amadoriase gene from a chromosomal DNA or cDNA library, or a suitable primer DNA based on the amino acid sequence. And amplifying DNA containing the gene fragment of interest encoding amadoriase by an appropriate polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR method) such as 5'RACE method or 3'RACE method. Can be ligated to obtain DNA containing the full length of the target amadoriase gene.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction
  • a preferred example of the gene encoding the amadoriase obtained in this way is the amadoriase gene derived from the genus Coniocaeta (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-235585).
  • amadoriase gene derived from the genus Phaeosphaeria an amadoriase gene derived from the genus Neocosmospora, an amadoriase gene derived from the genus Aspergillus, an amadoriase gene derived from the genus Cryptococcus, and an amadoriase gene derived from the genus Curvularia, and the genus Eupenicillium Amadoriase gene can be mentioned.
  • amadoriase genes are linked to various vectors as usual.
  • a recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 International Publication No. 2007/12579 containing DNA encoding an amadoriase gene derived from Coniochaeta sp. NISL 9330, GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma-Alcrich)
  • a recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 containing a DNA encoding the amadoriase gene can be obtained by extraction and purification.
  • amadoriase genes derived from other organisms those skilled in the art can obtain DNA by the same procedure according to conventional methods. Specifically, Escherichia coli carrying a recombinant plasmid pUTE100K′-EFP-T5 (International Publication No. 2007/1225779) containing a DNA encoding the amadoriase gene derived from Eupenicillium terrenum ATCC 18547 strain is cultured, and GenElute Plasmid Miniprep By using Kit, a recombinant plasmid pUTE100K′-EFP-T5 containing DNA encoding the amadoriase gene can be obtained by extraction from cells and purification.
  • a recombinant plasmid pET22b-AnFX containing DNA encoding the amadoriase gene can be obtained by extraction and purification.
  • a recombinant plasmid pET22b-CnFX International Publication No.
  • a recombinant plasmid pET22b-CnFX containing the encoding DNA can be obtained by extraction and purification. Further, by culturing Escherichia coli carrying a recombinant plasmid pET22b-NvFX (International Publication No. 2012/018094) containing DNA encoding an amadoriase gene derived from Neocosmospora vasinfecta, and using GenElute Plasmid Miniprep Kit, the Amadoriase gene is obtained. A recombinant plasmid pET22b-NvFX containing the encoding DNA can be obtained by extraction and purification.
  • the vector that can be used in the present invention is not limited to the above plasmid, and any other vector known to those skilled in the art, such as bacteriophage and cosmid, can be used. Specifically, for example, pBluescript II SK + (Stratagene) is preferable.
  • amadoriase gene mutation treatment The mutation process of the amadoriase gene can be performed by any known method depending on the intended mutant form. That is, a wide range of methods such as a method of contacting and acting an amadoriase gene or a recombinant DNA into which the gene is incorporated and a mutagen drug; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method Can be used.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • the various conditions for the contact and action are not particularly limited as long as it is possible to adopt conditions according to the type of drug used and the like and a desired mutation can be actually induced in the amadoriase gene.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M.
  • a reaction temperature 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M.
  • Even in the case of performing ultraviolet irradiation it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, 024-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985), Eckstein method (Nucleic Acid Res. 49 (Nucleic Acid Res. 49)). (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986), Kunkel method (Proc. Natl. Acid. Sci. US, 48, 1982). ): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • a technique known as a general PCR method can also be used (see Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified amadoriase gene can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • the determination or confirmation of the DNA base sequence of the amadoriase gene obtained by the above method can be performed by using, for example, a multicapillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies).
  • the amadoriase gene obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and the host corresponding to each vector is selected by a conventional method.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia for example, the obtained recombinant DNA, is used as a host to transform, for example, E. coli K-12 strain, preferably E. coli JM109 strain, E. coli DH5 ⁇ strain (both manufactured by Takara Bio Inc.) and the like. Transform or transduce them to obtain the respective strain.
  • amino acid sequence homology, identity or similarity The homology, identity, or similarity of amino acid sequences is determined by GENETYX (GENETYX) maximum matching and search homology programs, DNASIS Pro (Hitachi Solutions) maximum matching and multiple alignment, or CLUSTALW multiple alignment. It can be calculated by a program such as In order to calculate amino acid sequence identity, when two or more amadoriases are aligned, the amino acid positions that are identical in the two or more amadoriases can be examined. Based on such information, the same region in the amino acid sequence can be determined.
  • the percent identity is defined by using the total number of amino acids in the region that can be aligned when the alignment of two or more amino acid sequences is performed using an algorithm such as Blosum62, as the denominator.
  • the percentage when the number of positions occupied by the same amino acid is a molecule. Therefore, usually, when there is a region where no identity is found in two or more amino acid sequences, for example, when there is an additional sequence in one amino acid sequence where no identity is found at the C-terminal, there is no region with the identity. Cannot be used to calculate% identity because it cannot be aligned.
  • amino acid positions that are similar in two or more amadoriases can be examined.
  • CLUSTALW can be used to align multiple amino acid sequences.
  • Blosum62 is used as an algorithm, and amino acids that are judged to be similar when multiple amino acid sequences are aligned are called similar amino acids.
  • amino acid substitutions may be due to substitutions between such similar amino acids.
  • the term “homology region” refers to a region in which, when two or more amadoriases are aligned, the amino acids at corresponding positions of a reference amadoriase and a comparison amadoriase are the same or consist of similar amino acids. It is a region composed of 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more consecutive amino acids. For example, in FIG. 1, an amadoriase having a sequence identity of 74% or more of the full-length amino acid sequence was aligned. Among these, the 10th to 32nd positions are composed of the same or similar amino acids based on Coniochaeta sp.
  • Amadoriase represented by SEQ ID NO: 1, and thus correspond to the homology region.
  • the homology region of amadoriase is from positions 11 to 32, 36 to 41, 50 to 52, 54 to 58, and 84 to 86 based on ConiochaetaConsp.
  • Amadoriase represented by SEQ ID NO: 1. , 88-90, 145-150, 157-168, 202-205, 207-212, 215-225, 236-248, 258-261, 266-268, 270-273
  • the homology region of amadoriase is positions 11 to 18, 20 to 32, 50 to 52, 54 to 58, 266 to 268, based on Coniochaeta sp.
  • the Amadoriase mutant of the present invention has 50% or more, preferably 60% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% when aligned with an amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. As mentioned above, it has 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 99% or more full-length amino acid sequence identity, and high reactivity to ⁇ F6P. Furthermore, the amino acid sequence in the homology region of the amadoriase variant of the present invention is 80%, preferably 90%, preferably 95%, preferably 98%, more preferably 99% with the amino acid sequence of the homology region in SEQ ID NO: 1. % Sequence identity.
  • amino acid sequences are compared using a known algorithm such as Lippmann-Person method, and conserved amino acid residues present in the amino acid sequences of each amadoriase Can be performed by giving the maximum identity to.
  • the homologous amino acid residues in the sequence of each amadoriase sequence regardless of insertions or deletions in the amino acid sequences.
  • the homologous position is considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be estimated that the homologous position has a similar effect on the specific function of the target amadoriase.
  • the amino acid “position corresponding to arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. It means the amino acid corresponding to the arginine at position 62 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) Ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • the amino acid “position corresponding to leucine at position 63 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 It means the amino acid corresponding to leucine at position 63 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to leucine at position 63 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) Ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • the amino acid “position corresponding to glutamic acid at position 102 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 When compared with the sequence, it means the amino acid corresponding to glutamic acid at position 102 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • the amino acid of “position corresponding to glutamic acid at position 102 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is Auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117), In the case of ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta (SEQ ID NO: 54), fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans (SEQ ID NO: 89 and 149), fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinellum (SEQ ID NO: 123), glutamic acid at position 102, Pyrenochaeta sp Derived from ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113), ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum (SEQ ID NO: 38), Ulocladium sp.
  • fructosyl amino acid oxidase SEQ ID NO: 121
  • lysine at position 102 fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 119) derived from Emericella nidulans
  • glutamic acid at position 101 in the fructosyl amino acid oxidase SEQ ID NO: 62 and 147) derived from Aspergillus nidulans It is.
  • the amino acid at “position corresponding to aspartic acid at position 106 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, which is the Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1.
  • it means an amino acid corresponding to aspartic acid at position 106 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to aspartic acid at position 106 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is asparagine at position 106 in the amadoriase derived from Eupenicillium terrenum (SEQ ID NOs: 40 and 145), ketoamine derived from Pyrenochaeta sp. 106 for oxidase (SEQ ID NO: 113), ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata (SEQ ID NO: 117), fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum (SEQ ID NO: 38), fructosyl amino acid oxidase derived from Ulocladium sp.
  • the amino acid at “position corresponding to glutamine at position 110 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 When compared with the sequence, it means the amino acid corresponding to glutamine at position 110 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to glutamine at position 110 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Penicillium janthinellum-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 123) In lysine at position 110, ketoamine oxidase from Pyrenochaeta sp. (SEQ ID NO: 113), ketoamine oxidase from Curvularia clavata (SEQ ID NO: 117), and fructosyl amino acid oxidase from Ulocladium sp.
  • SEQ ID NO: 121 in position 110 Of alanine of Arthrinium sp. (SEQ ID NO: 115), glutamine at position 110, and ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 54) from Neocosmospora vasinfecta, glutamate at position 110, fructosyl from Cryptococcus neoformans Serine at position 110 for amino acid oxidase (SEQ ID NOs: 89 and 149), glycine at position 110 for Phaeosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 38), position 109 for fructosyl peptide oxidase derived from Emericella nidulans (SEQ ID NO: 119) Arginine, a fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs: 62 and 147), is lysine at position 109.
  • the amino acid at “position corresponding to alanine at position 113 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 It means the amino acid corresponding to alanine at position 113 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to alanine at position 113 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) Arthrinium sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 115), threonine at position 113, Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117), Cryptococcus neoformans-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NOs: 89 and 149), Phaeosphaeria Nodrum-derived fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 38), Ulocladium sp.-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 121), a
  • the amino acid “position corresponding to alanine at position 355 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 When compared with the sequence, it means the amino acid corresponding to alanine at position 355 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to alanine at position 355 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NO: 40 and 145), Cryptococcus neoformans-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 89 and 149), fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 62 and 147), fructosyl peptide oxidase derived from Emericella nidulans (SEQ ID NO: 119), and fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinellum (SEQ ID NO: 123) Alanine, Pyrenochaeta ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113), Curvularia clavata-
  • the amino acid “position corresponding to alanine at position 419 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. It means the amino acid corresponding to alanine at position 419 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to alanine at position 419 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is a glycine at position 419 in the amadoriase derived from Eupenicillium terrenum (SEQ ID NOs: 40 and 145), a ketoamine oxidase derived from Pyrenochaeta sp.
  • the amadoriase mutant of the present invention may be a single mutant or a multiple mutant having two or more amino acid substitutions, for example, a double to octal mutant.
  • the present inventors have directed against ⁇ F6P of amadoriase substituted with amino acids at positions corresponding to positions 62, 63, 102, 106, 110, 113, 355, and 419 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The activity was found to increase. In particular, it was found that the activity of the mutant against ⁇ F6P greatly increases as mutations are added to single, double, triple, quadruple, fivefold, sixfold and sevenfold.
  • the Amadoriase mutant of the present invention includes those in which the amino acid at the position corresponding to position 60 of SEQ ID NO: 1 is glycine.
  • Aspergillus nidulans-derived amadoriase is obtained by replacing the amino acid at position 59 in SEQ ID NO: 147 corresponding to position 60 in SEQ ID NO: 1 with serine in the wild type, but substituting it with glycine (SEQ ID NO: 62). It may be used as an amadoriase which is the basis for the variants of the invention. The same applies to Penicillium janthinellum (Pj) -derived amadoriase (SEQ ID NO: 123).
  • this strain may be cultured by a normal solid culture method, It is preferable to perform culture using a liquid culture method.
  • the present invention comprises a step of culturing a strain having an ability to produce amadoriase with improved substrate specificity under conditions capable of expressing amadoriase protein, and a step of isolating amadoriase from the culture or culture medium.
  • a method for producing amadoriase is provided.
  • a host cell transformed with a vector incorporating a gene encoding the amadoriase of the present invention can be used.
  • the condition under which the amadoriase protein can be expressed means that the amadoriase gene is transcribed and translated, and a polypeptide encoded by the gene is produced.
  • Examples of the medium for culturing the above strain include, for example, yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor or one or more nitrogen sources such as soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, dihydrogen phosphate. Add one or more inorganic salts such as potassium, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • the amount of the target enzyme produced by adding a substrate on which the amadoriase can act or a similar compound such as glycated amino acid, glycated peptide, glycated protein degradation product, or glycated protein such as glycated hemoglobin or glycated albumin. can be improved.
  • the culture is carried out at a culture temperature of 20 to 42 ° C., preferably at a culture temperature of about 25 to 37 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably at a culture temperature of about 25 to 37 ° C. for 8 to 16 hours, aeration and agitation deep culture, shaking. It is preferable to carry out by culture, stationary culture or the like.
  • the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • a normal enzyme collecting means For example, the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate or the like, and then ammonium sulfate, alcohol, acetone or the like is added thereto.
  • the fraction is collected and the precipitate is collected to obtain a crude enzyme of amadoriase.
  • an amadoriase purified enzyme preparation from the crude enzyme of the above amadoriase, for example, gel filtration method using Sephadex, Superdex or Ultrogel, ion exchange carrier, hydrophobic carrier, adsorption elution method using hydroxyapatite, Select electrophoresis method using polyacrylamide gel, sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation, affinity chromatography method, fractionation method using molecular sieve membrane or hollow fiber membrane, etc.
  • gel filtration method using Sephadex, Superdex or Ultrogel ion exchange carrier
  • hydrophobic carrier hydrophobic carrier
  • adsorption elution method using hydroxyapatite for example, gel filtration method using polyacrylamide gel, sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation, affinity chromatography method, fractionation method using molecular sieve membrane or hollow fiber membrane, etc.
  • amadoriase of the present invention (Improved specificity for ⁇ F6P in the amadoriase of the present invention)
  • the amadoriase of the present invention obtained by the means as described above is altered in the amino acid sequence due to genetic modification or the like, resulting in improved reactivity to ⁇ F6P and improved substrate specificity compared to that before modification. It is characterized by being.
  • the substrate specificity is improved” for ⁇ F6P specifically refers to “reactivity to ⁇ F6P” when the “reactivity to ⁇ FVH” is 1 as compared to that before modification. The ratio is increased. “Reactivity to ⁇ FVH” may be expressed as “ ⁇ FVH oxidation activity”.
  • ⁇ F6P / ⁇ FVH which indicates the ratio of reactivity to ⁇ F6P when the reactivity to ⁇ FVH is 1, is 10% or more, preferably 20% or more than before modification. It is preferably 30% or more, more preferably 40% or more.
  • ⁇ F6P / ⁇ FV which indicates the ratio of reactivity to ⁇ F6P when the reactivity to ⁇ FV is 1, is 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 30% relative to that before modification. % Or more, more preferably 40% or more. “Reactivity to ⁇ FV” may be expressed as “ ⁇ FV oxidation activity”.
  • the ratio of reactivity to ⁇ F6P with respect to reactivity to ⁇ FVH was measured under any condition using a known amadoriase measurement method. Can be compared. For example, at pH 6.5, the activity measured by adding 1 mM ⁇ F6P is divided by the activity measured by adding 1 mM ⁇ FVH to obtain a ratio to ⁇ F6P when the reactivity to ⁇ FVH is 1. The percentage of reactivity can be calculated and compared with that before and after modification.
  • the activity measured by adding 1 mM ⁇ F6P is divided by the activity measured by adding 1 mM ⁇ FV, whereby the reactivity to ⁇ FV is 1.
  • the ratio of reactivity to ⁇ F6P can be calculated and compared with that before and after modification.
  • amadoriase of the present invention having improved substrate specificity for ⁇ F6P compared to that before modification is, for example, amadoriase produced by E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H28) strain. It is done.
  • Such an amadoriase with modified substrate specificity is an enzyme based on the same principle as the practical standard method for measuring HbA1c defined by IFCC, characterized in that ⁇ F6P produced by treating HbA1c with Glu-C protease is measured.
  • the measurement system can be realized, which is very advantageous for industrial use.
  • Method for measuring amadoriase activity Various methods can be used as a method for measuring the activity of amadoriase. As an example, a method for measuring amadoriase activity used in the present invention will be described below.
  • Examples of the method for measuring the enzyme activity of amadoriase in the present invention include a method for measuring the amount of hydrogen peroxide produced by the reaction of the enzyme and a method for measuring the amount of oxygen consumed by the enzyme reaction.
  • a method for measuring the amount of hydrogen peroxide will be described.
  • ⁇ FV, ⁇ FVH, or ⁇ F6P is used as a substrate unless otherwise specified.
  • the enzyme titer is defined as 1 U for the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute when measured using ⁇ FV, ⁇ FVH, or ⁇ F6P as a substrate.
  • the specific activity (U / mg) is the enzyme titer (U) per 1 mg of enzyme.
  • fructosyl peptide such as ⁇ FVH
  • ⁇ FVH one synthesized and purified based on the method of Sakagami et al. Can be used (see JP 2001-95598 A).
  • glycated hemoglobin (HbA1c) endoproteinase Glu-C
  • ⁇ -glycated hexapeptide fructosyl Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • Glu-C endoproteinase Glu-C
  • ⁇ -glycated hexapeptide derived from ⁇ subunit of glycated hemoglobin (HbA1c) is obtained. Released (Clin. Chem., 43, 1994-1951 (1997)).
  • This can be used as an ⁇ F6P substrate.
  • a synthetic substrate fructosyl Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu manufactured by Peptide Institute
  • reagent 1 Preparation of reagent (reagent 1): 0.1 U phosphate buffer pH 6.5 containing 5 U / ml peroxidase, 0.49 mM 4-aminoantipyrine 5.0 kU peroxidase (manufactured by Kikkoman) and 100 mg of 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are dissolved in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.5) and adjusted to a volume of 1000 ml. .
  • Reagent 2 A 15 mM TOOS solution 500 mg of TOOS (manufactured by Dojindo Laboratories) is dissolved in ion-exchanged water, and the volume is adjusted to 100 ml.
  • Reagent 3 Substrate solution (30 mM; final concentration 1 mM) ⁇ F6P (Peptide Institute) 257.1 mg, or ⁇ FVH (Kikkoman) 124.9 mg, or ⁇ FV (Kikkoman) 83.8 mg is dissolved in ion-exchanged water, and the volume is adjusted to 10 ml.
  • the amount of change per minute ( ⁇ A0) in absorbance at 555 nm was measured in the same manner as described above except that 100 ⁇ l of ion-exchanged water was added instead of 100 ⁇ l of reagent 3.
  • the number of micromoles of hydrogen peroxide produced per minute at 37 ° C. was defined as the activity unit (U) in the enzyme solution and was calculated according to the following formula.
  • a suitable method for excising ⁇ F6P from the glycated protein to be measured includes digestion using protease or peptidase.
  • protease or peptidase for releasing ⁇ F6P any protease may be used as long as it can be used for clinical examination and can effectively cleave at least ⁇ F6P from HbA1c.
  • proteases examples include proteases such as endoproteinase Glu-C, V8 protease, proteinase K, proteinase P, pronase, thermolysin, subtilisin, carboxypeptidase, chymotrypsin, dispase, papain, ficin, bromelain, aminopeptidase, etc.
  • proteases such as endoproteinase Glu-C, V8 protease, proteinase K, proteinase P, pronase, thermolysin, subtilisin, carboxypeptidase, chymotrypsin, dispase, papain, ficin, bromelain, aminopeptidase, etc.
  • an endoprotease or endopeptidase that specifically cleaves the carboxyl terminus of a glutamic acid residue contained in a glycated protein, and examples thereof include endoproteinases Glu-C and V8 protease. .
  • protease for cleaving ⁇ F6P from a glycated protein various proteases described in Table 1 of JP-A-2005-110657, for example, IP enzyme derived from Aspergillus (Kikkoman), AO protease (Kikkoman), peptidase (Kikkoman), protease A5 (Kyowa Kasei), Umamizyme (Amano), Protease A (Amano), Protease M (Amano), Protease P (Amano), Sumiteam MP (Shin Nippon Chemical Industry), Sumiteam LP-20 (Shin Nippon Chemical Industry), Proteinase 6 (Fluca); Rhizopus-derived peptidase R (Amano); Bacillus-derived dispase (Roche), Proteinase N (Furka), Proteinase Type VII (Sigma), Proteinase Bacterial Subtilisin (Fluka), Protease N (A
  • the conditions for the protease treatment or peptidase treatment of the sample may be any conditions as long as the protease used acts on the glycated protein to be measured and the ⁇ -glycated hexapeptide is efficiently released in a short time.
  • the amount of protease to be used is appropriately selected depending on the content of HbA1c contained in the sample or the processing conditions. For example, endoproteinase Glu-C (for example, manufactured by Roche Diagnostics) is terminated.
  • the concentration is 0.1 to 50 U / mL, preferably 1 to 10 U / mL.
  • other proteases may be added as necessary.
  • the pH at the time of treatment with the protease may be unadjusted.
  • an appropriate pH adjusting agent such as hydrochloric acid, acetic acid, sulfuric acid, sodium hydroxide, hydroxylation is used so that the pH is suitable for the action of the protease used.
  • the pH may be adjusted to 2 to 9, preferably 3 to 8, with potassium or the like.
  • the treatment temperature may be 20 to 50 ° C., for example. Depending on the enzyme used, the treatment temperature may be 45 to 70 ° C. in a higher temperature range.
  • the treatment time at this time may be a time sufficient to decompose HbA1c. For example, the treatment time may be 5 seconds to 180 minutes, preferably 1 to 60 minutes, more preferably 1 to 10 minutes.
  • the obtained treatment solution is heated, centrifuged, concentrated, diluted, or the like as it is or as necessary, and then subjected to a glycated hexapeptide oxidase reaction as a sample containing ⁇ F6P.
  • the ⁇ F6P oxidase used in the measurement method of the present invention is allowed to act on the sample containing ⁇ F6P.
  • ⁇ F6P excision and ⁇ F6P oxidase may be performed continuously or simultaneously, and ⁇ F6P oxidase may be allowed to act after completion of the excision.
  • the action time of ⁇ F6P oxidase on ⁇ F6P is, for example, 5 seconds or more, 10 seconds or more, or 20 seconds or more, less than 180 minutes or less than 150 minutes, such as 0.5 to 120 minutes, preferably 0.5 to 60 minutes, more preferably Can be from 1 to 30 minutes.
  • the action time When the action time is too short, the glycated hexapeptide in the sample cannot be measured sufficiently, and good measurement cannot be performed.
  • the action time when the action time is too long, in addition to the problem that the measurement time is extended and the efficiency of the measurement process is poor, the sample and the measurement reagent are exposed to the measurement conditions for a long time. The problem of causing decomposition and modification of components occurs. Further, particularly in a micro measurement system, a change in concentration due to a decrease in sample volume resulting from drying over a long period of time can cause an error.
  • ⁇ F6P oxidase action time By setting the ⁇ F6P oxidase action time to 0.5 to 60 minutes, more preferably 1 to 30 minutes, and even more preferably 1 to 10 minutes, ⁇ F6P can be measured quickly and satisfactorily.
  • the working temperature depends on the optimum temperature of the enzyme to be used, but is, for example, 20 to 45 ° C., and the temperature used for normal enzyme reaction can be appropriately selected.
  • the suitable amount of ⁇ F6P oxidase used in the present invention depends on the amount of ⁇ F6P contained in the sample solution.
  • the final concentration is 0.1 to 50 U / mL, preferably 0.2 to 10 U / mL. What is necessary is just to add so that it may become mL.
  • the pH at the time of action is preferably adjusted using a buffering agent so as to be a pH suitable for the reaction in consideration of the optimum pH of ⁇ F6P oxidase, but is not limited to this as long as the pH is operable.
  • the pH is 3 to 11, particularly preferably 5 to 9.
  • buffering agents include, for example, N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate, citrate, dimethylglutamic acid Salt, tricine, HEPES, etc. are mentioned.
  • a surfactant (n-octyl- ⁇ -D-glucoside, n-octyl- ⁇ -D-thioglucoside, n-dodecyl- ⁇ -) may be used as a solubilizer, stabilizer, reactivity improver, etc.
  • the present invention is a method for measuring ⁇ F6P by measuring a product or a consumable by the action of ⁇ F6P oxidase.
  • it is a product that can be easily measured, and hydrogen peroxide is preferable as a measurement target.
  • Hydrogen peroxide produced by the action of ⁇ F6P oxidase may be detected by a chromogenic substrate or the like.
  • the chromogenic substrate used in the present invention for example, ADOS (N-ethyl-N—) in addition to 4-aminoantipyrine.
  • the measurement of hydrogen peroxide is preferably performed simultaneously with the step of generating hydrogen peroxide, and is preferably performed simultaneously with the action of ⁇ F6P oxidase.
  • dissolved oxygen is mentioned as a consumable to measure, The amount of dissolved oxygen in a reaction liquid can be measured using a dissolved oxygen meter etc.
  • the above-mentioned reagent for measuring ⁇ F6P oxidase and hydrogen peroxide, and the reagent for measuring ⁇ F6P to which a buffering agent or the like is added if desired can be obtained.
  • Various known components such as surfactants, salts, buffers, pH adjusters, preservatives and the like can be appropriately selected and added to the reagent.
  • the above-described reagent for measuring ⁇ F6P of the present invention may be prepared by containing each reagent in different containers, and can be provided, for example, as a liquid product and a frozen product or a freeze-dried product of the liquid product.
  • measuring reagents may be used in a dry product or dissolved state, or may be used by impregnating a carrier on a thin film, for example, a sheet-impregnated paper.
  • the enzymes used for the measuring reagent can be used repeatedly after being immobilized by a conventional method.
  • the reagent for measuring ⁇ F6P of the present invention can constitute a part of a reagent kit incorporating a protease for cleaving ⁇ F6P from a glycated protein.
  • the specification and use conditions of the reagent for measuring ⁇ F6P of the present invention may be selected in accordance with the contained components and the like, but for example, the measurement can be set to be performed at 20 to 45 ° C.
  • the time required for the measurement can be appropriately selected depending on various measurement conditions. For example, 0.5 to 60 minutes, preferably 0.5 to 30 minutes, and more preferably 1 to 10 minutes are preferable.
  • the degree of color development (change in absorbance) of the measurement reagent can be measured with a spectrophotometer, and compared with the standard absorbance, the glycated peptide or glycated protein contained in the sample can be measured.
  • a normal automatic analyzer can also be used for the measurement.
  • the ⁇ F6P measurement method of the present invention may be qualitative, but can also be a quantitative measurement method.
  • the quantitative measurement method of ⁇ F6P refers to a method of determining the concentration of ⁇ F6P in a sample. That is, one embodiment of the present invention provides a method for quantifying ⁇ -fructosyl hexapeptide in a sample comprising using an amadoriase mutant.
  • This quantification method comprises a step of bringing a sample containing ⁇ -fructosylhexapeptide ( ⁇ F6P) derived from HbA1c into contact with the amadoriase of the present invention, and a step of measuring a product or a consumer due to the action of the amadoriase on HbA1c-derived ⁇ F6P.
  • the contact used herein for the quantification method includes any embodiment in which the amadoriase is physically combined with the sample so that the amadoriase of the present invention can catalyze the oxidation reaction of ⁇ F6P.
  • a mode in which a solution sample containing ⁇ F6P is added or dropped to the amadoriase of the present invention supported on a solid support is also included.
  • the absorbance of the detected luminescent substrate also decreases proportionally.
  • the ⁇ F6P concentration range to be detected the lowest detectable ⁇ F6P concentration when the amadoriase is used can be determined. In the present specification, this concentration is sometimes referred to as a detection limit concentration.
  • the amount of enzyme and the reaction time are preferably set so that the detection limit of ⁇ F6P is lower than the ⁇ F6P concentration or blood glycated hemoglobin concentration in the measurement sample.
  • the amount of enzyme used and the reaction time are set so that the detection limit of the amadoriase mutant of the present invention is lower than the final concentration of 200 ⁇ M. It is preferable to set.
  • a calibration curve can be prepared in advance by performing regression analysis such as the least square method from a measured value such as absorbance of a control containing ⁇ F6P having a known concentration. By plotting the measured value of the sample whose ⁇ F6P concentration is unknown with respect to the created calibration curve, the ⁇ F6P concentration in the sample can be quantified.
  • ⁇ F6P in a sample can be well quantified using a Coniochaeta-derived amadoriase mutant, for example, the mutant of the present invention 25. See FIGS. 5 and 6.
  • Amadoriase variants of the present invention that exhibit good activity against ⁇ F6P can be used for quantitative measurement of ⁇ F6P as well.
  • conditions such as the amount of enzyme (enzyme concentration) and reaction time for such quantitative measurement can be appropriately set.
  • the kit for measuring HbA1c of the present invention may include a cleaving protease or peptidase in addition to the above-mentioned reagent for measuring ⁇ F6P, and, if necessary, other known stabilizers and contaminant elimination systems. Good. Techniques used in various reagents and kits for the purpose of measuring HbA1c by an enzymatic method can be appropriately used in the kit for measuring HbA1c using ⁇ F6P of the present invention.
  • the culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells. From this cell, the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 was extracted and purified using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma-Aldrich), and 2.5 ⁇ g of the recombinant plasmid pKK223-3-CFP was purified. -T7 DNA was obtained.
  • the base sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multi-capillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies), and the arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was alanine.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H1) encoding a modified amadoriase substituted with the above was obtained.
  • Table 1 shows the oxidation activity for ⁇ FV, ⁇ FVH and ⁇ F6P, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / ⁇ FV when ⁇ FVH oxidation activity is defined as 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7 showed ⁇ FV oxidation activity and ⁇ FVH oxidation activity but not ⁇ F6P oxidation activity. As a result, it was found that CFP-T7 has extremely high specificity for ⁇ -fructosyl dipeptide and does not act on ⁇ -fructosyl hexapeptide.
  • CFP-T7-H1 which is a mutant of the present invention, exhibited ⁇ F6P oxidation activity in addition to ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity.
  • a recombinant plasmid (pKK223) encoding a modified amadoriase in which arginine at position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine and glutamine at position 110 was replaced with leucine, phenylalanine or tyrosine.
  • pKK223 a recombinant plasmid encoding a modified amadoriase in which arginine at position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine and glutamine at position 110 was replaced with leucine, phenylalanine or tyrosine.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H2, pKK223-3-CFP-T7-H3, or pKK223-3-CFP-T7-H4 is cultured by the method described in (3) above.
  • 0.6 ml of a crude enzyme solution containing various modified amadoriases (CFP-T7-H2, CFP-T7-H3, CFP-T7-H4) was prepared.
  • CFP-T7-H2 and CFP-T7-H4 further increased the reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P compared to CFP-T7-H1.
  • CFP-T7-H2-62N and CFP-T7-H6 have higher ⁇ F6P oxidation activity than CFP-T7-H2.
  • Oxidizing activity against ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P was measured by the method shown in the activity measurement method.
  • Table 4 shows the oxidation activity for each substrate, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / FV when ⁇ FVH oxidation activity is defined as 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7-H6 has significantly improved ⁇ F6P oxidation activity and improved reactivity to ⁇ F6P (substrate specificity) compared to CFP-T7-H2.
  • a recombinant plasmid encoding amadoriase (pKK223-3-CFP-T7-H7, pKK223-3-CFP-T7-H8, pKK223-3-CFP-T7-H9), and an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • pKK223-3-CFP-T7-H7 or pKK223-3-CFP-T7-H8, or pKK223-3-CFP-T7-H9, or pKK223-3-CFP-T7-H10, or pKK223-3-CFP- E. coli JM109 strain transduced with T7-H11, or pKK223-3-CFP-T7-H12, or pKK223-3-CFP-T7-H13, or pKK223-3-CFP-T7-H14 is described in (3) above.
  • the modified amadoriase (CFP-T7-H7, CFP-T7-H8, CFP-T7-H9, CFP-T7-H10, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7) 0.6 ml of a crude enzyme solution containing -H13, CFP-T7-H14) was prepared.
  • CFP-T7-H10, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13, and CFP-T7-H14 all have a significantly improved ⁇ F6P oxidation activity ratio than CFP-T7-H6. Some things have improved dramatically.
  • Oxidizing activity against ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P was measured by the method shown in the activity measurement method.
  • the oxidation activity with respect to each substrate, ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / FV when ⁇ FVH oxidation activity is taken as 100 are shown in Table 6.
  • CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13, and CFP-T7-H14 are more reactive to ⁇ F6P than CFP-T7-H6 (substrate specificity) It has become clear that there is a significant improvement.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid, the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine, the glutamine at position 110 is replaced with leucine, and the alanine at position 113 is also lysine, or Recombinant plasmids (pKK223-3-CFP-T7-H20, pKK223-3-CFP-T7-H21) encoding modified amadoriase substituted with arginine were obtained.
  • Escherichia coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H20 or pKK223-3-CFP-T7-H21 is cultured by the method described in (3) above, and various modified amadoriases (CFP-T7-H20) are cultured. 0.6 ml of a crude enzyme solution containing CFP-T7-H21) was prepared.
  • Oxidizing activity against ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P was measured by the method shown in the activity measurement method.
  • Table 7 shows the oxidation activity for each substrate, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / FV when ⁇ FVH oxidation activity is set to 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7-H20 and CFP-T7-H21 have improved reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P than CFP-T7-H11.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid, aspartic acid at position 106 is replaced with lysine, glutamine at position 110 is replaced with leucine, and alanine at position 113 is replaced with lysine, Furthermore, recombinant plasmids (pKK223-3-CFP-T7-H24, pKK223-3-CFP-T7-) encoding a modified amadoriase in which leucine at position 63 is substituted with alanine, aspartic acid, histidine, or lysine. H25, pKK223-3-CFP-T7-H26, pKK223-3-CFP-T7-H27).
  • E. coli strain JM109 transduced with pKK223-3-CFP-T7-H24, or pKK223-3-CFP-T7-H25, or pKK223-3-CFP-T7-H26, or pKK223-3-CFP-T7-H27 Then, 0.6 ml of a crude enzyme solution containing various modified amadoriases (CFP-T7-H24, CFP-T7-H25, CFP-T7-H26, CFP-T7-H27) cultured by the method described in (3) above. Prepared.
  • Oxidizing activity against ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P was measured by the method shown in the activity measurement method.
  • Table 9 shows the oxidation activity for each substrate, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / ⁇ FV when ⁇ FVH oxidation activity is set to 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7-H24 and CFP-T7-H26 have improved reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P than CFP-T7-H20.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 30 to 33 and KOD-Plus- were used for PCR reaction under the same conditions as in (2) above. Transformation of E. coli JM109 and determination of the DNA sequence encoding amadoriase in the plasmid DNA retained by the growing colonies were performed.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • leucine at position 63 is histidine
  • aspartic acid at position 106 is lysine
  • glutamine at position 110 is leucine
  • 113 A recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H28) encoding a modified amadoriase in which the alanine at position is substituted with lysine and the glutamic acid at position 102 is substituted with lysine
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 Arginine at position 62 is replaced with aspartic acid
  • leucine at position 63 is replaced with histidine
  • aspartic acid at position 106 is replaced with lysine
  • glutamine at position 110 is replaced with leucine
  • alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H26, pKK223-3-CFP-T7-H28, or pKK223-3-CFP-T7-H29 is cultured by the method described in (3) above.
  • 0.6 ml of a crude enzyme solution containing various modified amadoriases (CFP-T7-H26, CFP-T7-H28, CFP-T7-H29) was prepared.
  • Oxidizing activity against ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P was measured by the method shown in the activity measurement method.
  • Table 11 shows the oxidation activity for each substrate, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / ⁇ FV when ⁇ FVH oxidation activity is set to 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7-H28 and CFP-T7-H29 have higher reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P than CFP-T7-H26.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • leucine at position 63 is histidine
  • glutamic acid at position 102 is lysine
  • aspartic acid at position 106 is lysine
  • 110 A recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H35) encoding a modified amadoriase in which the glutamine at the position is replaced by leucine, the alanine at the 113th position is replaced by lysine, and the alanine at the 355th position is replaced by serine Got.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H35 was cultured by the method described in (3) above to prepare 0.6 ml of a crude enzyme solution containing CFP-T7-H35, which is a modified amadoriase. .
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 4 and 10 and KOD-Plus- were used for PCR reaction under the same conditions as in (2) above, E. coli JM109 And the nucleotide sequence of the DNA encoding amadoriase in the plasmid DNA retained by the growing colony was determined.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-62D) encoding a modified amadoriase in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-62D was prepared.
  • E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7), E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-62D), E. coli producing the wild-type amadoriase derived from the genus Coniochaeta, and the modified amadoriase obtained as described above JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H20), E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H21), and E.
  • coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H35) were added at a final concentration of 0.1 mM. Inoculated into 120 ml of LB-amp medium supplemented with IPTG, and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. After separation, 24 ml of a crude enzyme solution was prepared.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed to 12 ml of Butyl Toyopearl 650C resin (manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.35 M (NH 4) 2 SO 4, and then 120 ml of the same.
  • the resin was washed with a buffer solution, and then the amadoriase adsorbed on the resin was eluted and collected with 84 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.05 M (NH 4) 2 SO 4.
  • the obtained crude enzyme solution containing amadoriase was transferred to a dialysis tube (Spectra / Por MWCO: 12,000-14,000) and dialyzed in 10 volumes of 5 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) three times.
  • (NH4) 2SO4 was completely removed from the crude enzyme solution containing amadoriase.
  • a crude enzyme solution containing amadoriase was applied to HiScreen Capto Q ImpRes (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) to bind the amadoriase to the anion exchange resin. .
  • SEQ ID NO: 36 is an amino acid sequence of Aspergillus oryzae RIB40-derived fructosyl amino acid oxidase (hereinafter referred to as FAOAo2).
  • a recombinant plasmid (hereinafter referred to as pUC19-) into which a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 (SEQ ID NO: 37) has been inserted.
  • FAOAo2 is produced by expressing E. coli DH5 ⁇ (referred to as FAOAo2), and it has been shown that FAOAo2 acts on fructosyl hexapeptide (see WO 2008/108385).
  • E. coli DH5 ⁇ (pUC19-FAOAo2) having the ability to produce FAOAo2 was inoculated into an LB-amp medium supplemented with IPTG to a final concentration of 0.1 mM, and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution is adsorbed on Q Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and then 10 mM Tris-HCl buffer (containing 50 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 8.5), and FAOAo2 adsorbed on the resin was then eluted and recovered with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 100 mM NaCl.
  • the obtained FAOAo2 crude enzyme solution was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl, and FAOAo2 was eluted with the same buffer solution. The fractions indicating were collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and was used as a purified FAOAo2 preparation.
  • SEQ ID NO: 38 is the amino acid sequence of Phaeosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase (hereinafter referred to as PnFX) (see Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010).
  • PnFX Phaeosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 was obtained by total synthesis of cDNA by total synthesis of the gene fragment, which is a conventional method, by PCR.
  • the gene synthesized above is treated with two types of restriction enzymes, NdeI site and BamHI (Takara Bio), and inserted into the NdeI-BamHI site of pET-22b (+) Vector (Novagen). Then, the recombinant plasmid pET22b-PnFX was obtained, and the E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as above to obtain the E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX) strain.
  • the prepared crude enzyme solution of PnFX was purified according to the method described in the above-mentioned non-patent literature (Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010). That is, the crude enzyme solution was fractionated with ammonium sulfate, dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), purified by anion exchange chromatography (in this example, using Q Sepharose Fast Flow), and gel Purification was performed by filtration chromatography (HiLoad 26/600 Suprdex 200 was used in this example). The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it had been purified to a purity free from other contaminating proteins, and was used as a purified PnFX preparation.
  • CFP-T7 did not show any reaction to ⁇ F6P as expected.
  • specific activities of CFP-T7-62D, CFP-T7-H20, CFP-T7-H21, and CFP-T7-H35 with respect to ⁇ F6P are 0.018 U / mg, 0.850 U / mg, and 0.795 U / mg, respectively.
  • the measurement method was 4.27 U / mg, and sufficiently high reactivity with ⁇ F6P was also shown in the measurement method that excluded the influence of protease / peptidase derived from the host E. coli.
  • the mutant of the present invention it was confirmed that not only the reactivity to ⁇ F6P but also the reactivity to ⁇ FV was increased as compared with that before amino acid substitution. It is expected that the ⁇ -glycated hexapeptide derived from the glycated N-terminus of the ⁇ chain will be excised from HbA1c by pretreatment and measured, and this will not be hindered. This is because, as described above, in the step of cleaving the ⁇ -glycated hexapeptide derived from the glycated N-terminus of the ⁇ chain by pretreatment from HbA1c, the other short-chain ⁇ -glycated peptide is hardly cleaved. This is because pretreatment enzymes with high cleavage specificity such as those described above are known, and when these are used for pretreatment, almost all of the ⁇ -glycated peptide to be cleaved becomes ⁇ F6P.
  • CFP-T7-H35 showed activity against ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P used for activity measurement.
  • CFP-T7-H35 has a higher specific activity for ⁇ F6P than that for ⁇ FVH, confirming its high substrate specificity.
  • SEQ ID NO: 40 is the amino acid sequence of fructosyl peptide oxidase derived from Eupenicillium terrenum (hereinafter referred to as EFP-T5), and the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 (sequence) No. 41) can be produced by Escherichia coli carrying the recombinant plasmid pUTE100K′-EFP-T5, and EFP-T5 has been confirmed to exhibit ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity (International Publication No. 2007/125779). And International Publication No. 2008/018094).
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D) encoding the EFP-T5 gene in which the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 was converted to aspartic acid using pUTE100K′-EFP-T5-62D as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 44 and 45.
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K) encoding the EFP-T5 gene in which asparagine at position 106 was replaced with lysine was obtained.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 is A recombinant plasmid (pUTE100K'-EFP-T5-62D / 106K / 110L) encoding the EFP-T5 gene in which aspartic acid was substituted with asparagine at position 106 with lysine and lysine at position 110 with leucine was obtained. .
  • pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 48 and 49 were used.
  • the pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L / 113K was used as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 50 and 51 were used.
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L / 113K / 355S) was obtained.
  • the pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L / 113K / 355S was used as a template, and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 52 and 53 were used.
  • Arginine at position 62 is replaced with aspartic acid
  • leucine at position 63 is replaced with histidine
  • asparagine at position 106 is replaced with lysine
  • lysine at position 110 is replaced with leucine
  • threonine at position 113 is replaced with lysine
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 355S) encoding the EFP-T5 gene was obtained.
  • ketoamine oxidase gene derived from Neocosmospora vasinfecta is the amino acid sequence of ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta (hereinafter referred to as NvFX), and the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 (SEQ ID NO: 55) It has been confirmed that NvFX exhibits ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity (see International Publication No. 2012/018094).
  • the recombinant plasmid pET22b-NvFX was used as a template, and synthetic oligonucleotides SEQ ID NOs: 56 and 57, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were used.
  • synthetic oligonucleotides SEQ ID NOs: 56 and 57, KOD-Plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • a recombinant plasmid (pET22b-NvFX-62D) encoding the NvFX gene in which the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 was converted to aspartic acid.
  • a recombinant plasmid (pET22b-NvFX-62D / 106K) encoding the NvFX gene in which the glycine at the position was replaced with lysine was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 is converted to aspartic acid
  • a recombinant plasmid (pET22b-NvFX-62D / 106K / 110L) encoding the NvFX gene in which arginine at position 106 was replaced with lysine and glutamic acid at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX-62D / 106K / 110L) strain.
  • SEQ ID NO: 62 is a fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans obtained by substituting serine at position 59 with glycine in order to confer fructosyl peptide oxidase activity (hereinafter referred to as AnFX)
  • AnFX The recombinant plasmid pET22b-AnFX containing the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 (SEQ ID NO: 63) can be produced by Escherichia coli, and AnFX exhibits ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activities It has been confirmed (see International Publication No. 2012/018094).
  • the recombinant plasmid pET22b-AnFX was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 64 and 65, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were used.
  • synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 64 and 65, KOD-Plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • arginine at position 61 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 was converted to aspartic acid using pET22b-AnFX-61D / 105K as a template and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 68 and 69.
  • a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L) encoding the AnFX gene in which glycine at position 105 was replaced with lysine and lysine at position 109 was replaced with leucine was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L) strain.
  • pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L was used as a template, and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 112 and 70 were used to convert arginine at position 61 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 into asparagine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L / 112K) encoding an AnFX gene in which glycine at position 105 is replaced by lysine, lysine at position 109 is replaced by leucine, and serine at position 112 is replaced by lysine. )
  • pET22b A recombinant plasmid encoding an AnFX gene in which glycine at position 105 is replaced by lysine, lysine at position 109 is replaced by leucine, serine at position 112 is replaced by lysine, and alanine at position 355 is replaced by serine.
  • pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L / 112K / 355S was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 73 and 74 were used, and position 61 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 62 was used. Arginine was replaced with aspartic acid, leucine at position 62 was replaced with histidine, glycine at position 105 was replaced with lysine, lysine at position 109 was replaced with leucine, serine at position 112 was replaced with lysine, and alanine at position 355 was replaced with serine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 62H / 105K / 109L / 112K / 355S) encoding the gene was obtained.
  • Arginine at position 61 is aspartic acid, leucine at position 62 is histidine, glutamic acid at position 101 is lysine, glycine at position 105 is lysine, lysine at position 109 is leucine, serine at position 112 is lysine, 355 A recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 62H / 101K / 105K / 109L / 112K / 355S) encoding the substituted AnFX gene in which the alanine at the position was replaced with serine was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX-61D / 62H / 101K / 105K / 109L / 112K / 355S) strain.
  • serine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 is converted to aspartic acid using pET22b-PnFX-62D / 106K as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 81 and 82.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L) encoding the PnFX gene in which aspartic acid at position 106 was replaced with lysine and glycine at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • serine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 is aspartic acid using pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 83 and 84.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K) encoding a PnFX gene in which aspartic acid at position 106 is replaced with lysine, glycine at position 110 is replaced with leucine, and alanine at position 113 is replaced with lysine. )
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K) strain.
  • serine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 is obtained using pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 85 and 86.
  • -PnFX-62D / 106K / 110L / 113K / 351S ).
  • pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K / 351S was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 87 and 88 were used, and position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 was used.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PnFX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 351S) encoding the gene was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 351S) strain.
  • SEQ ID NO: 89 is the amino acid sequence of fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans (hereinafter referred to as CnFX), and the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89 (SEQ ID NO: 90) can be produced by Escherichia coli carrying the recombinant plasmid pET22b-CnFX, and CnFX has been confirmed to exhibit ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity (see International Publication No. 2012/018094).
  • the recombinant plasmid pET22b-CnFX prepared as described above was used as a template, and synthetic oligonucleotides SEQ ID NOS: 91 and 92, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)
  • SEQ ID NOS: 91 and 92 synthetic oligonucleotides
  • KOD-Plus- KOD-Plus-
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-62D) encoding a CnFX gene in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 89 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 89 was converted to aspartic acid using pET22b-CnFX-62D / 106K as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 95 and 96.
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L) encoding a CnFX gene in which serine at position 106 was replaced with lysine and serine at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 89 is asparagine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) encoding a CnFX gene in which serine at position 106 is replaced with lysine, serine at position 110 with leucine, and alanine at position 113 with lysine. )
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) strain.
  • SEQ ID NO: 99 is an amadoriase having an amino acid sequence showing 95% sequence identity with Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase (hereinafter referred to as Cc95FX).
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 was obtained by total synthesis of cDNA by total synthesis by PCR of gene fragments, which is a conventional method. At this time, an NdeI site and a BamHI site were added to the 5 ′ end and 3 ′ end of SEQ ID NO: 100, respectively.
  • the gene synthesized above is treated with two types of restriction enzymes, NdeI site and BamHI (Takara Bio), and inserted into the NdeI-BamHI site of pET-22b (+) Vector (Novagen). Then, the recombinant plasmid pET22b-Cc95FX was obtained, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed under the same conditions as described above to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-Cc95FX).
  • pET22b-Cc95FX-62D / 106K was used as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 105 and 106 were used to convert arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 99 into aspartic acid.
  • a recombinant plasmid (pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L) encoding the Cc95FX gene in which aspartic acid at position 106 was replaced with lysine and alanine at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 was converted to asparagine using pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 107 and 108.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 using pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L / 113K as a template and using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 109 and 110 Is a recombinant plasmid encoding a Cc95FX gene in which aspartic acid is substituted with aspartic acid at position 106 with lysine, alanine at position 110 with leucine, alanine at position 113 with lysine, and alanine at position 353 with serine.
  • pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L / 113K / 353S was obtained.
  • pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L / 113K / 353S was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 111 and 102 were used, and position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 was used.
  • Arginine was replaced with aspartic acid
  • leucine at position 63 was replaced with histidine
  • aspartic acid at position 106 was replaced with lysine
  • alanine at position 110 was replaced with leucine
  • alanine at position 113 was replaced with lysine
  • alanine at position 353 was replaced with serine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-Cc95FX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 353S) encoding the Cc95FX gene was obtained.
  • the E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain an E. coli BL21 (DE3) (pET22b-Cc95FX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 353S) strain.
  • E. coli JM109 (pUTE100K′-EFP-T5), E. coli JM109 (pUTE100K′-EFP-T5-62D), E. coli JM109 producing wild-type EFP-T5 and modified EFP-T5 obtained as described above (PUTE100K'-EFP-T5-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 355S) was inoculated into LB-amp medium supplemented with IPTG to a final concentration of 0.1 mM, and cultured at 25 ° C.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • ammonium sulfate was added to a 35% saturation concentration and stirred, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes to collect the supernatant. Subsequently, ammonium sulfate was additionally added to the obtained supernatant to a 70% saturation concentration and stirred, centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was discarded, and the precipitate was 10 mM phosphoric acid. It was dissolved in potassium buffer (pH 7.0).
  • the obtained crude enzyme solution of wild type or modified EFP-T5 was dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), and then equilibrated with the same buffer, 4 ml of Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare). The protein not adsorbed on the resin was eluted with the same buffer. Subsequently, the obtained wild-type or modified EFP-T5M crude enzyme solution was dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then equilibrated with the same buffer, HiLoad 26/10 Q Sepharose HP column.
  • the obtained crude enzyme solution containing wild-type or modified EFP-T5 was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. Wild-type or modified EFP-T5 was eluted with a buffer, and a fraction showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadriase activity) was collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and used as a purified sample of wild-type or modified EFP-T5.
  • E. coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX) and E. coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX-62D / 106K / 110L) producing the wild-type NvFX and the modified NvFX obtained as described above were terminated.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), suspended in the same buffer, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed on Q Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then 10 mM potassium phosphate buffer (containing 20 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 8.0), and then the wild-type or modified NvFX adsorbed on the resin was eluted and collected with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 300 mM NaCl.
  • the obtained crude enzyme solution containing wild-type NvFX or modified NvFX was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. Wild-type NvFX or modified NvFX was eluted with the solution, and a fraction showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadoriase activity) was collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and used as a purified sample of wild type or modified NvFX.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed to SP Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and then 10 mM potassium phosphate buffer (containing 20 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 6.0), and then the modified AnFX adsorbed on the resin was eluted and collected with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 100 mM NaCl.
  • the obtained crude enzyme solution containing modified AnFX was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl, and modified AnFX with the same buffer solution. And fractions showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadoriase activity) were collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and was used as a purified sample of modified AnFX.
  • E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K) and E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 63H / 106K / 110L) producing the modified AnFX obtained as described above / 113K / 351S) was purified according to the purification method of wild type PnFX described above.
  • E. coli BL21 (DE3) (pET22b-CnFX) and E. coli BL21 (DE3) (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) that produce wild-type CnFX and modified CnFX obtained as described above were used.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), suspended in the same buffer, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed on Q Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then 10 mM potassium phosphate buffer (containing 20 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 8.0), and then the wild-type or modified CnFX adsorbed on the resin was eluted and recovered with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 300 mM NaCl.
  • the obtained crude enzyme solution containing wild-type CnFX or modified CnFX was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. Wild-type CnFX or modified CnFX was eluted with the solution, and a fraction showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadoriase activity) was collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and used as a purified sample of wild type or modified CnFX.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the specific activity when ⁇ F6P was used as a substrate was measured using the obtained wild-type enzymes of various amadoriases and purified preparations of modified enzymes. The results are shown in Table 15.
  • the protein concentration used to calculate the specific activity was measured by an ultraviolet absorption method using absorbance at 280 nm (see Protein Sci. IV 4, 2411-23, 1995).
  • the Coniochaeta-derived amadoriase (CFP-T7; Comparative Example 1) obtained in the present invention has an amino acid substitution that imparts or enhances the reactivity to ⁇ F6P, and the Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase obtained in the present invention and 95% sequence.
  • Cc95FX amadoriase
  • Comparative Example 8 shows identity, as expected, Cc95FX is newly given reactivity to ⁇ F6P, and Cc95FX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 355S has ⁇ F6P oxidation.
  • the activity exceeded the ⁇ FVH oxidation activity.
  • the effect of amino acid substitution that imparts or enhances the reactivity to ⁇ F6P to Coniochaeta-derived amadoriase found in the present invention is not limited only to Coniochaeta-derived amadoriase. It was shown that Amadoriase showing 74% or more sequence identity with Coniochaeta-derived Amadoriase as shown shows universally similar effects.
  • Sample 1 ⁇ F6P solution (final concentration 0.5-10 ⁇ M) 0 ⁇ M, 4.0 ⁇ M, 8.0 ⁇ M, 12 ⁇ M, 16 ⁇ M, 24 ⁇ M, 32 ⁇ M, 40 ⁇ M, 48 ⁇ M, 80 ⁇ M ⁇ F6P
  • Reagent 4 Leuco dye solution 24 mM HEPES-NaOH buffer pH 7.8 0.24 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Reagent 5 Peroxidase, F6P oxidase solution 400 mM MES-NaOH buffer pH 6.0 20 U / ml peroxidase (Kikkoman) 4.0 U / ml (0.94 mg / ml) CFP-T7-H35 (Invention 25)
  • Reagent 6 Peroxidase
  • HbA1c 6.5% which is a boundary value of diabetes.
  • An NGSP value of 6.5% corresponds to an IFCC value of 47 mmol / mol.
  • the blood hemoglobin concentration is 13 g / dl and the NGSP value is 6.5%
  • the blood concentration of hemoglobin ⁇ -chain having a glycated amino terminus is about 190 ⁇ M. It is. That is, unless ⁇ F6P can be quantified in a concentration range of at least 190 ⁇ M or less, it is difficult to apply to diabetes diagnosis, and it cannot be said that the problems in industrial use can be overcome.
  • HbA1c Quantification of HbA1c
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and HbA1c was measured as follows using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • Sample 2 HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM 423-8 (manufactured by Laboratory Medicine Reference Material Organization) Total hemoglobin concentration 133 g / l, HbA1c concentration 3 level (NGSP value 5.56, 7.74, 10.48%)
  • Reagent 7 Sample pretreatment solution 0.012% 1-dodecylpyridinium chloride (DPC, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
  • Reagent 8 Leuco dye, Glu-C protease solution 24 mM HEPES-NaOH buffer pH 7.8 0.24 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 8.0 U / ml V-8 protease (Endoproteinase Glu-C, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Reagent 9 Peroxidase
  • FIG. 6 is a graph in which the HbA1c concentration (NGSP value) final concentration of Sample 2 is plotted on the horizontal axis and the absorbance difference ⁇ A of 751 nm light before and after the quantitative reaction of hydrogen peroxide is plotted on the vertical axis.
  • NGSP value HbA1c concentration
  • Amadoriase SEQ ID NO: 123 Penicillium janthinellum (Pj) amino acid sequence SEQ ID NO: 124 Penicillium janthinellum (Pj ) Amadoriase nucleotide sequence SEQ ID NO: 125 Aspergillus fumigatus Amadoriase I amino acid sequence SEQ ID NO: 126 Amadoriase I nucleotide sequence SEQ ID NO: 127 Aspergillus oryzae FAOAo1 amino acid sequence SEQ ID NO: 128 FAOAo1 nucleotide sequence SEQ ID NO: 129 Aspergillus fumigatus Amadoriase II amino acid sequence SEQ ID NO: 130 Amadoriase II Base sequence SEQ ID NO: 131 Aspergillus terreus FAOD-A amino acid sequence SEQ ID NO: 132 FAOD-A base sequence SEQ ID NO: 133 CFP-T7-H20 (R62D, D106K, Q110L,
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 160 CFP-T7-H4 nucleotide sequence SEQ ID NO: 161 (Invention 5) CFP-T7-H2-62N R62N, Q110L) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 162 CFP-T7-H2-62N nucleotide sequence SEQ ID NO: 163 (Invention 6) CFP-T7-H6 (R62D, Q110L) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 176 CFP-T7-H21 nucleotide sequence SEQ ID NO: 177 (Invention 19) CFP-T7-H24 ( R62D, L63A, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 178 CFP-T7-H24 nucleotide sequence SEQ ID NO: 179 (Invention 21) CFP-T7-H26 (R62D, L63H, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp.
  • amino acid sequence SEQ ID NO: 180 CFP-T7-H26 nucleotide sequence SEQ ID NO: 181 (present invention 23) CFP-T7-H28 (R62D, L63H, E102K, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp.
  • amino acid sequence SEQ ID NO: 182 CFP- T7-H28 nucleotide sequence SEQ ID NO: 183 (Invention 24) CFP-T7-H29 (R62D, L63H, D106K, Q110L, A113K, A419 K) Coniochaeta sp.
  • SEQ ID NO: 187 (Invention 33) (PnFX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 351S) Phaeosphaeria nodorum amino acid sequence SEQ ID NO: 188 Base encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187 SEQ ID NO: 189 (Invention 34) (CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) Cryptococcus neoformans amino acid sequence SEQ ID NO: 190 Nucleotide sequence SEQ ID NO: 191 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 189 (Invention 35) (Cc95FX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 353S) Curvularia clavata amino acid sequence SEQ ID NO: 192 Base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 191 All publications, patents and patents cited herein It shall incorporate

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Abstract

　糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖アミノ末端に由来するα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対して高い反応性を有し、ＨｂＡ１ｃから切り出されるαＦ６Ｐを良好に定量することが可能となるアマドリアーゼを提供する。　コニオカエタ(Coniochaeta)属等由来のアマドリアーゼの６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位および４１９位よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換することにより得られる新規なアマドリアーゼ。　ＨｂＡ１ｃから切り出されるαＦ６Ｐを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できる。このようなアマドリアーゼを用いれば、既存の実用基準法と同じ原理に基づき、実用基準法との相関性においてより優れた、酵素法によるＨｂＡ１ｃの測定方法、測定キットを提供できる。

Description

フルクトシルヘキサペプチドに作用する改変型アマドリアーゼ
　本発明は、フルクトシルヘキサペプチドに作用するアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡ、並びに基質特異性が改変されたアマドリアーゼの製造法に関する。
　糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のα－アミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のε－アミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
　これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ＨｂＡ１ｃは、へモグロビン「β鎖」のＮ末端（アミノ末端）のＶａｌ（バリン）の、α－アミノ基にグルコースが結合したタンパク質である。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃの値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
　このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。
　アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα－ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素の総称である。アマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを酵素的方法により測定するために有用な酵素として知られている。アマドリアーゼはこれまでに、細菌、酵母、真菌から見出されており、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６～１５、非特許文献１～９参照。）。これらの属のことを本明細書においてコニオカエタ(Coniochaeta)属等と呼ぶことがある。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
　上述のような各種のアマドリアーゼを用いて、ＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法としては、プロテアーゼ等の切り出し用酵素でＨｂＡ１ｃを分解し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端より特定の測定用物質を遊離させ、遊離した測定用物質を、上述のようなアマドリアーゼを用いて定量する方法が知られている（例えば、特許文献１～７参照。）。
　具体的には、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりα－フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法が知られており、この測定方法が、現在のＨｂＡ１ｃ酵素法測定法の主流となっている。
　また、上述のＨｂＡ１ｃを定量する方法として提案されていた別の方法としては、α－フルクトシルバリン（以降αＦＶと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦＶを定量する方法がある。しかし、この方法は、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す工程で、標的とするＨｂＡ１ｃのへモグロビン「β鎖」のＮ末端部位以外の様々な部位からも各種の夾雑物を切り出してしまうこと等により、正確な測定値が得られ難いという課題を有している。
　これらのＨｂＡ１ｃ測定法においては、より正確な測定値を得る目的で、測定しようとする特定の測定用物質に対する反応特異性ができるだけ高いアマドリアーゼを選抜・探索・創出することが重要であり、その努力が現在も継続されている。
　さらに、アマドリアーゼを用いる酵素的方法でＨｂＡ１ｃを測定するための、第３の方法としては、糖化されたβ鎖アミノ末端のバリンを含む６アミノ酸からなるα－フルクトシルヘキサペプチド（α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸、以降αＦ６Ｐと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦ６Ｐを定量する方法がある（例えば、特許文献１７、１８参照。）。
　従来、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）により定められたＨｂＡ１ｃ測定法は、ＨｂＡ１ｃβ鎖をＧｌｕ－Ｃプロテアーゼを用いて消化することにより、αＦ６Ｐを遊離させ、このαＦ６ＰをＨＰＬＣ－ＣＥ（ＨＰＬＣキャピラリー電気泳動法）またはＨＰＬＣ－ＭＳ（ＨＰＬＣ－質量分析法）を用いて測定することによりＨｂＡ１ｃ値を求める方法である（非特許文献１０参照）。
　この方法は、検出時に特殊な装置や煩雑な操作を必要とするために、酵素的測定法の開発が求められることとなった経緯があるものの、ＩＦＣＣの定める上記の測定方法は、特異性に優れた実用基準法として、酵素的なＨｂＡ１ｃが普及する以前から現在でも広く認知され、対応する設備や技術を保有する検査機関においてはこの方法が用いられている実情もある。
　現在のＨｂＡ１ｃ酵素法測定法の主流であり、アマドリアーゼによってαＦＶＨを測定する方法と、ＨＰＬＣ－ＣＥまたはＨＰＬＣ－ＭＳを用いたＩＦＣＣのＨｂＡ１ｃ測定の実用基準法とを比較すると、前者は主としてα－フルクトシルジペプチド、すなわちαＦＶＨを測定対象としているのに対し、後者は主としてα－フルクトシルヘキサペプチド、すなわちαＦ６Ｐを測定対象としている。αＦ６Ｐを定量することでＨｂＡ１ｃを測定するという、実用基準法と同じ原理に基づく酵素的な測定法が実現すれば、実用基準法と酵素的測定法の相関性をより高めることができるという観点からも、産業利用上非常に有意義である。しかしながら、公知のほとんどのアマドリアーゼは、比較的短いα－フルクトシルペプチドにしか高い反応性を示さず、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端から遊離されるαＦ６Ｐに良好に作用し、迅速にその定量を可能にし得る実用的なアマドリアーゼ（以降、フルクトシルヘキサペプチドオキシダーゼ（Ｆ６Ｐオキシダーゼ））は、未だ見出されていないのが実情である。
　ＩＦＣＣの実用基準法においては、ＨｂＡ１ｃに切り出し酵素であるＧｌｕ－Ｃプロテアーゼを作用させ、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端よりαＦ６Ｐを切り出す（非特許文献１０参照）。αＦ６ＰにＧｌｕ－Ｃプロテアーゼを作用させても、α－フルクトシルアミノ酸やα－フルクトシルジペプチドはほとんど切り出されず（特許文献１６参照）、このことから、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ－Ｃプロテアーゼで切断した際に糖化されたβ鎖Ｎ末端部分から切り出される糖化ペプチドは、ほぼその全てがαＦ６Ｐの形でとどまり、それ以上短鎖のペプチドまで分解されることはほとんどないと考えられる。そして、公知のほとんどのアマドリアーゼは、比較的短いα－フルクトシルペプチドにしか高い反応性を示さず、αＦ６Ｐを定量することができない。
　これまでに開示されたαＦ６Ｐに作用し得るアマドリアーゼとしては、ショウガ科植物由来のアマドリアーゼ（特許文献１７参照）、Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ（特許文献１８参照）、Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（特許文献１５、１９参照）がある。
　ショウガ科植物由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼは、αＦ６Ｐに作用するアマドリアーゼとして最初に報告された（特許文献１７参照）。しかし、その粗酵素液を用いてαＦ６Ｐを検出するためには、約１６時間という長時間を要するため、実用的なＦ６Ｐオキシダーゼとは言い難い。また、この酵素は未精製で、植物起源であるため、遺伝子組換え微生物を利用した一般的な酵素の量産化プロセスに適用する際には技術的な各種課題を有することも予測され、実際、その後本酵素が精製されたり、量産され実用化されたという報告もない。
　別のアプローチとして、アスペルギルス属由来の複数のアマドリアーゼがαＦ６Ｐに作用し得ることが報告されている（特許文献１８参照）。しかしながら、粗酵素中のαＦ６Ｐ酸化活性を検出するために、４時間もの長時間の反応時間を必要とすることから、アスペルギルス属由来のこれらのＦ６Ｐオキシダーゼの生産性は極めて低いか、あるいはアマドリアーゼ１分子当たりの反応性、すなわち比活性が極めて低いことが推定される。生産性が低いことは、産業利用上好ましくなく、また、比活性が低いほど、αＦ６Ｐ測定用の組成物またはキットを調製する際に多量の酵素を使用する必要が生じてしまうという課題を有する。
　アスペルギルス属以外の例としては、Phaeosphaeria nodorum由来のアマドリアーゼがαＦ６Ｐに対する反応性を有することが見出されている（特許文献１５）。しかし、この酵素も実用面からは途上段階にあり、その比活性は０．００１３Ｕ／ｍｇと極めて低い。この値は、例えば、ＨｂＡ１ｃからαＦＶＨを遊離させて定量するという現在の酵素的測定法の主流である方法に用いられるアマドリアーゼとして普及しているConiochaeta属由来のアマドリアーゼのαＦＶＨに対する比活性（２３．８Ｕ／ｍｇ）と比較すれば（非特許文献１）、１８３００分の１より小さい。すなわち、Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼを用いてαＦ６Ｐを測定するためには、極めて多量の酵素を使用する必要があり、現実的とは言い難い。
国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１－９５５９８号公報 特公平０５－３３９９７号公報 特開平１１－１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２０１１－２２９５２６号公報 特開２００３－２３５５８５号公報 特開２００４－２７５０１３号公報 特開２００４－２７５０６３号公報 特開２０１０－３５４６９号公報 特開２０１０－５７４７４号公報 国際公開第２０１０／４１７１５号 国際公開第２０１０／４１４１９号 国際公開第２０１１／１５３２５号 特開２００５－１１０６５７号公報 国際公開第２００４／３８０３４号 国際公開第２００８／１０８３８５号 国際公開第２０１１／１５３２６号
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　３１１，　１０４－１１，　２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１０６，　３５８－６６，　２０１０ Ｊ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１０２，　２４１－３，　２００６ Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　７４，　８１３－９，　２００７ Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２４２，　４９９－５０５，　１９９６ Ｍａｒ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　６，　６２５－３２，　２００４ Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６６，　１２５６－６１，　２００２ Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６６，　２３２３－２９，　２００２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７，　２７－３２，　２００５ Ｊｅｐｐｓｓｏｎ　ＪＯ，　ｅｔ　ａｌ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ　ＩＦＣＣ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＨｂＡ１ｃ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｌｏｏｄ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌａｂ．　Ｍｅｄ．　４０，　７８－８９，２００２
　本発明が解決しようとする課題は、αＦ６Ｐに対する高い反応性を有し、ＨｂＡ１ｃから切り出されるαＦ６Ｐを良好に定量することが可能となるアマドリアーゼを提供することにある。
　本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
　また、本発明者らは、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基の置換に関する知見に基づき、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ、Cryptococcus属由来のアマドリアーゼ、Curvularia属由来のアマドリアーゼ、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼについてもConiochaeta属由来のアマドリアーゼ中の位置に対応する位置に同様のアミノ酸置換を導入することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
　また、本発明者らは、αＦ６Ｐに対する反応性を獲得したアマドリアーゼ変異体を用いる、αＦ６Ｐの定量的測定方法さらにはＨｂＡ１ｃの定量的測定法を確立し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下に関する。
[１]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[２]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]に記載のアマドリアーゼ。
[３]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]又は[２]に記載のアマドリアーゼ。
[４]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]～[３]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[５]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]～[４]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[６]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]～[５]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[７]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]～[６]のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
[８]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する[１]～[７]のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
[９]
　配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、配列番号６２、配列番号８９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、又は配列番号１２３に示すアミノ酸配列を有し、前記[１]～[８]のいずれかに規定したアミノ酸置換を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する、[１]～[８]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１０]
　前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、[１]～[９]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１１]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
　(i)　配列番号１５１、配列番号１５３又は配列番号１５５に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１５１、配列番号１５３又は配列番号１５５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１２]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
　(i)　配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１又は配列番号１６３に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位及び１１０位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１又は配列番号１６３のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１３]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
　(i)　配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１又は配列番号１７３に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、１１０位、及び、１０６位又は１１３位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１又は配列番号１７３のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１４]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５又は配列番号１８９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、１１０位、１０６位及び１１３位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５又は配列番号１８９のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１５]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　配列番号１７７又は配列番号１７９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０６位、１１０位及び１１３位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１７７又は配列番号１７９のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１６]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７又は配列番号１９１に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０６位、１１０位及び１１３位、並びに、１０２位又は３５５位又は４１９位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７又は配列番号１９１のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１７]
　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　配列番号１４１又は配列番号１８５に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位及び３５５位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は配列番号１８５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[１８]
　改変前のアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している、[１]～[１７]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１９]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（ｈ）よりなる群から選択されるアミノ酸の位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
（ａ）配列番号１の６２位のアルギニン
（ｂ）配列番号１の６３位のロイシン
（ｃ）配列番号１の１０２位のグルタミン酸
（ｄ）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）配列番号１の１１０位のグルタミン
（ｆ）配列番号１の１１３位のアラニン
（ｇ）配列番号１の３５５位のアラニン
（ｈ）配列番号１の４１９位のアラニン
[２０]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（h）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換され、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
（a）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、アスパラギン又はアラニンに置換されている。
（b）配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンに置換されている。
（c）配列番号１の１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
（d）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンに置換されている。
（e）配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンに置換されている。
（f）配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンに置換されている。
（g）配列番号１の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリン又に置換されている。
（h）配列番号１の４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
[２１]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（ｐ）から（ｕ）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
（ｐ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、かつ、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジン、アルギニンに置換されている。
（ｑ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、かつ、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジン、アルギニンに置換されている。
（ｒ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、ヒスチジンに置換されている。
（ｓ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、かつ、配列番号１の１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
（ｔ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、かつ、配列番号１の４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
（u）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号１の１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号１の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。
[２２]
　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号４０記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号４０記載のアミノ酸配列において以下（ｖ）に記載したアミノ酸残基の置換を有し、配列番号４０記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
（ｖ）配列番号４０記載の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号４０記載の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号４０記載の１０６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号４０記載の１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号４０記載の１１３位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号４０記載の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。
[２３]　[１]から[２２]のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
[２４]　[２３]記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
[２５]　[２４]記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
[２６]　以下の工程を含む、アマドリアーゼの製造方法、
（i）[２５]記載の宿主細胞を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び
（ii）培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程。
[２７]　[１]から[２２]のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、ＨｂＡ１ｃの測定に用いるためのキット。
[２８]　ＨｂＡ１ｃ由来のα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）を含む試料に[１]から[２２]のいずれかに記載のアマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに対する作用による生成物又は消費物を測定することを特徴とするαＦ６Ｐの測定方法。
[２９]　試料中のＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐを定量する、[２８]に記載の方法。
[３０]　以下の工程を含む、ＨｂＡ１ｃの測定方法、
(i)ＨｂＡ１ｃを含む試料をプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼで処理し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端よりαＦ６Ｐを遊離させる工程、及び
(ii)遊離したＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに[１]～[２２]のいずれかに記載のアマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程。
[３１]　試料中のＨｂＡ１ｃを定量する、[３０]に記載の方法。
　また、本発明は以下からなる群より選択されるアマドリアーゼを提供する。
(i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１１～１８位、２０～３２位、５０～５２位、５４～５８位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７７～２８６位、及び３７０～３８３位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
　該(ii)におけるアマドリアーゼは、アミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンであってもよく、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンであってもよく、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンであってもよく、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンであってもよく、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンであってもよくさらに配列番号１に示すアミノ酸配列における３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンであってもよく、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼであり得る。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-102771号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、ＨｂＡ１ｃから切り出されるαＦ６Ｐを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できるアマドリアーゼを提供できる。このようなアマドリアーゼを用いれば、既存の実用基準法と同じ原理に基づき、実用基準法との相関により優れたＨｂＡ１ｃの酵素法による測定方法、測定キットを提供できる。
各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する１番目の図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nvのほか、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。 図１－１のつづきである。 図１－２のつづきである。 図１－３のつづきである。 図１－４のつづきである。 各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する２番目の図である。Co、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjのほか、Co、Et、Py、Ar、Cc、及びNvをアライメントした。 図２－１のつづきである。 図２－２のつづきである。 図２－３のつづきである。 図２－４のつづきである。 １７種のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する図である。 図３－１のつづきである。 図３－２のつづきである。 図３－３のつづきである。 図３－４のつづきである。 １７種のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一アミノ酸及び類似アミノ酸を例示する図である。 図４－１のつづきである。 図４－２のつづきである。 図４－３のつづきである。 図４－４のつづきである。 本発明のCFP-T7変異体を用いたαＦ６Ｐの定量的測定を示す図である。 比較例の結果を示す図である。 本発明のCFP-T7変異体を用いたＨｂＡ１ｃの定量的測定を示す図である。 比較例の結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（糖化タンパク質）
　本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
（フルクトシルヘキサペプチド、フルクトシルペプチド）
　本発明におけるフルクトシルペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものが含まれる。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα－アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε－アミノ基などが挙げられるが、本発明におけるフルクトシルペプチドとは、より具体的には、α－糖化ペプチド（α－フルクトシルペプチド）である。α－フルクトシルペプチドは、Ｎ末端のα－アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、特定対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα－フルクトシルペプチドは、糖化されたＮ末端から切り出される糖化されたペプチドを指し、特に、ＨｂＡ１ｃを定量する目的からは、ヘモグロビンβ鎖の糖化されたＮ末端から切り出される糖化されたペプチドを指す。
　本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質は、α－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）である。ＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端から切り出されるαＦ６Ｐの場合、該当する物質は、具体的には、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸である。
（アマドリアーゼ）
　アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα－ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。本発明のアマドリアーゼは、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有することを特徴とする。
（アマドリアーゼ改変体）
　本発明は、配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、又は配列番号６２、又は配列番号８９、又は配列番号９９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製された、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。
　本発明はさらに、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３又は配列番号１４５又は配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を提供する。
　また、本発明の知見に基づき、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来する他の野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を取得することができる。
（Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼに基づく改変体）
　ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。
　上記のような変異体の例としては、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼが挙げられる。
　また、このような変異体の例として配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼを挙げることができる。ここで１又は数個のアミノ酸とは、全長が４００アミノ酸を超えるアミノ酸配列について言う場合は１～１５個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。また、１又は数個のアミノ酸とは、全長が２００～４００アミノ酸の配列について言う場合は、１～１０個、好ましくは１～７個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸以上、２００アミノ酸未満の配列について言う場合は、１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸未満の配列について言う場合は、１又は２個のアミノ酸をいう。
　また、このような変異体の例として、１５２、配列番号１５４、配列番号１５６（一重変異体）、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４（二重変異体）、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４（三重変異体）、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１７６、配列番号１９０（四重変異体）、配列番号１７８、配列番号１８０（五重変異体）、配列番号１４４、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２（六重変異体）、配列番号１４２又は配列番号１８６（七重変異体）に示す塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼを挙げることができる。ここでストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションはSambrookら, Molecular Cloning第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory press）やCurrent protocols in molecular biology（Frederick M. Ausubel ら, 編, 1987）等に記載されている。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、6～10×SSC(0.15～1.5M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃～約50℃でインキュベートし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃～約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。また別のストリンジェントな条件において、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
　なお、本発明の変異体は、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、若しくはアルスロバクター属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
　Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る。ここで、アマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換とは、１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸置換をいう。好ましくは１又は複数のアミノ酸置換は１、２、３、４、５、６、又は７つのアミノ酸置換である。　
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
上記Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）において、好ましくは、（ａ）６２位のアルギニンは、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンは、ヒスチジン又はアラニンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸は、リジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミンはロイシン又はチロシンへと置換される。好ましくは（ｆ）１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｇ）３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のアラニンはリジンへと置換されていてもよい。
　Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（PnFX、配列番号３８）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のセリン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグリシン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５１位のアラニン
（ｈ）４１６位のセリン
上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（配列番号３８）において、好ましくは（ａ）６２位のセリンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグリシンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５１位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１６位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
　Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（NvFX、配列番号５４）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のグリシン
（ｅ）１１０位のグルタミン酸
（ｆ）１１３位のリジン
（ｇ）３５５位のセリン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（配列番号５４）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミン酸はロイシンへと置換される。場合により１１３位のリジンは置換されなくともよい。場合により３５５位のセリンは置換されなくともよい。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（AnFX、配列番号６２）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のグリシン
（ｅ）１０９位のリジン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（配列番号６２）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは（ｄ）１０５位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１０９位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（配列番号４０）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のグリシン
上記EFP-T5由来アマドリアーゼ（配列番号４０）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。
　Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９又は１４９）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のイソロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のセリン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（CnFX、配列番号８９又は１４９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のイソロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のセリンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアラニン
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５６位のアラニン
（ｈ）４２１位のアラニン
上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５６位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２１位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（Cc95FX、配列番号９９）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のセリン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（配列番号９９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
　Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のリジン
（ｅ）１０９位のアルギニン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により（ｄ）１０５位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは１０９位のアルギニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
　Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）に基づく改変体は、以下の位置に置いて１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のアスパラギン酸
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のセリン
上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
　本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体からは、αＦ６Ｐに対する活性をほとんど又は全く示さない野生型のアマドリアーゼ、例えば配列番号１、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼは除くものとする。本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体というとき、特に断らない限り、こうしたαＦ６Ｐに対する活性をほとんど又は全く示さない野生型のアマドリアーゼは除かれる。
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
　これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
　このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３－２３５５８５号公報）が挙げられる。
　また、別の好ましい例として、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCryptococcus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCurvularia属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼ遺伝子が挙げられる。
　これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７（国際公開第２００７／１２５７７９号）から、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７を、抽出、精製して得ることができる。他の生物由来のアマドリアーゼ遺伝子についても、当業者であれば慣用法により、同様の手順でＤＮＡを取得することができる。具体的には、Eupenicillium terrenum ATCC 18547株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５（国際公開第２００７／１２５７７９号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を、細胞から抽出、精製して得ることができる。また、Aspergillus nidulans FGSC A26株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＡｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＡｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Cryptococcus neoformans由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Neocosmospora vasinfecta由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸを、抽出、精製して得ることができる。
（ベクター）
　本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（Stratagene社製）等が好ましい。
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
　アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２，　９４４１　（１９８４）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３５０　（１９８７）：　Ｇｅｎｅ，　３７，　７３　（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　８７４９　（１９８５）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　８７６５　（１９８５）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１４，　９６７９　（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８２，　４８８　（１９８５）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３６７　（１９８７））等が挙げられる。
　また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，　１，　１１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
　上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）等を用いることにより行うことができる。
（形質転換・形質導入）
　上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
　アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTALWのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
　また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
　本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位～３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位は相同性領域に該当しうる。
　好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位～３２位、３６～４１位、５０～５２位、５４～５８位、８４～８６位、８８～９０位、１４５～１５０位、１５７～１６８位、２０２～２０５位、２０７～２１２位、２１５～２２５位、２３６～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、３４７～３５４位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、及び４０５～４１０位のアミノ酸配列である。
　さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１～１８位、２０～３２位、５０～５２位、５４～５８位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７７～２８６位、及び３７０～３８３位のアミノ酸配列である。
　本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
（アミノ酸に対応する位置の特定）
　本発明において、あるベースとなるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置、又は相当する位置という。また、「アミノ酸の位置に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行う方法が挙げられる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
　なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では６１位のアルギニンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６２位のロイシンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０２位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０２位のリジン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０１位のグルタミン酸である。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０５位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０５位のグリシンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では、１０９位のリジンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１３位のアスパラギン酸である。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では３５１位のアラニンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１９位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では４２０位のアラニンである。
（置換の相乗効果について）
　本発明のアマドリアーゼ変異体は、一重変異体であってもよいが、２以上のアミノ酸置換を有する多重変異体、例えば二重～八重変異体であってもよい。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する活性が増大することを見出した。特に一重、二重、三重、四重、五重、六重及び七重と変異を追加するにつれ変異体のαＦ６Ｐに対する活性が大きく増大することを見出した。実施例に示すアマドリアーゼ変異体のαＦ６Ｐに対する活性の増大からみて、これらのアミノ酸置換が相乗効果を有することは明らかである。また、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置のアミノ酸置換の種々の組合せが同様にαＦ６Ｐに対する活性の増大をもたらす、と当業者であれば理解する。
（予備的な置換について）
　アマドリアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαＦＶＨ活性を示さなかった酵素が、置換後にαＦＶＨ活性を示すようになることが報告されている（特開２０１０－３５４６９号公報、国際公開第２０１２／０１８０９４号参照）。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号１の６０位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号１の第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号１の６０位に対応する配列番号１４７中の第５９位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの（配列番号６２）を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ（配列番号１２３）についても同様である。
（本発明のアマドリアーゼの生産）
　上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
　すなわち、本発明は、基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明のアマドリアーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここでアマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件とは、アマドリアーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
　また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
　培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。培養は、２０～４２℃の培養温度、好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で８～１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
　培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
　上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のαＦ６Ｐに対する特異性が向上したアマドリアーゼを得ることができる。
（本発明のアマドリアーゼにおけるαＦ６Ｐに対する特異性の向上）
　上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してαＦ６Ｐに対する反応性が向上し、基質特異性が向上していることを特徴とする。本発明においてαＦ６Ｐに対する「基質特異性が向上している」とは、具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性」を１とした時の「αＦ６Ｐに対する反応性」の割合が増大していることを特徴とする。なお、「αＦＶＨに対する反応性」は「αＦＶＨ酸化活性」と表記することもある。
　ＩＦＣＣが定めたＨｂＡ１ｃ測定の実用基準法と同じ原理、すなわち、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ－Ｃプロテアーゼで処理することで生じるαＦ６Ｐを測定することを特徴とする酵素法による測定系を実現するには、αＦ６Ｐに対して作用しやすいアマドリアーゼを取得することが必要となる。
　具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上向上していることが好ましい。
　また、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を示すαＦ６Ｐ／αＦＶは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上向上していることが好ましい。なお、「αＦＶに対する反応性」は「αＦＶ酸化活性」と表記することもある。
　αＦＶＨに対する反応性に対するαＦ６Ｐに対する反応性の割合（αＦ６Ｐに対する反応性とαＦＶＨに対する反応性との比）は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ６．５において、１ｍＭのαＦ６Ｐを添加して測定した活性を、１ｍＭのαＦＶＨを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶＨに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。また、例えば、ｐＨ６．５において、１ｍＭのαＦ６Ｐを添加して測定した活性を、１ｍＭのαＦＶを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。
　改変前のものと比較してαＦ６Ｐに対する基質特異性が向上している本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このような基質特異性が改変されたアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ－Ｃプロテアーゼで処理することで生じるαＦ６Ｐを測定することを特徴とする、ＩＦＣＣが定めるＨｂＡ１ｃ測定の実用基準法と同じ原理に基づく酵素測定系の実現を可能にし、産業利用上非常に有利である。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
　アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
　本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
　本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りの無い限り、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、またはαＦ６Ｐを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、またはαＦ６Ｐを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
　また、比活性（U/mg）は、酵素1mg当たりの酵素力価（U）である。
　αＦＶＨ等のフルクトシルペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１－９５５９８号公報参照）。例えば糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃで処理することにより、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のβサブユニット由来のα－糖化ヘキサペプチド（フルクトシルＶａｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ）が遊離する（Clin.Chem.,43,1994-1951(1997))。これをαＦ６Ｐ基質として使用することができる。また、このα－糖化ヘキサペプチドと同一物質である、合成基質フルクトシルＶａｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ（ペプチド研究所製）を用いることもできる。
Ａ．：試薬の調製
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ　４－アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ　リン酸緩衝液　ｐＨ６．５
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４－アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（試薬２）：１５ｍＭ　ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（試薬３）：基質溶液（３０ｍＭ；　終濃度１ｍＭ）
αＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）　２５７．１ｍｇ、若しくはαＦＶＨ（キッコーマン社製）　１２４．９ｍｇ、若しくはαＦＶ（キッコーマン社製）　８３．８ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
Ｂ：活性測定法
　２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ－３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定した。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出した。
活性(U/ml)＝｛(ΔAs－ΔA0)×3.0×df｝÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数
（αＦ６Ｐを含む測定用試料の調製）
　本発明の測定法においては、糖化蛋白質由来のαＦ６Ｐを含む試料にαＦ６Ｐオキシダーゼを作用させ、その作用による生成物又は消費物を測定する。ＨｂＡ１ｃ等の糖化蛋白質の測定を目的として、測定対象の糖化蛋白質からαＦ６Ｐを切り出すための好適な方法としては、プロテアーゼやペプチダーゼを用いた消化が挙げられる。αＦ６Ｐを遊離させるためのプロテアーゼまたはペプチダーゼとしては、臨床検査に使用が可能で、ＨｂＡ１ｃから、少なくともαＦ６Ｐを有効に切り出し得るものであれば、いかなるプロテアーゼを用いても良い。そのようなプロテアーゼの例としては、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、Ｖ８プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＰ、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン、カルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、ディスパーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはペプチダーゼ等が挙げられ、特に好ましくは、糖化蛋白質に含まれるグルタミン酸残基のカルボキシル末端を特異的に開裂させるエンドプロテアーゼあるいはエンドペプチダーゼが挙げられ、その一例としてはエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、Ｖ８プロテアーゼが挙げられる。
　さらに、糖化蛋白質からαＦ６Ｐを切り出すためのプロテアーゼとしては、特開2005-110657の表１に記載の各種プロテアーゼ、例えばアスペルギルス由来のIP酵素（キッコーマン）、AOプロテアーゼ（キッコーマン）、ペプチダーゼ（キッコーマン）、プロテアーゼA5（協和化成）、ウマミザイム（天野）、プロテアーゼＡ（天野）、プロテアーゼＭ（天野）、プロテアーゼＰ（天野）、スミチームＭＰ（新日本化学工業）、スミチームLP-20（新日本化学工業）、プロテイナーゼ６（フルカ）；リゾパス由来のペプチダーゼR（天野）；バチルス由来のディスパーゼ（ロシュ）、プロテイナーゼＮ（フルカ）、プロテイナーゼTypeVII（シグマ）、プロテイナーゼBacterial Subtilisin（フルカ）、プロテアーゼＮ（天野）、プロテアーゼＳ（天野）、プロテイナーゼTypeX（シグマ）、サーモリシン（大和化成）、プロナーゼＥ（科研化学）、中性プロテアーゼ（東洋紡）；ストレプトマイセス由来のプロナーゼ（べーリンガー）、プロテイナーゼTypeXIV（シグマ）、アルカリプロテアーゼ（東洋紡）；トリチラチウム由来のプロテイナーゼＫ（ロシュ）、プロテイナーゼＫ（和光）；パパイヤ由来のパパイン（ロシュ）、パパイン（和光）、パパイン（シグマ）、パパインW40（天野）、パパイン（アサヒ）；イチジク由来のフィシン（シグマ）；ブタ膵臓由来のパンクレアチン（和光）；及びウシ脾臓由来のカテプシンＢ（シグマ）等が挙げられるが、これらに限られない。また適当なプロテアーゼを２以上組み合わせてもよい。
　試料のプロテアーゼ処理またはペプチダーゼ処理の条件は、用いるプロテアーゼが測定対象の糖化蛋白質に作用し、α－糖化ヘキサペプチドを短時間に効率よく遊離する条件であれば、いかなる条件でもよい。使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれるＨｂＡ１ｃの含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を、終濃度が０．１～５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは１～１０Ｕ／ｍＬとなるように加える。さらに必要により適宜他のプロテアーゼを加えてもよい。プロテアーゼで処理する際のｐＨは、無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、ｐＨ２～９、好ましくはｐＨ３～８に調整してもよい。処理温度は、例えば、２０～５０℃で行ってもよく、用いる酵素によっては、より高温域の４５～７０℃で行ってもよい。この際の処理時間は、ＨｂＡ１ｃを分解するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間～１８０分間、好ましくは１～６０分間、さらに好ましくは１～１０分間で行うことができる。得られる処理液を、そのまま、あるいは必要により適宜、加熱、遠心分離、濃縮、希釈等を行ったのち、αＦ６Ｐを含む試料として糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの反応に供する。
（遊離させたαＦ６Ｐの測定）
　上記のαＦ６Ｐを含む試料に、本発明の測定法に使用するαＦ６Ｐオキシダーゼを作用させる。αＦ６Ｐの切り出しとαＦ６Ｐオキシダーゼの作用の時期は連続的でも、同時でも、切り出しを終了してからαＦ６Ｐオキシダーゼを作用させてもよい。αＦ６Ｐに対するαＦ６Ｐオキシダーゼの作用時間は例えば、５秒以上、１０秒以上、又は２０秒以上、１８０分未満又は１５０分未満、例えば０．５～１２０分間、好ましくは０．５～６０分間、より好ましくは１～３０分間とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中の糖化ヘキサペプチドを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。αＦ６Ｐオキシダーゼ作用時間を０．５～６０分間、より好ましくは１～３０分間、さらに好ましくは１～１０分間とすることにより、迅速かつ良好にαＦ６Ｐを測定することができる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０～４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
　本発明に使用するαＦ６Ｐオキシダーゼの好適な使用量は、試料溶液中に含まれるαＦ６Ｐの量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１～５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．２～１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、αＦ６Ｐオキシダーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３～１１、特に好ましくはｐＨ５～９である。
　本発明の測定方法においては、酵素や試薬の安定化や反応性向上等の目的でｐＨを調節及び／又は維持するため、必要により適宜、各種の緩衝剤を使用することが好ましい。使用可能な緩衝剤としては、例えば、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤等として、界面活性剤（ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－マルトシド、１－ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ－１００、ブリッジ３５、ツイーン８０、コール酸塩等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ－システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
　本発明は、αＦ６Ｐオキシダーゼの作用による生成物又は消費物を測定することによりαＦ６Ｐを測定する方法であるが、測定が容易な生成物であり、測定対象として好ましいものとして過酸化水素が挙げられる。αＦ６Ｐオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素は、発色基質等によって検出してもよく、本発明に用いられる発色基質としては、４－アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン）、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３、７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン）、ＤＡ－６４（Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４、４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミン）等が挙げられる。過酸化水素の測定は、一般に、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことが好ましく、αＦ６Ｐオキシダーゼの作用時と同時に進行させることが好ましい。また、測定する消費物としては、溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
　本発明においては、上述のαＦ６Ｐオキシダーゼと過酸化水素の測定用試薬、それに所望により緩衝剤等を添加したαＦ６Ｐ測定用試薬を得ることができる。この試薬中には、各種既知の成分、例えば、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加することができる。上述の本発明のαＦ６Ｐ測定用試薬は、各試薬を異なる容器に含むものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供することもできる。また、これらの測定用試薬は、乾燥物又は溶解した状態で用いてもよく、薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含浸させて用いてもよい。また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用することもできる。本発明のαＦ６Ｐ測定用試薬は、糖化蛋白質からαＦ６Ｐを切り出すためのプロテアーゼを組み込んだ試薬キットの一部を構成することができる。
　本発明のαＦ６Ｐ測定用試薬の仕様や使用条件は、その含有成分等に応じて最適なものを選択すればよいが、例えば、測定を２０～４５℃において行うよう設定することができる。測定に要する時間も種々の測定条件により適宜選択できるが、例えば、０．５～６０分間、好ましくは、０．５～３０分間、さらに好ましくは１～１０分間が好ましい。例えば、上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化ペプチドあるいは糖化蛋白質を測定することができる。測定には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
（α－フルクトシルヘキサペプチドの定量）
　本発明のαＦ６Ｐ測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでαＦ６Ｐの定量的測定方法とは、試料中のαＦ６Ｐの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼ変異体を使用することを含む、試料中のα－フルクトシルヘキサペプチドの定量法を提供する。この定量法は、ＨｂＡ１ｃ由来のα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）を含む試料と本発明のアマドリアーゼを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここで該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがαＦ６Ｐの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼを試料と物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とαＦ６Ｐを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにαＦ６Ｐを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
　用いるアマドリアーゼ変異体の酵素量及び反応時間（作用時間）を一定とし、添加するαＦ６Ｐの量を変化させた場合に、αＦ６Ｐ添加量が減少するにつれて、検出される発光基質の吸光度も比例的に減少するαＦ６Ｐ濃度範囲を調べることで、当該アマドリアーゼを用いた場合の検出可能な最低αＦ６Ｐ濃度を決定することができる。この濃度を本明細書において検出限界濃度ということがある。本発明のＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐ定量法では、αＦ６Ｐの検出限界が、測定試料中のαＦ６Ｐ濃度又は血中糖化ヘモグロビン濃度よりも低くなるように酵素量及び反応時間を設定することが好ましい。一例として、糖化ヘモグロビンの血中濃度が約200μM程度の試料を定量的に測定したい場合、本発明のアマドリアーゼ変異体の検出限界が終濃度200μMよりも低くなるように、用いる酵素量及び反応時間を設定することが好ましい。
　本発明の定量的測定では、予め、濃度既知のαＦ６Ｐを含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、αＦ６Ｐ濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中のαＦ６Ｐ濃度を定量できる。
　本発明者らは、Coniochaeta由来アマドリアーゼ変異体、例えば本発明２５の変異体を用いて、良好に試料中のαＦ６Ｐを定量できることを示した。図５及び６を参照されたい。当業者であれば、こうした知見に基づき、αＦ６Ｐに対する良好な活性を示す他の本発明のアマドリアーゼ変異体も同様にαＦ６Ｐの定量的測定に用いることができる、と理解する。また、そのような定量的測定のための酵素量（酵素濃度）、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
　本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットには、上述のαＦ６Ｐ測定用試薬に加え、切り出し用プロテアーゼまたはペプチダーゼ、さらに、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを包含してもよい。ＨｂＡ1ｃを酵素法により測定することを目的とした、各種の試薬やキットに用いられている技術を、本発明のαＦ６Ｐを用いたＨｂＡ１ｃ測定用キットに適宜用いることができる。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡの調製
　Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
　この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを得た。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）を得た。
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
（４）αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶの測定
　上述のＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１を含む酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７は、αＦＶ酸化活性およびαＦＶＨ酸化活性は示したが、αＦ６Ｐ酸化活性は示さなかった。これにより、ＣＦＰ－Ｔ７はα－フルクトシルジペプチドに極めて特異性が高く、α－フルクトシルヘキサペプチドには作用しないことがわかった。
　一方、本発明の変異体であるＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１は、αＦＶ、αＦＶＨ酸化活性に加えて、αＦ６Ｐ酸化活性も示した。
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７に対しＲ６２Ａのアミノ酸置換を導入することにより、ＣＦＰ－Ｔ７に新たにαＦ６Ｐ酸化活性を付与することができ、Ｆ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。 
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１　ＤＮＡを鋳型として、配列番号５～８のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換され、かつ１１０位のグルタミンがロイシン、またはフェニルアラニン、若しくはチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４は、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１と比較して、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）がさらに増大していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２　ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、配列番号９～１２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、かつ６２位のアルギニンがアスパラギン、またはアスパラギン酸、またはグルタミン、若しくはグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｑ、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｅ）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｑ、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｅを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｑ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｅ）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性比率は表３の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、またはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表４の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２よりも大幅にαＦ６Ｐ酸化活性が向上し、αＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６　ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３～２４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに６４位のアルギニンがアラニン、またはグルタミン酸、若しくはヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ７、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ８、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ９）、および、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１０６位のアスパラギン酸がアラニン、またはリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２）、及び、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ７、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ８、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ９、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ７、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ８、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ９、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７ー－Ｈ６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表５の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６よりも全て大幅にαＦ６Ｐ酸化活性比率が向上し、一部のものでは飛躍的に向上した。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表６の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　すなわち、表６に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６よりもαＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が大幅に向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２１～２４のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表７の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１は、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５～２９のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに６３位のロイシンがアラニン、またはアスパラギン酸、またはヒスチジン、若しくはリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２５、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２７）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２５、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２７を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２５、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２７）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表８の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　すなわち、表８に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、またはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、若しくはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表９の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　すなわち、表９に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６　ＤＮＡを鋳型として、配列番号３０～３３のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに１０２位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８）、および配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに４１９位のアラニンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、又はｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１０の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　すなわち、表１０に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、又はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、若しくはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１１の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　すなわち、表１１に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、及びＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８　ＤＮＡを鋳型として、配列番号３４～３５のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに３５５位のアラニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して改変型アマドリアーゼであるＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１２の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　すなわち、表１２に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、１０のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ）を得た。続いて、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を作製した。
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Coniochaeta属由来改変型アマドリアーゼの生産および精製）
　Coniochaeta属由来の野生型アマドリアーゼ、および上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地１２０ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液２４ｍｌを調製した。 
　調製した粗酵素液を１．３５Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１２ｍｌのＢｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃ樹脂（東ソー社製）に吸着させ、次に１２０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて８４ｍｌの１．０５Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していたアマドリアーゼを溶出させ回収した。
　得られたアマドリアーゼを含む粗酵素液を透析チューブ（Spectra/Por MWCO: 12,000-14,000）に移し、１０倍量の５ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析する操作を三度繰り返し、アマドリアーゼを含む粗酵素液から（ＮＨ４）２ＳＯ４を完全に除去した。続いて、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ　Ｃａｐｔｏ　Ｑ　ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥヘルスケア社製）にアマドリアーゼを含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に含まれるＮａＣｌ濃度を０ｍＭから１６０ｍＭまで直線的に増加させることにより、樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られたアマドリアーゼ活性を示す画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析により、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＣＦＰ－Ｔ７、ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１、およびｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５の精製標品とした。
（Aspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
　配列番号３６はAspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＦＡＯＡｏ２と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３７）を挿入した組換え体プラスミド（以降ｐＵＣ１９－ＦＡＯＡｏ２と称する）を大腸菌ＤＨ５αで発現させることにより、ＦＡＯＡｏ２が生産され、ＦＡＯＡｏ２がフルクトシルヘキサペプチドに対して作用することが示されている（国際公開第２００８／１０８３８５号公報参照）。
上記ＦＡＯＡｏ２生産能を有する大腸菌ＤＨ５α（ｐＵＣ１９－ＦＡＯＡｏ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂に吸着していたＦＡＯＡｏ２を溶出させ回収した。
　得られたＦＡＯＡｏ２粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液でＦＡＯＡｏ２を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＦＡＯＡｏ２の精製標品とした。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産株の作製）
　配列番号３８はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＰｎＦＸと称する）のアミノ酸配列である（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８－３６６, ２０１０参照）。配列番号３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３９）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号３９の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＰｎＦＸの配列と一致していることを確認した。
　続いて、取得した配列番号３９の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）　Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ）株を得た。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
　上記のようにして得られたＰｎＦＸ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製したＰｎＦＸの粗酵素液を前述の非特許文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８－３６６, ２０１０）記載の方法に従い、精製した。すなわち、粗酵素液を硫酸アンモニウムにより分画し、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（本実施例ではＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗを用いた）により精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー（本実施例ではＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｅｐｒｄｅｘ　２００を用いた）により精製した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｎＦＸの精製標品とした。
　得られたＣＦＰ－Ｔ７、ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５、およびＦＡＯＡｏ２、およびＰｎＦＸの精製標品を用いて、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１３に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ． ４，　 ２４１１－２３，　１９９５参照）。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　精製したＣＦＰ－Ｔ７は、予想通り、αＦ６Ｐに対する反応を示さなかった。それに対し、ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５のαＦ６Ｐに対する比活性はそれぞれ０．０１８Ｕ／ｍｇ、０．８５０Ｕ/ｍｇ、０．７９５Ｕ/ｍｇ、４．２７Ｕ／ｍｇであり、宿主である大腸菌由来のプロテアーゼ／ペプチダーゼの影響を排除した測定方法においても、αＦ６Ｐに対する十分に高い反応性が示された。
また、既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼである、ＦＡＯＡｏ２（国際公開第２００８／１０８３８５号参照）、およびＰｎＦＸ（国際公開第２０１１／１５３２６号参照、該当文献中ではＰ．ｎ　ＦＰＯＸと記載されている）のαＦ６Ｐに対する比活性は、それぞれ０．００２２Ｕ／ｍｇ、０．００９１Ｕ／ｍｇであった。本発明で獲得したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの改変体はこれら既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼの２倍（本発明２６／比較例３）から１９４０倍（本発明２５／比較例２）もの比活性を示した。すなわち、本発明により、αＦ６Ｐに対して従来成し得なかった水準の反応性を示す、極めて実用性の高いアマドリアーゼを得ることができた。
　なお、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１が示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨの値は、粗酵素液を用いて測定した場合と、精製酵素を用いて測定した場合の間で、大きな乖離は確認できなかった。
　本発明の変異体においては、アミノ酸置換を行う前のものと比較して、αＦ６Ｐへの反応性のみならず、αＦＶへの反応性も増大していることが確認されたが、この点自体は、ＨｂＡ１ｃから前処理によりβ鎖の糖化Ｎ末端に由来するα－糖化ヘキサペプチドを切り出し、これを測定するという測定原理において何ら支障とならないことが見込まれる。なぜなら、前述の通り、ＨｂＡ１ｃから前処理によりβ鎖の糖化Ｎ末端に由来するα－糖化ヘキサペプチドを切り出す工程には、それ以外の短鎖のα－糖化ペプチドを切り出すことがほとんどないＧｌｕ－Ｃなどの切断特異性の高い前処理酵素が公知であり、これらを前処理に用いることにより、切り出されるα－糖化ペプチドのほぼ全てがαＦ６Ｐとなるからである。
（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５の基質特異性の評価）
　上記のようにして得られたＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５の精製標品を用いて、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１４に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ． ４，　 ２４１１－２３，　１９９５参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５は活性測定に使用したαＦＶ、αＦＶＨ、及びαＦ６Ｐに対して活性を示した。特にＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５はαＦＶＨに対する比活性よりもαＦ６Ｐに対する比活性が大きく、その基質特異性の高さが確認された。
（各種アマドリアーゼへの点変異導入）
　本発明の知見は、まずConiochaeta属由来のアマドリアーゼを用いて検証されたが、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様な効果を奏することが期待できるという示唆を与え得る。そこで、実際に本発明の知見を、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも導入して、この検証を行った。
１．Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号４０はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＥＦＰ－Ｔ５と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４１）を挿入した組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を保持する大腸菌により生産でき、ＥＦＰ－Ｔ５はαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２００７／１２５７７９号公報および国際公開第２００８／０１８０９４号公報参照）。
　ＥＦＰ－Ｔ５に基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を鋳型にして、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＥＦＰ－Ｔ５変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ）を得た。 
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄを鋳型とし、配列番号４４，４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号４８，４９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号５０，５１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号５２，５３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
２．Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号５４はNeocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＮｖＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号５４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５５）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＮｖＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
　ＮｖＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号５６、５７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＮｖＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸ－６２Ｄ）を得た。 
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号５８，５９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のグリシンがリジンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号６０，６１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアルギニンがリジンに、１１０位のグルタミン酸がロイシンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）株を得た。
３．Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号６２はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＡｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号６２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号６３）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＡｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
　ＡｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号６４、６５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＡｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄを鋳型とし、配列番号６６，６７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋを鋳型とし、配列番号６８，６９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）株を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌを鋳型とし、配列番号１１２，７０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋを鋳型とし、配列番号７１，７２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７３，７４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７５，７６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０１位のグルタミン酸がリジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換された置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）株を得た。
４．Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　ＰｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸを鋳型にして、配列番号７７、７８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＰｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号７９、８０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号８１、８２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号８３、８４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号８５，８６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓを鋳型とし、配列番号８７，８８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）株を得た。
５．Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号８９はCryptococcus neoformans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＣｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号９０）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＣｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
　ＣｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号９１、９２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号９３、９４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号９５、９６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号９７、９８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
６．Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産株の作製）
　配列番号９９はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである（以降Ｃｃ９５ＦＸと称する）。配列番号９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１００）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１００の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。
　続いて、取得した配列番号１００の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）　Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ）株を得た。
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入）
　Ｃｃ９５ＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸを鋳型にして、配列番号１０１、１０２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｃ９５ＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号１０３、１０４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号１０５、１０６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号１０７、１０８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号１０９、１１０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓを鋳型とし、配列番号１１１、１０２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）株を得た。
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＥＦＰ－Ｔ５、および前述の様にして得られた改変型ＥＦＰ－Ｔ５を生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５の粗酵素液に硫酸アンモニウムを３５％飽和濃度になるように添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した。続いて、得られた上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和濃度になるように追加添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を廃棄し、沈殿物を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。
　得られた野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５の粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後、同緩衝液で平衡化した４ｍｌのＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に供し、同緩衝液で樹脂に吸着しないタンパク質を溶出させた。続いて、得られた野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５Ｍの粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて同緩衝液中のＮａＣｌの濃度を０ｍＭから１００ｍＭまで直線的に増加させながら樹脂に吸着していた野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５を溶出させ回収した。
　得られた野生型、または改変型ＥＦＰ－Ｔ５を含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５を溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５の精製標品とした。
（Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＮｖＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＮｖＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＮｖＦＸを溶出させ回収した。
　得られた野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＮｖＦＸの精製標品とした。
（Aspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＡｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂に吸着していた改変型ＡｎＦＸを溶出させ回収した。
　得られた改変型ＡｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で改変型ＡｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＡｎＦＸの精製標品とした。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
　前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を、前述の、野生型ＰｎＦＸの精製方法に従い精製した。ＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムによる精製終了後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより純度を分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＰｎＦＸの精製標品とした。
（Cryptococcus neoformans由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＣｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＣｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＣｎＦＸを溶出させ回収した。
　得られた野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＣｎＦＸの精製標品とした。　
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産）
　野生型のＣｃ９５ＦＸ、および前述の様にして得られた改変型Ｃｃ９５ＦＸを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　得られた各種アマドリアーゼの野生型酵素、および改変型酵素の精製標品を用いて、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１５に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ． ４，　 ２４１１－２３，　１９９５参照）。
　また、Ｃｃ９５ＦＸ、またはＣｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ．活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１６の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本発明で獲得したConiochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７；比較例１）に対してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を各種のアマドリアーゼに導入した結果、予想通り、ＥＦＰ－Ｔ５、ＮｖＦＸ、ＡｎＦＸ、ＣｎＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与された。また、ＰｎＦＸは従来よりαＦ６Ｐに対する反応を僅かながら示したが、本発明で見出したアミノ酸置換の導入により比活性が１３．７倍向上した。
　また、本発明で獲得したConiochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７；比較例１）に対してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を本発明で獲得したCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Ｃｃ９５ＦＸ；比較例８）に導入した結果、予想通り、Ｃｃ９５ＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与され、Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓでは、αＦ６Ｐ酸化活性がαＦＶＨ酸化活性を上回った。
すなわち、本発明で見出した、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼに対してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するするアミノ酸置換の効果は、Coniochaeta由来アマドリアーゼに対してのみ限定される訳ではなく、図１および図２に示した様なＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼと７４％以上の配列同一性を示すアマドリアーゼであれば、普遍的に同様の効果を示すことが示された。 
（αＦ６Ｐの定量）
　以下の組成から成るαＦ６Ｐ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子）を利用して下記の通りαＦ６Ｐの測定を実施した。
試料１：αＦ６Ｐ溶液（終濃度０．５～１０μＭ）
０μＭ、４．０μＭ、８．０μＭ、１２μＭ、１６μＭ、２４μＭ、３２μＭ、４０μＭ、４８μＭ、８０μＭ　αＦ６Ｐ
試薬４：ロイコ色素溶液
２４ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．８
０．２４ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬５：パーオキシダーゼ、Ｆ６Ｐオキシダーゼ溶液
４００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．０
２０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
４．０Ｕ／ｍｌ（０．９４ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５（本発明２５）
試薬６：パーオキシダーゼ、αＦ６Ｐ酸化活性を示さないアマドリアーゼ溶液
４００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．０
２０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
０．９４ｍｇ／ｍｌ　ＣＦＰ－Ｔ７（比較例１）
　１２５μｌの試薬４に２５μｌの試料１を添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、波長７５１ｎｍの光の吸光度を測定した（Ａ０）、続いて５０μｌの試薬５または試薬６を添加してαＦ６Ｐの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた後、再度波長７５１ｎｍの光の吸光度を測定した（Ａ５）。試料１に由来するαＦ６Ｐの終濃度を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の吸光度差ΔＡ（Ａ５－Ａ０より算出）を縦軸にプロットしたグラフを図５に示した。
　試薬５を用いた場合、αＦ６Ｐ濃度０．５μＭ～１０μＭの範囲でΔＡとαＦ６Ｐ濃度の間に良好な相関関係が成立した（図５－１）。それに対し、試薬６を用いた場合、ΔＡとαＦ６Ｐ濃度の間に相関性は認められなかった（図５－２）。したがって、本発明のＦ６Ｐオキシダーゼを配合することで、αＦ６Ｐの定量を迅速（５分）かつ高感度（０．５μＭまで）に行えることが示された。
　糖尿病診断を行うには、糖尿病の境界値であるＨｂＡ１ｃ　６．５％（ＮＧＳＰ値）を判別できる必要がある。ＮＧＳＰ値６．５％はＩＦＣＣ値４７ｍｍｏｌ／ｍｏｌに相当し、血中ヘモグロビン濃度が１３ｇ／ｄｌ、ＮＧＳＰ値６．５％の場合、アミノ末端が糖化されたヘモグロビンβ鎖の血中濃度はおよそ１９０μＭである。すなわち、少なくとも１９０μＭ以下の濃度範囲においてαＦ６Ｐを定量可能でなければ、糖尿病診断への適用は難しく、産業利用上の課題を克服できているとは言い難い。その点、本発明のＦ６Ｐオキシダーゼを用いれば、前述の血液を３８０倍希釈してもＨｂＡ１ｃβ鎖アミノ末端由来のαＦ６Ｐを検出することが可能であり、産業利用上非常に有利である。
（ＨｂＡ１ｃの定量）
以下の組成から成るＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。
試料２：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３－８（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　５．５６、７．７４、１０．４８％）
試薬７：試料前処理液
０．０１２％　１－ドデシルピリジニウムクロリド（ＤＰＣ、東京化成工業製）
試薬８：ロイコ色素、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼ溶液
２４ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．８
０．２４ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
８．０Ｕ／ｍｌ　Ｖ－８プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、和光純薬工業製）
試薬９：パーオキシダーゼ、Ｆ６Ｐオキシダーゼ溶液
４００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．０
２０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
８．０Ｕ／ｍｌ（１．９ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５（本発明２５）
試薬１０：パーオキシダーゼ、αＦ６Ｐ酸化活性を示さないアマドリアーゼ溶液
４００ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．０
２０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１．９ｍｇ／ｍｌ　ＣＦＰ－Ｔ７（比較例１）
　１２５μｌの試薬８に、試薬７で２０倍希釈した試料２を２５μｌを添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬９または試薬１０を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端から遊離したαＦ６Ｐの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。試料２のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）終濃度を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを図６に示した。
　試薬６を用いた場合、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した（図６－１）。それに対し、試薬７を用いた場合、ΔＡとαＦ６Ｐ濃度の間に相関性は認められなかった（図６－２）。したがって、本発明のＦ６ＰオキシダーゼとＧｌｕ－Ｃプロテアーゼを併用することで、実際にＨｂＡ１ｃの定量を迅速（１０分）に行えることが示された
　以上の通り、本発明のアマドリアーゼは、αＦ６Ｐに対する優れた反応性（基質特異性）を示し、αＦ６Ｐを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できる実用性に優れた測定用酵素として非常に有望であり、酵素法によるＨｂＡ１ｃの測定において産業上の利用価値が期待される。
　以下の表に比較例と、本発明の変異体の、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位のアミノ酸及び置換があれば置換後のアミノ酸の関係を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
配列番号１　Coniochaeta sp. NISL 9330アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号２　配列番号１のアマドリアーゼの塩基配列
配列番号３－３３　PCRプライマー
配列番号３４　PCRプライマー
配列番号３５　PCRプライマー
配列番号３６　Aspergillus oryzae RIB40　（FAOAo2）　アミノ酸配列
配列番号３７：　FAOAo2塩基配列
配列番号３８　Phaeosphaeria nodorum（PnFX）　アミノ酸配列
配列番号３９　PnFX塩基配列
配列番号４０　Eupenicillium terrenum（EFP-T5）アミノ酸配列
配列番号４１　EFP-T5塩基配列
配列番号４２－５３　PCRプライマー
配列番号５４　Neocosmospora vasinfecta（NvFX）アミノ酸配列
配列番号５５　NvFX塩基配列
配列番号５６－６１　PCRプライマー
配列番号６２　Ｓ５９Ｇ置換　Aspergillus nidulans（AnFX）　アミノ酸配列
配列番号６３　AnFX塩基配列
配列番号６４－８８　PCRプライマー
配列番号８９　Cryptococcus neoformans　（CnFX）　アミノ酸配列
配列番号９０　CnFX塩基配列
配列番号９１－９８　PCRプライマー
配列番号９９　Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Cc95FX）　アミノ酸配列
配列番号１００　Cc95FX塩基配列
配列番号１０１－１１２　PCRプライマー
配列番号１１３　Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１４　Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１５　Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１６　Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１７　Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１８　Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１９　Emericella nidulans(En)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２０　Emericella nidulans(En)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２１　Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２２　Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２３　Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２４　Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２５　Aspergillus fumigatus Amadoriase Iのアミノ酸配列
配列番号１２６　Amadoriase I塩基配列
配列番号１２７　Aspergillus oryzae FAOAo1アミノ酸配列
配列番号１２８　FAOAo1塩基配列
配列番号１２９　Aspergillus fumigatus Amadoriase IIアミノ酸配列
配列番号１３０　Amadoriase II塩基配列
配列番号１３１　Aspergillus terreus FAOD-Aアミノ酸配列
配列番号１３２　FAOD-A塩基配列
配列番号１３３　CFP-T7-H20（R62D、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１３４　CFP-T7-H20塩基配列
配列番号１３５　PnFPOX（S62D、D106K、G110L、A113K）Phaeosphaeria nodorum アミノ酸配列
配列番号１３６　配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３７　(本発明２９)NvFX-62D/106K/110L（R62D、G106K、E110L）Neocosmospora vasinfectaアミノ酸配列
配列番号１３８　配列番号１３７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３９　(本発明３０)AnFX-61D/105K/109L(S59G、R61D、G105K、K1091L）Aspergillus nidulans　アミノ酸配列
配列番号１４０　配列番号１３９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４１　CFP-T7-H35（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１４２　CFP-T7-H35塩基配列
配列番号１４３　EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S　Eupenicillium terrenumアミノ酸配列
配列番号１４４　配列番号１４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４５　Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４６　Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４７　AnFX　野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４８　AnFX　野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４９　CnFX　野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１５０　CnFX　野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１５１　（本発明１）CFP-T7-H1（R62A）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５２　CFP-T7-H1塩基配列
配列番号１５３　（本発明２６）CFP-T7-62D（R62D)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５４　CFP-T7-62D塩基配列
配列番号１５５（本発明２７）EFP-T5-R62D（R62D) Eupenicillium terrenum アミノ酸配列
配列番号１５６　EFP-T5-R62D塩基配列
配列番号１５７　（本発明２）CFP-T7-H2（R62A、Q110L）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５８　CFP-T7-H2塩基配列
配列番号１５９　（本発明４）CFP-T7-H4（R62A、Q110Y）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６０　CFP-T7-H4塩基配列
配列番号１６１　（本発明５）CFP-T7-H2-62N（R62N、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６２　CFP-T7-H2-62N塩基配列
配列番号１６３　（本発明６）CFP-T7-H6（R62D、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６４　CFP-T7-H6塩基配列
配列番号１６５　（本発明１２）CFP-T7-H10（R62D、D106A、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６６　CFP-T7-H10塩基配列
配列番号１６７　（本発明１３）CFP-T7-H11（R62D、D106K、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６８　CFP-T7-H11塩基配列
配列番号１６９　（本発明１４）CFP-T7-H12（R62D、D106R、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７０　CFP-T7-H12塩基配列
配列番号１７１　（本発明１５）CFP-T7-H13（R62D、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７２　CFP-T7-H13塩基配列
配列番号１７３　（本発明１６）CFP-T7-H14（R62D、Q110L、A113R）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７４　CFP-T7-H14塩基配列
配列番号１７５　（本発明１８）CFP-T7-H21(R62D、D106K、Q110L、A113R)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７６　CFP-T7-H21塩基配列
配列番号１７７　（本発明１９）CFP-T7-H24（R62D、L63A、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７８　CFP-T7-H24塩基配列
配列番号１７９　（本発明２１）CFP-T7-H26（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８０　CFP-T7-H26塩基配列
配列番号１８１　（本発明２３）CFP-T7-H28（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K）　Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８２　CFP-T7-H28塩基配列
配列番号１８３　（本発明２４）CFP-T7-H29（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419K）　Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８４　CFP-T7-H29塩基配列
配列番号１８５　（本発明３１）（AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S）Aspergillus nidulansアミノ酸配列
配列番号１８６　配列番号１８５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８７　（本発明３３）（PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S）Phaeosphaeria nodorumアミノ酸配列
配列番号１８８　配列番号１８７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８９　（本発明３４）（CnFX-62D/106K/110L/113K）Cryptococcus neoformansアミノ酸配列
配列番号１９０　配列番号１８９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９１　（本発明３５）（Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S）Curvularia clavataアミノ酸配列
配列番号１９２　配列番号１９１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (31)

  1. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  2. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１に記載のアマドリアーゼ。
  3. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１又は２に記載のアマドリアーゼ。
  4. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１～３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  5. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１～４のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  6. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１～５のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  7. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１～６のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  8. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号１に示すアミノ酸配列における４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する請求項１～７のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  9. 　配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、配列番号６２、配列番号８９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、又は配列番号１２３に示すアミノ酸配列を有し、前記請求項１～８のいずれかに規定したアミノ酸置換を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  10. 　前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、請求項１～９のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  11. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    　(i)　配列番号１５１、配列番号１５３又は配列番号１５５に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１５１、配列番号１５３又は配列番号１５５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  12. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    　(i)　配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１又は配列番号１６３に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位及び１１０位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１又は配列番号１６３のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  13. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    　(i)　配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１又は配列番号１７３に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、１１０位、及び、１０６位又は１１３位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１又は配列番号１７３のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  14. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５又は配列番号１８９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、１１０位、１０６位及び１１３位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５又は配列番号１８９のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  15. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　配列番号１７７又は配列番号１７９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０６位、１１０位及び１１３位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１７７又は配列番号１７９のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  16. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７又は配列番号１９１に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０６位、１１０位及び１１３位、並びに、１０２位又は３５５位又は４１９位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７又は配列番号１９１のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  17. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　配列番号１４１又は配列番号１８５に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位及び３５５位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は配列番号１８５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
  18. 　改変前のアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している、請求項１～１７のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
  19. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（ｈ）よりなる群から選択されるアミノ酸の位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
    （ａ）配列番号１の６２位のアルギニン
    （ｂ）配列番号１の６３位のロイシン
    （ｃ）配列番号１の１０２位のグルタミン酸
    （ｄ）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸
    （ｅ）配列番号１の１１０位のグルタミン
    （ｆ）配列番号１の１１３位のアラニン
    （ｇ）配列番号１の３５５位のアラニン
    （ｈ）配列番号１の４１９位のアラニン
  20. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（h）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換され、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
    （a）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、アスパラギン又はアラニンに置換されている。
    （b）配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンに置換されている。
    （c）配列番号１の１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
    （d）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンに置換されている。
    （e）配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンに置換されている。
    （f）配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンに置換されている。
    （g）配列番号１の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリン又に置換されている。
    （h）配列番号１の４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
  21. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（ｐ）から（ｕ）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
    （ｐ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、かつ、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジン、アルギニンに置換されている。
    （ｑ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、かつ、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジン、アルギニンに置換されている。
    （ｒ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、ヒスチジンに置換されている。
    （ｓ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、かつ、配列番号１の１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
    （ｔ）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、かつ、配列番号１の４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
    （u）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号１の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号１の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号１の１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号１の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。
  22. 　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号４０記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号４０記載のアミノ酸配列において以下（ｖ）に記載したアミノ酸残基の置換を有し、配列番号４０記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α－フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α－フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
    （ｖ）配列番号４０記載の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号４０記載の６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号４０記載の１０６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号４０記載の１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号４０記載の１１３位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号４０記載の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。
  23. 　請求項１から請求項２２のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
  24. 　請求項２３記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
  25. 　請求項２４記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
  26. 　以下の工程を含む、アマドリアーゼの製造方法、
    （i）請求項２５記載の宿主細胞を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び
    （ii）培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程。
  27. 　請求項１から請求項２２のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、ＨｂＡ１ｃの測定に用いるためのキット。
  28. 　ＨｂＡ１ｃ由来のα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）を含む試料に請求項１から請求項２２のいずれかに記載のアマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに対する作用による生成物又は消費物を測定することを特徴とするαＦ６Ｐの測定方法。
  29. 　試料中のＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐを定量する、請求項２８に記載の方法。
  30. 　以下の工程を含む、ＨｂＡ１ｃの測定方法、
    (i)ＨｂＡ１ｃを含む試料をプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼで処理し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端よりαＦ６Ｐを遊離させる工程、及び
    (ii)遊離したＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに請求項１～２２のいずれかに記載のアマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃ由来αＦ６Ｐに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程。
  31. 　試料中のＨｂＡ１ｃを定量する、請求項３０に記載の方法。
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