CN105431533B - 糖化六肽氧化酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换；并提供了一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其特征在于，将样品中的糖化血红蛋白与蛋白酶反应以产生糖化六肽，将产生的糖化六肽与上述蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

Description

糖化六肽氧化酶及其用途

技术领域

本发明涉及具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质、编码所述蛋白质的DNA、用于生产所述蛋白质的方法、使用所述蛋白质测量糖化血红蛋白的方法以及用于测量糖化血红蛋白的试剂。

背景技术

在生物样品例如体液和毛发中含有糖化蛋白，并且体液包括活体中的血液等。血液中存在的糖化蛋白的浓度取决于溶解在血清中的糖例如葡萄糖的浓度，并且在临床诊断领域中，作为血液中的一种糖化蛋白的血红蛋白A1c(在后文中称为HbA1c；非专利文献1)的浓度的测量正被用于诊断和监测糖尿病。血红蛋白是由两种类型的亚基、即α-链和β-链各两个构成的血红素蛋白，并具有64,000的分子量。HbA1c被定义为其中具体来说β-链的N-端缬氨酸残基被糖化的血红蛋白。作为测量这种HbA1c的方法，已知的有使用高效液相色谱(HPLC)的仪器分析方法(非专利文献2)、使用抗原-抗体反应的免疫测定法(例如非专利文献3)等，但在近年中已开发了酶测定法，例如，已开发了使用蛋白酶和糖化肽氧化酶的方法(专利文献1)。酶测定法可以应用于多用途自动化分析仪，并且由于操作也简单，它们正被积极地开发。

在酶测定法中使用的糖化肽氧化酶是这样一种酶，其催化的反应通过在氧分子存在下，氧化性切开酮糖衍生物中的C-N键来产生邻酮醛糖(一种α-酮基醛)、肽和过氧化氢，所述酮糖衍生物由通过葡萄糖的半缩醛与肽的N-端氨基之间的反应产生的葡萄糖胺的Amadori重排而产生。

在酶测定法的情形中，下述方法是已知的：首先将HbA1c用蛋白酶降解，并从血红蛋白的β-链的N端产生α-糖化的缬氨酰组氨酸(在后文中称为α-FVH)；接下来，使糖化肽氧化酶作用于产生的α-FVH以产生过氧化氢，在过氧化物酶存在下由产生的过氧化氢产生醌染料，并使用分光光度计通过比色法测定产生的量(专利文献1)。

然而，通过蛋白酶处理，作为副产物产生了其中糖结合于赖氨酸的ε-氨基的ε-糖化的赖氨酸(在后文中称为ε-FK)和含有ε-FK的糖化肽，并且已经指出，存在着在糖化肽氧化酶作用于它们的情况下HbA1c的测量值可能高于真实值的风险(专利文献2)。

已从细菌、真菌和植物发现糖化肽氧化酶。例如，源自于Achaetomiella属、毛壳菌属(Chaetomium)(专利文献3)、弯孢属(Curvularia)(专利文献2)、蔷薇科(Rosaceae)、葡萄科(Vitaceae)、伞形科(Apiaceae)(专利文献5)等的糖化肽氧化酶是已知的。

然而，到目前为止报道的糖化肽氧化酶具有缺点，例如：

(1)与α-糖化的氨基酸(例如α-糖化的缬氨酸(在后文中称为α-FV))相比，对作为HbA1c来源的α-糖化二肽的α-糖化的缬氨酰组氨酸(在后文中称为α-FVH)的活性不一定高；

(2)正如上面描述的，除了N-端α-糖化的二肽之外，它还作用于ε-FK，并在HbA1c测量中增加测量值；并且

(3)在使用酶的测量方法的情况下，酶在测量或储存期间变得不稳定。

为了克服这些缺点，已报道了由于将突变人工引入到糖化肽氧化酶中而产生的对ε-FK具有降低的反应性的酶(专利文献4)、具有提高的热稳定性的酶(非专利文献4)等。此外，已经报道了同时克服上述(1)至(3)的缺点的酶(专利文献6)。

按照惯例，作为由国际临床化学和实验室医学联盟(International Federationof Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)(IFCC)宣布的HbA1c测量方法，用于确定HbA1c浓度的已知方法是下述方法：使用Glu-C蛋白酶消化HbA1cβ-链以解离由包括糖化的N-端氨基酸的6个氨基酸构成的肽片段[α-糖化六肽：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu(在后文中称为α-F6P)]，并且使用HPLC-毛细管电泳(HPLC-CE)或HPLC-质谱术(HPLC-MS)对其进行测量(非专利文献5)。这种方法到目前为止被广泛用作具有出色特异性的实用标准方法，但是它需要特殊装置进行检测，并且它具有需要复杂操作的问题。

上述HbA1c测量中的实用标准方法(其使用HPLC-CE或HPLC-MS)与酶测定法相比，前者的测量对象是糖化六肽，而后者的测量对象主要是糖化的二肽。这是因为大多数已知的糖化肽氧化酶对相对短的糖化肽具有高反应性。开发基于与所述实用标准方法相同的原理，在其中测量源自于HbA1c的糖化六肽α-F6P并由此测量HbA1c的酶测定法，据信在工业上并且也从提高这两种方法之间的相关性的观点来看，是非常有意义的。

已知的作用于对应于HbA1c的β-链的N端的糖化六肽α-F6P的糖化六肽氧化酶，是源自于姜科(Zingiberaceae)植物的糖化肽氧化酶(专利文献7)，源自于蔷薇科(Rosaceae)、葡萄科(Vitaceae)和伞形科(Apiaceae)植物的糖化肽氧化酶(专利文献5)，源自于微生物的糖化肽氧化酶(专利文献8)，以及由两种类型的微生物来源的糖化肽氧化酶序列构成的嵌合酶(非专利文献6)；然而，它们具有例如需要长时间与糖化六肽反应或与糖化六肽的反应性不足的问题。

此外，如上所述，常规的糖化肽氧化酶只能作用于具有最多6个氨基酸的肽，对更长的肽链和糖化血红蛋白具有氧化酶活性的酶尚未发现。因此，在通过酶测定法测量糖化血红蛋白的情形中，必须如上所述用蛋白酶解离肽片段，然后使糖化肽氧化酶作用于所述片段；然而，在除了糖化血红蛋白测量之外的其他测量是使用自动化分析仪等同时进行的情况下，用于测量糖化血红蛋白的试剂中的蛋白酶可能作用于其他试剂，并可能影响测量值。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2001-95598号公报

专利文献2：国际公开第2004/104203号小册子

专利文献3：特开2003-235585号公报

专利文献4：特开2010-233502号公报

专利文献5：国际公开第2004/038033号小册子

专利文献6：国际公开第2010/041715号小册子

专利文献7：国际公开第2004/038034号小册子

专利文献8：国际公开第2008/108385号小册子

非专利文献

非专利文献1：Clin Chem Lab Med,第36卷,p.299-308(1998)。

非专利文献2：Diabetes,第27卷,第2号,p.102-107(1978)。

非专利文献3：日本临床检查自动化学会杂志,第18卷,第4号,p.620(1993)。

非专利文献4：Appl Microbiol Biotechnol,第78卷,第5号,p.775-781(2008)。

非专利文献5：Clin Chem Lab Med,40,78-89,(2002)。

非专利文献6：Mol Biotechnol,54(3)p.939-943(2013)。

发明内容

本发明待解决的问题

考虑到上述问题，完成了本发明。本发明的一个目的是提供具有氧化源自于糖化血红蛋白的糖化六肽并产生过氧化氢的活性(在后文中称为糖化六肽氧化酶活性)的蛋白质。本发明的另一个目的是提供编码所述蛋白质的DNA，包含所述DNA的重组DNA，用所述重组DNA转化的转化体，使用所述转化体等产生具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质的方法，使用所述蛋白质测量糖化血红蛋白的方法，以及包含所述蛋白质的用于测量糖化血红蛋白的试剂。此外，本发明的另一个目的是提供具有直接氧化糖化血红蛋白的活性的蛋白质，使用所述蛋白质测量糖化血红蛋白的方法，以及包含所述蛋白质的用于测量糖化血红蛋白的试剂。

解决上述问题的手段

本发明涉及下列(1)至(29)。

(1)一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换。

(2)一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中在(1)的蛋白质的氨基酸序列中除了61位处的氨基酸之外的一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性。

(3)一种蛋白质，所述蛋白质包含与(1)的蛋白质的氨基酸序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性。

(4)一种蛋白质，在所述蛋白质中，(1)的蛋白质的氨基酸残基被选自下列[1]至[15]的至少一个突变修饰：

[1]其中63位处的精氨酸被选自甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸的氨基酸替换的突变；

[2]其中62位处的亮氨酸被甘氨酸替换的突变；

[3]其中93位处的谷氨酰胺被谷氨酸替换的突变；

[4]其中267位处的苯丙氨酸被酪氨酸替换的突变；

[5]其中71位处的酪氨酸被丝氨酸或半胱氨酸替换的突变；

[6]其中115位处的天冬氨酸被选自天冬酰胺和精氨酸的氨基酸替换的突变；

[7]其中108位处的甲硫氨酸被选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸替换的突变；

[8]其中75位处的亮氨酸被选自丙氨酸和苯丙氨酸的氨基酸替换的突变；

[9]其中34位处的丝氨酸被苏氨酸替换的突变；

[10]其中52位处的酪氨酸被组氨酸替换的突变；

[11]其中57位处的异亮氨酸被缬氨酸替换的突变；

[12]其中66位处的脯氨酸被组氨酸替换的突变；

[13]其中95位处的天冬氨酸被谷氨酸替换的突变；

[14]其中105位处的赖氨酸被精氨酸替换的突变；以及

[15]其中355位处的丙氨酸被丝氨酸替换的突变。

(5)一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中在(4)的蛋白质的氨基酸序列中除了34、52、57、61、62、63、66、71、75、93、95、105、108、115、267和355位处的氨基酸之外的至少一个氨基酸被缺失、替换或添加，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性。

(6)一种蛋白质，其包含由SEQ ID NO：3至37中的任一个表示的氨基酸序列。

(7)一种蛋白质，其包含与由SEQ ID NO：3至37中的任一个表示的氨基酸序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性。

(8)一种蛋白质，其包含由SEQ ID NO：6至37中的任一个表示的氨基酸序列。

(9)一种蛋白质，其包含与由SEQ ID NO：6至37中的任一个表示的氨基酸序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列，并且具有直接氧化糖化血红蛋白的活性。

(10)(9)的蛋白质，其中所述糖化血红蛋白是HbA1c。

(11)一种DNA，其编码(1)至(10)任一项的蛋白质。

(12)一种DNA，其包含由SEQ ID NO：41至75中的任一个表示的核苷酸序列。

(13)一种DNA，其在严紧条件下与具有与编码(6)的蛋白质的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质。

(14)一种DNA，其在严紧条件下与具有与由SEQ ID NO：41至75中的任一个表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质。

(15)一种DNA，其包含由SEQ ID NO：44至75中的任一个表示的核苷酸序列。

(16)一种DNA，其在严紧条件下与具有与编码(8)的蛋白质的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有直接氧化糖化血红蛋白的活性的蛋白质。

(17)一种DNA，其在严紧条件下与具有与由SEQ ID NO：44至75中的任一个表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有直接氧化糖化血红蛋白的活性的蛋白质。

(18)(16)或(17)的DNA，其中所述糖化血红蛋白是HbA1c。

(19)一种重组DNA，其包含(11)至(18)任一项的DNA。

(20)一种转化体，其带有(19)的重组DNA。

(21)一种用于生产(1)至(10)任一项的蛋白质的方法，其中所述方法包括培养(20)的转化体，在培养物中产生并积累(1)至(10)任一项的蛋白质，并从所述培养物收集所述蛋白质。

(22)一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其中所述方法包括通过将所述样品中的糖化血红蛋白与蛋白酶反应来产生糖化六肽，将产生的糖化六肽与(1)至(10)任一项的蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

(23)一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其中所述方法包括将所述样品中的糖化血红蛋白与(8)至(10)任一项的蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

(24)(22)或(23)的测量方法，其中所述糖化血红蛋白是HbA1c。

(25)(22)至(24)任一项的测量方法，其中由所述反应产生的物质是过氧化氢。

(26)一种用于测量糖化血红蛋白的试剂，其中所述试剂包含蛋白酶和(1)至(10)任一项的蛋白质。

(27)一种用于测量糖化血红蛋白的试剂，其中所述试剂包含(8)至(10)任一项的蛋白质。

(28)(26)或(27)的试剂，其还包含用于测量过氧化氢的试剂。

(29)(26)至(28)任一项的试剂，其中所述糖化血红蛋白是HbA1c。

本发明的效果

本发明提供了具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质、编码所述蛋白质的DNA、包含所述DNA的重组DNA、用所述重组DNA转化的转化体、使用所述转化体等生产具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质的方法、使用所述蛋白质测量糖化血红蛋白的方法、包含所述蛋白质的用于测量糖化六肽的试剂、具有直接氧化糖化血红蛋白的活性的蛋白质、使用所述蛋白质测量糖化血红蛋白的方法，以及包含所述蛋白质的用于测量糖化血红蛋白的试剂。

附图说明

图1示出的图指示了本发明的使用V8蛋白酶和FPOX-19的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

图2示出的图指示了本发明的使用V8蛋白酶和FPOX-32的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

图3示出的图指示了本发明的使用V8蛋白酶和FPOX-42的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

图4示出的图指示了本发明的使用FPOX-19并且不使用蛋白酶的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

图5示出的图指示了本发明的使用FPOX-20并且不使用蛋白酶的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

图6示出的图指示了本发明的使用FPOX-32并且不使用蛋白酶的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

图7示出的图指示了本发明的使用FPOX-42并且不使用蛋白酶的测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性。

执行本发明的方式

1.本发明的蛋白质

本发明的蛋白质包括：

[1]一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换；

[2]一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中在[1]的蛋白质的氨基酸序列中除了61位处的氨基酸之外的一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性；

[3]一种蛋白质，所述蛋白质包含与[1]的蛋白质的氨基酸序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性；

[4]一种蛋白质，在所述蛋白质中，[1]的蛋白质的氨基酸残基被选自下列(1)至(15)的至少一个突变修饰：

(1)其中63位处的精氨酸被选自甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸的氨基酸替换的突变；

(2)其中62位处的亮氨酸被甘氨酸替换的突变；

(3)其中93位处的谷氨酰胺被谷氨酸替换的突变；

(4)其中267位处的苯丙氨酸被酪氨酸替换的突变；

(5)其中71位处的酪氨酸被丝氨酸或半胱氨酸替换的突变；

(6)其中115位处的天冬氨酸被选自天冬酰胺和精氨酸的氨基酸替换的突变；

(7)其中108位处的甲硫氨酸被选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸替换的突变；

(8)其中75位处的亮氨酸被选自丙氨酸和苯丙氨酸的氨基酸替换的突变；

(9)其中34位处的丝氨酸被苏氨酸替换的突变；

(10)其中52位处的酪氨酸被组氨酸替换的突变；

(11)其中57位处的异亮氨酸被缬氨酸替换的突变；

(12)其中66位处的脯氨酸被组氨酸替换的突变；

(13)其中95位处的天冬氨酸被谷氨酸替换的突变；

(14)其中105位处的赖氨酸被精氨酸替换的突变；以及

(15)其中355位处的丙氨酸被丝氨酸替换的突变；

[5]一种蛋白质，其包含这样一种氨基酸序列，即其中在[4]的蛋白质的氨基酸序列中除了34、52、57、61、62、63、66、71、75、93、95、105、108、115、267和355位处的氨基酸之外的至少一个氨基酸被缺失、替换或添加，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性；

[6]一种蛋白质，其包含由SEQ ID NO：3至37中的任一个表示的氨基酸序列；

[7]一种蛋白质，其包含与由SEQ ID NO：3至37中的任一个表示的氨基酸序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列，并且所述蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性；

[8]一种蛋白质，其包含由SEQ ID NO：6至37中的任一个表示的氨基酸序列；

[9]一种蛋白质，其包含与由SEQ ID NO：6至37中的任一个表示的氨基酸序列具有90％或更高的同源性的氨基酸序列，并且具有直接氧化糖化血红蛋白的活性；以及

[10][9]的蛋白质，其中所述糖化血红蛋白是HbA1c。

上文中，包含具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列并具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质，可以例如通过使用在下述文献中描述的位点特异性诱变方法，向包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的编码DNA引入位点特异性突变来获得：《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)(在后文中简写为《分子克隆》第二版)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)John Wiley & Sons(1987-1997)(在后文中简写为《分子生物学现代方法》)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic AcidsResearch,13,4431(1985)；以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等。

尽管对被缺失、替换或添加的氨基酸的数目没有特别限制，但它是可以通过已知方法例如上述位点特异性诱变方法缺失、替换或添加的数目，并且所述数目是1至几十，优选为1至20，更优选为1至10，甚至更优选为1至5。

在其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换的氨基酸序列中，在除了61位处的氨基酸之外的一个或多个氨基酸被缺失、替换或添加的情况下，可以在同一序列中除了氨基酸位置61之外的任何位置处缺失、替换或添加一个或多个(例如两个至几个)氨基酸。

可以进行氨基酸缺失或添加的氨基酸位置的实例包括其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换的氨基酸序列的N-端或C-端一侧处的一个至几个氨基酸。

缺失、替换或添加可以同时发生，并且被替换或添加的氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸类型。天然存在的氨基酸类型的实例包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-半胱氨酸。

在下文中，示出了可相互替换的氨基酸的实例。被包含在同一组中的氨基酸可以相互替换。

组A：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基丝氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，环己基丙氨酸

组B：天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸

组C：天冬酰胺，谷氨酰胺

组D：赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2,4-二氨基丁酸，2,3-二氨基丙酸

组E：脯氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸

组F：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸

组G：苯丙氨酸，酪氨酸

此外，为了使本发明的蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性，期望地，所述蛋白质与其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换的氨基酸序列具有90％或更高、例如94％或更高、优选地95％或更高、更优选地96％或更高、甚至更优选地97％或更高、甚至还更优选地98％或更高、特别优选地99％或更高的同源性。

氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可以使用Karlin和Altshul的BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA[Methods Enzymol.,183,63(1990)]来确定。已经基于这种BLAST算法开发了被称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。在通过基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列的情形中，参数被设定在例如分值＝100和字长＝12。在通过基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列的情形中，参数被设定在例如分值＝50和字长＝3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情形中，使用每个程序的默认参数。

包含与其中包含由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换的氨基酸序列具有90％或更高、例如94％或更高、优选地95％或更高、更优选地96％或更高、甚至更优选地97％或更高、甚至更优选地98％或更高、特别优选地99％或更高的同源性的氨基酸序列并且具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质，也是本发明的蛋白质。

本发明的蛋白质是例如包含由SEQ ID NO：3至37中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质(其分别被称为FPOX-16、FPOX-17、FPOX-18、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-21、FPOX-22、FPOX-23、FPOX-24、FPOX-25、FPOX-26、FPOX-27、FPOX-28、FPOX-29、FPOX-30、FPOX-31、FPOX-32、FPOX-33、FPOX-34、FPOX-35、FPOX-36、FPOX-37、FPOX-38、FPOX-39、FPOX-40、FPOX-41、FPOX-42、FPOX-43、FPOX-44、FPOX-45和FPOX-46)。

作为用于证实本发明的蛋白质具有糖化六肽氧化酶活性的手段，人们可以例如通过下述方法来证实：通过DNA重组方法产生表达本发明的蛋白质的转化体，使用所述转化体产生本发明的蛋白质，然后使用α-F6P作为底物，测量由使用所述底物的反应产生或消耗的物质。在这里，由使用所述底物的反应产生的物质是例如过氧化氢。

本发明的蛋白质使用分子氧来氧化糖化血红蛋白来源的糖化六肽或糖化血红蛋白HbA1c，以产生邻酮醛糖(一种α-酮基醛)、六肽或血红蛋白和过氧化氢。

对本发明的蛋白质的糖化六肽氧化酶活性的最佳pH和稳定的pH范围没有特别限制，并且最佳pH优选在约6.0至8.0，对于在40℃下处理10分钟来说稳定的pH优选为pH 6.0至9.0。

对活性的最佳温度范围没有特别限制，并且优选在约20℃至50℃。蛋白质的热稳定性越高，蛋白质越优选，并且可以有利地使用在50℃下处理15分钟后残留活性为25％或更高的蛋白质。

(测量糖化六肽氧化酶活性的方法)

糖化六肽氧化酶活性的测量可以通过下述方法来进行，并且将在1分钟内从α-F6P产生1μmol过氧化氢的酶量定义为一个单位(U)。(用于活性测量的试剂)

溶液A：50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)

溶液B：着色剂

10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)在二甲基甲酰胺(DMF)中的24mmol/L溶液

溶液C：过氧化物酶溶液

过氧化物酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L溶液

溶液D：底物溶液

α-F6P的1mmol/L水溶液

溶液E：纯化的酶溶液

糖化六肽氧化酶的0.1至10mg/mL水溶液

(测量程序)

向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并将得到的溶液以每个样品190μL的量分发在96孔微孔板的每个孔中。加入20μL溶液D和10μL溶液E并混合，使用全自动微孔板EIA分析仪在660nm(主波长)/750nm(次波长)下测量溶液在反应前的吸光度和溶液在30℃或37℃反应30至120分钟后的吸光度，并计算吸光度变化。通过减去空白值来计算测量值，空白值通过使用蒸馏水代替底物溶液(溶液D)进行测量来获得。

随后，向上述测量体系添加各种不同量的过氧化氢，测量660nm(主波长)/750nm(次波长)下的吸光度，并制备显示出过氧化氢的量与吸光度之间的关系的校准曲线。从由于每个纯化的酶样品造成的信号变化计算单位时间内产生的过氧化氢的量。

2.本发明的DNA

本发明的DNA包括：

[a]一种DNA，其编码上述[1]至[10]任一项的蛋白质；

[b]一种DNA，其包含由SEQ ID NO：41至75中的任一个表示的核苷酸序列；

[c]一种DNA，其在严紧条件下与具有与编码上述[6]的蛋白质的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质；

[d]一种DNA，其在严紧条件下与具有与由SEQ ID NO：41至75中的任一个表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质；

[e]一种DNA，其包含由SEQ ID NO：44至75中的任一个表示的核苷酸序列；

[f]一种DNA，其在严紧条件下与具有与编码上述[8]的蛋白质的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有直接氧化糖化血红蛋白的活性的蛋白质；

[g]一种DNA，其在严紧条件下与具有与由SEQ ID NO：44至75中的任一个表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交，其中所述DNA编码具有直接氧化糖化血红蛋白的活性的蛋白质；以及

[h][f]或[g]的DNA，其中所述糖化血红蛋白是HbA1c。

在本文中，“杂交”意味着目标DNA与具有特定核苷酸序列的DNA或该DNA的一部分杂交。因此，具有特定核苷酸序列的DNA或该DNA的一部分的核苷酸序列，可能是可作为探针用于Northern或Southern印迹分析或可作为寡核苷酸引物用于PCR分析的具有一定长度的DNA。用作探针的DNA包括至少100或更多个核苷酸、优选地200或更多个核苷酸、更优选地500或更多个核苷酸的DNA；并且，它们也可以是至少10或更多个核苷酸或优选地15或更多个核苷酸的DNA。

用于DNA杂交实验的方法是公知的。例如可以按照下述文献中的描述确定用于杂交的条件并进行实验：《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版，第三版(2001)；《普通和分子细菌学方法》(Methods for General and Molecular Bacteriology)，ASM Press(1994)；《免疫学方法手册》(Immunology methods manual)，Academic press(Molecular)，以及许多其他标准教科书。

上述严紧条件的实例包括下述高严紧性条件，将固定有DNA的滤膜和探针DNA在含有50％甲酰胺、5x SSC(750mmol/L氯化钠和75mmol/L柠檬酸钠)、50mmol/L磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、20μg/L变性鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃下温育过夜，并且在温育后，将滤膜在例如约65℃下在0.2x SSC溶液中洗涤；并且，也可以使用具有较低严紧性的条件。可以通过调整甲酰胺的浓度(当甲酰胺浓度降低时条件的严紧性变低)或通过改变盐浓度和温度条件，来修改严紧性条件。低严紧性条件的实例包括下述条件：在含有6x SSCE(20x SSCE：3mol/L氯化钠，0.2mol/L磷酸二氢钠和0.02mol/L EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺和100μg/L变性鲑鱼精子DNA的溶液中在37℃下温育过夜，然后使用1x SSC、0.1％SDS溶液在50℃下洗涤。严紧性更低的条件的实例包括下述条件：杂交在上述低严紧性条件下使用具有高盐浓度的溶液(例如5x SSC)进行，然后进行洗涤。

上述的各种不同条件也可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的阻断试剂来设置。在添加上述阻断试剂的情形中，可以改变杂交条件以使所述条件相容。

能够在上述严紧条件下杂交的DNA包括包含当例如使用诸如上述BLAST和FASTA的程序基于上述参数进行计算时，与由SEQ ID NO：41至75中的任一个表示的核苷酸序列具有至少90％或更高、例如94％或更高、优选地95％或更高、更优选地96％或更高、甚至更优选地97％或更高、甚至更优选地98％或更高、特别优选地99％或更高的同源性的核苷酸序列的DNA。

可以通过下述方法证实在严紧条件下与上述DNA杂交的DNA是编码具有糖化六肽氧化酶活性的蛋白质的DNA：制备表达所述DNA的重组DNA，将重组DNA导入到宿主细胞中，培养获得的微生物，纯化从培养物获得的蛋白质，并测量通过作为酶源的纯化的蛋白质与作为底物的α-F6P的反应产生的过氧化氢。

本发明的DNA的实例包括编码包含由SEQ ID NO：3-37中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA，以及包含由SEQ ID NO：41-75中的任一个表示的核苷酸序列的DNA。

3.本发明的转化体

本发明的转化体的实例包括使用包含上面2中描述的本发明的DNA的重组DNA，通过已知方法转化宿主细胞而获得的转化体。宿主细胞的实例包括细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞，并且优选为细菌，更优选为原核细胞，甚至更优选为属于埃希氏杆菌(Escherichia)属的微生物。

4.本发明的DNA的制备

本发明的DNA可以例如从微生物如丝状真菌、优选地从属于曲霉属(Aspergillus)或裸胞壳属(Emericella)的微生物或特别优选地从属于构巢裸胞壳(Emericellanidulans)等的微生物，使用可以根据由SEQ ID NO：41-75中的任一个表示的核苷酸序列设计的探针来获得。

或者，基于各种遗传序列数据库，人们可以搜索与包含由SEQ ID NO：3至37表示的氨基酸序列的蛋白质的编码DNA的核苷酸序列具有90％或更高、例如94％或更高、优选地95％或更高、更优选地96％或更高、甚至更优选地97％或更高、甚至更优选地98％或更高、特别优选地99％或更高的同源性的序列，并且基于通过搜索获得的核苷酸序列，也可以按照上述方法，从具有所述核苷酸序列的生物体的染色体DNA、cDNA文库等，获得本发明的DNA或在本发明的生产方法中使用的DNA。

DNA的核苷酸序列可以通过下述方法确定：使用原样的获得的DNA或将它用适合的限制性酶切开，通过常规方法将它插入到载体中，将获得的重组DNA导入到宿主细胞中，然后使用常规使用的核苷酸序列分析方法例如双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74,5463(1977)]或核苷酸序列分析仪例如373A DNA测序仪(由Perkin Elmer制造)进行分析。

用于插入本发明的DNA的载体的实例包括pBluescript II KS(+)(由Stratagene制造)、pDIRECT[Nucleic Acids Res.,18,6069(1990)]、pCR-Script Amp SK(+)(由Stratagene制造)、pT7Blue(由by Novagen,Inc.制造)、pCR II(由Invitrogen Corp.制造)和pCR-TRAP(由GenHunter Corp.制造)。

作为宿主细胞，可以使用属于埃希氏杆菌(Escherichia)属等的微生物。属于埃希氏杆菌属的微生物的实例包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue、大肠埃希氏杆菌XL2-Blue、大肠埃希氏杆菌DH1、大肠埃希氏杆菌MC1000、大肠埃希氏杆菌ATCC 12435、大肠埃希氏杆菌W1485、大肠埃希氏杆菌JM109、大肠埃希氏杆菌HB101、大肠埃希氏杆菌No.49、大肠埃希氏杆菌W3110、大肠埃希氏杆菌NY49、大肠埃希氏杆菌MP347、大肠埃希氏杆菌NM522、大肠埃希氏杆菌BL21和大肠埃希氏杆菌ME8415。

作为导入重组DNA的方法，可以使用任何用于将DNA导入到上述宿主细胞中的方法，实例包括使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体方法(特开昭63-248394)和电穿孔方法[Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)]。

在作为核苷酸序列测定的结果，得到的DNA是部分DNA的情形中，可以通过使用所述部分DNA作为探针对染色体DNA文库进行Southern杂交等来获得全长DNA。

此外，也可以根据测定的DNA的核苷酸序列，使用由PerSeptive Biosystems制造的8905型DNA合成仪等，通过化学合成来制备所需DNA。

如上所述获得的DNA的实例是包含由SEQ ID NO：41-75中的任一个表示的核苷酸序列的DNA。

5.用于本发明的生产方法的转化体的生产方法

基于本发明的DNA，在必要时制备含有编码本发明的蛋白质的DNA的适合长度的DNA片段。通过修改编码所述蛋白质的DNA的核苷酸序列，并通过替换所述核苷酸序列中的核苷酸以便获得最适于在宿主中表达的密码子，可以获得具有提高的蛋白质生产速率的转化体。

通过将DNA片段插入到适合的表达载体中启动子的下游，产生重组DNA。通过将所述重组DNA导入到适合于所述表达载体的宿主细胞中，可以获得生产本发明的蛋白质的转化体。

作为宿主细胞，可以使用任何宿主细胞例如细菌细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞，只要它能表达目标基因即可。

所使用的表达载体是能够在上述宿主细胞中自主复制或整合到染色体中，并在能够使本发明的DNA转录的位置处包含启动子的表达载体。

在使用原核生物例如细菌作为宿主细胞的情形中，包含本发明的DNA的重组DNA优选地是能够在原核生物中自主复制，并在同时由启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA和转录终止序列组成的重组DNA。也可以包括调节启动子的基因。

表达载体的实例是pCold I(由TAKARA BIO Inc.制造)、pCDF-1b和pRSF-1b(两者都由Novagen Inc.制造)、pMAL-c2x(由New England Biolabs Inc.制造)、pGEX-4T-1(由GEHealthcare Biosciences制造)、pTrcHis(由Invitrogen Corp.制造)、pSE280(由Invitrogen Corp.制造)、pGEMEX-1(由Promega Corp.制造)、pQE-30(由Qiagen Inc.制造)、pET-3(由Novagen Inc.制造)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(+)、pBluescript II KS(-)(由Stratagene制造)、pTrS30[从大肠埃希氏杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[从大肠埃希氏杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pPAC31(WO 98/12343)、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(由TAKARA BIO Inc.制造)、pUC118(由TAKARA BIOInc.制造)、pPA1(特开昭63-233798)和pTrc99a载体(4,176-bp，由GE HealthcareBiosciences制造)。

可以使用任何启动子，只要它能够在宿主细胞例如大肠埃希氏杆菌中起作用即可。实例包括源自于大肠埃希氏杆菌、噬菌体等的启动子，例如trp启动子(P_trp)、lac启动子(P_lac)、P_L启动子、P_R启动子和P_SE启动子，以及SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子。也可以使用具有人工设计的变化的启动子，例如两个P_trp串联排列的启动子、tac启动子、lacT7启动子和let I启动子。

此外，也可以使用用于在属于芽孢杆菌(Bacillus)属的微生物中表达的xylA启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,35,594-599(1991)]、用于在属于棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)]等。

优选地，使用其中作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间的距离被适当地调整(例如6至18个核苷酸)的质粒。

在其中已将本发明的DNA连接到表达载体的重组DNA中，转录终止序列不总是必需的；然而，转录终止序列优选地放置在紧靠结构基因的下游。

这样的重组DNA的实例是pET21-plu1440。

原核生物的实例包括属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、着色菌属(Chromatium)、欧文氏菌属(Erwinia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、席藻属(Phormidium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、栅列藻属(Scenedesmus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻属(Synechoccus)和发酵单胞菌属(Zymomonas)的微生物。例如，它们是大肠埃希氏杆菌XL1-Blue、大肠埃希氏杆菌XL2-Blue、大肠埃希氏杆菌DH1、大肠埃希氏杆菌DH5α、大肠埃希氏杆菌MC1000、大肠埃希氏杆菌KY3276、大肠埃希氏杆菌W1485、大肠埃希氏杆菌JM109、大肠埃希氏杆菌HB101、大肠埃希氏杆菌No.49、大肠埃希氏杆菌W3110、大肠埃希氏杆菌NY49、大肠埃希氏杆菌MP347、大肠埃希氏杆菌NM522、大肠埃希氏杆菌BL21、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 33712、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC 14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 14297、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假单胞菌属物种(Pseudomonassp.)D-0110、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根病土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、圆柱形鱼腥藻(Anabaena cylindrica)、桶形鱼腥藻(Anabaena doliolum)、水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、柠檬色节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、裂烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacterhydrocarboglutamicus)、Arthrobacter mysorens、烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)、Arthrobacter roseoparaffinus、硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、Chromatium buderi、微温着色菌(Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、Chromatium warmingii、Chromatium fluviatile、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、胡萝卜欧文氏菌(Erwinia carotovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、Erwinia punctata、Erwinia terreus、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、席藻属物种(Phormidiumsp.)ATCC 29409、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、Rhodopseudomonas blastica、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonasmarina)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、Rhodospirillum salexigens、Rhodospirillum salinarum、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。

作为用于将重组DNA导入到原核生物中的方法，可以使用任何方法，只要它将DNA导入到上述宿主细胞中即可，并且实例包括使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体方法(特开昭63-248394)和电穿孔方法[Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)]。

在使用酵母菌株作为宿主细胞的情形中，YEp13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC 37419)、pHS19和pHS15可以被用作表达载体。

作为启动子，可以使用任何启动子，只要它在酵母菌株中起作用即可，并且实例包括启动子例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子和CUP 1启动子。

宿主细胞的实例包括属于糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)的酵母菌株，并且具体实例包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、Schwanniomyces alluvius、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和产朊假丝酵母(Candida utilis)。

作为用于将重组DNA导入到酵母中的方法，可以使用任何方法，只要它将DNA导入到酵母中即可，并且实例包括电穿孔方法[Methods Enzymol.,194,182(1990)]、原生质球方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4889(1984)]和乙酸锂方法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]。

在使用动物细胞作为宿主的情形中，可以使用pcDNAI、pcDM8(可以从FunakoshiCo.,Ltd.商购)、pAGE107(特开平3-22979)、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(由Invitrogen Corp.制造)、pREP4(由Invitrogen Corp.制造)、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等作为表达载体。

作为启动子，可以使用任何启动子，只要它在动物细胞中起作用即可，并且实例包括巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)基因的启动子、SV40早期启动子或金属硫蛋白启动子、逆转录病毒的启动子、热休克启动子、SRα启动子等。此外，人类CMV的IE基因的增强子可以与启动子组合使用。

宿主细胞的实例包括小鼠骨髓瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠杂交瘤细胞、作为人类细胞的Namalwa细胞和Namalwa KJM-1细胞、人类胚胎肾细胞、人类白血病细胞、非洲绿猴肾细胞、中华仓鼠来源的CHO细胞和HBT5637(特开昭63-299)。

小鼠骨髓瘤细胞的实例包括SP2/0和NSO；大鼠骨髓瘤细胞的实例包括YB2/0；人类胚胎肾细胞的实例包括HEK293(ATCCCRL-1573)；人类白血病细胞的实例包括BALL-1；并且非洲绿猴肾细胞的实例包括COS-1和COS-7。

作为用于将重组DNA导入到动物细胞中的方法，可以使用任何方法，只要它将DNA导入到动物细胞中即可，并且实例包括电穿孔方法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙方法(特开平2-227075)、脂质体转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]和Virology,52,456(1973)中描述的方法。

在使用昆虫细胞作为宿主的情形中，可以通过使用例如在下述文献中描述的方法来生产蛋白质：《杆状病毒表达载体实验指南》(Baculovirus Expression Vectors,ALaboratory Manual)，W.H.Freeman and Company，New York(1992)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)；《分子生物学实验指南》(MolecularBiology,A Laboratory Manual)；Bio/Technology,6,47(1988)等。

具体来说，可以通过将重组基因转移载体和杆状病毒共同导入到昆虫细胞中以在昆虫细胞的培养上清液中获得重组病毒，然后用所述重组病毒感染昆虫细胞，来生产蛋白质。

在该方法中使用的基因转移载体的实例包括pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII(都由Invitrogen Corp.制造)。

作为杆状病毒，可以使用例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒，其是感染夜蛾科盗夜蛾亚科(Noctuidae Hadeninae)昆虫的病毒。

作为昆虫细胞，可以使用草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞、源自于桑蚕卵巢的培养的细胞等。

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞的实例包括Sf9和Sf21(《杆状病毒表达载体实验指南》(Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual))；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢细胞的实例包括High 5和BTI-TN-5Bl-4(InvitrogenCorp.)；并且源自于桑蚕卵巢的培养的细胞的实例包括家蚕(Bombyx mori)N4。

用于将上述重组基因转移载体和上述杆状病毒共同导入到昆虫细胞以制备重组病毒的方法的实例包括磷酸钙方法(特开平2-227075)和脂质体转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]。

在使用植物细胞作为宿主细胞的情形中，可以使用Ti质粒或烟草花叶病毒载体作为表达载体。

作为启动子，可以使用任何启动子，只要它在植物细胞中起作用即可，并且实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和水稻肌动蛋白1启动子。

宿主细胞的实例包括烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麦、大麦等的植物细胞。

作为用于将重组载体导入到植物细胞中的方法，可以使用任何方法，只要它将DNA导入到植物细胞中即可，并且实例包括使用土壤杆菌(Agrobacterium)的方法(特开昭59-140885，特开昭60-70080，WO 94/00977)、电穿孔方法(特开昭60-251887)以及使用粒子枪(基因枪)的方法(特许第2606856号和特许第2517813号)。

6.生产本发明的蛋白质的方法

本发明的蛋白质可以通过下述方法来生产：将通过上述5的方法获得的转化体在培养基中培养，使本发明的蛋白质在培养物中产生并积累，并从所述培养物收集蛋白质。

上述用于生产本发明的蛋白质的转化体的宿主可以是任何宿主，例如细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，并且它优选为细菌，更优选为属于埃希氏杆菌属的微生物，甚至更优选为属于大肠埃希氏杆菌的微生物。

在使用酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞表达的情况下，可以获得连接有糖或糖链的蛋白质。

用于在培养基中培养上述转化体的方法可以遵照用于培养宿主的通用方法来进行。

作为用于培养通过使用原核生物例如大肠埃希氏杆菌或真核生物例如酵母作为宿主获得的转化体的培养基，可以使用天然培养基或合成培养基，只要它是含有可以被所述生物体同化的碳源、氮源、无机盐等并且所述转化体可以在其中高效培养的培养基即可。

作为碳源，可以使用能够被生物体同化的任何碳源，并且可以使用糖例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解物，有机酸例如乙酸和丙酸，以及醇例如乙醇和丙醇。

作为氮源，可以使用氨，有机或无机酸的铵盐例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵，和其他含氮化合物，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼、大豆饼水解物和各种不同的发酵性微生物细胞以及它们的消化产物。

作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

培养通常在好氧条件下进行，例如通过振摇培养或深部通气搅拌培养。培养温度优选为15至40℃，培养时间长度通常为5小时至7天。在培养期间将pH维持在3.0至9.0。通过使用有机或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行pH调节。

如有必要，在培养期间可以向培养基添加抗生素例如氨苄青霉素和四环素。

在对用包含诱导型启动子作为启动子的表达载体转化的微生物进行培养的情形中，如有必要可以向培养基添加诱导物。例如，在培养用包含lac启动子的表达载体转化的微生物的情形中，可以向培养基添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等；并且在培养用包含trp启动子的表达载体转化的微生物的情形中，可以向培养基添加吲哚丙烯酸等。

作为用于培养通过使用动物细胞作为宿主获得的转化体的培养基，可以使用常用培养基例如RPMI1640培养基[J.Am.Med.Assoc.,199,519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、DMEM培养基[Virology,8,396(1959)]和199培养基[Proc.Soc.Biol.Med.,73,1(1950)]，或已向这些培养基添加胎牛血清等的培养基。

培养通常在5％CO₂等的存在下，在25℃至40℃下，在pH 6至8的条件下进行1至7天。

如有必要，可以在培养期间向培养基添加抗生素例如卡那霉素、青霉素和链霉素。

作为用于培养通过使用昆虫细胞作为宿主获得的转化体的培养基，可以使用常用培养基例如TNM-FH培养基(由Pharmingen,Inc.制造)、Sf-900II SFM培养基(由LifeTechnologies,Inc.制造)、ExCell 400和ExCell 405(两者都由JRH Biosciences,Inc.制造)和Grace的昆虫培养基[Nature,195,788(1962)]。

培养通常在25至30℃、pH 6至7等的条件下进行1至5天。

如有必要，可以在培养期间向培养基添加抗生素例如庆大霉素。

通过使用植物细胞作为宿主获得的转化体可以作为细胞进行培养或在分化成植物细胞或植物器官后进行培养。作为用于培养转化体的培养基，可以使用常用培养基例如Murashige和Skoog(MS)培养基、White培养基以及已向这些培养基添加植物激素例如植物生长素和细胞分裂素的培养基。

培养通常在20℃至40℃、pH 5至9的条件下进行3至60天。

如有必要，可以在培养期间向培养基添加抗生素例如卡那霉素和潮霉素。

用于生产本发明的蛋白质的方法包括在宿主细胞内部生产的方法、分泌到宿主细胞外部的方法以及在宿主细胞外膜上生产的方法。待生产的蛋白质的结构可以根据所选方法而变。

在本发明的蛋白质在宿主细胞中或在宿主细胞外膜上生产的情形中，可以通过使用Paulson等的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]或在特开平5-336963、WO 94/23021等中描述的方法，将蛋白质主动分泌到宿主细胞外部。

具体来说，可以通过使用遗传工程技术，通过以在含有本发明的蛋白质的活性位点的蛋白的上游添加信号肽的形式生产所述蛋白质，将本发明的蛋白质主动分泌到宿主细胞外部。

也可以按照特开平2-227075中描述的方法，通过利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统来提高生产水平。

此外，通过导入有基因的动物或植物细胞的重新分化，可以构建导入有基因的动物(非人类转基因动物)或植物(转基因植物)，并且可以使用它们来生产本发明的蛋白质。

在生产本发明的蛋白质的转化体是动物或植物的情形中，可以通过按照通用方法饲养动物或培养植物，使所述蛋白质形成并积累，并从所述动物或植物收集蛋白质，来生产所述蛋白质。

使用动物生产本发明的蛋白质的方法包括例如在按照已知方法通过基因导入构建的动物中生产本发明的蛋白质的方法[Am.J.Clin.Nutr.,63,639S(1996)；Am.J.Clin.Nutr.,63,627S(1996)；Bio/Technology,9,830(1991)]。

在动物的情形中，可以例如如下生产本发明的蛋白质：饲养已导入有本发明的DNA或在本发明的生产方法中使用的DNA的非人类转基因动物，使所述蛋白质在所述动物中产生并积累，并从所述动物收集所述蛋白质。动物中产生并积累所述蛋白质的位置包括动物的奶(特开昭63-309192)、蛋等。作为在这一方法中使用的启动子，可以使用任何启动子，只要它在所述动物中起作用即可，并且例如可以优选地使用乳腺细胞特异性启动子例如α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。

使用植物生产本发明的蛋白质的方法包括例如通过以下步骤来生产所述蛋白质的方法：对已按照已知方法[Soshiki Baiyo(Tissue Culture),20(1994)；Soshiki Baiyo,21(1995)；Trends Biotechnol.,15,45(1997)]在其中导入编码本发明的蛋白质的DNA的转基因植物进行培养，使所述蛋白质在所述植物中产生并积累，并从所述植物收集所述蛋白质。

作为分离和/或纯化使用产生本发明的蛋白质的转化体生产的本发明的蛋白的方法，可以使用用于分离和纯化酶的通用方法。

例如，在本发明的蛋白质在细胞中以可溶状态生产的情形中，在培养完成后通过离心收集细胞，将其悬浮在水性缓冲液中，然后使用超声仪、French压力器、Manton Gaulin匀浆器、Dynomill等破碎，以获得无细胞提取物。

通过单独或组合地使用用于分离和纯化酶的通用方法，可以从通过无细胞提取物的离心获得的上清液制备纯化的蛋白质。所述通用方法包括溶剂萃取、使用硫酸铵等的盐析、脱盐、使用有机溶剂的沉淀、使用诸如二乙基氨基乙基(DEAE)-Sepharose或DIAIONHPA-75(由Mitsubishi Kasei Corp.制造)的树脂的阴离子交换层析、使用诸如S-Sepharose FF(由GE Healthcare Biosciences制造)的树脂的阳离子交换层析、使用诸如丁基Sepharose和苯基Sepharose的树脂的疏水层析、使用分子筛的凝胶过滤、亲和层析、层析聚焦和电泳例如等电聚焦。

在所述蛋白质在细胞中以不溶体的形式生产的情形中，类似地将细胞收集并破碎，离心以获得沉淀物级分，并在通过常用方法从沉淀物级分回收所述蛋白质后，使用蛋白质变性剂溶解所述蛋白质的不溶体。

可以通过将溶解的溶液用不含蛋白质变性剂的溶液或含有不使蛋白质变性的低浓度蛋白质变性剂的溶液进行稀释或透析，将所述蛋白质构建成具有正常的三维结构，然后进行与上述相似的分离和纯化方法，来制备纯化的蛋白质。

在本发明的蛋白质或其衍生物例如糖基化形式被分泌到细胞外的情形中，可以在培养上清液中回收所述蛋白质或其衍生物例如糖基化形式。

具体来说，通过与上述类似的手段例如离心对培养物进行处理以获得可溶性级分，并且可以使用与上述类似的分离和纯化方法从所述可溶性级分制备纯化的蛋白质。

以上述方式获得的蛋白质的实例包括包含由SEQ ID NO：3-37中的任一个表示的氨基酸序列的蛋白质。

此外，本发明的蛋白质可以作为与另一种蛋白质的融合蛋白来生产，并使用对融合蛋白具有亲和性的物质通过使用亲和层析来纯化。例如，可以按照Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]或在特开平5-336963和WO 94/23021中描述的方法将本发明的蛋白质作为与蛋白A的融合蛋白来生产，并使用免疫球蛋白G通过亲和层析来纯化。

本发明的蛋白质也可以作为与Flag肽的融合蛋白来生产，并使用抗Flag抗体通过亲和层析来纯化[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]，或者可以作为与聚组氨酸的融合蛋白来生产，并使用对聚组氨酸具有高亲和性的金属配位的树脂通过亲和层析来纯化。此外，可以使用针对蛋白质本身的抗体，通过亲和层析来纯化蛋白质。

可以根据上面获得的关于蛋白质的氨基酸序列信息，通过化学合成方法例如Fmoc方法(芴甲氧羰基方法)和tBoc方法(叔丁氧羰基方法)来生产本发明的蛋白质。此外，可以使用来自于Advanced ChemTech、Perkin-Elmer、Pharmacia、Protein TechnologyInstrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、Shimadzu Corporation等的肽合成仪来化学合成所述蛋白质。

7.使用本发明的蛋白质测量糖化六肽的方法

本发明的蛋白质具有通过作用于糖化六肽而产生过氧化氢的特征，所述糖化六肽是在蛋白酶作用于糖化血红蛋白后从糖化血红蛋白产生的；因此，它们可用于测量各种不同类型样品中的糖化蛋白。具体来说，可以如下测量样品中的糖化血红蛋白：将样品与蛋白酶反应以产生糖化六肽，将产生的糖化六肽与本发明的蛋白质反应，并测量由糖化六肽与本发明的蛋白质之间的反应产生的物质或在糖化六肽与本发明的蛋白质之间的反应中消耗的物质。与样品中糖化血红蛋白的测量相关的反应，可以在下面描述的水性介质中进行。本发明中的糖化血红蛋白是例如HbA1c。

下面描述本发明的测量方法。

(待测量的样品和组分)

对在本发明的测量方法中使用的样品没有特别限制，只要它含有糖化血红蛋白即可，并且实例包括生物样品例如全血、血浆、血清、血细胞、细胞样品、尿液、脊髓液、汗液、泪液、唾液、皮肤、粘膜和毛发。作为样品，全血、血浆、血清、血细胞等是优选的，全血、血细胞等是特别优选的。全血包括源自于全血的血细胞级分与血浆混合的样品。对于这些样品来说，可以使用经历预处理例如溶血、分离、稀释、浓缩和纯化的样品。

血红蛋白α-链的N端处的三个氨基酸的序列是缬氨酸-亮氨酸-丝氨酸，β-链的N端处的三个氨基酸的序列是缬氨酸-组氨酸-亮氨酸。HbA1c被定义为其中具体来说β-链的N-端缬氨酸残基被糖化的血红蛋白。此外，已知血红蛋白在分子内具有多个糖化位点，包括α-链的N端(The Journal of Biological Chemistry(1980),256,3120-3127)。

通过使蛋白酶作用于含有糖化血红蛋白的样品，产生糖化氨基酸和/或糖化寡肽，例如α-FV、α-FVH、源自于其中β-链的N-端缬氨酸残基被糖化的糖化血红蛋白的α-F6P、α-FV、α-糖化的缬氨酰亮氨酸(在后文中简写为α-FVL)、源自于其中α-链的N-端缬氨酸残基被糖化的糖化血红蛋白的α-果糖基Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Asp以及源自于α-链和/或β-链内部的赖氨酸残基的ε-氨基的糖化的ε-FK。

此外，在样品是全血的情况下，也从全血中除了糖化血红蛋白之外的糖化蛋白例如糖化白蛋白产生糖化氨基酸例如ε-FK。

也就是说，在使蛋白酶作用于含有纯化的血红蛋白的样品或含有全血的样品的情形中，产生例如α-F6P、α-FVH、α-FV、ε-FK和α-FVL，其中α-F6P、α-FVH和α-FVL源自于糖化血红蛋白，并且α-F6P和α-FVH具体来说源自于HbA1c。

因此，在测量HbA1c的情况下，人们可以具体地测量α-F6P或α-FVH。本发明的蛋白质对α-F6P具有高反应性；因此，可以有效地测量HbA1c。

在由国际临床化学联盟(International Federation of Clinical Chemistry)(IFCC)宣布的用于HbA1c的参考测量程序中，HbA1c如下测量：通过内切蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)的作用从HbA1c切下糖化的N-端六肽(α-F6P)，然后通过HPLC分析α-F6P。在目前使用的用于HbA1c的酶测定法中，通过用蛋白酶处理HbA1c而产生的糖化二肽是测量靶。这是因为大多数已知糖化肽氧化酶不识别比糖化二肽更长的糖化肽。因此，如果人们能够开发基于测量HbA1c的原理使用糖化六肽作为测量靶的酶测定法，则与IFCC参考测量程序相符的酶测定法将变得可能，并且它被认为在工业上是非常有意义的。

(蛋白酶)

作为可用于本发明的蛋白酶，可以使用任何蛋白酶，只要它作用于样品中包含的待测量的糖化血红蛋白以产生糖化六肽即可，并且实例包括蛋白酶和肽酶例如内切蛋白酶Glu-C、V8蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶P、链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、分散酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶和氨肽酶，特别优选的实例包括内切蛋白酶Glu-C和V8蛋白酶。

样品的蛋白酶处理的条件可以是任何条件，只要它能够使所用的蛋白酶作用于作为测量靶的糖化血红蛋白以在短时间段内高效释放α-F6P即可。所使用的蛋白酶的量根据样品中的HbA1c含量、处理条件等适合地选择，并且作为实例，添加内切蛋白酶Glu-C(例如由Roche Diagnostics制造的)以使终浓度变成0.1至50U/mL，或优选为1至10U/mL。如果需要，可以适合地添加其他蛋白酶。在蛋白酶处理期间，pH可以不调节，或者可以例如使用适合的pH调节剂例如盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠或氢氧化钾调节到适合于待使用的蛋白酶的作用的pH，例如pH 2至9，或优选地pH 3至8。处理温度可以为20℃至50℃，并且取决于所使用的酶，可以使用更高的范围例如45℃至70℃。对处理花费的时间没有限制，只要所述时间足够HbA1c的降解即可，并且实例包括5秒至180分钟，优选为1至60分钟。在处理后获得的溶液不用进一步处理即可使用，或在需要时在适当的加热、离心、浓缩、稀释等后使用，并作为含有糖化六肽的样品经历糖化六肽氧化酶的反应。

(测量方法)

本发明的样品中待测量的糖化血红蛋白可以通过顺序执行下列步骤(i)至(iii)来测量：

(i)通过将样品中的糖化血红蛋白与蛋白酶进行反应，产生糖化六肽；

(ii)将产生的糖化六肽与本发明的蛋白质反应；以及

(iii)测量在步骤(ii)中产生或消耗的物质。

上述步骤(i)至(iii)可以在水性介质中进行。水性介质的实例包括去离子水、蒸馏水和缓冲液，并且缓冲液是优选的。在缓冲液中使用的缓冲剂的实例包括三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂(Tris缓冲剂)、磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂和Good’s缓冲剂。

Good’s缓冲剂的实例包括2-吗啉乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]-甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)和N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)。

对缓冲液的浓度没有特别限制，只要它适合于测量即可，但所述浓度优选为0.001mol/L至2.0mol/L，更优选为0.005mol/L至1.0mol/L。

对于每个步骤中的反应来说，反应温度为例如10℃至50℃，优选为20℃至40℃，并且反应时间为1秒至60分钟，优选为1至10分钟。

对于本发明的糖化血红蛋白测量方法来说，在将含有糖化血红蛋白的样品与蛋白酶反应的步骤中，糖化血红蛋白的变性剂或氧化剂可能共存。或者，可以将含有糖化血红蛋白的样品预先用变性剂或氧化剂处理，然后可以使处理过的样品经历与蛋白酶的反应。对变性剂没有特别限制，只要它能够使本发明的测量方法进行即可，并且实例包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性表面活性剂。对氧化剂没有特别限制，只要它能够使本发明的测量方法进行即可，并且实例包括碘酸钾、高碘酸钾和溴酸钾。

如果蛋白酶不影响步骤(ii)的反应，在进行步骤(i)后不必将其特别失活，并且可以进行加热、冷却、离心、膜过滤、抑制剂添加等，以使酶在步骤(ii)中不起作用。

在步骤(ii)中，反应溶液中由于糖化六肽与本发明的蛋白质之间的反应而产生的产物包括过氧化氢、邻酮醛糖(α-酮基醛)和肽。此外，在步骤(ii)中，被糖化六肽与本发明的蛋白质之间的反应消耗的物质是例如氧分子。例如使用氧电极通过电化学测量方法来测量在步骤(ii)中消耗的氧分子。

在本发明的步骤(ii)中产生的过氧化氢可以使用例如光学技术或电化学技术来测量。光学技术的实例包括吸光度方法和发光方法。具体实例包括使用用于测量过氧化氢的试剂的光学测定和使用过氧化氢电极的电化学测定。

用于测量过氧化氢的试剂是用于将产生的过氧化氢转变成可检测物质的试剂。可检测物质的实例包括染料和光，并且染料是优选的。

在可检测物质是染料的情况下，用于测量过氧化氢的试剂包括过氧化活性物质例如过氧化物酶和氧化性着色发色体。氧化性着色发色体的实例包括氧化偶联类型的发色体和隐色发色体，其在后面描述。

在可检测物质是光的情况下，用于测量过氧化氢的试剂包括化学发光物质，其包括生物发光物质。实例包括鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯和草酸酯。

在使用包含过氧化活性物质例如过氧化物酶和氧化性着色发色体的试剂作为测量过氧化氢的试剂的情形中，过氧化氢可以如下测量：将过氧化氢与氧化性着色发色体在过氧化活性物质存在下进行反应以产生染料，然后测量产生的染料。此外，在使用包含化学发光物质的测量过氧化氢的试剂的情形中，过氧化氢可以如下测量：将过氧化氢与化学发光物质进行反应以产生光子，然后测量产生的光子。

氧化偶联类型的发色体是在过氧化活性物质例如过氧化物酶存在下与过氧化氢反应，通过氧化偶联反应产生染料的发色体。氧化偶联类型的发色体的具体实例包括偶联剂例如4-氨基安替比林以及酚型或苯胺型氢供体。偶联剂和酚型或苯胺型氢供体化合物在过氧化氢和过氧化活性物质存在下经历氧化偶联，以产生染料。

偶联剂的实例包括4-氨基安替比林(4-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。

酚型氢供体的实例包括苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚和3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)。

苯胺型氢供体的实例包括N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)、N-[2-(琥珀酰基氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(MASE)和N-乙基-N-[2-(琥珀酰基氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(Et-MASE)。

隐色发色体是自身通过在过氧化活性物质例如过氧化物酶存在下与过氧化氢反应产生染料的发色体。具体实例包括10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)、4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)、N,N,N’,N’,N”,N”-六-3-磺丙基-4,4’,4”-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)、二氨基联苯胺、羟基苯基丙酸、四甲基联苯胺和邻苯二胺。

在过氧化氢的测量中，对过氧化活性物质的浓度没有特别限制，只要它适合于测量即可；并且在使用过氧化物酶作为过氧化活性物质的情形中，浓度优选为1U/mL至100U/mL，更优选为2U/mL至50U/mL。对氧化性着色发色体的浓度没有特别限制，只要它适合于测量即可；并且它优选为0.01g/L至10g/L，更优选为0.02g/L至5g/L。

在使用过氧化氢电极测量过氧化氢的情形中，对所使用的电极没有特别限制，只要它是允许与过氧化氢进行电子转移的材料即可，实例包括铂、金和银。作为测量方法，可以使用已知方法例如电流分析法、电位分析法和电量分析法。通过在电极与氧化酶或底物之间的反应中插入电子转移物质，也可以测量得到的氧化或还原电流或其电量。

可以使用具有转移电子功能的任何物质作为电子转移物质，并且实例包括诸如二茂铁衍生物和醌衍生物的物质。此外，通过在电极与通过氧化酶反应产生的过氧化氢之间插入电子转移物质，可以测量得到的氧化或还原电流或其电量。

在步骤(ii)中，与过氧化氢一起产生邻酮醛糖(一种α-酮基醛)；因此，也可以通过测量产生的邻酮醛糖(一种α-酮基醛)来测量样品中的糖化血红蛋白。通过使葡萄糖氧化酶作用于所述α-酮基醛并通过也测量产生的过氧化氢，可以获得高度灵敏的测量(特开2000-333696)。

(用于制备样品的方法)

如有必要，可以从生物样品分离含有待测量的糖化蛋白的样品。分离方法的实例包括离心、过滤和使用血细胞分离膜的方法。例如，通过离心分离的方法能够将全血分离成血细胞和血浆或血清。如有必要，可以将血细胞用等渗溶液例如生理盐水溶液洗涤，以获得源自于血浆的组分已被去除的洗涤过的血细胞。

在使用血细胞作为样品的情形中，可以通过使用低渗溶液稀释含有血细胞的样品例如全血、血细胞或洗涤过的血细胞，来进行溶血。可以使用任何低渗溶液，只要它能够引起血细胞的溶血即可；实例包括水和缓冲液，并且所述低渗溶液优选地含有添加剂例如表面活性剂。表面活性剂的实例包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性表面活性剂。

用于制备洗涤过的血细胞的方法包括下述方法。

从健康个体和糖尿病患者收集血液，并通过颠倒进行混合，然后将其在25℃下离心(3,000rpm)5分钟。在离心后，除去上清血浆。对于1份下部血细胞层来说，加入4份生理盐水溶液，并将混合物通过颠倒进行混合，并在25℃下进行5分钟离心(3,000rpm)。在离心后，除去上清生理盐水溶液。在将该洗涤操作重复三次后，向1份洗涤过的血细胞层加入9份蒸馏水，以产生洗涤过的血细胞。

(用于测量糖化血红蛋白的试剂和试剂盒)

本发明的用于测量糖化血红蛋白的试剂和用于测量糖化血红蛋白的试剂盒可用于本发明的测量糖化血红蛋白的方法中。本发明的用于测量糖化血红蛋白的试剂可以采取试剂盒的形式作为适合于储存、运输和分配的形式。试剂盒的形式的实例包括双试剂系统和三试剂系统。

本发明的用于测量糖化血红蛋白的试剂包含蛋白酶和本发明的蛋白质。此外，本发明的用于测量糖化血红蛋白的试剂可以包含用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂。由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的实例包括过氧化氢、邻酮醛糖(一种α-酮基醛)和肽(Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)。用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的实例包括用于测量过氧化氢的试剂、用于测量邻酮醛糖(一种α-酮基醛)的试剂和用于测量肽(Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)的试剂，并且用于测量过氧化氢的试剂是优选的。

本发明的用于测量待测量的糖化血红蛋白的试剂盒的实例包括下列实施方式的试剂盒：

-试剂盒1(双试剂系统试剂盒)

包含下列两种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶的试剂；和

(2)包含本发明的蛋白质的试剂。

-试剂盒2(双试剂系统试剂盒)

包含下列两种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶的试剂；和

(2)包含本发明的蛋白质和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂。

-试剂盒3(双试剂系统试剂盒)

包含下列两种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂；和

(2)包含本发明的蛋白质的试剂。

-试剂盒4(双试剂系统试剂盒)

包含下列两种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂；和

(2)包含本发明的蛋白质和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂。

-试剂盒5(三试剂系统试剂盒)

包含下列三种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶的试剂；

(2)包含本发明的蛋白质的试剂；和

(3)用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂。

-试剂盒6(三试剂系统试剂盒)

包含下列三种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂；

(2)包含本发明的蛋白质的试剂；和

(3)用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂。

-试剂盒7(三试剂系统试剂盒)

包含下列三种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶的试剂；

(2)包含本发明的蛋白质和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂；和

(3)用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂。

-试剂盒8(三试剂系统试剂盒)

包含下列三种试剂的试剂盒：

(1)包含蛋白酶和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂；

(2)包含本发明的蛋白质和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的试剂；和

(3)用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂。

在本发明的用于测量的试剂和试剂盒中使用的每种蛋白酶、本发明的蛋白质、糖化血红蛋白和用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂的实例包括上面提到的那些。

在用于测量由本发明的蛋白质与从糖化血红蛋白产生的糖化六肽之间的反应所产生的产物的试剂是用于测量过氧化氢的试剂的情形中，用于测量过氧化氢的试剂的实例包括上述用于测量过氧化氢的试剂。在使用氧化偶联类型的发色体作为用于测量过氧化氢的试剂的情形中，偶联剂和酚型或苯胺型氢供体可以被包含在同一试剂中；并且它们优选地被包含在分开的试剂中。

本发明的用于测量的试剂和用于测量的试剂盒还可以包含用于测量的标准物质例如标准蛋白质。

如有必要，本发明的用于测量的试剂和用于测量的试剂盒可以包含缓冲剂、稳定剂、防腐剂、用于除去影响物质的试剂、用于抑制非特异性反应的试剂、表面活性剂等。缓冲剂的实例包括上面描述过的缓冲剂。稳定剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、氨基酸、白蛋白、葡聚糖和盐例如乙酸钙。防腐剂的实例包括叠氮钠和抗生素。用于除去影响物质的试剂的实例包括用于消除抗坏血酸影响的抗坏血酸氧化酶。用于抑制非特异性反应的试剂的实例包括聚合化合物例如硫酸葡聚糖。表面活性剂的实例包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性表面活性剂。

本发明的用于测量的试剂和试剂盒可以处于冷冻干燥状态或溶解在反应溶液中的状态下。在使用处于冷冻干燥状态下的试剂盒的情形中，试剂盒可以在溶解在上述水性介质或反应溶液中后使用。在使用处于冷冻干燥状态下的试剂盒的情形中，如有必要，可以在试剂盒中包含用于溶解冷冻干燥的试剂的试剂等。

本发明的用于测量的试剂盒中蛋白酶的含量优选为在溶解在水性介质中的状态下提供0.01U/mL至1,000,000U/mL的浓度、更优选为0.1U/mL至100,000U/mL的浓度的含量。

本发明的用于测量的试剂盒中本发明的蛋白质的含量优选为在溶解在水性介质中的状态下提供0.01U/mL至10,000U/mL的浓度、更优选为0.1U/mL至1,000U/mL的浓度的含量。

在使用包含过氧化物酶和氧化偶联类型的发色体的试剂作为用于测量过氧化氢的试剂的情形中，试剂盒中过氧化物酶和氧化偶联类型的发色体的含量优选为在溶解在水性介质中的状态下分别提供1U/mL至600U/mL和0.5g/L至40g/L的浓度、更优选地分别提供2U/mL至150U/mL和1g/L至20g/L的浓度的含量。

(用于直接测量糖化血红蛋白的方法)

本发明的蛋白质包括具有直接氧化糖化血红蛋白以产生过氧化氢的活性(在后文中称为糖化血红蛋白氧化酶活性)的蛋白质。通过使用具有糖化血红蛋白氧化酶活性的蛋白质(在后文中称为糖化血红蛋白氧化酶)，可以在不需要蛋白酶对糖化血红蛋白的作用下，通过本发明的糖化血红蛋白氧化酶直接作用于糖化血红蛋白以产生过氧化氢，然后测量该过氧化氢，来直接测量糖化血红蛋白。

本发明的糖化血红蛋白氧化酶可以是具有直接氧化糖化血红蛋白的能力的任何糖化六肽氧化酶，并且实例包括下列糖化六肽氧化酶：

[1]一种蛋白质，其包含由SEQ ID NO：6至37中的任一个表示的氨基酸序列；以及

[2]一种蛋白质，其包含与由SEQ ID NO：6至37表示的氨基酸序列具有90％或更高、例如94％或更高、优选地95％或更高、更优选地96％或更高、甚至更优选地97％或更高、甚至更优选地98％或更高、特别优选地99％或更高的同源性，并具有糖化血红蛋白氧化酶活性的氨基酸序列。

对于本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的方法来说，在含有糖化血红蛋白的样品与糖化血红蛋白氧化酶反应的步骤中，变性剂或氧化剂可能共存。或者，可以将含有糖化血红蛋白的样品预先用变性剂或氧化剂处理，然后可以使处理过的样品经历与糖化血红蛋白氧化酶的反应。变性剂和氧化剂的实例分别包括上面提到过的变性剂和氧化剂。

(用于测量糖化血红蛋白氧化酶活性的方法)

糖化血红蛋白氧化酶活性可以例如通过下述方法来测量。

(用于活性测量的试剂)

溶液A：0.1mol/L MOPS缓冲液(pH6.8)

溶液B：DA-67在DMF中的24mmol/L溶液

溶液C：过氧化物酶在0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/溶液

溶液D：10g/L的人类血细胞来源的溶血样品

溶液E：5g/L的碘酸钾和50％(v/v)AMPHITOL 20N(两性表面活性剂)的水性溶液

溶液F：糖化血红蛋白氧化酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的0.5至1.0U/mL溶液

(测量程序)

(i)将2μL溶液E混合在20μL溶液D中，并将其在37℃下温育10至30分钟。

(ii)向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并将获得的溶液以每个样品190μL的量分发到96孔微孔板中。然后加入20μL通过混合溶液D和E产生的溶液和20μL溶液F并混合。使用全自动微孔板EIA分析仪，在混合后立即测量溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的吸光度，然后通过在37℃温育60至120分钟进行酶反应，在660nm(主波长)/750nm(次波长)下测量获得的溶液的吸光度，并确定在酶反应之前和之后吸光度的变化。

上述步骤可以在水性介质中进行。水性介质的实例包括上面提到过的水性介质(优选为缓冲液)，并且缓冲液的浓度可以为例如上面提到过的缓冲液浓度。

对于每个步骤中的反应来说，反应温度为例如10℃至50℃，优选为20℃至40℃，并且反应时间为1秒至120分钟，优选为1至90分钟，特别优选为1至60分钟。

(用于直接测量糖化血红蛋白的试剂和试剂盒)

本发明的用于测量糖化血红蛋白的试剂包括用于直接测量糖化血红蛋白的试剂。本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的试剂可以用于本发明的测量糖化血红蛋白的方法中。通过使用本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的试剂，可以不使用蛋白酶，通过测量由糖化血红蛋白的直接氧化产生或消耗的物质，来测量糖化血红蛋白。本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的试剂可以采取试剂盒的形式作为适合于储存、运输和分配的形式。试剂盒的形式的实例包括双试剂系统和三试剂系统。

本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的试剂包含本发明的糖化血红蛋白氧化酶。此外，本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的试剂可以包含用于测量由本发明的糖化血红蛋白氧化酶与糖化血红蛋白之间的反应所产生的产物的试剂。由本发明的糖化血红蛋白氧化酶与糖化血红蛋白之间的反应所产生的产物的实例包括过氧化氢、邻酮醛糖(一种α-酮基醛)和血红蛋白。用于测量由本发明的糖化血红蛋白氧化酶与糖化血红蛋白之间的反应所产生的产物的试剂的实例包括用于测量过氧化氢的试剂、用于测量邻酮醛糖(一种α-酮基醛)的试剂和用于测量血红蛋白的试剂；并且用于测量过氧化氢的试剂是优选的。

本发明的用于直接测量糖化血红蛋白的试剂盒的实例包括下列实施方式的试剂盒：

包含下列两种试剂的试剂盒：

(1)包含糖化血红蛋白氧化酶的试剂；以及

(2)用于测量由糖化血红蛋白氧化酶与糖化血红蛋白之间的反应所产生的产物的试剂。

在本发明的用于直接测量的试剂和试剂盒中使用的糖化血红蛋白氧化酶和用于测量由糖化血红蛋白氧化酶与糖化血红蛋白之间的反应所产生的产物的试剂的实例分别包括上面提到的那些。

在用于测量由本发明的糖化血红蛋白氧化酶与糖化血红蛋白之间的反应所产生的产物的试剂是用于测量过氧化氢的试剂的情形中，用于测量过氧化氢的试剂的实例包括上面提到的用于测量过氧化氢的试剂。在使用氧化偶联类型的发色体作为用于测量过氧化氢的试剂的情形中，偶联剂和酚型或苯胺型氢供体可以被包含在同一试剂中；并且它们优选地被包含在分开的试剂中。

本发明的用于直接测量的试剂和用于直接测量的试剂盒还可以包含用于测量的标准品例如标准蛋白质。

如有必要，本发明的用于直接测量的试剂和用于直接测量的试剂盒可以各自包含上面提到的缓冲剂、稳定剂、防腐剂、用于除去影响物质的试剂、用于抑制非特异性反应的试剂、表面活性剂等。

本发明的用于直接测量的试剂和用于直接测量的试剂盒可以处于冷冻干燥状态或溶解在反应溶液中的状态下。在使用处于冷冻干燥状态下的试剂盒的情形中，试剂盒可以在溶解在上述水性介质或反应溶液中后使用。在使用处于冷冻干燥状态下的试剂盒的情形中，如有必要，可以在试剂盒中包含用于溶解冷冻干燥的试剂的试剂等。

在本发明的用于直接测量的试剂盒中，糖化血红蛋白氧化酶的含量优选为在溶解在水性介质中的状态下提供0.01U/mL至1,000,000U/mL的浓度、更优选地0.1U/mL至100,000U/mL的浓度的含量。

在使用包含过氧化物酶和氧化偶联类型的发色体的试剂作为用于测量过氧化氢的试剂的情形中，试剂盒中过氧化物酶和氧化偶联类型的发色体的含量优选为在溶解在水性介质中的状态下分别提供1U/mL至600U/mL和0.5g/L至40g/L的浓度、更优选地分别提供2U/mL至150U/mL和1g/L至20g/L的浓度的含量。

本文中引用的所有现有技术参考文献通过参考并入本说明书。

实施例

在下文中描述了实施例，但本发明不应被解释为受限于此。在本发明的实施例中使用了下列制造商的试剂、酶和仪器：

磷酸二氢钾(Wako Pure Chemical Industries)，磷酸氢二钾(Wako PureChemical Industries)，DA-67(由Wako Pure Chemical Industries制造)，过氧化物酶(由TOYOBO制造)，α-糖化缬氨酸(由Peptide Institute Inc.制造)，α-糖化六肽(由PeptideInstitute Inc.制造)，MOPS(由Dojindo Laboratories制造)，二甲基甲酰胺(由Wako PureChemical Industries制造)，碘酸钾(由Wako Pure Chemical Industries制造)，4-氨基安替比林(4-AA)(由Wako Pure Chemical Industries制造)，EMSE(由Daito ChemixCorporation制造)，四水氯化锰(由Wako Pure Chemical Industries制造)，异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(由Nacalai Tesque Inc.制造)，氯化钾(由Wako Pure ChemicalIndustries 制造)，咪唑(由Wako Pure Chemical Industries制造)，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(由Wako Pure Chemical Industries制造)，Luria-Bertani miller培养基(LB培养基)(由Becton,Dickinson and Company制造)，氨苄青霉素钠(由Wako PureChemical Industries制造)，KOD-Plus-(DNA聚合酶；由TOYOBO制造)，Dpn I(限制性酶；由New England Biolabs制造)，Bgl II(限制性酶；由Roche Applied Science制造),Xho I(限制性酶；由Roche Applied Science制造)，以及Competent high DH5α(大肠埃希式杆菌感受态细胞；由TOYOBO制造)。

[实施例1]FPOX-15表达质粒和表达FPOX-15的大肠埃希式杆菌菌株的构建

(pTrc-FPOX-9表达质粒的产生)

将在登记号FERM BP-11026下保藏的表达糖化肽氧化酶FPOX-9的大肠埃希式杆菌XL1-Blue MRF'菌株接种在3mL含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃振摇培养过夜。将培养溶液以8,000rpm离心2分钟以收集细菌细胞。使用由Promega制造的“WizardPlus SV Minipreps DNA纯化试剂盒”，从获得的细菌细胞提取在大肠埃希式杆菌细胞内部表达具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的糖化肽氧化酶FPOX-9的表达质粒pTrc-FPOX-9。

使用在国际公开号WO 2010/041715小册子中描述的方法，通过上述质粒pTrc-FPOX-9生产pTrc-FPOX-15表达质粒，其表达具有由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列并且具有出色的热稳定性和对作为糖化六肽的部分结构的α-FVH的反应特异性的FPOX-15。

(用于位点特异性氨基酸替换的方法)

使用pTrc-FPOX-15表达质粒作为模板DNA和其中被靶向突变的氨基酸的密码子被对应于替换氨基酸的密码子替换的引物对，使用下述试剂组成和PCR条件扩增PCR产物(含有突变的表达质粒)。按照随DNA聚合酶“KOD-Plus-”这种由TOYOBO制造的PCR试剂盒所提供的方案来进行PCR。

(试剂组成)

-反应缓冲液

-模板DNA 1至2ng/μL

-正向引物 0.3μmol/L

-反向引物 0.3μmol/L

-dNTP溶液混合物 各0.2mmol/L

-MgSO₄ 1mmol/L

-DNA聚合酶 0.02U/μL

-无菌水 添加到补足至50μL

(PCR条件)

1.94℃ 2分钟

2.98℃ 15秒

3.60℃ 30秒

4.68℃ 6分钟

5.重复2至4(总共30个循环)

6.68℃ 10分钟

向50μL PCR产物加入1μL由New England Biolabs制造的“限制性酶Dpn I”，并通过将其在37℃温育1小时，降解模板DNA。使用由Promega制造的“Wizard SV凝胶和PCR清洁系统”纯化经历过限制性酶处理的PCR产物，并使用一部分该样品转化由TOYOBO制造的大肠埃希式杆菌感受态细胞“Competent high DH5α”。选择在含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落，并使用由Promega制造的“Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化试剂盒”提取质粒。

使用DNA测序仪对提取的质粒进行序列分析，以证实含有由SEQ ID NO：39表示的编码FPOX-15的核苷酸序列的DNA的质粒的构建。对于序列分析来说，使用具有包含由SEQID NO：87和88表示的核苷酸序列(其分别反映出紧接pTrc99a载体的多克隆位点之前和之后的核苷酸序列)的DNA的引物，以及具有包含由SEQ ID NO：89表示的核苷酸序列(其是具有由SEQ ID NO：39表示的核苷酸序列的FPOX-15的核苷酸序列中第530至548位的核苷酸序列)的DNA的引物。

[实施例2]FPOX-15和本发明的蛋白质的生产，以及FPOX-15和本发明的蛋白质的糖化六肽氧化酶活性的测量

对于在酶修饰方法中显示出显著活性的突变体，遵照在国际公开号WO 2010/041715小册子中描述的糖化肽氧化酶FPOX-15的表达和纯化方法制备纯化的样品，以评估它们的活性。

由于作为本发明的蛋白质的糖化六肽氧化酶和糖化血红蛋白氧化酶携带黄素-腺嘌呤二核苷酸(在后文中写为FAD)作为辅酶，因此它们的蛋白浓度可以通过下列方法来测量，在所述方法中测量特异性源自于FAD的452nm处的吸光度。

使用10mmol/L磷酸盐缓冲液稀释可商购的糖化肽氧化酶FPOX-CE(由KikkomanCo.制造)，以制备各自具有下列浓度的每种FPOX-CE溶液：0.7，1.4，2.8，5.6和11.2mg/mL。使用由GE Healthcare 制造的“Ultrospec 2100pro”分光光度计，在452nm(主波长)/600nm(次波长)下对以每种浓度制备的FPOX-CE溶液进行吸光度测量，以制备指示了FPOX-CE浓度与吸光度之间的关系的校准曲线。使用同样的方法测量纯化的蛋白质的吸光度，区别在于使用纯化的蛋白质作为样品代替一系列FPOX-CE(由Kikkoman Co.制造)的稀释溶液。通过将纯化的蛋白质的实测吸光度值与上述校准曲线的值进行比较，确定纯化的蛋白质的蛋白浓度。

使用下列试剂和下列测量程序来评估获得的糖化血红蛋白氧化酶的糖化六肽氧化酶活性。

(用于活性测量的试剂)

溶液A：50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)

溶液B：DA-67在DMF中的24mmol/L溶液

溶液C：在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L过氧化物酶

溶液D：α-F6P的1mmol/L水性溶液

溶液E：本发明的糖化六肽氧化酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的0.1mg/mL溶液

(测量程序)

向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并且将获得的溶液以每个样品190μL的量分发到96孔板中。加入20μL溶液D和10μL溶液E并混合，并使其在30℃反应30分钟。使用全自动微孔板EIA分析仪(AP-96，由Kyowa Medex Co.,Ltd.制造)，测量溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应前吸光度Abs_(反应前)和在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应后吸光度Abs_(反应后)。通过从吸光度Abs_(反应后)减去吸光度Abs_(反应前)，确定由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)。空白的吸光度变化Δ'Abs_(空白)通过执行相似方法来确定，区别在于使用蒸馏水代替溶液E(蛋白质溶液)。通过从由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_{(蛋白质溶液)}减去空白的吸光度变化Δ'Abs_(空白)，获得反应吸光度ΔAbs_(反应)。

在上述测量体系中，使用各种不同浓度的过氧化氢代替溶液D来进行相似反应，并在660nm(主波长)/750(次波长)下测量反应之前和之后的吸光度变化，以制备显示出过氧化氢浓度与吸光度变化之间的关系的校准曲线。使用溶液D(底物溶液)和溶液E(蛋白质溶液)进行酶反应，并通过将伴随酶反应的吸光度变化与上述校准曲线中的值进行比较，确定酶反应中产生的过氧化氢的浓度。在使用α-F6P作为底物进行的酶反应中，在1分钟内产生1μmol过氧化氢的酶活性被定义为1U。基于前面确定的纯化的蛋白质的浓度和如上所述定义的酶活性两者，将使用的纯化的蛋白质的活性表示为比活性(U/mg)，其是1mg纯化的酶所具有的活性。此外，基于上面提到的比活性(U/mg)，将所使用的纯化的酶的活性表示为比活性(U/mL)，其是每1mL纯化的蛋白质溶液的总活性。

(位点特异性氨基酸替换)

使用pTrc-FPOX-15和源自于它的表达质粒作为模板DNA，通过实施例1中描述的方法引入位点特异性氨基酸替换。通过与实施例1中描述的用于引入位点特异性氨基酸替换的方法相似的方法来进行位点特异性饱和诱变，并且以SEQ ID NO：90和91的核苷酸序列为例，使用其中目标氨基酸位置被NNS代替的引物。N表示随机包含核苷酸A、T、G和C中的任一个，S表示随机包含核苷酸G和C中的任一个。

制备的突变体糖化肽氧化酶和构建的突变体糖化肽氧化酶文库通过下列方法来评估。选择在含有增补有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基的平板上在过夜培养中生长的菌落(转化体)。使用含有100μL增补有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基的96孔微孔板，将它们在37℃振摇培养12小时。向2μL培养物溶液加入10μL由Novagen制造的“BugBuster(注册商标)蛋白质提取试剂(在后文中写为BugBuster)”以裂解细菌细胞，并在离心后将上清液用作样品。

在制备的突变体糖化肽氧化酶文库中包含的突变体糖化肽氧化酶的α-FV氧化酶活性，使用下述试剂和下述测量程序来评估。

(用于活性评估的试剂)

-50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0) 10mL

-4-AA的10g/L水性溶液 100μL

-EMSE的10g/L水性溶液 100μL

-过氧化物酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L溶液 35μL

-80mmol/Lα-FV 62.5μL(测量程序)

将100μL每种用于评估的试剂分发在96孔微孔板的每个孔中，另外加入10μL样品，并将其在30℃温育30分钟。在温育之前和之后在550nm(主波长)/650nm(次波长)下进行测量，并选择显示出较大吸光度变化的克隆。

向含有200μL增补有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基的96孔微孔板加入2μL具有显著α-FV活性的克隆的培养物溶液，并将其在37℃振摇培养2小时。在培养后，加入2μL10mmol/L IPTG(由Nacalai Tesque Inc.制造)，并将其在37℃继续振摇培养5小时。在培养后，通过离心收集细菌细胞。向获得的细菌细胞加入20μL BugBuster，并在细菌细胞裂解和离心后，使用上清液作为样品来测量糖化六肽氧化酶活性。

对于突变体的筛选来说，使用下述试剂和下述测量程序评估糖化六肽氧化酶对α-F6P的活性。

(用于活性评估的试剂)

-50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0) 10mL

-DA-67在DMF中的24mmol/L溶液 12.6μL

-过氧化物酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L溶液 35μL

-α-F6P的0.25mmol/L水性溶液 720μL

(测量程序)

将30μL每种用于活性评估的试剂分发到384孔板中，加入5μL样品，并将其在30℃温育1小时。在温育后观察每个孔，并选择具有显著强的显色的克隆。

同时，从每个转化体制备质粒，并按照实施例1的方法使用DNA测序仪验证FPOX基因部分的核苷酸序列。然后将酶活性的变化与核苷酸序列(氨基酸序列)的变化相关联。

使用具有包含由SEQ ID NO：90和91表示的核苷酸序列的DNA的引物对，向表达FPOX-15的pTrc-FPOX-15质粒引入位点特异性饱和突变。使用引入有位点特异性饱和突变的质粒，构建了一组突变体，其包含其中FPOX-15的61位处的精氨酸被精氨酸之外的19种氨基酸替换的蛋白质。使用α-FV和α-F6P活性作为指标来评估该组构建的突变体，并且如表1中所示，发现每个突变体的糖化六肽氧化酶活性都显著提高。具体来说，在该组突变体中，其61位被甘氨酸替换的突变体(在后文中称为FPOX-16)的α-F6P活性是FPOX-15的63.9倍，其61位被丝氨酸替换的突变体(在后文中称为FPOX-17)的α-F6P活性是FPOX-15的67.7倍，并且它们的糖化六肽氧化酶活性提高。FPOX-16和FPOX-17的氨基酸序列分别示出在SEQ IDNO：3和4中。

表1

＊当将FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

接下来，使用具有包含由SEQ ID NO：92和93表示的核苷酸序列的DNA的引物对，通过向FPOX-16引入靶向63位处的精氨酸的位点特异性饱和突变，来构建突变体文库。作为使用对α-FV和α-F6P的氧化酶活性作为指标评估文库的结果，获得了替换成丙氨酸、脯氨酸或甘氨酸的突变体。如表2中所示，上述突变体显示出的对α-F6P的糖化六肽氧化酶活性是FPOX-16的2至2.7倍。特别是，通过用丙氨酸替换，糖化六肽氧化酶活性显示出最大的提高。

表2

*当将FPOX-16的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

**当将FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

使用通过向FPOX-16引入位点特异性饱和突变而构建的突变体文库进行的筛选证实了用丙氨酸替换63位处的精氨酸提高了糖化六肽氧化酶活性，并使用具有包含由SEQ IDNO：94和95表示的核苷酸序列的DNA的引物对向FPOX-17引入该突变，以获得其中FPOX-17的氨基酸序列中63位处的精氨酸被丙氨酸替换的突变体。接下来，使用具有包含SEQ ID NO：96和97的核苷酸序列的DNA的引物对，对位于被发现对糖化六肽氧化酶活性的提高有贡献的61和63位处的氨基酸之间的62位处的亮氨酸进行饱和诱变，以通过引入位点特异性饱和突变来构建突变体文库。作为使用对α-FV和α-F6P的氧化酶活性作为指标来评估文库的结果，获得了替换成甘氨酸的突变体(在后文中称为FPOX-18)。如表3中所示，上述突变引起对α-F6P的氧化酶活性提高为FPOX-17的2.8倍。FPOX-17和FPOX-18的氨基酸序列分别示出在SEQ ID NO：4和5中。

表3

*当将FPOX-17的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

**当将FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

通过位点特异性氨基酸替换，通过使用具有包含由SEQ ID NO：98和99表示的核苷酸序列的DNA的引物对获得了其中FPOX-18的93位处的谷氨酰胺被谷氨酸替换的突变体，并通过使用具有包含由SEQ ID NO：100和101表示的核苷酸序列的DNA的引物对获得了其中267位处的苯丙氨酸被酪氨酸替换的突变体。如表4中所示，对α-F6P的糖化六肽氧化酶活性分别提高为FPOX-18的1.3倍和1.5倍。

表4

*当将FPOX-18的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

**当将FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

接下来，使用pTrc-FPOX-18作为模板DNA，使用糖化六肽氧化酶活性作为指示，检查随机突变的引入。

(用于检查随机突变的质粒的构建)

首先，通过与实施例1的方法类似的方法获得含有编码FPOX-18的DNA的pTrc-FPOX-18质粒。然后，使用所述质粒作为模板DNA，并通过使用具有包含由SEQ ID NO：102和103表示的核苷酸序列的DNA的引物对，通过与实施例1的用于引入位点特异性氨基酸替换的方法类似的方法将FPOX-18基因中168位处的腺嘌呤用鸟嘌呤替换，引入了Bgl II限制性酶位点而不伴有氨基酸替换。获得的修饰的质粒被称为pTrc-FPOX-18'。

为了进行随机突变，使用具有包含由SEQ ID NO：102和104表示的核苷酸序列的DNA并被设计用于扩增对应于pTrc-FPOX-18'中包含的FPOX基因中第58至119位氨基酸的区域的引物对，并使用下述试剂组成和PCR条件，通过PCR随机进行核苷酸替换。通过部分修改由TOYOBO制造的PCR试剂盒“rTaq DNA聚合酶”的方案，使用易错(Error Prone)PCR来进行PCR。

(试剂组成)

-反应缓冲液

-模板DNA 0.2ng/μL

-正向引物 1μmol/L

-反向引物 1μmol/L

-MgCl₂ 7mmol/L

-MnCl₂ 0.5mmol/L

-dATP 0.2mmol/L

-dTTP 1mmol/L

-dGTP 0.1mmol/L

-dCTP 1mmol/L

-DNA聚合酶 0.04U/μL

(PCR条件)

1.94℃ 3分钟

2.94℃ 30秒

3.50℃ 30秒

4.72℃ 30秒

5.重复步骤2至4(总共45个循环)

6.72℃ 1分钟

使用限制性酶Bgl II和Xho I消化含有随机核苷酸替换的PCR引物，然后将其使用“Wizard SV凝胶和PCR清洁系统”纯化以获得消化产物。使用由Takara Bio Inc.制造的“DNA连接试剂盒Mighty Mix”，将上述消化产物连接到用相同的限制性酶处理的pTrc-FPOX-18'，并将其用于转化大肠埃希氏杆菌DH5α菌株。

作为使用pTrc-FPOX-18'作为模板DNA的随机突变试验的结果，获得pTrc-FPOX-18A质粒，其表达具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的FPOX-18A，其中半胱氨酸替换了具有由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列的FPOX-18的氨基酸序列中71位处的酪氨酸。此外，通过使用pTrc-FPOX-18'作为模板DNA并使用具有包含由SEQ ID NO：105和106表示的核苷酸序列的DNA的引物对引入位点特异性饱和突变，构建了一组突变体。作为使用对α-FV和α-F6P的氧化酶活性作为指标评估所述突变体的结果，获得了pTrc-FPOX-18B质粒，其表达具有由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列的FPOX-18B，其中丝氨酸替换了具有由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列的FPOX-18的氨基酸序列中71位处的酪氨酸。

通过靶向其糖化六肽氧化酶活性因随机突变而被发现提高的具有由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列的FPOX-18的氨基酸序列的115位处的天冬氨酸，通过使用pTrc-FPOX-18B作为模板DNA，并通过使用具有包含由SEQ ID NO：107和108表示的核苷酸序列的DNA的引物对来引入位点特异性饱和突变，构建了一组突变体。作为使用对α-FV和α-F6P的氧化酶活性作为指标评估所述突变体的结果，获得了pTrc-FPOX-18C质粒和pTrc-FPOX-18D质粒。pTrc-FPOX-18C质粒表达具有由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的FPOX-18C，其中天冬酰胺替换了具有由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列的FPOX-18B的氨基酸序列中115位处的天冬氨酸。pTrc-FPOX-18D质粒表达具有由SEQ ID NO：9表示的氨基酸序列的FPOX-18D，其中精氨酸替换了具有由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列的FPOX-18B的氨基酸序列中115位处的天冬氨酸。

此外，通过靶向其糖化六肽氧化酶活性因随机突变而被发现提高的具有由SEQ IDNO：5表示的氨基酸序列的FPOX-18的氨基酸序列的108位处的甲硫氨酸，通过使用pTrc-FPOX-18D作为模板DNA，并通过使用具有包含由SEQ ID NO：109和110表示的核苷酸序列的DNA的引物对来引入位点特异性饱和突变，构建了一组突变体。作为使用对α-FV和α-F6P的氧化酶活性作为指标评估所述突变体的结果，获得了pTrc-FPOX-19质粒，其表达具有由SEQID NO：10表示的氨基酸序列的FPOX-19，其中赖氨酸替换了具有由氨基酸序列SEQ ID NO：9表示的氨基酸序列的FPOX-18D的氨基酸序列中108位处的甲硫氨酸。

通过使用pTrc-FPOX-19作为模板DNA，并通过使用具有包含由SEQ ID NO：111和112表示的核苷酸序列的DNA的引物对来引入位点特异性氨基酸替换以用丙氨酸替换具有由SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列的FPOX-19的氨基酸序列中75位处的亮氨酸，获得了表达具有由SEQ ID NO：11表示的氨基酸序列的FPOX-20的pTrc-FPOX-20质粒。

将如上所述获得的6种重组蛋白表达质粒转染在大肠埃希氏杆菌DH5α菌株中，以产生表达重组蛋白的大肠埃希氏杆菌菌株。

使用每种表达重组蛋白的大肠埃希氏杆菌菌株，按照国际公开号WO 2010/041715小册子中描述的糖化肽氧化酶FPOX-15的表达和纯化方法制备纯化的蛋白质，并评估每种蛋白质对α-F6P的糖化六肽氧化酶活性。

如表5中所示，每种蛋白质FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX-19和FPOX-20的糖化六肽氧化酶活性与FPOX-18的糖化六肽氧化酶活性相比提高到6.0至38.0倍，并且与FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性相比提高到190至7240倍。

表5

*当将FPOX-18的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

**当将FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

[实施例3]通过引入氨基酸突变提高糖化六肽氧化酶活性

通过使用在实施例2中制备的pTrc-FPOX-19作为模板DNA，并通过使用具有包含由SEQ ID NO：113和114表示的核苷酸序列的DNA的引物对来引入位点特异性氨基酸替换以用苯丙氨酸替换具有由SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列的FPOX-19的氨基酸序列中75位处的亮氨酸，获得了表达具有由SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列的FPOX-21的pTrc-FPOX-21质粒。

使用糖化六肽氧化酶活性作为指标并使用pTrc-FPOX-21作为模板DNA，检查通过易错PCR引入的随机突变。

使用具有包含由SEQ ID NO：87和104表示的氨基酸序列的DNA并被设计用于扩增对应于包含在pTrc-FPOX-21中的蛋白质编码基因中第1至119位氨基酸的区域的引物对，通过易错PCR进行随机突变。从随机突变获得作为扩增产物的随机导入有突变的DNA。将包含随机导入有突变的DNA的扩增产物用限制性酶Nco I和Xho I处理以获得片段，并通过与实施例2的方法类似的方法获得含有带有导入的突变的DNA的质粒，区别在于用获得的片段替换用上述限制性酶处理的pTrc-FPOX-18’的相应区域的操作。通过使用对α-FV和α-F6P的氧化酶活性作为指标评估从所述质粒表达的一组突变体，来检查获得的质粒。作为结果，获得了下列质粒作为表达具有与FPOX-21相比提高的对α-F6P的氧化酶活性的蛋白质的质粒：

-pTrc-FPOX-22质粒，其表达具有由SEQ ID NO：13表示的氨基酸序列的FPOX-22，其中用苏氨酸替换具有由SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列的FPOX-21的氨基酸序列中34位处的丝氨酸；

-pTrc-FPOX-23质粒，其表达具有由SEQ ID NO：14表示的氨基酸序列的FPOX-23，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中52位处的酪氨酸；

-pTrc-FPOX-24质粒，其表达具有由SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列的FPOX-24，其中用缬氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中57位处的异亮氨酸；

-pTrc-FPOX-25质粒，其表达具有由SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列的FPOX-25，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸；

-pTrc-FPOX-26质粒，其表达具有由SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列的FPOX-26，其中用谷氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中95位处的天冬氨酸；

-pTrc-FPOX-27质粒，其表达具有由SEQ ID NO：18表示的氨基酸序列的FPOX-27，其中用精氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中105位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-28质粒，其表达具有由SEQ ID NO：19表示的氨基酸序列的FPOX-28，其中用精氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-29质粒，其表达具有由SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列的FPOX-29，其中用丝氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-30质粒，其表达具有由SEQ ID NO：21表示的氨基酸序列的FPOX-30，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，并用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸；

-pTrc-FPOX-31质粒，其表达具有由SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列的FPOX-31，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，并用精氨酸替换105位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-32质粒，其表达具有由SEQ ID NO：23表示的氨基酸序列的FPOX-32，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，并用精氨酸替换108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-33质粒，其表达具有由SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列的FPOX-33，其中用苏氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中34位处的丝氨酸，用组氨酸替换66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，并用精氨酸替换108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-34质粒，其表达具有由SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列的FPOX-34，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中52位处的酪氨酸，用组氨酸替换66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，并用精氨酸替换108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-35质粒，其表达具有由SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列的FPOX-35，其中用缬氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中57位处的异亮氨酸，用组氨酸替换66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，并用精氨酸替换108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-36质粒，其表达具有由SEQ ID NO：27表示的氨基酸序列的FPOX-36，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，并用精氨酸替换108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-37质粒，其表达具有由SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列的FPOX-37，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，并用精氨酸替换108位处的赖氨酸；

-pTrc-FPOX-38质粒，其表达具有由SEQ ID NO：29表示的氨基酸序列的FPOX-38，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-39质粒，其表达具有由SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列的FPOX-39，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-40质粒，其表达具有由SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列的FPOX-40，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-41质粒，其表达具有由SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的FPOX-41，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用精氨酸替换108位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-42质粒，其表达具有由SEQ ID NO：33表示的氨基酸序列的FPOX-42，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，用精氨酸替换108位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-43质粒，其表达具有由SEQ ID NO：34表示的氨基酸序列的FPOX-43，其中用苏氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中34位处的丝氨酸，用组氨酸替换66位处的脯氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，用精氨酸替换108位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-44质粒，其表达具有由SEQ ID NO：35表示的氨基酸序列的FPOX-44，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中52位处的酪氨酸，用组氨酸替换66位处的脯氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，用精氨酸替换108位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；

-pTrc-FPOX-45质粒，其表达具有由SEQ ID NO：36表示的氨基酸序列的FPOX-45，其中用缬氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中57位处的异亮氨酸，用组氨酸替换66位处的脯氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，用精氨酸替换108位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸；以及

-pTrc-FPOX-46质粒，其表达具有由SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列的FPOX-46，其中用组氨酸替换FPOX-21的氨基酸序列中66位处的脯氨酸，用谷氨酸替换95位处的天冬氨酸，用精氨酸替换105位处的赖氨酸，用精氨酸替换108位处的赖氨酸，并用丝氨酸替换355位处的丙氨酸。

将如上所述获得的26种质粒导入到大肠埃希氏杆菌DH5α菌株中，以产生表达突变体的大肠埃希氏杆菌菌株。按照在国际公开号WO 2010/041715小册子中描述的糖化肽氧化酶FPOX-15的表达和纯化方法，使用上述产生的大肠埃希氏杆菌菌株来获得纯形式的每种突变体，并评估每种获得的纯化的突变体对α-F6P的糖化六肽氧化酶活性。如表6中所示，每种突变体FPOX-21至FPOX-46的糖化六肽氧化酶活性为FPOX-19的糖化六肽氧化酶活性的1.3至4.7倍，为FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性的7,000至25,500倍，并且发现它们的糖化六肽氧化酶活性显著提高。

表6

*当将FPOX-19的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

**当将FPOX-15的糖化六肽氧化酶活性定义为1时的活性比率

[实施例4]本发明的蛋白质与源自于丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的FPOX(AoFPOX)之间糖化六肽氧化酶活性的比较

将具有由SEQ ID NO：38表示的氨基酸序列并在国际公开号WO2008/108385小册子中被描述为对α-F6P具有氧化酶活性的源自于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40的FPOX(在NITE处分析的基因组的DOGAN数据库中使用登记号AO090023000307登记，http:// www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/AO；在后文中称为AoFPOX)的糖化六肽氧化酶活性，与每种本发明的蛋白质FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32和FPOX-42的糖化六肽氧化酶活性进行比较。

合成包含由SEQ ID NO：76表示的核苷酸序列的编码AoFPOX的DNA，并将合成的DNA引入到pUC57的多克隆位点(MCS)中，以构建含有所述DNA的pUC-AoFPOX载体。(表达AoFPOX的大肠埃希氏杆菌菌株的制备)

通过使用pUC-AoFPOX作为模板DNA，向对应于AoFPOX cDNA序列的5’末端的序列添加有四个组氨酸残基的标签和Nco I限制性酶位点且具有包含由SEQ ID NO：132表示的核苷酸序列的DNA的引物，以及向对应于3’末端的序列添加有Bam HI限制性酶位点且具有包含由SEQ ID NO：133表示的核苷酸序列的DNA的引物，使用由TOYOBO制造的PCR试剂盒“KOD-Plus-”DNA聚合酶，在下述PCR条件下进行PCR，获得了编码“在N-端带有四个组氨酸残基标签的AoFPOX”的DNA片段。将获得的DNA片段用限制性酶Nco I和Bam HI处理以获得消化产物。使用由TakaraBio Inc.制造的“DNA连接试剂盒Mighty Mix”，将上述消化产物连接到同样地用限制性酶Nco I和Bam HI处理的表达载体pTrc99a，以转化大肠埃希氏杆菌DH5α菌株。从在含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落提取质粒，并将从序列分析发现的含有AoFPOX基因的克隆确定为表达重组AoFPOX的大肠埃希氏杆菌菌株。

(试剂组成(终浓度))

-反应缓冲液

-模板DNA 1至2ng/μL

-正向引物 0.3μmol/L

-反向引物 0.3μmol/L

-dNTP溶液混合物 各0.2mmol/L

-MgSO₄ 1mmol/L

-DNA聚合酶 0.02U/L

(PCR条件)

1.94℃ 2分钟

2.98℃ 15秒

3.60℃ 30秒

4.68℃ 2分钟

5.重复2至4(总共30个循环)

6.68℃ 5分钟

(纯化的酶AoFPOX的制备)

将如上所述获得的表达重组AoFPOX蛋白的大肠埃希氏杆菌菌株接种到200mL含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，并将其在37℃振摇培养。在O.D.600处的浊度达到0.5后，加入200μL 0.1mol/L异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的水性溶液，并将其在37℃继续振摇培养5小时。在培养后，通过在8,000rpm下离心10分钟收集细菌细胞。

将细菌细胞悬浮在10mL含有10mmol/L咪唑和0.4mol/L氯化钾的50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，然后对其进行超声波处理。将在以8,000rpm离心10分钟后获得的上清液通过0.8μm滤器过滤，并将获得的样品用作粗酶溶液。

使用镍螯合柱的纯化

将柱用5mL由QIAGEN制造的“Ni-NTA琼脂糖”装填，并使用上述缓冲液平衡。将粗酶溶液通过柱以将AoFPOX吸附到树脂，并将柱用3倍体积的相同缓冲液洗涤，然后使用含有0.5mol/L咪唑和0.4mol/L氯化钾的50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱。通过分级收集AoFPOX级分，并将其针对10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行透析。

在实施例2中获得的FPOX-19和FPOX-20、在实施例3中获得的FPOX-32和FPOX42以及AoFPOX的浓度，通过遵照在实施例1中描述的方法测量特异性源自于FPOX所带有的FAD的吸光度来确定。

使用FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32、FPOX-42和AoFPOX蛋白中的每一种，使用下述试剂和测量程序测量每种蛋白质的糖化六肽氧化酶活性。

(用于活性测量的试剂)

溶液A：50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)

溶液B：DA-67在DMF中的24mmol/L溶液

溶液C：过氧化物酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L溶液

溶液D：α-F6P的1mmol/L水性溶液

溶液E：糖化六肽氧化酶(AoFPOX、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32或FPOX-42)在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的0.1mg/mL至10mg/mL溶液

(测量程序)

向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并且将获得的溶液以每个样品190μL的量分发到96孔微孔板的每个孔中。加入20μL溶液D和10μL溶液E并混合，并使其在30℃反应30分钟。使用全自动微孔板EIA分析仪(AP-96，由Kyowa Medex Co.,Ltd.制造)，测量溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应前吸光度Abs_(反应前)和溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应后吸光度Abs_(反应后)。通过从吸光度Abs_(反应后)减去吸光度Abs_(反应前)，确定由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)。空白的吸光度变化Δ'Abs_(空白)通过相似方法来确定，区别在于使用蒸馏水代替溶液E(蛋白质溶液)。通过从由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)减去空白的吸光度变化Δ'Abs_(空白)，获得蛋白的反应吸光度ΔAbs_(反应)。每种蛋白质的糖化六肽氧化酶活性的比活性(U/mg)，遵照在实施例2中描述的方法从获得的吸光度ΔAbs_(反应)来计算。

如表7中所示，AoFPOX的糖化六肽氧化酶活性约为FPOX-20的糖化六肽氧化酶活性的0.5％，并且本发明的FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32和FPOX-42的糖化六肽氧化酶活性明显比在国际公开号WO2008/108385小册子中描述的糖化肽氧化酶AoFPOX的活性更高。

表7

蛋白质	比活性(mU/mg)	％<sup>*</sup>
			FPOX-19	19.6	85.6
FPOX-20	22.9	100.0
			FPOX-32	64.7	282.5
FPOX-42	92.1	402.2
			AoFPOX	0.12	0.5

*FPOX-20的比活性被定义为100％

[实施例5]使用V8蛋白酶和本发明的蛋白质测量HbA1c

通过下述方法，使用血细胞作为样品，并使用V8蛋白酶和本发明的蛋白质FPOX-19、FPOX-32或FPOX-42，测量溶血样品中的HbA1c。

使用下述试剂和测量程序，将样品中的HbA1c用V8蛋白酶处理，将产生的α-F6P与每种蛋白质FPOX-19、FPOX-32和FPOX-42反应，并测量来自于反应的吸光度变化。

(用于活性测量的试剂)

溶液A：0.1mol/L MOPS缓冲液(pH6.8)

溶液B：DA-67在DMF中的24mmol/L溶液

溶液C：过氧化物酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L溶液

溶液D：人类血细胞来源的溶血样品[血红蛋白浓度为10mg/mL，并且从HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者已测定到HbA1c浓度为9.8、11.1、12.3、13.3、14.5、15.4、17.9和23.3μmol/L。]

溶液E：在100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中的8g/L碘酸钾和10％(v/v)AMPHITOL20N的溶液

溶液F：V8蛋白酶在20％甘油中的80U/mL溶液

溶液G：糖化六肽氧化酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的10mg/mL溶液

在使用血红蛋白-SLS方法的血红蛋白浓度测量中，使用血红蛋白B-test Wako。

(测量程序)

(i)向40μL溶液D添加4μL溶液E并混合，然后加入4.4μL溶液F，并将其在37℃温育15分钟。

(ii)向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并将获得的溶液以每个样品190μL的量分发到96孔微孔板的每个孔中。然后加入20μL在上面(i)中制备的处理过的血细胞溶液和10μL溶液G并混合，并使其在37℃反应15分钟。

使用全自动微孔板EIA分析仪(AP-96，由Kyowa Medex Co.,Ltd.制造)，测量溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应前吸光度Abs_(反应前)和在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应后吸光度Abs_(反应后)。通过从吸光度Abs_(反应后)减去吸光度Abs_(反应前)，确定由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)。空白的吸光度变化Δ'Abs_(空白)通过相似方法来确定，区别在于使用蒸馏水代替溶液D(人类血细胞来源的溶血样品)。通过从由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)减去空白的吸光度变化Δ'Abs_(空白)，获得人类血细胞来源的溶血样品的反应吸光度ΔAbs_(反应)。对每种人类血细胞来源的溶血样品进行相似的反应，并确定每种人类血细胞来源的溶血样品的反应吸光度ΔAbs_(反应)。

作为结果，如图1至3中所示，在通过HPLC方法和血红蛋白-SLS方法两者确定的HbA1c浓度与通过上述测定法获得的每种人类血细胞来源的溶血样品的反应吸光度ΔAbs_(反应)之间发现了良好的线性。

结果显示，通过使用本发明的蛋白质和对HbA1c进行消化以解离α-F6P的V8蛋白酶，可以测量样品中的HbA1c。

[实施例6]本发明的蛋白质的糖化血红蛋白氧化酶活性的测量

使用在实施例2中获得的FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19和FPOX-20、在实施例3中获得的FPOX-32和FPOX-42以及FPOX-15，使用下述试剂和测量程序，测量糖化血红蛋白氧化酶活性。

(用于活性测量的试剂)

溶液A：0.1mol/L MOPS缓冲液(pH6.8)

溶液B：DA-67在DMF中的24mmol/L溶液

溶液C：过氧化物酶在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L溶液

溶液D：人类血细胞来源的溶血样品[血红蛋白浓度为10mg/mL，并且从HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者已测定到HbA1c浓度为84.2μmol/L。]

溶液E：5g/L碘酸钾和50％(v/v)AMPHITOL 20N的水性溶液

溶液F：糖化血红蛋白氧化酶(FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32、FPOX-42和FPOX-15)在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的30mg/mL溶液

(测量程序)

(i)将2μL溶液E混合在20μL溶液D中，并将其在37℃下温育10分钟。

(ii)向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并将获得的溶液以每个样品190μL的量分发到96孔微孔板的每个孔中。然后加入20μL通过混合溶液D和E产生的溶液和10μL溶液F并混合，并使其在37℃反应60分钟。

使用全自动微孔板EIA分析仪(AP-96，由Kyowa Medex Co.,Ltd.制造)，测量溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应前吸光度Abs_(反应前)和在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应后吸光度Abs_(反应后)。通过从吸光度Abs_(反应后)减去吸光度Abs_(反应前)，确定由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)。源自于酶溶液的空白的吸光度变化Δ'Abs_{(酶溶液空白)}通过相似方法来确定，区别在于使用pH7.0的10mmol/L磷酸盐缓冲液代替溶液F(酶溶液)。通过类似的方法确定源自于人类血细胞来源的溶血样品的空白的吸光度变化Δ'Abs_{(溶血样品空白)}，区别在于使用蒸馏水代替溶液D(人类血细胞来源的溶血样品)。

通过从由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)减去Δ'Abs_{(酶溶液空白)}和Δ'Abs_{(溶血样品空白)}，获得蛋白质的反应吸光度ΔAbs_(反应)。每种蛋白质FPOX-15、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32和FPOX-42的反应吸光度ΔAbs_(反应)示出在表8中。

如表8中所示，尽管对于FPOX-15来说ΔAbs低于检测限，但FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32和FPOX-42的ΔAbs值分别为0.017、0.021、0.054、0.080、0.235和0.246。已发现，通过使用FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32和FPOX-42，酶与HbA1c之间的反应得以进行以产生过氧化氢。

表8

蛋白质	ΔAbs<sub>(反应)</sub>
		FPOX-15	n.d.<sup>*</sup>
FPOX-18A	0.017
		FPOX-18B	0.021
FPOX-19	0.054
		FPOX-20	0.080
FPOX-32	0.235
		FPOX-42	0.246

＊未检测到

[实施例7]使用本发明的蛋白质测量糖化血红蛋白的方法与使用HPLC方法和血红蛋白-SLS方法两者测量糖化血红蛋白的方法之间的相关性

使用下述试剂和测量程序来证实本发明的使用在实施例2中获得的FPOX-19和FPOX-20以及在实施例3中获得的FPOX-32和FPOX-42这些蛋白质中的每一种来进行的HbA1c测量方法与使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者的HbA1c测量方法之间的相关性。

(用于活性测量的试剂)

溶液A：0.1mol/L MOPS缓冲液(pH6.8)

溶液B：DA-67在DMF中的24mmol/L溶液

溶液C：在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1kU/L过氧化物酶

溶液D：人类血细胞来源的溶血样品[血红蛋白浓度为10mg/mL，并且从HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者已测定到HbA1c浓度为9.8、11.1、12.3、13.3、14.5、15.4、17.9和23.3μmol/L。]

溶液E：5g/L碘酸钾和50％(v/v)AMPHITOL 20N的水性溶液

溶液F：糖化血红蛋白氧化酶(FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32或FPOX-42)在10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的30mg/mL溶液

(测量程序)

(i)将4μL溶液E混合在40μL溶液D中，并将其在37℃下温育10分钟。

(ii)向10mL溶液A加入12.6μL溶液B和35μL溶液C，并将获得的溶液以每个样品190μL的量分发到96孔微孔板的每个孔中。然后加入20μL通过混合溶液D和E产生的溶液和10μL溶液F并混合，并使其在37℃反应60分钟。

使用全自动微孔板EIA分析仪(AP-96，由Kyowa Medex Co.,Ltd.制造)，测量溶液在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应前吸光度Abs_(反应前)和在660nm(主波长)/750nm(次波长)下的反应后吸光度Abs_(反应后)。通过从吸光度Abs_(反应后)减去吸光度Abs_(反应前)，确定由反应造成的吸光度变化Δ'Abs_(反应)。

使用具有已知HbA1c浓度的两个人类血细胞来源的溶血样品(其中血红蛋白浓度为10mg/mL并且HbA1c浓度分别为9.82μmol/L和24.2μmol/L的样品)进行类似的测量，以制备指示HbA1c浓度与反应吸光度ΔAbs_(反应)之间的关系的校准曲线。

通过将每个人类血细胞来源的溶血样品的反应吸光度ΔAbs_(反应)与上述校准曲线的值进行比较，确定每个人类血细胞来源的溶血样品中的HbA1c浓度。将通过这种方式确定的HbA1c浓度与通过使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者的HbA1c测量方法确定的HbA1c浓度进行比较。

如图4至7中所示，在通过本发明的测量方法确定的HbA1c浓度与通过使用HPLC方法(KO500方法)和血红蛋白-SLS方法两者的HbA1c测量方法确定的HbA1c浓度之间观察到良好的相关性。因此，发现本发明的使用每种蛋白质FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32和FPOX-42的测量方法能够在不使用蛋白酶的情况下测量样品中的HbA1c。

工业实用性

本发明提供了可用于诊断生活方式疾病例如糖尿病的新蛋白质，编码所述蛋白质的DNA，用于生产所述蛋白质的方法，以及使用所述蛋白质测量糖化血红蛋白的方法和包含所述蛋白质的用于测量糖化血红蛋白的试剂。

序列表独立文本

SEQ ID NO：1-人工序列的描述：FPOX-15的氨基酸序列

SEQ ID NO：2-人工序列的描述：FPOX-9的氨基酸序列

SEQ ID NO：3-人工序列的描述：FPOX-16的氨基酸序列

SEQ ID NO：4-人工序列的描述：FPOX-17的氨基酸序列

SEQ ID NO：5-人工序列的描述：FPOX-18的氨基酸序列

SEQ ID NO：6-人工序列的描述：FPOX-18A的氨基酸序列

SEQ ID NO：7-人工序列的描述：FPOX-18B的氨基酸序列

SEQ ID NO：8-人工序列的描述：FPOX-18C的氨基酸序列

SEQ ID NO：9-人工序列的描述：FPOX-18D的氨基酸序列

SEQ ID NO：10-人工序列的描述：FPOX-19的氨基酸序列

SEQ ID NO：11-人工序列的描述：FPOX-20的氨基酸序列

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SEQ ID NO：14-人工序列的描述：FPOX-23的氨基酸序列

SEQ ID NO：15-人工序列的描述：FPOX-24的氨基酸序列

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SEQ ID NO：31-人工序列的描述：FPOX-40的氨基酸序列

SEQ ID NO：32-人工序列的描述：FPOX-41的氨基酸序列

SEQ ID NO：33-人工序列的描述：FPOX-42的氨基酸序列

SEQ ID NO：34-人工序列的描述：FPOX-43的氨基酸序列

SEQ ID NO：35-人工序列的描述：FPOX-44的氨基酸序列

SEQ ID NO：36-人工序列的描述：FPOX-45的氨基酸序列

SEQ ID NO：37-人工序列的描述：FPOX-46的氨基酸序列

SEQ ID NO：38-人工序列的描述：AoFPOX的氨基酸序列

SEQ ID NO：39-人工序列的描述：FPOX-15的DNA

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SEQ ID NO：76-人工序列的描述：AoFPOX的DNA

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SEQ ID NO：83-人工序列的描述：N272D-F引物

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SEQ ID NO：104-人工序列的描述：EP-R引物

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Claims (39)

1.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的61位处的精氨酸被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸替换后形成的氨基酸序列构成。

2.一种蛋白质，在所述蛋白质中，权利要求1的蛋白质的氨基酸残基被选自下列(1)至(8)的至少一个突变修饰：

(1)其中63位处的精氨酸被选自甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸的氨基酸替换的突变；

(2)其中62位处的亮氨酸被甘氨酸替换的突变；

(3)其中93位处的谷氨酰胺被谷氨酸替换的突变；

(4)其中267位处的苯丙氨酸被酪氨酸替换的突变；

(5)其中71位处的酪氨酸被丝氨酸或半胱氨酸替换的突变；

(6)其中115位处的天冬氨酸被选自天冬酰胺和精氨酸的氨基酸替换的突变；

(7)其中108位处的甲硫氨酸被赖氨酸替换的突变；以及

(8)其中75位处的亮氨酸被丙氨酸替换的突变。

3.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：3至11中任一者所表示的氨基酸序列构成。

4.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：6至11中任一者所表示的氨基酸序列构成。

5.一种DNA，其编码权利要求1至4任一项的蛋白质。

6.一种DNA，其由SEQ ID NO：41至49中任一者所表示的核苷酸序列构成。

7.一种DNA，其由SEQ ID NO：44至49中任一者所表示的核苷酸序列构成。

8.一种重组DNA，其包含权利要求5至7任一项的DNA。

9.一种转化体，其带有权利要求8的重组DNA。

10.一种用于生产权利要求1至4任一项的蛋白质的方法，其中所述方法包括培养权利要求9的转化体，在培养物中产生并积累权利要求1至4任一项的蛋白质，并从所述培养物收集所述蛋白质。

11.一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其中所述方法包括通过将所述样品中的糖化血红蛋白与蛋白酶反应来产生糖化六肽，将产生的糖化六肽与权利要求1至4任一项的蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

12.权利要求11的方法，其中所述糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。

13.一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其中所述方法包括将所述样品中的糖化血红蛋白与权利要求4的蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

14.权利要求13的方法，其中所述糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。

15.权利要求11至14任一项的方法，其中由所述反应产生的物质是过氧化氢。

16.一种用于测量糖化血红蛋白的试剂，其中所述试剂包含蛋白酶和权利要求1至4任一项的蛋白质。

17.权利要求16的试剂，其还包含用于测量过氧化氢的试剂。

18.一种用于测量糖化血红蛋白的试剂，其中所述试剂包含权利要求4的蛋白质。

19.权利要求18的试剂，其还包含用于测量过氧化氢的试剂。

20.权利要求16至19任一项的试剂，其中所述糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。

21.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的61位处的精氨酸被甘氨酸或丝氨酸替换后形成的氨基酸序列构成，并且所述蛋白质的氨基酸残基被选自下列(1)至(15)的至少一个突变修饰：

(1)其中63位处的精氨酸被选自甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸的氨基酸替换的突变；

(2)其中62位处的亮氨酸被甘氨酸替换的突变；

(3)其中93位处的谷氨酰胺被谷氨酸替换的突变；

(4)其中267位处的苯丙氨酸被酪氨酸替换的突变；

(5)其中71位处的酪氨酸被丝氨酸或半胱氨酸替换的突变；

(6)其中115位处的天冬氨酸被选自天冬酰胺和精氨酸的氨基酸替换的突变；

(7)其中108位处的甲硫氨酸被选自赖氨酸和精氨酸的氨基酸替换的突变；

(8)其中75位处的亮氨酸被选自丙氨酸和苯丙氨酸的氨基酸替换的突变；

(9)其中34位处的丝氨酸被苏氨酸替换的突变；

(10)其中52位处的酪氨酸被组氨酸替换的突变；

(11)其中57位处的异亮氨酸被缬氨酸替换的突变；

(12)其中66位处的脯氨酸被组氨酸替换的突变；

(13)其中95位处的天冬氨酸被谷氨酸替换的突变；

(14)其中105位处的赖氨酸被精氨酸替换的突变；以及

(15)其中355位处的丙氨酸被丝氨酸替换的突变。

22.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：3至37中任一者所表示的氨基酸序列构成。

23.一种蛋白质，其由SEQ ID NO：6至37中任一者所表示的氨基酸序列构成。

24.一种DNA，其编码权利要求21至23任一项的蛋白质。

25.一种DNA，其由SEQ ID NO：41至75中任一者所表示的核苷酸序列构成。

26.一种DNA，其由SEQ ID NO：44至75中任一者所表示的核苷酸序列构成。

27.一种重组DNA，其包含权利要求24至26任一项的DNA。

28.一种转化体，其带有权利要求27的重组DNA。

29.一种用于生产权利要求21至23任一项的蛋白质的方法，其中所述方法包括培养权利要求28的转化体，在培养物中产生并积累权利要求21至23任一项的蛋白质，并从所述培养物收集所述蛋白质。

30.一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其中所述方法包括通过将所述样品中的糖化血红蛋白与蛋白酶反应来产生糖化六肽，将产生的糖化六肽与权利要求21至23任一项的蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

31.权利要求30的方法，其中所述糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。

32.一种用于测量样品中的糖化血红蛋白的方法，其中所述方法包括将所述样品中的糖化血红蛋白与权利要求23的蛋白质反应，并测量由所述反应产生或消耗的物质。

33.权利要求32的方法，其中所述糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。

34.权利要求30至33任一项的方法，其中由所述反应产生的物质是过氧化氢。

35.一种用于测量糖化血红蛋白的试剂，其中所述试剂包含蛋白酶和权利要求21至23任一项的蛋白质。

36.权利要求35的试剂，其还包含用于测量过氧化氢的试剂。

37.一种用于测量糖化血红蛋白的试剂，其中所述试剂包含权利要求23的蛋白质。

38.权利要求37的试剂，其还包含用于测量过氧化氢的试剂。

39.权利要求35至38任一项的试剂，其中所述糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。