CN1823166B - 血红蛋白a1c的测定方法和用于此目的的酶及其生产方法 - Google Patents

血红蛋白a1c的测定方法和用于此目的的酶及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供使用酶不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和用于此的测定试剂盒。筛选从糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。通过使用通过该筛选方法获得的蛋白酶，提供了特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和测定试剂盒。根据本发明，可以不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端。

Description

血红蛋白A1C的测定方法和用于此目的的酶及其生产方法
技术领域
本发明涉及无需分离操作而使用酶特异测定糖化血红蛋白的糖化β-链N末端的方法、测定试剂盒、可以用于该特异测定的蛋白酶和其生产方法、其筛选方法、和可以用于该特异测定的酮胺氧化酶。 
背景技术
测定糖化蛋白质在诊断和控制糖尿病方面是非常重要的。尤其是，近来对血红蛋白A1c的研究已经证明，通过将水平控制在7％或更低可以显著地降低并发症的发生和发展危险，由此该水平常常被用作临床领域中的一个基本指标。作为血红蛋白A1c的定量方法，有通常已知的电泳、离子交换层析、亲和层析、免疫和酶学方法。然而，电泳和层析方法需要昂贵的专用设备，而且其处理速度缓慢，因此这些方法并不适用于处理大量样品的临床检查。同时，免疫分析方法相对容易，可以在短时间内实施，这导致该方法在近年来快速扩展。然而，由于该方法使用抗原-抗体反应来完成，这就导致一个问题——由于共存物质的再现性和影响，准确度并不总是很好。 
同时，酶学方法已经被提示是一种无需专用设备的测定方法，具有高处理速度、高准确性、并且简单而价廉(JP-A-08-336386，WO97/13872，JP-A-2001-95598，JP-A-2000-300294，和Clinical Chemistry49(2)：269-274(2003))。 
血红蛋白在分子内赖氨酸的ε-氨基基团上以及在α-和β-链N末端缬氨酸的α-氨基基团上发生糖化，而血红蛋白A1c是在血红蛋白β链N末端缬氨酸的α-氨基基团上发生糖化的血红蛋白(被接受为国际标准的定义，见Clinical Chemistry and Laboratory Medicine40(1)：78-89(2002))。因此，为了能够使用蛋白酶和酮胺氧化酶特异地 测定糖化的血红蛋白的糖化β-链N末端而无需分离操作过程，蛋白酶和酮胺氧化酶之一或两者的酶学反应的特异性被认为是必要的。 
具体地，糖化的血红蛋白具有三个糖化位点，即，分子内的赖氨酸、α-链N末端和β-链N末端，这样为了仅仅测定糖化的β-链N末端，需要根据如下所述将酶联合起来。 
即，在蛋白酶和酮胺氧化酶分别属于(P1)至(P4)和(K1)至(K5)类时，需要按如下方式联合这些酶：<(P1)和(K1)或(K2)或(K3)或(k4)>，<(P2)和(K1)或(K3)>，<(P3)和(K1)或(K2)>，<(P4)和(K1)>，<(P3)和(K5)和(K3)>，和<(P3)和(K5)和(K4)>。 
各类酶的性质如下： 
(P1)仅从糖化血红蛋白的糖化β-链N末端切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(P2)仅从糖化血红蛋白的糖化α-和β-链N末端切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(P3)仅从糖化血红蛋白的糖化β-链N末端和包括分子内赖氨酸的位点上切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(P4)从糖化血红蛋白的糖化α-和β-链N末端和包括分子内赖氨酸的位点上切除糖化氨基酸和/或糖化肽；(K1)仅与由组合使用的蛋白酶从糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自糖化β-链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应；(K2)仅与由组合使用的蛋白酶从糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自糖化α-和β-链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应；(K3)仅与由组合使用的蛋白酶从糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自糖化β链N末端和来自包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应；(K4)与由组合使用的蛋白酶从糖化血红蛋白上切下的来自糖化α-和β-链N末端及包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应；和(K5)与由组合使用的蛋白酶从糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应，但不与来自糖化β-链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应。 
然而，对于从糖化血红蛋白或其片段产生用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，已有在JP-A-08-336386、WO 97/13872、JP-A-2001-95598、JP-A-2001-57897、WO 00/50579、WO00/61732、Clinical Chemistry 49(2)：269-274(2003)等中描述的已知蛋白酶。然而，没有关于从糖化血红蛋白或其片段的糖化β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化α-链N末端切割糖化氨基酸或糖化肽的特异性的描述。 
此外，从已知的底物特异性上，JP-A-2000-300294中描述的血管紧张肽转化酶也被估计可以与β-链N末端的糖化三肽反应，但没有报道显示从糖化血红蛋白或其片段的糖化β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化α-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的特异性，例如，没有报道给出血管紧张肽转化酶对α-链N末端糖化三肽和对β-链N末端糖化三肽的特异性的定量结果。 
再者，在JP-A-2000-300294中，也没有描述过：用于从糖化血红蛋白产生β-链N末端糖化三肽的胰蛋白酶、脯氨酸特异性内切蛋白酶和羧肽酶P并不从包括分子内赖氨酸的位点和糖化α-链N末端产生糖化氨基酸和糖化肽。 
而且，本发明发明人证实，血管紧张肽转化酶在一般的反应条件下几乎不从β-链N末端糖化三肽上切割果糖基缬氨酸，因此，血管紧张肽转化酶并不被认为是可以从糖化β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从α-链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。 
如上述，尚没有已知的蛋白酶和蛋白酶反应条件可以用于从糖化血红蛋白或其片段的糖化β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化α-链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽，即，尚没有已知的具有上述(P1)或(P3)特异性的蛋白酶和设计用于实现上述(P1)或(P3)特异性的蛋白酶反应条件。 
一般地，以下筛选方法被视为是可以从糖化血红蛋白或其片段的糖化β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化α-链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的筛选方法，即，具有上 述(P1)或(P3)特异性的蛋白酶的筛选方法。具体地，糖化血红蛋白被分为α-链N末端被糖化的血红蛋白和β-链N末端被糖化的血红蛋白，对于在这些血红蛋白用作底物时选择性地仅从β-链N末端被糖化的血红蛋白上切割糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，可以通过使用与该蛋白酶切割下来的糖化氨基酸和/或糖化肽反应的酶(例如，酮胺氧化酶)、基于颜色改变来进行寻找。然而，天然存在的糖化血红蛋白具有低的糖化率(大约5％)。因此，分离α-链N末端被糖化的血红蛋白和β-链N末端被糖化的血红蛋白的产率是非常低的，而且由于血红蛋白是红色的，使用这些物质作为底物难于检测蛋白酶的活性。正如上述，尚未有简单有效的筛选方法。 
另一方面，酮胺氧化酶包括以下酶： 
1)来源于镰孢属(Fusarium)(JP-A-07-289253)、赤霉属(Gibberella)、假丝酵母属(Candida)(JP-A-06-46846)或曲霉属(Aspergillus)(WO 97/20039)的微生物并主要与ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸(此后也称作FK)或包括它的肽及果糖基缬氨酸(此后也称作FV)反应的酮胺氧化酶； 
2)来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)(JP-A-61-280297)、青霉属(Penicillium)(JP-A-08-336386)或丝孢酵母属(Trichosporon)(JP-A-2000-245454)的微生物并主要与FV反应的酮胺氧化酶。一般地，使用蛋白酶从血红蛋白β-链N末端糖化肽切割FV的步骤存在缺陷，因为该反应通常几乎不发生，其实施必需大量的酶和长时间；因此为了克服此缺陷，需要也可以与从血红蛋白β-链N末端糖化肽上经过蛋白酶作用切割下来的糖化肽反应的酮胺氧化酶用作血红蛋白A1c测定过程中使用的酮胺氧化酶。因此， 
3)近年来已经报道了具有上述性质的来源于棒状杆菌属(JP-A-2001-95598)的突变酮胺氧化酶和来源于Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielabia属、毛壳属(Chaetomium)、麻孢壳属(Gelasinospora)、小囊菌属(Microascus)、Coniochaeta属或Eupenicillium属(EP 1,291,416)的微生物并与1-脱氧果糖基-L-缬氨酰 -L-组氨酸(此后也称作FVH)反应的酮胺氧化酶。 
然而，属于1)的酮胺氧化酶具有性质(K4)，属于2)的酮胺氧化酶具有性质(K2)，但是没有它们与FVH反应的描述。当与FVH的反应被定义为100％时，属于3)的酮胺氧化酶，甚至是来源于Eupenicillium属微生物并与FK以最低比率反应的酮胺氧化酶，与FK以9.78％的比率反应(EP 1,291,416)。因此，该酮胺氧化酶被认为可以充分地与从糖化血红蛋白经蛋白酶作用切割下来的来自包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应，然而关于与从糖化血红蛋白经蛋白酶作用切割下来的来自糖化α-链N末端的糖化肽的反应，例如与1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-亮氨酸(此后也称作FVL)的反应，没有描述，因此该酮胺氧化酶不被认为是具有性质(K1)、(K2)或(K3)的酮胺氧化酶。 
如上所述，尚没有报道过具有性质(K1)；具有性质(K2)并与FVH反应；或具有性质(K3)的酮胺氧化酶。 
此外，为了制备具有性质(K1)并具有性质(K2)且与FVH反应的酮胺氧化酶，可以考虑通过氨基酸替代、缺失、插入等方式修饰已知的酮胺氧化酶。然而，该酶一级结构中有助于降低与FK或FZK的反应的氨基酸残基尚属未知。因此，不可能通过修饰任何酮胺氧化酶基因来降低对FK或ε-1-脱氧果糖基-(α-苄氧羰基-L-赖氨酸)(此后也称作FZK)的活性，即，通过修饰来制备具有性质(K1)并具有性质(K2)且与FVH反应的酮胺氧化酶的方法仍是未知的。 
同时，通过调节能够与FVH反应的酮胺氧化酶的反应条件来降低酶对FK或FZK的活性与酶对FVH的活性的比，也是未知的。 
为了使用蛋白酶和酮胺氧化酶清楚地区分和确定糖化血红蛋白中存在的β-链N末端缬氨酸的α-氨基基团的糖化，如上所述必须联合蛋白酶和酮胺氧化酶的特异性。然而，在JP-A-08-336386、WO97/13872、JP-A-2001-95598和Clinical Chemistry 49(2)：269-274(2003)中，没有关于特异确定血红蛋白的糖化β-链N末端的描述，而仅有关于通过HPLC方法获得的或可以通过该方法获得的数据与通过公开的 酶学方法获得的测定数据显著相关的报道。而且，没有过所用蛋白酶和酮胺氧化酶的特异性的提及，而通过蛋白酶降解糖化血红蛋白而被简单地切割的糖化氨基酸和/或糖化肽通过酮胺氧化酶检测，这样据认为所检测的是分子内赖氨酸的ε-氨基和α-及β-链N末端缬氨酸的α-氨基已经被糖化的血红蛋白的混合物。而且，在JP-A-2001-95598的例子中，使用蛋白酶和与FVH反应的酮胺氧化酶测定糖化血红蛋白。然而，实施了离心操作，而没有不经分离操作可以实施测定的描述。 
JP-A-2000-300294提示了特异地仅仅测定在血红蛋白β-链N末端缬氨酸的α-氨基被糖化的血红蛋白的酶学方法。在该方法中，利用能够切割血红蛋白β-链N末端第3位亮氨酸的羧基侧的蛋白酶、然后利用能够从果糖基-Val-His-Leu切下His-Leu由此产生果糖基缬氨酸的蛋白酶进行相继处理，并特异地测定血红蛋白β-链N末端缬氨酸的α-氨基糖化的量。然而，该方法具有如下缺点：该方法需要两个阶段的蛋白酶反应；严格地控制第一个阶段中用于从血红蛋白β-链N末端切割第3位亮氨酸的羧基侧的蛋白酶反应是困难的；而且在第二阶段从血红蛋白β-链N末端糖化肽上切下α-糖化氨基酸的反应通常几乎不进行，而必须使用大量的酶和长时间来实施。此外，在实施例显示的方法中，进行了两次繁琐的分离操作(超过滤)，而且没有本申请的方法能够无需分离操作即可特异地测定糖化血红蛋白的糖化β-链N末端的描述。 
EP 1,291,416提示了用能够与蛋白酶例如Molsin、AO-蛋白酶、肽酶(Peptidase)(可从Kikkoman Corporation获得)、羧肽酶Y或Protin P(可从Daiwa Kasei K.K.获得)作用所释放的FVH反应的氧化酶测定糖化蛋白酶例如血红蛋白A1c的方法。该说明书还指出，在通过蛋白酶作用产生的FK构成问题的情况下，可以在用与FK反应的果糖基胺氧化酶消除FK后利用能够与FVH反应的氧化酶进行测定，或者可以使用与FVH反应而几乎不与FK反应的氧化酶进行测定。然而，没有提及过与来自糖化血红蛋白的糖化α-链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的区分，也没有通过该提示方法测定糖化血红蛋白的糖 化β-链N末端的证实性实施例。此外，也没有描述该提示方法可不经分离操作来进行。 
尽管上述涉及糖化血红蛋白的测定方法是已知的，但是无需分离操作而使用酶特异地测定糖化血红蛋白的糖化β-链N末端的方法和试剂盒是未知的。 
发明内容
本发明的目的是提供无需分离操作、能够特异地仅测定糖化血红蛋白的糖化β-链N末端的方法、测定试剂盒、可以用于该特异测定的蛋白酶、其生产方法和筛选方法、和可以用于该特异测定的酮胺氧化酶。 
本发明的发明人经过深入的研究，结果首先发明了筛选在糖化血红蛋白或其片段的β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地在α-链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的方法。即，发明了检测如下蛋白酶活性的方法，其中所说蛋白酶活性从糖化血红蛋白的糖化β-链N末端切下用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化血红蛋白的糖化α-链N末端切下用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和糖化肽，所述方法通过使用糖化血红蛋白的α-链N末端和β-链N末端存在的糖化肽作为蛋白酶的底物来实施。 
其次，本发明筛选方法可以用于筛选各种各样可以从β-链N末端的糖化五肽切下用作酮胺氧化物底物的糖化氨基酸和/或糖化肽但不实质性地从α-链N末端的糖化五肽切下用作酮胺氧化酶底物的糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。结果发现，在商业可获得的蛋白酶制品例如来源于芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)的中性蛋白酶(由Toyobo Co.，Ltd.生产)中或在细菌例如芽孢杆菌属种、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)或产酶溶杆菌产生的蛋白酶中存在此目的蛋白酶反应。 
此外，发现在这些蛋白酶中嗜水气单胞菌和产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)产生的蛋白酶与已知的弹性蛋白酶具有 同源性。常规地，已知弹性蛋白酶具有底物特异性，是在亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸的C端侧切割肽键的酶。本发明第一次揭示了该弹性蛋白酶在1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-苏氨酰-L-脯氨酸(以下也称作血红蛋白β链N末端的糖化五肽)中不在亮氨酸的C端侧而是在N端侧切割肽键以释放FVH。 
再者，已经完成了当目的蛋白酶不仅从糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而且从糖化血红蛋白或其片段切割FK和/或包括FK的糖化肽但不从糖化血红蛋白或其片段的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽时，不经分离操作、使用酶特异地测定糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端的方法，该方法通过先用不与来自糖化β链N末端的糖化肽反应但与FK或包括FK的糖化肽反应的酮胺氧化物消除FK和/或包括FK的糖化肽来实现。 
此外，发现了在蛋白酶不仅从糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而且从糖化血红蛋白或其片段切割FK和/或包括FK的糖化肽但不从糖化血红蛋白或其片段的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的情况下能够显著地降低酮胺氧化酶对FZK的反应性的反应条件。制备和使用具有高特异性的与FZK以5％或更低比率反应(相较于定义为100％的与FVH的反应而言)的新酮胺氧化酶使得可以特异地仅测定从糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽。即，本发明发明人发现，在来源于Curvulariaclavata的酮胺氧化酶中在58和62位的氨基酸替代有助于降低对FZK的反应性。基于此事实制备和使用该氧化酶导致完成了无需分离操作、使用酶特异地测定糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端的方法。 
而且，发现了用于目的蛋白酶降解糖化血红蛋白或其片段的如下反应条件： 
i)不切割可以与和目的蛋白酶联用的酮胺氧化酶反应的FK和/或包括FK的糖化肽的条件； 
ii)不切割来源于糖化α链N末端并可以与和目的蛋白酶联用的酮 胺氧化酶反应的糖化氨基酸和糖化肽的条件； 
iii)切割来源于糖化β链N末端并可以与和目的蛋白酶联用的酮胺氧化酶反应的糖化氨基酸或糖化肽的条件。结果，本发明人完成了使用酶不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端的方法。 
即，本发明具有如下内容： 
(1)可从糖化血红蛋白的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不实质性地从糖化血红蛋白的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。 
(2)可从糖化血红蛋白的包括糖化β链N末端的片段切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不实质性地从糖化血红蛋白的包括糖化α链N末端的片段切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。 
(3)当其从糖化血红蛋白的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反应被定义为100％时，其从糖化血红蛋白的糖化α链N末端切割糖化氨基酸或糖化肽的反应以10％或更少发生的蛋白酶。 
(4)根据以上(1)至(3)项之任一的蛋白酶，其中从糖化血红蛋白的糖化β链N末端或从糖化血红蛋白的包括糖化β链N末端的片段切下的糖化肽是1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸。 
(5)根据以上(1)至(4)项之任一的蛋白酶，其中不被实质性地从糖化血红蛋白的糖化α-链N末端或糖化血红蛋白的包括糖化α-链N末端的片段切下的糖化氨基酸和糖化肽分别是1-脱氧果糖基-L-缬氨酸和1-脱氧果糖基-L-缬氨酸-L-亮氨酸。 
(6)根据以上(1)至(5)项之任一的蛋白酶，其是来源于溶杆菌属(Lysobacter)细菌的蛋白酶。 
(7)根据以上(1)至(5)项之任一的蛋白酶，其是来源于芽孢杆菌属种ASP-842(FERM BP-08641)或嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)NBRC3820的蛋白酶。 
(8)根据以上(1)至(7)项之任一的蛋白酶，其是金属蛋白酶、中性蛋白酶或弹性蛋白酶。 
(9)切割蛋白质或肽中的亮氨酸的N端侧肽键的弹性蛋白酶。 
(10)产酶溶杆菌YK-366(FERM BP-10010)株。 
(11)芽孢杆菌属种ASP-842(FERM BP-08641)株。 
(12)根据以上(6)项的蛋白酶的生产方法，其包括以下步骤(a)和(b)： 
(a)在培养液中培养溶杆菌属细菌；和 
(b)从培养液中提取蛋白酶。 
(13)根据以上(7)项的蛋白酶的生产方法，其包括以下步骤(a)和(b)： 
(a)在培养液中培养芽孢杆菌属种ASP-842(FERM BP-08641)或嗜水气单胞菌NBRC 3820；和 
(b)从该培养液提取蛋白酶。 
(14)具有以下特性(A)的酮胺氧化酶： 
(A)与对1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸的反应性相比而言，对ε-1-脱氧果糖基-(α-苄氧羰基-L-赖氨酸)的反应性是5％或更低。 
(15)根据以上(14)项的酮胺氧化酶，其还具有以下特性(B)和(C)： 
(B)由与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列有至少75％同源性的氨基酸组成；和 
(C)在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的第58或62位至少一个氨基酸被其它氨基酸替代。 
(16)根据以上(15)项的酮胺氧化酶，其中在(C)中所述的氨基酸替代中，第58位的氨基酸被缬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸替代；而第62位的氨基酸被组氨酸替代。 
(17)编码以上(14)至(16)项之任一的酮胺氧化酶的氨基酸序列的基因。 
(18)含有以上(17)项的基因的酮胺氧化酶表达载体。 
(19)含有以上(18)项的表达载体的宿主细胞。 
(20)不经分离操作，使用酶特异地测定糖化血红蛋白的糖化β-链N末端的方法。 
(21)根据以上(20)项的测定方法，其中所述酶包括蛋白酶(i)。 
(22)根据以上(21)项的测定方法，其中所述酶还包括酮胺氧化酶(ii)。 
(23)根据以上(22)项的测定方法，其中N末端通过以下反应步骤(iii)和/或(iv)特异地进行测定： 
(iii)反应步骤，其中蛋白酶(i)从糖化血红蛋白的糖化β-链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽但不实质性地从糖化血红蛋白切割可与酮胺氧化酶(ii)反应的ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸和/或包括ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸的糖化肽；和 
(iv)反应步骤，其中酮胺氧化酶(ii)对ε-1-脱氧果糖基-(α-苄氧羰基-L-赖氨酸)的反应性与其对1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸的反应性相比是30％或更低。 
(24)根据以上(23)项的测定方法，其中反应步骤(iii)在pH 5.0至6.0的反应条件下进行。 
(25)根据以上(23)或(24)项的测定方法，其中反应步骤(iv)在pH 5.5至6.5的反应条件下进行。 
(26)根据以上(21)至(25)项之任一的测定方法，其中蛋白酶(i)是根据以上(1)至(8)项之任一项的蛋白酶。 
(27)根据以上(22)至(26)项之任一的测定方法，其中酮胺氧化酶(ii)是可与蛋白酶自糖化血红蛋白的糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反应的酮胺氧化酶。 
(28)根据以上(27)项的测定方法，其中酮胺氧化酶来源于弯孢属(Curvularia)细菌。 
(29)根据以上(22)至(28)项之任一的测定方法，其中酮胺氧化酶(ii)包括以下两种酮胺氧化酶(a)和(b)： 
(a)与蛋白酶自糖化血红蛋白的糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反应的酮胺氧化酶；和 
(b)与蛋白酶自糖化血红蛋白的糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽不发生实质性反应但与ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸和/ 或包括ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸的糖化肽反应的酮胺氧化酶。 
(30)根据以上(29)项的测定方法，其中酮胺氧化酶(a)来源于弯孢属细菌和/或酮胺氧化酶(b)来源于镰孢属(Fusarium)细菌。 
(31)根据以上(22)至(26)项之任一的测定方法，其中酮胺氧化酶(ii)是根据以上(14)至(16)项之任一的酮胺氧化酶。 
(32)筛选可从糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端切下糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化α链N末端切下糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶的方法，其中使用具有3至20个氨基酸长的血红蛋白α链N末端糖化肽和具有3至20个氨基酸长的血红蛋白β链N末端糖化肽。 
(33)根据以上(32)项的筛选方法，其中血红蛋白α链N末端糖化肽和血红蛋白β链N末端糖化肽具有5个氨基酸长。 
(34)用于不经分离操作而特异测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的试剂盒，其包括以下(i)和(ii)： 
(i)蛋白酶；和 
(ii)根据以上(14)项的酮胺氧化酶。 
根据本发明，提供无需分离操作而能够特异地仅测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法、测定试剂盒、用于该特异测定的蛋白酶、该蛋白酶的生产方法或筛选方法、和可以用于该特异测定的酮胺氧化酶。 
附图简述 
图1显示酮胺氧化酶氨基酸序列的同源性。 
图2显示来源于芽孢杆菌属种ASP 842的蛋白酶的最适pH。 
图3显示来源于芽孢杆菌属种ASP 842的蛋白酶的pH稳定性。 
图4显示来源于芽孢杆菌属种ASP 842的蛋白酶的最适温度。 
图5显示来源于芽孢杆菌属种ASP 842的蛋白酶的热稳定性。 
图6显示来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶的最适pH。 
图7显示来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶的pH稳定 性。 
图8显示来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶的最适温度。 
图9显示来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶的热稳定性。 
图10显示来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的最适pH。 
图11显示来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的pH稳定性。 
图12显示来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的最适温度。 
图13显示来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的热稳定性。 
图14显示质粒pPOSFOD923的限制性图谱。 
图15显示吸光度差ΔAs和FVH浓度之间的关系。 
图16显示蛋白酶反应时间和所得测定值之间的关系。 
图17显示：利用FOD2消除掉在蛋白酶降解糖化血红蛋白后来源于糖化赖氨酸和包括糖化赖氨酸的肽的信号后，使用FOD923测定FVH的量时的测定方案。 
图18显示：在不消除蛋白酶降解糖化血红蛋白后来源于糖化赖氨酸和包括糖化赖氨酸的肽的信号的情况下，使用FOD923测定FVH的量时的测定方案。 
图19显示：在不消除蛋白酶降解糖化血红蛋白后来源于糖化赖氨酸和包括糖化赖氨酸的肽的信号的情况下，使用FOD923M测定FVH的量时的测定方案。 
最佳实施方式 
以下更详细地描述本发明的内容和优选实施方式。 
<Amadori化合物> 
术语“Amadori化合物”在本发明中指具有通式-(CO)-CHR-NH-(R表示氢原子或羟基)代表的酮胺结构的化合物，该化合物由具有氨基基团的化合物例如蛋白质和具有醛基基团的化合物例如葡萄糖的美拉反应(Maillard reaction)产生。Amadori化合物包括：糖化蛋白质例如糖化血红蛋白或糖化白蛋白；通过肽的糖化产生的糖化肽；等等。 
<糖化血红蛋白> 
该术语指通过美拉反应对血红蛋白进行糖化后产生的Amadori化合物，其中α链和β链N末端中的缬氨酸的各α-氨基基团或分子内赖氨酸的ε-氨基基团被认为经历了糖化。糖化血红蛋白的片段指通过降解糖化血红蛋白得到的肽。 
<血红蛋白A1c> 
在接受为国际标准的定义中，血红蛋白A1c被认为是血红蛋白β链N末端中的缬氨酸的α-氨基基团被糖化的糖化血红蛋白(ClinicalChemistry and Laboratory Medicine 36(5)：299-308(1998))。 
<特异地> 
短语“特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端”用于如下情况：通过测定糖化血红蛋白的糖化水平获得的值以80％比例或更高比例、期望地90％或更高比例、更期望地95％或更高比例来自血红蛋白β链N末端中缬氨酸α-氨基基团的糖化。 
<糖化氨基酸和糖化肽> 
在短语“蛋白酶不实质性地从糖化血红蛋白或其片段的糖化α链N末端切割糖化氨基酸或糖化肽”中，术语“糖化氨基酸”指1-脱氧果糖基-L-缬氨酸，而术语“糖化肽”指具有来自血红蛋白α链N末端的20个或更少氨基酸的长度、包括1-脱氧果糖基-L-缬氨酸作为N末端缬氨酸、并可以通过与蛋白酶联用的酮胺氧化酶检测的肽。例如，在来源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶与蛋白酶联用的情况下，该术语指1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-亮氨酸。 
在短语“蛋白酶可从糖化血红蛋白或其片段的糖化β链N末端切割糖化氨基酸或糖化肽”中，术语“糖化氨基酸”指1-脱氧果糖基-L-缬氨酸，而术语“糖化肽”指具有来自血红蛋白β链N末端的20或更少个氨基酸的长度、包括1-脱氧果糖基-L-缬氨酸作为N末端缬氨酸、并可以被与蛋白酶联用的酮胺氧化酶检测的肽。例如，在来源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶与蛋白酶联用时，该术语指1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸。在短语“蛋白酶可从糖化血红蛋白切割包括ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸的糖化肽”中，术语“糖化肽”指具有50或更少个氨基酸的长度的糖化肽。
注意，Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)已经于2004年4月12日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本。 
<实质性地> 
在蛋白酶反应中，短语“从糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽而不实质性地从糖化α链N末端切割糖化氨基酸和糖化肽”是指如下事实：当将从糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反应性定义为100％时，从糖化α链N末端切割糖化氨基酸或糖化肽的反应性为10％或更低，期望地1％或更低，更期望地0.1％或更低。注意，上述蛋白酶反应使用酮胺氧化酶，优选地来源于Curvulariaclavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶或来源于尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的酮胺氧化酶(由Asahi Kasei PharmaCorporation生产)，通过检测切割的产物进行测定。 
在酮胺氧化酶反应中，短语“与ε-糖化氨基酸反应而不实质性地与蛋白酶自糖化β-链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反应”是指如下事实：当将与ε-糖化氨基酸的反应性定义为100％时，与蛋白酶自糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽的反应性为10％或更低、优选地8％或更低、更优选地1％或更低、最优选地0.1％或更低。同时，在酮胺氧化酶反应中，短语“与蛋白酶自糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反应而不实质性地与ε-糖化氨基酸 反应”是指如下事实：当将与蛋白酶自糖化β链N末端切下的糖化氨基酸和/或糖化肽的反应性定义为100％时，与ε-糖化氨基酸的反应性为8％或更低、期望地1％或更低、更期望地0.1％或更低。注意，酮胺氧化酶反应通过检测产生的过氧化氢进行测定。 
<酮胺氧化酶> 
该术语指可与具有酮胺结构的化合物反应产生过氧化氢的酶，该酶也称作果糖基-胺氧化酶。 
<相比于和1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸的反应性，和ε-1-脱氧果糖基-(α-苄氧羰基-L-赖氨酸)的反应性为5％或更低的酮胺氧化酶> 
短语“相比于和1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸(以下也称作FVH)的反应性，酮胺氧化酶和ε-1-脱氧果糖基-(α-苄氧羰基-L-赖氨酸)(以下也称作FZK)的反应性为5％或更低”是指这样的事实：通过如下步骤进行测定时，反应性的比例为5％或更低：向200μl反应溶液(50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、0.1％Triton X-100、0.03％4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)、0.02％TOOS、5U/ml过氧化物酶和2mM FZK或FVH)加入20μl酮胺氧化酶；允许混合物在37℃反应5分钟；添加0.5ml 0.5％SDS；测定555nm的吸光度(A1)；使用不含FZK和FVH的反应溶液进行相同操作以测定吸光度(Ab)；和从差(A1-Ab)确定反应性。 
<分离操作> 
术语“分离操作”是指在一系列用于测定样品(例如全血样品或溶血的红细胞样品)中糖化血红蛋白的测定步骤的过程中，用于增加糖化血红蛋白或来源于糖化血红蛋白的物质的纯度或浓度的操作，其包括柱层析操作、膜过滤操作、吸附分离操作和沉淀分离操作。 
为了不经分离操作而使用酶特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端，在糖化血红蛋白的三种糖化位点——分子内赖氨酸、α链N 末端和β链N末端——中，酶必须具有仅仅针对β链N末端的糖化位点的特异性。作为用于获得该特异性的酶，可以使用一种酶或可以联合使用多种酶。例如，可以通过联合与通过蛋白酶降解糖化血红蛋白切下的来自糖化β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应的酶——氧化酶、脱氢酶、激酶等——获得该特异性。而且，为了使用蛋白酶或酮胺氧化酶仅仅测定糖化的β链N末端，必须根据如下特异性来联合酶。 
即，在蛋白酶和酮胺氧化酶分别划分为(P1)至(P4)和(K1)至(K5)类时，需要按如下联合这些酶：<(P1)和(K1)或(K2)或(K3)或(K4)>，<(P2)和(K1)或(K3)>，<(P3)和(K1)或(K2)>，<(P4)和(K1)>，<(P3)和(K5)和(K3)>，及<(P3)和(K5)和(K4)>。 
各类酶的性质如下： 
(P1)仅从糖化血红蛋白的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽， 
(P2)仅从糖化血红蛋白的糖化α链和β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽， 
(P3)仅从糖化血红蛋白的糖化β链N末端及包括分子内赖氨酸的位点切割糖化氨基酸和/或糖化肽， 
(P4)从糖化血红蛋白的糖化α链和β链N末端及包括分子内赖氨酸的位点切割糖化氨基酸和/或糖化肽， 
(K1)仅与所联用的蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自糖化β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应， 
(K2)仅与所联用的蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自糖化α链和β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应， 
(K3)仅与所联用的蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自糖化β链N末端及包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应， 
(K4)与所联用的蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的、来自糖化α链 和β链N末端及来自包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应， 
(K5)与所联用的蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的糖化氨基酸和/或糖化肽中来自包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽反应，但不与来自糖化β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽反应。 
<蛋白酶的筛选> 
本发明人经过深入的研究，结果发明了在使用血红蛋白α链N末端糖化肽和血红蛋白β链N末端糖化肽作为底物时仅利用血红蛋白β链N末端糖化肽作为底物以切割糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶的选择方法，作为获得具有(P1)或(P3)特异性的蛋白酶的筛选方法。以上所用α链N末端糖化肽和β链N末端糖化肽的长度不受特别的限制，但是已经发现使用长度为3至20个氨基酸的糖化肽可以进行筛选。这些肽可以从化学合成的化合物或天然产物例如糖化血红蛋白获得。 
其具体例子包括：作为β链N末端糖化肽，1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-苏氨酰-L-脯氨酸(由Peptide Institute，Inc.生产，之后也称作β糖化五肽)；和作为α链N末端糖化肽，1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-脯氨酰-L-丙氨酸(由PeptideInstitute，Inc.生产，之后也称作α糖化五肽)。当这些五肽用作底物时，蛋白酶可以切下糖化氨基酸、糖化二肽、糖化三肽或糖化四肽。蛋白酶自α链N末端糖化肽和β链N末端糖化肽切下的糖化氨基酸和/或糖化肽可以使用与切下的糖化氨基酸和/或糖化肽反应而不实质性地与α链N末端糖化肽和β链N末端糖化肽反应的酶进行检测，这些酶的实例包括氧化酶、脱氢酶和激酶。 
氧化酶的例子包括酮胺氧化酶。酮胺氧化酶的例子包括来源于Achaetomiella属、Achaetomium属、草根霉属(Thielavia)、毛壳霉属(Chaetomium)、麻孢壳属(Gelasinospora)、小囊菌属(Microascus)、Coniochaeta属、Eupenicillium属(其全部描述在EP 1,291,416的说明书中)、棒状杆菌属(Corynebacterium)(JP-A-61-268178)、曲霉属 (JP-A-03-155780)、青霉属(Penicillium)(JP-A-04-4874)、镰孢属(JP-A-05-192193，JP-A-07-289253，JP-A-08-154672)、赤霉属(JP-A-05-192153，JP-A-07-289253)、假丝酵母属(JP-A-06-46846)、曲霉属(JP-A-10-33177，JP-A-10-33180)、Neocosmospora vasinfecta(NBRC 7590)、Coniochaetidium savoryi(ATCC36547)、Arthrinium属种TO6(FERM P-19211)、Arthrinium phaeospermum(NBRC31950)、Arthrinium phaeospermum(NBRC 6620)、Arthriniumjaponicam(NBRC 31098)、Pyrenochaeta属种YH807(FERMP-19210)、Pyrenochaeta gentianicola(MAFF425531)、Pyrenochaetaterrestris(NBRC 30929)、Leptosphaeria nodorum(在分生孢子世代，名称为Phoma hennebelgii)(NBRC 7480)、桶孢小球腔菌(Leptosphaeria doliolum)(JCM2742)、Leptosphaeria maculans(在分生孢子世代，名称为Phoma lingam)(MAFF726528)、葱叶格孢腔菌(Pleospora herbarum)(NBRC 32012)、Pleospora betae(在分生孢子世代，名称为Phoma betae)(NBRC 5918)、Ophiobolus herpotrichus(NBRC 6158)、Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酶及其突变酶。 
来源于Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶对FVH的底物特异性为100％，而对1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酸(之后也称作β糖化三肽或FVHL)、1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酰-L-亮氨酰-L-苏氨酸(之后也称作β糖化四肽或FVHLT)、β糖化五肽、1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-亮氨酸(之后也称作FVL)和α糖化五肽的底物特异性分别为0.09％、0.0009％、0％、3.4％和0.01％。因此，蛋白酶从β糖化五肽切割FVH的活性和蛋白酶从α糖化五肽切割FVL的活性可以使用该酮胺氧化酶进行检测。当通过蛋白酶切割的糖化氨基酸和/或糖化肽使用氧化酶检测时，可以通过电极、发光、荧光、吸光度等检测产生的过氧化氢的量，但是容易的是使用过氧化物酶和色素原检测吸光度。例如，可以通过使用4-氨基安替比林(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)和 TODB(由Dojindo Laboratories生产)作为色素原测定从540nm至570nm的吸光度改变，容易地证实蛋白酶活性。 
通过上述筛选方法获得的具有(P1)或(P3)特异性的蛋白酶的实例包括来源于芽孢杆菌属、气单胞菌属和溶杆菌属细菌的蛋白酶。更具体的实例包括：来源于芽孢杆菌属种的中性蛋白酶(由Toyobo Co.，Ltd.生产)；和来源于芽孢杆菌属种ASP842(FERM BP-08641)、嗜水气单胞菌NBRC 3820或产酶溶杆菌YK-366(FERM BP-10010)的蛋白酶。 
在这些菌株中，芽孢杆菌属种ASP842(FERM BP-08641)和产酶溶杆菌YK-366(FERM BP-10010)是本发明人分离的新菌株，芽孢杆菌属种ASP842(FERM BP-08641)和产酶溶杆菌YK-366(FERMBP-10010)已经分别于2004年2月24日和2004年4月12日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(InternationalPatent Organism Depository，National Insititute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本。 
这些保藏菌株的真菌学特性显示如下，并按如下鉴定： 
1.ASP842(FERM BP-08641)是0.8至1.0x2.0至3.0μm大小并具有表1所示特性的革兰氏阳性细菌，因此根据Bergy’s Manual ofSystematic Bacteriology(1984)其被鉴定为芽孢杆菌属种。 
表1 
  (a)形态学特征  
  培养条件(培养基：营养琼脂；30℃)  
  细胞形状   0.8-1.0x2.0-3.0μm
  细胞多态性   -
  运动性   +(有缘毛的)
  孢子形成   +
  (b)培养特征  
  培养条件(培养基：营养琼脂；30℃)  
  颜色   奶油色
  光滑   -
  色素产生   -
  培养条件(液体培养基：营养培养液；30℃)  
  在表面上生长   +
  培养基不透明   -
  培养条件(明胶穿刺培养；30℃)  
  生长   +
  明胶液化   +
  培养条件(石蕊牛奶；30℃)  
  凝固   -
  液化   -
  (c)生理学特征  
  1)革兰氏染色   +
  2)硝酸盐还原   +
  3)反硝化反应   -
  4)MR试验   -
  5)VP试验   +
  6)吲哚产生   -
  7)硫化氢产生   -
  8)淀粉水解   +
  9)柠檬酸盐(Koser/Christensen)的利用   -/+
  10)无机氮源(硝酸盐/铵盐)的利用   -/+w
  12)脲酶活性   -
  13)氧化酶   +
  14)过氧化氢酶   +
  15)生长范围pH 5/8/10   +/+/+w
  生长范围温度20/25/45/50   +/+/+/+
  16)生长条件(需氧/厌氧)   +/-
  17)O-F试验(氧化/发酵)   -/-
  18)从糖产生酸/气体  
  L-阿拉伯糖   -/-
  D-葡萄糖   +/-
  D-果糖   +/-
  麦芽糖   +/-
  乳糖   +/-
  D-山梨糖醇   +/-
  肌醇   +/-
  D-木糖   +/-
  D-甘露糖   +/-
  D-半乳糖   -/-
  蔗糖   +/-
  海藻糖   +/-
  D-甘露糖醇   +/-
  甘油   +/-
  (d)其它生理学特征  
  β-半乳糖苷酶活性   -
  精氨酸双水解酶(dihydrolase)活性   -
  赖氨酸脱羧酶活性   -
  色氨酸脱氨酶活性   +
  明胶酶活性   +
  磷酸酶活性   +
  丙酸利用   -
  在10％NaCl存在下生长   +
  酪蛋白水解   +
  马尿酸水解   -
2.YK-366(FERM BP-10010)是具有0.4×5至50μm大小以及表2 所示特征的革兰氏阴性需氧杆菌，因此根据Bergy’s Manual ofSystematic Bacteriology(1989)，其被鉴定为产酶溶杆菌。 
表2 
<从培养产物产生蛋白酶> 
接下来，描述培养可以用于本发明的蛋白酶生产细菌的方法和产生该蛋白酶的方法。对于培养本发明的蛋白酶生产细菌的方法，可以使用固体培养或液体培养，但优选使用摇瓶、小型发酵罐等进行有氧液体培养。对于培养基，可以使用一般用于细菌培养的各种培养基。可用的碳源的实例包括葡萄糖、甘油、山梨糖醇、乳糖、甘露糖等。 可用的氮源的实例包括酵母提取物、肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨等。可用的无机盐的实例包括氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化钙等。对于培养条件，可以使用致使靶蛋白酶在pH 5.0至8.0及25至37℃的培养温度下达到最大效价或最大纯度的培养时间，例如，可以进行16至72小时的培养。 
之后将描述蛋白酶的收集。当细胞分泌蛋白酶时，使用通过过滤、离心等方式从培养基中除去细胞后获得的含有粗蛋白酶的溶液。而在蛋白酶存在于细胞中时，使用通过下述步骤获得的含有粗蛋白酶的溶液：通过过滤、离心等从培养基中分离细胞；将细胞悬浮在缓冲液例如磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中，如果必要，所述缓冲液中补加表面活性剂、金属盐、糖、氨基酸、多元醇、螯合剂等；使用溶菌酶、超声波、玻璃珠等匀浆细胞；和通过过滤、离心等方式除去不溶性产物。含有粗蛋白酶的溶液使用已知的用于蛋白质或酶的分离或纯化方式处理，产生纯化的蛋白酶。例如，可以适当地选择并组合一般的酶纯化方法，例如使用有机溶剂(包括丙酮或乙醇)的分级沉淀方法、使用硫酸铵等的盐析方法、离子交换层析方法、疏水层析方法、亲和层析方法和凝胶过滤方法，以获得纯化的蛋白酶。在添加单独一种或组合添加两种或更多种的适当稳定剂例如蔗糖、甘油或氨基酸(大约1至50％)和辅酶等(大约0.01至1％)后，可以冷冻保藏纯化的蛋白酶。 
<筛选酮胺氧化酶> 
对于获得具有性质(K1)；具有性质(K2)并可与FVH反应；或具有性质(K3)的酮胺氧化酶的筛选方法，其实例包括基于与如下物质的反应性的指数的方法：作为来源于α链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的代表性例子的FVL；作为来源于β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的代表性例子的FVH；或作为来自包括分子内赖氨酸的位点的糖化氨基酸和/或糖化肽的代表性例子的FK或ZFK；其中，这些物质已经通过蛋白酶作用从糖化血红蛋白上切割下来。具体地，该方法基于与FVH的反应性相比，与FK或FZK的反应性为5％或更低的指数进行。该反应性优选为4％或更低，更优选2％或更低。由此获得的具 有性质(K1)；具有性质(K2)并与FVH反应；或具有性质(K3)的酮胺氧化酶可以是：从自然界分离的天然酮胺氧化酶；通过使用已知的遗传工程技术，例如氨基酸替代、缺失或插入，人为地修饰天然酮胺氧化酶获得的突变酮胺氧化酶；和可以通过使用聚乙二醇衍生物、琥珀酰亚胺衍生物、马来酰亚胺衍生物等，化学修饰天然和突变酮胺氧化酶获得的酮胺氧化酶。 
<突变的酮胺氧化酶> 
对于可以通过人为地修饰(例如替代、缺失或插入)其一个或多个氨基酸用于获得具有性质(K1)；具有性质(K2)并与FVH反应；或具有性质(K3)的突变酮胺氧化酶的已有酮胺氧化酶，没有特别的限制。其实例包括在筛选方法中描述的、用于获得具有(P1)或(P3)特异性的蛋白酶的酮胺氧化酶。 
此外，可与FVH反应的酮胺氧化酶的实例包括来源于Coniochaeta属(EP 1,291,416)、Eupenicillium属(EP 1,291,416)、弯孢属和Neocosmospora属微生物的酮胺氧化酶。 
这些酶已经在遗传水平上进行了分析，所估计的一级结构显示在图1中。这些酶在氨基酸水平上的同源性为75％或更高，存在符号“＊”表示的保守区域，因此包括这些酶以作为包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列有至少75％同源性的氨基酸序列的酮胺氧化酶的实例。而且，只要实施的突变可以达到具有性质(K1)；具有性质(K2)并与FVH反应；或具有性质(K3)的目的，并不对氨基酸的替代、缺失或插入加以限制；但是期望地，例如，对相应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第58和62位氨基酸的氨基酸中至少一个进行替代。更期望的是，用缬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸替代相应于第58位氨基酸的氨基酸；和用组氨酸替代相应于第62位氨基酸的氨基酸。 
<突变酮胺氧化酶的表达载体和宿主细胞> 
具有性质(K1)；具有性质(K2)并与FVH反应；或具有性质(K3)的酮胺氧化酶可以按如下方式获得：如果必要，编码该酶的基因与质粒载体连接；将基因转移到宿主微生物例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、支顶孢属(Acremonium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、栖热菌属(Thermus)或埃希氏杆菌属(Escherichia)微生物中；培养微生物；或者体外转录和翻译编码基因；和使用已知用于蛋白质或酶的分离或纯化方法进行处理。 
<测定试剂盒> 
通过使用蛋白酶和酮胺氧化酶、不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和试剂盒可以包括为获得对糖化β链N末端的特异性而组合的蛋白酶和酮胺氧化酶以及过氧化物酶和色素原，而且如果必要，可以适当地添加缓冲液成分、盐、表面活性剂、金属离子、电子受体、螯合剂、糖、氨基酸、抗坏血酸氧化酶、四唑盐、多元醇、酶稳定剂、酶反应促进剂、抗细菌剂、抗氧化剂、还原剂、辅酶等。 
当蛋白酶和酮胺氧化酶被分别划分成如上述的(P1)至(P4)和(K1)至(K5)时，如下组合均可以用作蛋白酶和酮胺氧化酶的组合以获得对糖化β链N末端的特异性：<(P1)和(K1)或(K2)或(K3)或(K4)>、<(P2)和(K1)或(K3)>、<(P3)和(K1)或(K2)>、<(P4)和(K1)>、<(P3)和(K5)和(K3)>、及<(P3)和(K5)和(K4)>。然而，一般地，当蛋白质的N末端氨基基团已经被糖化时，从N末端区域切割糖化氨基酸的反应性低。因此，期望的是，蛋白酶从β链N末端的糖化氨基酸切下糖化肽。可以通过上述蛋白酶筛选获得的、具有性质(P3)并具有从β链N末端切割FVH的性质的蛋白酶的实例包括：来源于属于芽孢杆菌属、气单胞菌属、溶杆菌属等的细菌的蛋白酶。更具体的实例包括来源于芽孢杆菌属种的中性蛋白酶(由Toyobo Co.，Ltd.生产)、来源于芽孢杆菌属种ASP-842(FERM BP-08641)、嗜水气单胞菌NBRC 3820和产酶溶杆菌YK-366(FERM BP-10010)的蛋白酶。此外，为了提高反应性并同 时保持特异性，所筛选的蛋白酶可以和其它适当的蛋白酶联用。 
从血红蛋白的糖化β链N末端切下的糖化肽的长度为20个氨基酸或更短，并且只要可以使用所联用的酮胺氧化酶检测该肽，该长度不受特别限制。例如，在使用来源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶的情况下，期望的是，通过蛋白酶自血红蛋白的糖化β链N末端切下的糖化肽是FVH。 
尽管只要酮胺氧化酶可以与蛋白酶构建上述的联合，对该酮胺氧化酶不加以限制，但是期望的是，就反应性而言，蛋白酶自β链N末端切割的是糖化肽而不是糖化氨基酸。因此，期望地，在(K1)至(K5)中提及的来源于糖化β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽是来源于糖化β链N末端的糖化肽。例如，来源于Curcularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶可与来源于糖化β链N末端的糖化二肽(FVH)反应，但不实质性地与来源于糖化α链N末端的糖化二肽(FVL)反应，这样该酮胺氧化酶可以用作具有性质(K3)的酮胺氧化酶。而且，相对于和FVH的反应性而言和FZK的反应性为5％或更低的突变体可以用作具有性质(K1)的酮胺氧化酶，而来源于尖孢镰孢的果糖基胺氧化酶(由Asahi Kasei Pharma Corparation生产)可以用作具有性质(K5)的酮胺氧化酶。 
<反应条件> 
蛋白酶切割糖化血红蛋白糖化β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽的反应条件只要足够反应进行，即可不加限制。例如，一般地，期望的是，通过调节pH、盐浓度、添加的表面活性剂的量、添加的金属离子的量、反应温度、添加的氧化剂-还原剂的量、或缓冲液浓度增加具有(P3)或(P2)性质的蛋白酶的特异性从而获得性质(P1)的反应条件。具体地，对于来源于芽孢杆菌属种的中性蛋白酶(由Toyobo Co.Ltd.生产)和来源于芽孢杆菌属种ASP-842(FERM BP-08641)、嗜水气单胞菌NBRC 3820和产酶溶杆菌YK-366(FERM BP-10010)的蛋白酶，当来源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧 化酶用作待联合的酮胺氧化酶时，这些蛋白酶必须在pH 5.0至6.0的反应条件下成为具有性质(P1)的蛋白酶，因此优选该反应条件。 
酮胺氧化酶的反应条件只要足够反应进行，即可不加以限制。例如，期望是，通过调节pH、盐浓度、添加的表面活性剂的量、添加的金属离子的量、反应温度、添加的氧化还原量、或缓冲液浓度从而对FZK获得30％或更低的反应性的反应条件。尤其期望的是pH5.5至6.5的反应条件，因为可以增强对FVH——通过蛋白酶的切割作用来源于β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽——的特异性。 
上述利用蛋白酶和酮胺氧化酶不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和试剂盒对糖化血红蛋白的糖化β链N末端的正确测定，可以通过使用其中的血红蛋白含量和血红蛋白β链N末端的糖化率得到正确证实的样品进行验证。对于其中的血红蛋白含量和血红蛋白β链N末端的糖化率得到正确证实的样品，期望使用的是通过Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 40(1)：78-89(2002)描述的方法获得的测定值(IFCC值)得到明确说明的样品。或者，在明确说明了通过其它方法获得的测定值的样品中，可以通过RinshoKensa 46(6)，729-734(2002)所述的换算公式获得IFCC值。而且，可以从人血液通过适当地组合操作例如血细胞分离、溶血、离心、透析、离子交换层析和亲和层析(Clinical Chemistry and LaboratoryMedicine 36(5)：299-308(1998))制备糖化血红蛋白样品，或者可以购买和使用市售样品。 
<测定对象> 
上述使用蛋白酶和酮胺氧化酶不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和试剂盒的测定对象，只要包括糖化血红蛋白即可不加限制，其实例包括全血样品、溶血的血细胞样品和纯化的血红蛋白样品。 
以下将通过参考实施例和实施例描述本发明。 
[参考实施例：生产来源于Curvularia clavata YH 923(FERMBP-10009)的酮胺氧化酶的方法] 
尽管Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)产生可与FVH反应的酮胺氧化酶(之后也称作FOD923)，但是酮胺氧化酶的产量低。因此，如下述，在大肠杆菌中表达FOD923基因，并加以纯化以得到FOD923。 
(1)制备Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的染色体DNA将100ml Sabouraud氏培养基(葡萄糖4.0％、聚胨1.0％、pH 5.6)倒入500ml体积的摇瓶中，高压灭菌，向其中接种Curvularia clavataYH 923(FERM BP-10009)，25℃振荡培养4天，之后使用2号滤纸过滤培养基，由此收集细胞。所收集的细胞经液氮冷冻后在研钵中粉碎得到细粉末。然后，向其中加入15ml用于DNA提取的缓冲液(5.0％SDS，0.1M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)，缓慢地摇动混合物以溶解粉末。随后，离心(5,000rpm，6min，室温)收集上清液，进行3次苯酚/氯仿提取和2次醚提取，蒸发剩余在水层中的醚。然后，加入1ml 3M乙酸钠和25ml乙醇，混合物在-30℃放置30分钟。 
之后离心(12,000rpm，10min，4℃)收集染色体DNA，70％乙醇洗涤，溶解在400μl TE中。之后，向所获DNA溶液中加入10μl(0.132U)RNase，混合物在37℃处理1小时。然后加入5μl(o.6U)蛋白酶K，混合物在50℃处理1小时。之后，苯酚/氯仿提取(2次)和氯仿/异戊醇提取(1次)，乙醇沉淀收集DNA。收集的DNA用70％乙醇溶液洗涤，除去乙醇后溶解在200μl TE中，由此得到染色体DNA溶液。 
(2)扩增FOD923基因片段 
(a)获得FOD923基因片段 
基于已知的酮胺氧化酶基因信息，设计以下引物P11和P12。 
P11AA(A/G)GC(C/T)AT(C/T)AACGC(C/T)AT(C/T)GG(SEQID NO：2) 
P12AC(C/G)ACGTGCTT(A/G)CC(A/G)ATGTT(SEQ ID NO：3) 
使用通过上述方法获得的染色体DNA作为模板DNA，利用引物P11和引物P12组合，进行35个PCR循环。结果，特异地扩增了大约800bp的DNA片段，测序该扩增的DNA片段(SEQ ID NO：1中第1021位碱基至第1790位碱基的序列)。 
(b)FOD923基因测序 
(a)中获得的大约800bp的DNA片段的相邻5’上游区DNA片段通过盒连接介导的PCR，使用LA-PCR体外克隆试剂盒(由Takara BioInc.生产)，在用限制性酶XbaI消化染色体DNA后进行扩增。即，XbaI盒(由Takara Bio Inc.生产)与限制性酶处理染色体DNA后获得的片段连接，使用所得DNA作为模板DNA并利用引物C1(由Takara Bio Inc.生产)以及以下引物P13进行35个PCR循环。然后，利用稀释反应溶液100倍得到的溶液作为模板，利用引物C2(由Takara Bio Inc.生产)以及以下引物P14，再进行35个PCR循环。结果特异地扩增了1,200bp大小的DNA片段。然后，测序该扩增的DNA片段(在SEQ IDNO：1中从第1位碱基至第1044位碱基的序列)。 
(a)中获得的大约800bp的DNA片段的相邻3’下游区DNA片段通过盒连接介导的PCR，使用LA-PCR体外克隆试剂盒(由Takara BioInc.生产)，在用限制性酶SalI消化染色体DNA后进行扩增。即，SalI盒(由Takara Bio Inc.生产)与限制性酶处理染色体DNA后获得的片段连接，使用所得DNA作为模板DNA并利用引物C1(由Takara Bio Inc.生产)以及以下引物P15进行35个PCR循环。然后，利用稀释反应溶液100倍得到的溶液作为模板，利用引物C2(由Takara Bio Inc.生产)以及以下引物P16，再进行35个PCR循环。结果特异地扩增了1,000bp大小的DNA片段。然后，测序该扩增的DNA片段(在SEQ IDNO：1中从第1775位碱基至第2212位碱基的序列)。 
连接以上确定的碱基序列以确定FOD923基因的碱基序列(SEQID NO：1)。 
P13GCCAAAAGAGGCTGCTTGAACGAT 
(与SEQ ID NO：1的1,083至1,106的碱基序列互补的序列) 
P14GCATCCAGCACCACCAAAACAAAC 
(与SEQ ID NO：1的1,062至1,086的碱基序列互补的序列) 
P15TGGTGCCAGAACAACATGTACTGACC 
(SEQ ID NO：1的1,713至1,738的碱基序列) 
P16ACCTGGTTTGCCTAGGCACACA 
(SEQ ID NO：1的1,736至1,757的碱基序列) 
(3)制备表达来源于Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶的大肠杆菌(Escherichia coli) 
为了在大肠杆菌中表达FOD923，从微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)来源的酮胺氧化酶(JP-A-11-46769)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)来源的酮胺氧化酶之间的同源性，估计SEQ IDNO：1中的三个区域，即，SEQ ID NO：1中第753位碱基至第807位碱基的序列，SEQ ID NO：1中第1231位碱基至第1279位碱基的序列，和SEQ ID NO：1中第1696位碱基至1750位碱基的序列，是内含子。 
通过如下操作除去内含子并产生在大肠杆菌中的表达质粒。 
首先，合成：DNA片段P22至P27——其具有包括40至50个碱基而位于待除去的内含子所在区域的侧翼的序列的正序列及互补序列；DNA片段P21——其通过在FOD923基因的起始密码子ATG上添加限制性酶NcoI的限制性序列获得；和DNA片段P28——其具有通过在恰好位于FOD923基因终止密码子后面的位点上添加限制性酶SacI而获得的互补序列。 
随后，使用Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的染色体DNA作为模板并分别使用引物P21和P23、P22和P25、P24和P27、以及P26和P28的联合，进行4种PCR，由此产生大小分别为327bp、480bp、471bp或254bp的、已经除去了内含子区域的扩增DNA片段。然后，所得4个片段混合并用作模板，通过使用P21和P28作为引物 再次进行PCR，由此得到大小约1.4kb的DNA片段，该DNA片段具有一个由四个片段在三个同源区域连接而成的、除去了内含子的FOD923基因。 
为了在大肠杆菌中高水平地产生FOD923，使用来源于浅绿气球菌(Aerococcus viridans)的丙酮酸氧化酶启动子(JP-A-07-67390)——一种高表达启动子。其具体步骤描述如下。 
1)为了从包括浅绿气球菌的丙酮酸氧化酶基因(见JP-B-07-67390)的质粒pOXI3获得丙酮酸氧化酶基因的启动子区域，用DraI切割pOX13以分离具有SEQ ID NO：6所示202bp大小的DNA序列的丙酮酸氧化酶基因启动子区，然后与SalI切割pUC13并用T4DNA聚合酶平端化后得到的片段连接，由此得到质粒pKN19，在pKN19中pUC13的氨苄青霉素抗性基因的方向和丙酮酸氧化酶基因启动子的方向相同。 
2)为了通过启动子更有效地表达，合成：具有SEQ ID NO：7所示碱基序列的DNA片段P31——该片段经设计可以在pKN19的丙酮酸氧化酶基因启动子下游提供核糖体结合序列区和多克隆位点；和具有其互补序列的DNA片段P32——P32具有SEQ ID NO：8所示碱基序列。然后，实施退火，将这些片段与XbaI和EcoRI切割的pKN19连接，由此制备质粒pPOS2。 
3)约1.4kb大小并包括上述已经除去了内含子的FOD923基因的DNA片段用NcoI和SacI切割，所得产物整合在也用NcoI和SacI切割的pPOS2中，由此制备质粒pPOSFOD923，其中FOD923基因整合在丙酮酸氧化酶基因启动子的下游。 
4)用所得pPOSFOD923转化大肠杆菌W3110以产生表达FOD923的大肠杆菌FAOD923。 
P21 
CACACATCCTCGTCATTTCGCCATGGCGCCCTCAAGAGCAAAC(SEQ ID NO：4) 
P22 
CAAAGAGTATTTCCACAACACTGGAAGACTCGACTGTGCACATGGGGAAGAGG 
(SEQ ID NO：1中725至752和808至832的碱基序列) 
P23 
CCTCTTCCCCATGTGCACAGTCGAGTCTTCCAGTGTTGTGGAAATACTCTTTG 
(SEQ ID NO：1中725至752和808至832的碱基序列的互补序列) 
P24 
GACCTGGAAGATCAATGCGTTTCAAAAGCTTGGGTATATGCTCACATACAGCTTAC 
(SEQ ID NO：1中1,204至1,230和1,280至1,308的碱基序列) 
P25 
GTAAGCTGTATGTGAGCATATACCCAAGCTTTTGAAACGCATTGATCTTCCAGGTC 
(SEQ ID NO：1的1,204至1,230和1,280至1,308的碱基序列的互补序列) 
P26 
CTTTGTGCTGGCGACAGGGGACAGCGGGCACACATTCAAACTTTTGCCAAATATC 
(SEQ ID NO：1的1,669至1,695和1,751至1,778的碱基序列) 
P27 
GATATTTGGCAAAAGTTTGAATGTGTGCCCGCTGTCCCCTGTCGCCAGCACAAAG 
(SEQ ID NO：1的1,669至1,695和1,751至1,778的碱基序列的互补序列) 
P28 
CACGCTACAAGACGAGTTTCGAGCTCTATAACTTGGACTTGACAAC(SEQ ID NO：5) 
P31 
CTAGAGGAATAACACCATGGCCGTCGACGCTAGCATGCATGGATCCCGGGTACCGAGCTCG(SEQ ID NO：7) 
P32 
AATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCCATGCAGCTAGCGTCGACGGCCATGGTGTTATTCCT(SEQ ID NO：8) 
(4)制备来源于Curvularia clavata YH 923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶 
在2.4cm直径的试管中接种上述制备的大肠杆菌FAOD923，其中每个试管中含有10ml具有3％山梨糖醇、1.5％蛋白胨、1.5％啤酒酵母提取物和50μg/ml氨苄青霉素的培养基(pH 7.0)，在28℃振荡培养12小时得到接种物。在含有20L培养基(pH 7.0)的30L小型发酵罐中接种该接种物，其中所述培养基含有3％山梨糖醇、1.5％蛋白胨、1.5％啤酒酵母提取物、0.1％消泡剂和50μg/ml氨苄青霉素，37℃搅动培养18小时。 
培养完成后，收集培养细胞并悬浮在4L 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，通过超声粉碎进行溶解(212KU)。溶解的溶液在8,000rpm离心30分钟，上清液使用Q-Sepharose Big Beads树脂(2L)(Amersham生产)进行离子交换层析。用包括0M、0.1M、0.3M或0.5MNaCl的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)实施洗脱。结果，收集用包括0.3M和0.5M NaCl的缓冲液洗脱的级分作为活性级分(180KU)。通过组件(Amicon生产)将酶溶液浓缩到750ml，浓缩的溶液在10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中透析过夜。使用Q-Sepharose HP树脂(Amersham生产)(500ml)对透析的溶液进行离子交换层析。用包括0至0.3M NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)通过线性梯度进行洗脱，收集用包括0.15至0.2M NaCl的缓冲液洗脱的级分(92KU)。将酶溶液浓缩到500ml，浓缩的溶液对10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)透析过夜，之后冷冻干燥得到纯化的FOD923。以下描述用于FOD923活性的测定试剂和测定方法。 
<测定试剂> 
50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5) 
1mM FVH(Peptide Institute，Inc.生产) 
0.02％4-氨基安替比林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产) 
0.02％TOOS(Dojindo Laboratories生产) 
5U/ml过氧化物酶(Sigma Corporation生产) 
(TOOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺) 
<测定方法> 
将1ml测定试剂加入试管，在37℃预热5分钟，然后向其中加入0.05ml酶溶液，允许溶液反应5分钟。反应后，加入2ml 0.5％SDS终止反应，测定550nm波长的吸光度(Aa)。同时，作为空白试验，使用不包括FVH的测定试剂实施相同操作以测定吸光度(Ab)。从吸光度(Aa)和空白的吸光度(Ab)的吸光度差(Aa-Ab)，计算酶活性。 
一个单位的酶活性定义为37℃下1分钟产生1μmol过氧化氢的酶量。 
[参考实施例：来源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶的制备方法] 
尽管Neocosmospora vasinfecta 474产生与FVH反应的酮胺氧化酶(以下也称作FOD474)，但酮胺氧化酶的产量低。因此，如下述，在大肠杆菌中表达该酮胺氧化酶基因并纯化得到酮胺氧化酶。 
(1)制备Neocosmospora vasinfecta 474的染色体DNA 
将100ml Sabouraud培养基(葡萄糖4.0％、聚胨1.0％、pH 5.6)倒入500ml体积的Sakaguchi瓶中，高压灭菌，向其中接种Neocosmospora vasinfecta 474，25℃振荡培养4天，之后使用2号滤 纸过滤培养基，由此收集细胞。收集的细胞用液氮冷冻，在研钵中粉碎得到细的粉末，使用DNeasy Plant Maxi试剂盒(QIAGEN生产)获得染色体DNA溶液。 
(2)克隆酮胺氧化酶基因 
(a)制备放射性DNA探针 
预期Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶基因与FOD923基因同源。因此，用限制性酶NcoI和SacI切割包括FOD923基因的上述质粒pPOSFOD923，分离约1.4kb大小并包括酮胺氧化酶基因的DNA片段。然后，使用BcaBEST标记试剂盒(Takara Bio Inc.生产)和[α-32P]dCTP及该DNA片段制备放射性DNA探针。 
(b)通过Southern杂交检测含有酮胺氧化酶基因的DNA片段 
为了从通过(1)中所述操作获得的Neocosmospora vasinfecta 474的染色体DNA制备基因文库，用各种限制性酶切割该染色体并检测含有靶基因的DNA片段的长度。首先，用各种限制性酶切割Neocosmospora vasinfecta 474的染色体DNA，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，将DNA从琼脂糖凝胶转移至尼龙膜(Biodyne A：PALLCorporation生产)。接着，膜空气干燥后浸没在杂交溶液(0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白，0.75M氯化钠，75mM柠檬酸钠，50mM磷酸三钠，0.1％十二烷基硫酸钠，250μg/ml鲑精DNA，和50％甲酰胺)中，42℃预杂交2小时。预杂交后，将杂交溶液更换为新的杂交溶液，加入(a)中制备的放射性DNA探针，之后在42℃杂交过夜。杂交后，膜用洗涤溶液(75mM氯化钠，7.5mM柠檬酸钠和0.1％SDS)在50℃洗涤10分钟，自然干燥。干燥的膜放置在X光片上，-70℃曝光24小时。 
曝光后，X光片显影，观察通过各种限制性酶切割染色体显示的阳性条带的大小。结果，发现在通过用SacI切割获得的大约8kb大小的DNA片段上存在酮胺氧化酶基因，使用通过SacI切割而获得的8kb 染色体DNA片段产生基因文库。 
(c)制备基因文库 
通过(1)中所述操作获得的Neocosmospora vasinfecta 474染色体DNA用限制性酶SacI切割，进行琼脂糖电泳以分离大约8kb大小的DNA片段。所得DNA片段使用DNA连接试剂盒(Takara Bio Inc.生产)与在用限制性酶SacI切割后用碱性磷酸酶脱磷酸化的pUC119连接。用所得物转化大肠杆菌JM 109感受态细胞(Takara Bio Inc.生产)，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基(Becton，Dickinson andCompany生产)上培养，得到大约5,000个氨苄青霉素抗性菌落，这些菌落用作基因文库。 
(d)通过菌落杂交筛选包含含有酮胺氧化酶基因的DNA片段的重组大肠杆菌 
将(c)中获得的基因文库复制在尼龙膜(Biodyne A：PALLCorporation生产)上，根据膜的所附手册，将细胞的DNA固定于其上。将固定了DNA的膜浸没在(b)中所示杂交溶液中，42℃预杂交1小时。预杂交后，将杂交溶液更换为新的杂交溶液，加入(a)中制备的放射性DNA探针，之后42℃杂交处理过夜。杂交后，膜用(b)中所示洗涤溶液在50℃洗涤10分钟，自然干燥。干燥的膜放置在X光片上，-70℃曝光24小时。曝光后，X光片显影，鉴定到显示阳性信号的8个菌落。 
(e)提取重组质粒和测序酮胺氧化酶基因 
将(d)中选择的显示阳性信号的菌落接种在含有50μg/ml氨苄青霉素的1.5ml LB液体培养基(Becton，Dickinson and Company生产)中，37℃振荡培养16小时，提取质粒。结果，来源于8个菌落的质粒被发现具有相同的染色体DNA片段。对于其中一个质粒，鉴定到与FOD923基因同源的一个区域，并对FOD474基因进行测序。SEQ ID NO：9显示测定的FOD474基因碱基序列和由其编码的氨基酸序列。 
(3)构建表达Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶的大肠杆菌为了在大肠杆菌中表达FOD474，合成：在FOD474基因的起始密码子ATG上添加了限制性酶BspHI的限制性序列的引物P41(SEQID NO：10)；和恰好在酮胺氧化酶基因的终止密码子后面的位点上添加了限制性酶SacI的识别序列的、具有互补序列的引物P42(SEQ IDNO：11)。 
之后，使用Neocosmospora vasinfecta 474的染色体DNA作为模板，使用P41和P42作为引物进行25个PCR循环，由此产生大约1.4kb大小并包括FOD474基因的DNA片段。用BspHI和SacI切割DNA片段，将所得产物掺入NcoI和SacI切割的pPOS2以制备质粒pPOSFOD474，在该质粒中酮胺氧化酶基因整合在丙酮酸氧化酶基因启动子的下游。此外，将通过用XbaI和SacI切割获得的、大约1.4kb大小并包括FOD474基因的DNA片段掺入质粒pUC119，由此产生质粒p119-FOD474(FERM BP-08642)，并测序。结果，证实没有发生由于PCR引起的突变。用所得pPOSFOD474转化大肠杆菌W3110，以构建表达FOD474的大肠杆菌FAOD474。 
质粒p119-FOD474(FERM BP-08642)已经于2004年2月24日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，TsukubaCentral 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本。 
P41TTTTTTCATGACCACCCCCCGCAAAGAAACCACCGTCCTC(SEQ ID NO：10) 
P42TTTTTGAGCTCATCTTGACTCGCTGTCCTGATCGTGCTTC(SEQ ID NO：11) 
(4)制备来源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶使用大肠杆菌FAOD474以和所述FOD923相同的方式进行操作。同时，用于FOD474活性的测定试剂和方法也与上述用于FOD923的 相同。 
[参考实施例：来源于Curvularia clavata YH923(FERM BP-10009)的酮胺氧化酶、来源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶、和来源于尖孢镰孢的酮胺氧化酶(Asahi Kasei Pharma Corporation生产)的底物特异性] 
将20μl酶溶液加入200μl反应溶液(50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、0.1％Triton X-100、0.03％4-氨基安替比林、0.02％TOOS、5U/ml过氧化物酶和2mM底物)中，混合物在37℃反应5分钟，然后加入0.5ml 0.5％SDS。测定555nm的吸光度(A1)，使用不含底物的反应溶液进行相同操作以测定吸光度(Ab)，由此从(A1-Ab)差确定反应性。表3显示：所用来源于FOD923、FOD474和尖孢镰孢(由Asahi KaseiPharma Corporation生产：之后也称作FOD2)的酮胺氧化酶的酶溶液浓度；所用底物；吸光度差(A1-Ab)；和相对活性(％)。 
[参考实施例：通过血管紧张肽转化酶从FVHL释放果糖基缬氨酸的反应] 
将来源于猪肾的血管紧张肽转化酶(Sigma Corporation生产：之后称作ACEP)和来源于兔肺的血管紧张肽转化酶(Sigma Corporation生产：之后称作ACER)溶解在酶溶解溶液(100mM HEPES(pH 8.3)，300mM NaCl)中以具有20U/ml浓度，从而制备ACEP溶液和ACER溶液。之后，将20μl所述酶溶解溶液、ACEP溶液和ACER溶液分别加入各含有20μl 2mM FVHL(Peptide Institute，Inc.生产)溶液的三个试管中，混合物在37℃反应1小时。然后，将200μl显色溶液(50mMTris-HCl(pH 7.5)、0.1％Triton X-100、5U/ml POD、50U/ml FOD2和0.02mM DA-64)加入各反应物，混合物在37℃反应5分钟。之后，加入500μl 0.5％SDS终止显色反应，测定730nm的吸光度。除了使用蒸馏水代替2mM FVHL溶液外，进行相同反应。同时，向40μl FV溶液(0，5，10，20或50μM)加入200μl显色溶液，按以上相同的方式 进行测定。然后，产生校准曲线，并确定分别通过ACEP和ACER从FVHL释放的FV量。FV的校准曲线揭示，在5μM、10μM、20μM和50μM的FV浓度(μM)下吸光度差分别为0.019、0.033、0.065和0.0154。同时，发现显示通过ACEP反应释放的FV的吸光度差为-0.006，而发现显示通过ACER反应释放的FV的吸光度差为0.000。这些结果揭示，在一般的反应中通过ACEP和ACER几乎不能从FVHL释放FV。而且发现，当通过向40μl样品(25μM FV，10U/mlACER)添加显色溶液进行相同测定时，吸光度差是0.062，由此说明在该显色溶液中ACER几乎不抑制显色反应。 
表3 
Figure G04819882020060206D000401
实施例1 
筛选用于血红蛋白A1c测定(pH 7.5)的蛋白酶 
显示筛选如下蛋白酶的方法，所述蛋白酶可从血红蛋白β链的N末端糖化五肽切割糖化肽而不实质性地从血红蛋白α链的N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽。将各10μl用于筛选的样品分别放入96孔板的3个孔。然后，第一个孔补加50μl α溶液，第二个孔补加50μl β溶液，而第三个孔补加50μl对照溶液。板子在37℃温育60分钟后，加入50μl蒸馏水和50μl显色溶液，整个在室温放置30分钟。然后，使用小平板读数器(550型，Bio-Rad生产)测定550nm测量波长下的吸光度和595nm参考波长下的吸光度，以选择如下样品，对于所述样品，补加β溶液的孔和补加对照溶液的孔之间的吸光度差大于补加α溶液的孔和补加对照溶液的孔之间的吸光度差。由此选择目的蛋白酶。所用样品包括：羧肽酶B(Sigma-Aldrich Corp.生产)；羧肽酶W(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)；羧肽酶Y(Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)；蛋白酶(XXVII类nagase：Sigma-Aldrich Corp.生产)；蛋白酶(VIII类枯草杆菌蛋白酶Carlsberg：Sigma-Aldrich Corp.生产)；蛋白酶(XXIV类Bacterial：Sigma-AldrichCorp.生产)；蛋白酶K(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)；中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产)；羧肽酶A(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生产)；嗜热菌蛋白酶(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)；和蒸馏水。为了验证通过显色溶液造成的显色程度，将10μl 1mM FVH(Peptide Institute Inc.生产)和1mM FVL(PeptideInstitute Inc.生产)分别加入孔中，之后添加50μl对照溶液。整个在37℃温育60分钟。然后，加入50μl蒸馏水和50μl显色溶液，整个在室温放置30分钟，之后按上述相似的方式实施测定。结果显示在表4和表5。结果证实，羧肽酶B、羧肽酶W、中性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶是在pH 7.5下从血红蛋白β链N末端糖化五肽切割糖化肽而不实质性地从血红蛋白α链N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。 
<α溶液> 
50mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.1％Triton X-100 
0.2mM α糖化五肽(Peptide Institute Inc.生产) 
<β溶液> 
50mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.1％Triton X-100 
0.2mM β糖化五肽(Peptide Institute Inc.生产) 
<对照溶液> 
50mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.1％Triton X-100 
<显色溶液> 
100mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.09％4-氨基安替比林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产) 
0.06％TODB(Dojindo Laboratories生产) 
15U/ml过氧化物酶(Sigma-Aldrich Corp.生产) 
18.75U/ml FOD923 
(TODB：N，N-二(4-磺基丁基)-3-甲基苯胺) 
表4 
原始数据(pH 7.5) 
    α溶液   β溶液   对照溶液
  羧肽酶B(100U/ml)   0.036   0.127   0.028
  羧肽酶W(520U/ml)   0.035   0.194   0.028
  羧肽酶Y(1010U/ml)   0.240   0.209   0.031
  XXVII类蛋白酶(810U/ml)   0.021   0.031   0.016
  VIII类蛋白酶(1100U/ml)   0.023   0.020   0.012
  XXIV类蛋白酶(1070U/ml)   0.018   0.033   0.010
  蛋白酶K(520U/ml)   0.031   0.077   0.017
  中性蛋白酶(4000U/ml)   0.029   0.196   0.026
  蒸馏水   0.028   0.039   0.028
  1mM果糖基-Val-His   ---   ---   0.188
  1mM果糖基-Val-Leu   ---   ---   0.198
表5 
原始数据(pH 7.5) 
    α溶液   β溶液   对照溶液
  羧肽酶A(1000U/ml)   0.022   0.145   0.018
  嗜热菌蛋白酶(75kU/ml)   0.053   0.249   0.055
  蒸馏水   0.013   0.011   0.010
  1mM果糖基-Val-His   ---   ---   0.169
  1mM果糖基-Val-Leu   ---   ---   0.161
实施例2： 
筛选用于血红蛋白A1c测定(pH 3.5)的蛋白酶 
显示筛选如下蛋白酶的方法，所述蛋白酶从血红蛋白β链的N末端糖化五肽切割糖化肽而不实质性地从血红蛋白α链的N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽。将各10μl用于筛选的样品分别放入96 孔板的3个孔。然后，第一个孔补加50μl α溶液，第二个孔补加50μl β溶液，而第三个孔补加50μl对照溶液。板子在37℃温育60分钟后，加入50μl调节pH的溶液和50μl显色溶液，整个在室温放置30分钟。然后，使用小平板读数器(550型，Bio-Rad生产)测定550nm测量波长下的吸光度和595nm参考波长下的吸光度，以选择如下样品，对于所述样品，补加β溶液的孔和补加对照溶液的孔之间的吸光度差大于补加α溶液的孔和补加对照溶液的孔之间的吸光度差。由此选择目的蛋白酶。所用样品包括：羧肽酶B(Sigma-Aldrich Corp.生产)；羧肽酶W(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)；羧肽酶Y(Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)；蛋白酶(XXVII类nagase：Sigma-Aldrich Corp.生产)；蛋白酶(VIII类枯草杆菌蛋白酶Carlsberg：Sigma-Aldrich Corp.生产)；蛋白酶(XXIV类Bacterial：Sigma-AldrichCorp.生产)；蛋白酶K(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)；中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产)；和蒸馏水。为了证实通过显色溶液造成的显色程度，将10μl 1mM FVH(Peptide Institute Inc.生产)和1mM FVL(Peptide Institute Inc.生产)分别加入孔中，之后添加50μl对照溶液。整个在37℃温育60分钟。然后，加入50μl调节pH的溶液和50μl显色溶液，整个在室温放置30分钟，之后按上述相似的方式实施测定。结果显示在表6中。结果证实，羧肽酶B是在pH 3.5下从血红蛋白β链N末端糖化五肽切割糖化肽而不实质性地从血红蛋白α链N末端糖化五肽切割糖化氨基酸和糖化肽的蛋白酶。 
<α溶液> 
50mM乙酸-乙酸钠(pH 3.5) 
0.1％Triton X-100 
0.2mM α糖化五肽(Peptide Institute Inc.生产) 
<β溶液> 
50mM乙酸-乙酸钠(pH 3.5) 
0.1％Triton X-100 
0.2mM β糖化五肽(Peptide Institute Inc.生产) 
<对照溶液> 
50mM乙酸-乙酸钠(pH 3.5) 
0.1％Triton X-100 
<调节pH的溶液> 
100mM CAPS-NaOH(pH 11.0) 
(CAPS：3-环己基氨基丙磺酸：Dojindo Laboratories生产) 
<显色溶液> 
100mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.09％4-氨基安替比林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产) 
0.06％TODB(Dojindo Laboratories生产) 
15U/ml过氧化物酶(Sigma-Aldrich Corp.生产) 
18.75U/ml FOD923 
(TODB：N，N-二(4-磺基丁基)-3-甲基苯胺) 
表6 
原始数据(pH 3.5) 
    α溶液   β溶液   对照溶液
  羧肽酶B(100U/ml)   0.063   0.147   0.060
  羧肽酶W(520U/ml)   0.211   0.184   0.032
  羧肽酶Y(1010U/ml)   0.195   0.206   0.034
  XXVII类蛋白酶(810U/ml)   0.025   0.021   0.019
  VIII类蛋白酶(1100U/ml)   0.019   0.018   0.016
  XXIV类蛋白酶(1070U/ml)   0.013   0.012   0.012
  蛋白酶K(520U/ml)   0.024   0.026   0.023
  中性蛋白酶(4000U/ml)   0.036   0.040   0.035
  蒸馏水   0.038   0.040   0.038
  1mM果糖基-Val-His   ---   ---   0.192
  1mM果糖基-Val-Leu   ---   ---   0.180
实施例3 
筛选用于血红蛋白A1c测定的来源于微生物的蛋白酶 
在Difco Lactobacilli MRS液体培养基(Becton，Dickinson andCompany生产)、MM培养基(2.5％甘露糖、2.5％啤酒酵母提取物、pH 7.0)和YPG培养基(2％葡萄糖、1％聚胨、2％酵母提取物、0.1％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁七水合物、pH 7.0)中在28至30℃温度下振荡培养各种细菌1至7天。然后，离心从培养液中除去细胞以获得培养物上清液。通过用10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)稀释所获的培养物上清液10倍，制备样品，并以和实施例1所述相似的方式进行测定。表7显示从MRS液体培养基中培养的细菌获得的结果，表8显示从MM培养基中培养的细菌获得的结果，表9显示从YPG培养基培养的细菌获得的结果(注意，表9中未确定参考波长)。 
表7 
原始数据(pH 7.5) 
    α溶液   β溶液   对照溶液
 芽孢杆菌属种(FERM BP-08641)   0.063   0.229   0.058
 蒸馏水   0.040   0.033   0.049
 1mM果糖基-Val-His   ---   ---   0.218
 1mM果糖基-Val-Leu   ---   ---   0.238
表8 
原始数据(pH 7.5) 
    α溶液   β溶液   对照溶液
  枯草芽孢杆菌NBRC3037   0.062   0.198   0.066
  蒸馏水   0.018   0.021   0.015
  1mM果糖基-Val-His   ---   ---   0.172
  1mM果糖基-Val-Leu   ---   ---   0.181
表9 
原始数据(pH 7.5) 
    α溶液   β溶液   对照溶液
  产酶溶杆菌YK-366  (FERM BP-10010)   0.170   0.696   0.168
  嗜水气单胞菌NBRC3820   0.156   0.510   0.152
实施例4 
纯化来源于芽孢杆菌属种ASP842(FERM BP-08641)的蛋白酶的方法及该蛋白酶的物理化学性质 
在4个加有150ml Difco Lactobacilli MRS液体培养基的500ml锥形瓶中28℃振荡培养芽孢杆菌属种ASP842(FERM BP-08641)3天。然后，离心从培养液中除去细胞以获得培养物上清液(77mU/ml，560ml)。向培养上清液添加210g硫酸铵和8.4g珍珠岩(Toko PerliteIndustry Co.，Ltd.生产)，整个进行搅拌。然后，用90mm直径的5A号滤纸(Toyo-Roshi Kaisha，Ltd.生产)过滤，收集沉淀的蛋白酶。随后，将沉淀物悬浮在10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中，随后使用5A滤纸(Toyo-Roshi Kaisha，Ltd.生产)过滤，由此获得具有蛋白酶活性的滤液(215mU/ml，90ml)。滤液使用5L 10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)透析。 
在10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)平衡的柱 
Figure G04819882020060206D000471
中用DEAE-Sepharose FF(Amercham生产)吸附透析后的蛋白酶溶液，通过用0M至0.5M NaCl梯度洗脱获得具有蛋白酶活性的级分(217mU/ml，54ml)。将硫酸铵加入该级分中至1M浓度后，在用1M硫酸铵和10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)平衡的柱子 中用Phenyl-Sepharose CL-4B(Amersham生产)吸附所述级分。然后，用1M硫酸铵、0％乙二醇至0M硫酸铵、20％乙二醇的梯度洗脱具有蛋白酶活性的级分(237mU/ml，18ml)，用Amicon Ultra 10000MWCO(Millipore生产)浓缩，由此获得纯化的蛋白酶(13.9U/ml，0.42ml)。如下描述用于本发明蛋白酶活性测定的试剂和方法。 
<测定试剂> 
50mM Tris-HCl(pH 7.5) 
2mM氯化钙 
0.1％Triton X-100 
0.03％4-氨基安替比林 
0.02％TOOS 
5U/ml过氧化物酶 
5U/ml FOD923 
0.25mM底物 
<测定方法> 
将0.2ml测定试剂放入试管，37℃预热5分钟。然后，向其中加入0.02ml酶溶液，进行10分钟反应。反应后，加入0.5ml 0.5％SDS以终止反应。然后，测定555nm波长的吸光度(Aa)。此外，代替酶溶液加入蒸馏水作为空白对照，通过实施相似操作以确定吸光度(Ab)。从吸光度(Aa)和空白的吸光度(Ab)的差(Aa-Ab)，获得酶活性。一个单位酶活性定义为37℃下每分钟允许产生1μmol过氧化氢的酶量。注意，β糖化五肽被用作底物。 
<物理化学性质> 
(1)底物特异性 
除了将FOD923的浓度更改为50U/ml以及使用0.25mM β糖化五肽、0.25mM α糖化五肽、0.03mM FVH、0.03mM FVL和0.03mMFV作为底物外，根据实施例4中的<测定方法>实施测定。此外，将FOD923改为FOD2，进行相似测定。而且，使用中性蛋白酶(ToyoboCo.，Ltd.生产)进行相似测定以用于比较。表10显示所获的吸光度差(Aa-Ab)。结果证实，本发明蛋白酶以和中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产)的切割方式相同的方式，从β糖化五肽切割FVH而不从α糖化 五肽切割糖化氨基酸和糖化肽。 
表10 
Figure G04819882020060206D000491
(2)最适pH 
图2显示，根据实施例4所述的测定方法，但是分别使用50mMTris-HCl(pH 8.0，8.5)、50mM PIPES(pH 6.0，6.5，7.0)和50mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH 5.5，6.0，6.5)代替50mM Tris-HCl(pH 7.5)并将0.25mM底物更换为0.1mM β糖化五肽进行测定所得到的结果。这些结果证实大约6.0的pH是最适的。 
(3)pH稳定性 
用50mM Tris-HCl(pH 7.5，8.0，8.5)和50mM PIPES(pH 6.0，6.5，7.0)在50℃处理酶20分钟，测定其残余活性。图3显示了结果。 
(4)最适温度 
将20μl蛋白酶溶液加入100μl反应溶液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，2mM氯化钙，0.1％Triton X-100，2.5mM β五肽)。在30、37、42、50、55、60和65℃进行反应(每个温度各进行10分钟)，之后通过加入5μl 0.5M EDTA终止反应。然后，向其中添加95μl显色溶液(0.03％4-氨基安替比林，0.02％TOOS，50U/ml过氧化物酶，10.5U/ml FOD923)，37℃反应5分钟。随后，向其中添加95μl 0.5％SDS，测定555nm吸光度，由此确定最适温度。图4显示了结果。 
(5)热稳定性 
将蛋白酶放入50mM Tris-HCl(pH 7.5)中，在4，37，50，60和70℃处理(每个温度处理10分钟)，之后测定残余活性。图5显示了结果。 
(6)分子量 
35kDa(SDS-PAGE) 
32,721Da(MALDI-TOF MASS分析) 
实施例5 
嗜水气单胞菌NBRC 3820株来源的蛋白酶的培养方法和纯化方法及其酶学性质 
<培养方法> 
将各100ml的YPG培养基(2.0％葡萄糖，1.0％聚胨，2.0％酵母提取物，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH 7.0)放入10个500mlSakaguchi瓶并灭菌，之后接种嗜水气单胞菌NBRC 3820。整个在30℃振荡培养2天。 
<纯化方法> 
离心所得培养溶液。向所得培养上清液添加硫酸铵至40％饱和度，将离心的上清液加至用添加了40％饱和硫酸铵的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)平衡的Butyl Toyopearl 650M柱( TosohCorp.生产)。用含有加至10％饱和度的硫酸铵的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)实施洗涤，用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)实施洗脱。将洗脱的活性级分在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)中透析，之后活性级分加至用相同缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱( Amersham生产)，用0至0.5M梯度的NaCl进行洗脱。 向洗脱的活性级分添加硫酸铵至40％饱和度。整个加至用添加40％饱和度硫酸铵的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)平衡的Butyl-Toyopearl650M( 
Figure G04819882020060206D000511
Tosoh Corp.生产)柱，用具有40％至0％线性梯度的饱和硫酸铵进行洗脱。收集活性级分，用蒸馏水透析，由此获得纯化的蛋白酶。表11显示纯化过程。 
本发明酶的活性按如下方式测定。将其中溶解了β糖化五肽至0.5mM的0.45ml 100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)放入具有1cm光程长度的小池中。整个在37℃预热5分钟，之后加入0.05ml酶溶液，进行10分钟反应。反应后，向其中加入0.5ml测定试剂(含有0.04％TOOS、0.06％4-氨基安替比林、10U过氧化物酶和10U来源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5))。显色2分钟后，加入2ml 0.5％SDS终止反应，然后测定550nm波长的吸光度(Aa)。此外，通过使用不含底物的各种缓冲液作为空开对照，进行相似操作以测定吸光度(Ab)。从吸光度(Aa)和空白对照的吸光度(Ab)的差(Aa-Ab)，获得酶活性。 
表11 
纯化来源于嗜水气单胞菌NBRC3820的蛋白酶 
  纯化步骤   总蛋白  (A280)   总活性  (U)   比活性  (U/A280)   回收率  (％)
  40-80％硫酸铵沉淀   32,500   455   0.01   100.0
  Butyl-Toyopearl  650M   31.5   302   9.60   66.5
  DEAE-Sepharose FF   13.4   132   9.82   29.0
  Butyl-Toyopearl  650M   11.4   112   9.85   24.7
<物理化学性质> 
(1)作用 
表12显示本发明来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶对α糖化五肽和β糖化五肽的作用。在该反应中各底物的浓度设定为0.25mM。向其中加入来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶(1.0U)，在30℃反应5至60分钟。然后，将反应溶液加入蛋白质测序仪(Shimadzu Corp.生产)，确定通过蛋白酶作用产生的肽的N末端氨基酸序列。 
结果，来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶不作用于α糖化五肽，但其切割β糖化五肽中组氨酸和亮氨酸之间的肽键，产生FVH和亮氨酰-苏氨酰-脯氨酸(LTP)。 
(2)最适pH 
将pH 3.0至11.0的0.45ml不同缓冲液(pH 3-5的100mM乙酸盐缓冲液、pH 5-7的100mM柠檬酸盐缓冲液、pH 7-9的100mM Tris-HCl缓冲液、和pH 9-11的100mM硼酸盐缓冲液)加入具有1cm光程长度的小池中，其中在所述缓冲液中各溶解了β糖化五肽至0.5mM。整个在37℃预热5分钟，之后添加0.05ml酶溶液并进行10分钟反应。反应后，向其中添加0.5ml测定试剂(含有0.04％TOOS、0.06％4-氨基安替比林、10U过氧化物酶和10U来源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5))。显色2分钟后，加入2ml 0.5％SDS以终止反应，然后测定550nm波长的吸光度(Aa)。此外，通过使用不含底物的各种缓冲溶液作为空白对照进行相似操作，测定吸光度(Ab)。从吸光度(Aa)和空白对照的吸光度(Ab)之差(Aa-Ab)，获得酶活性。图6显示了结果。 
(3)pH稳定性 
用10mM各种缓冲液在4℃处理酶溶液24小时，根据<纯化方法>中描述的活性测定方法测定残余活性。图7显示结果。 
(4)最适温度 
将0.45ml溶解了β糖化五肽至0.5mM的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)放入光程长度1cm的小池。整个在15至70℃预热5分钟，之后加入0.05ml酶溶液，反应10分钟。反应后，整个在冰上冷却。然后，添加0.5ml测定试剂(含有0.04％TOOS、0.06％4-氨基安替比林、10U过氧化物酶和10U来源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5))。显色2分钟后，加入2ml0.5％SDS以终止反应，然后测定550nm波长的吸光度(Aa)。此外，通过使用不含FVH的各种缓冲溶液作为空白对照进行相似操作，测定吸光度(Ab)。从吸光度(Aa)和空白对照的吸光度(Ab)之差(Aa-Ab)，获得酶活性。图8显示了通过将温度从15℃改变至70℃而获得的最适温度结果。 
(5)<热稳定性> 
针对各温度，用100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)处理酶溶液30分钟，根据上述用于酶的活性测定方法测定残余活性。图9显示结果。 
(6)分子量 
使用YMC-Pack Diol-200G( YMC生产)，通过凝胶过滤获得本发明酶的分子量。使用牛血清白蛋白、卵清蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂(所有均由Sigma Corp.生产)作为标准蛋白质。结果，分子量为大约33,000。 
使用Laemmli氏方法的10％凝胶进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)导致大约33,000的分子量。注意，SDS-PAGEStandard Low(Bio-Rad生产)用作标准蛋白质。 
以上结果揭示，本发明来源于嗜水气单胞菌NBRC3820的蛋白酶是单体。 
(7)N末端部分的氨基酸序列 
根据以上方法，在蒸馏水中溶解从嗜水气单胞菌NBRC 3820培 养溶液获得的纯化酶，并使用N末端测序仪(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生产)进行分析。SEQ ID NO：12显示了所获序列。对所获的N末端部分氨基酸序列与已知蛋白酶进行同源性检索，发现所获的N末端部分氨基酸序列与来源于嗜水气单胞菌的弹性蛋白酶具有98％同源性。 
Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr PheTyr Gly(SEQ ID NO：12) 
(8)部分氨基酸序列 
使用根据以上方法从嗜水气单胞菌NBRC3820培养溶液获得的纯化酶的60g冻干产物，根据“Method of purifying minor proteins formcirosequence，p48-52，1992，Yodosha Co.，Ltd.”，获得酶片段以确定其序列。具体地，添加50μl的45mM二硫苏糖醇，整个在50℃处理15分钟，之后加入5μl的100mM碘乙酰胺，放置15分钟。随后，加入140μl蒸馏水和1.0μg内切蛋白酶Lys-C(Roche Diagnostics生产)，整个在37℃孵育过夜。通过HPLC分离片段化后的酶，由此获得各酶片段。各片段使用N末端测序仪(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生产)进行分析。以下的SEQ ID NO：13和14显示了所获序列。所获的两个部分氨基酸序列分别与来源于嗜水气单胞菌的弹性蛋白酶的氨基酸序列完全匹配。 
Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His(SEQ ID NO：13) 
Phe Gly Asp Gly Ala Thr(SEQ ID NO：14) 
表12显示来源于嗜水气单胞菌NBRC 3820的蛋白酶的上述性质。 
表12 
Figure G04819882020060206D000551
实施例6 
用于来源于产酶溶杆菌YK-366株(FERM BP-10010)的蛋白酶的培养方法和纯化方法及该蛋白酶的酶学性质 
<纯化方法> 
通过与实施例5所述制备方法和纯化方法相同的方法收集活性级分，并在蒸馏水中透析，由此获得纯化的蛋白酶。表13显示纯化过程。 
活性测定方法按照与实施例5中方法相同的方式实施。 
表13 
来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的纯化 
  纯化步骤   总蛋白  (A280)   总活性  (U)   比活性  (U/A280)   回收率  (％)
  40-80％硫酸  铵沉淀   39,500   524   0.01   100.0
  Butyl-Toyopearl 650M   36.8   261   7.09   49.8
  DEAE-sepharose FF   5.6   49   8.75   9.4
  Butyl-Toyopearl 650M   5.1   41   8.04   7.8
<物理化学性质> 
(1)作用 
表14显示本发明来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶对α糖化五肽和β糖化五肽的作用。按照实施例5之(1)中所述方法，研究来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶对α糖化五肽和β糖化五肽的作用。结果，来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶不作用于α糖化五肽，但其切割β糖化五肽中组氨酸和亮氨酸之间的肽键，产生FVH和LTP。 
(2)最适pH 
按照实施例5之(2)中所述方法研究来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的最适pH，所获结果显示在图10中。 
(3)pH稳定性 
按照实施例5之(3)中所述方法研究来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的pH稳定性，所获结果显示在图11中。 
(4)最适温度 
按照实施例5之(4)中所述方法研究来源于产酶溶杆菌YK-366的 蛋白酶的最适温度，所获结果显示在图12中。 
(5)热稳定性 
按照实施例5之(5)中所述方法研究来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶的热稳定性，所获结果显示在图13中。 
(6)分子量 
根据实施例5之(6)中所述方法通过凝胶过滤和SDS-PAGE获得分子量，结果所得分子量均为大约35,000。 
以上结果揭示，本发明来源于产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶是单体。 
(7)N末端部分的氨基酸序列 
根据以上方法，在蒸馏水中溶解从产酶溶杆菌YK-366培养溶液获得的纯化酶，并使用N末端测序仪(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生产)进行分析。SEQ ID NO：15显示了所获序列。 
Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys Thr Gly Gln TyrGlu Tyr Gly Thr(SEQ ID NO：15) 
(8)部分氨基酸序列 
使用根据以上方法从产酶溶杆菌YK-366培养溶液获得的纯化酶的60g冻干产物，根据常规方法(“Method of purifying minor proteinsfor mcirosequence，p48-52，1992，Yodosha Co.，Ltd.”)，获得酶片段以确定其序列。具体地，添加50μl的45mM二硫苏糖醇，整个在50℃处理15分钟，之后加入5μl的100mM碘乙酰胺，放置15分钟。随后，加入140μl蒸馏水和1.0μg内切蛋白酶Lys-C(Roche Diagnostics生产)，整个在37℃孵育过夜。通过HPLC分离片段化后的酶，由此获得各酶片段。各片段使用N末端测序仪(PPSQ-21，Shimadzu Corp.生产)进行分析。以下的SEQ ID NO：16和17显示了所获序列。 
Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala(SEQ ID NO：16) 
Phe Gly Asp Gly Ala Thr(SEQ ID NO：17) 
表14显示来源于产酶溶杆菌NBRC 3820的蛋白酶的上述性质。 
表14 
实施例7 
通过基因修饰获得对FZK具有降低活性的突变酮胺氧化酶 
<构建来源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶的突变文库> 
从利用DNA聚合酶的错读的易错PCR，构建FOD923的突变文库。易错PCR使用上述参考实施例中描述的pPOSFOD923作为模板，利用P51引物和P52引物(见如下SEQ ID NO：18和19)和Ready-To-Go PCR珠(Amersham生产)进行，因此添加氯化镁至2.5mM的终浓度。在如下循环条件下进行PCR：94℃×40秒、55℃×30秒、72℃×1分钟；和25个循环。 
P51ACACCATGGCGCCCTCAAGAGCAAACACT(SEQ ID NO：18) 
P52TTCGAGCTCTATAACTTGGACTTGACAACATCGTC(SEQID NO：19) 
使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham生产)，纯化扩增的PCR产物。 
用限制性酶NcoI和SacI消化0.2μg纯化的PCR产物，并通过乙醇沉淀收集。此外，也利用相同的限制性酶消化0.5μgpPOSFOD923，通过琼脂糖凝胶电泳分离不含酮胺氧化酶基因的2.9kbp DNA片段，使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒收集。上述两个DNA片段使用Ligation High试剂盒(Toyobo Co.，Ltd.生产)在16℃进行30分钟反应，以彼此连接。利用连接的DNA片段转化大肠杆菌JM109感受态细胞。将转化体涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃静置培养直至菌落生长至大约1-2mm。 
<筛选对FZK具有降低活性的突变酮胺氧化酶> 
将100μl预灭菌的表达培养基(含有3％山梨糖醇、1.5％聚胨、1.5％酵母提取物和50μg/ml氨苄青霉素及调节至pH 7.0的培养基)加至96孔微量培养板。其中接种生长的转化体，并在30℃培养过夜。培养结束后，在96孔板的两个孔中各分配5μl培养溶液，向每个孔各添加50μl测定试剂(50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，含有1mMFVH或FZK、0.02％TOOS、0.02％4-氨基安替比林和10U/ml过氧化物酶)，30℃反应10至60分钟。加入150μl 0.5％SDS终止反应， 使用Microreader(450型，Bio-Rad生产)测定550nm吸光度。从构建的突变文库，选择产生作用于FVH但对FZK具有降低活性的酮胺氧化酶的重组体。筛选结果是，获得了有利的突变株923-F1和923-F2。测序这些突变株含有的酮胺氧化酶，得到在表15中所示的碱基中引入了突变。 
表15 
    基因突变   相应氨基酸  突变   所用的限制  性酶   FZK/FVH
  FOD923   -   -   -   1.1
  923-F1   185g→a   62R→H   -   0.24
  923-F2   172a→g  185g→a  988t→c   58I→V  62R→H  330F→L    -    0.025
  923-I58V   172a→g   58I→V   XbaI   0.12
  923-F330L   988t→c   330F→L   NcoI  Bst1107I   0.95
  923-Fro2   172a→g  185g→a   58I→V  62R→H→   NcoI  Bst1107I   0.025
注意：所述碱基编号从位置471开始计算，位置471在SEQ ID NO：1的碱基序列中被认为是除了内含子位点外的第一个位置。 
<证实突变酮胺氧化酶的底物特异性> 
将来自所选菌株的菌落接种至5ml LB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素)，30℃振荡培养20小时。培养结束后通过离心从培养液收集细胞，悬浮在5ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，通过超声破碎进行溶解。离心溶解的溶液(8,000rpm，10分钟)，使用得到的上清液作为酮胺氧化酶的粗酶溶液。利用此粗酶溶液以及使用FVH和FZK作为底物，根据<筛选对FZK具有降低活性的突变酮胺氧化酶>中所述的活性测定方法，获得特异性(对FZK的活性相对于对FVH的活性而 言的比活性；此后表示为FZK/FVH)。结果是，923-F1和923-F2的FZK/FVH比分别是0.24和0.025(见表15)，这说明突变酶对FZK的活性大幅度降低。 
<鉴定有效的突变位置> 
为了鉴定对上述底物特异性的提高产生影响的有效突变位置，通过如下方法产生引入了表15中所示点突变的突变酮胺氧化酶。 
1)从利用质粒转化的大肠杆菌获得突变酶923-F330L和923-Fro2，其中所述质粒通过如下方式获得：基于图14所示的质粒pPOSFOD923的限制性酶图谱，用表15所示限制性酶处理野生型酶或突变型酶923-F2的基因；切下含有目的突变位置的片段；和将该片段插入用相同限制性酶处理的其它质粒。 
(2)从使用质粒转化的大肠杆菌获得突变酶923-I58V，其中所述质粒通过如下方式获得：用突变引物P53和P54(SEQ ID NO：20和21显示)进行PCR以扩增含有目的突变的区域；用表15中所示限制性酶处理获得的片段；并将片段插入相同限制性酶切割的pPOSFOD923中。表15显示通过<筛选对FZK具有降低活性的突变酮胺氧化酶>中所述测定方法评估这些突变酶的结果。结果说明，缬氨酸替代58位的亮氨酸(I58)或组氨酸替代62位的精氨酸(R62)可以有效地降低酶对FZK的活性。 
P53 
CGACTCTAGAGGAATAACACCATGGCGCCCTC 
(SEQ ID NO：20，包括位于pPOS2的多克隆位点下游的XbaI位点) 
P54 
GCTTCTAGACTCAATTGGAGATCGACCTTGTTCCGCAAGCGGATACCCATGACCTTAT 
(SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：1的637至694的序列的互补序列，其含有导致在FOD923中V替代氨基酸58I的突变) 
<测试有效突变氨基酸残基的点突变> 
高度有效的58位氨基酸亮氨酸(I58)由另一氨基酸替代以寻找有效的点突变型酮胺氧化酶。使用P53(SEQ ID NO：20)和具有(表15-2)所示序列的引物(P55-64)，通过<鉴定有效突变位置>之2)中所述方法，制备突变株。通过<筛选对FZK具有降低活性的突变酮胺氧化酶>中所述方法测定突变酶对FZK的活性和对FVK的活性，所得结果显示在(表15-2)中。 
结果揭示，对于降低对FZK的活性，除了使用缬氨酸外，使用苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、丝氨酸和丙氨酸替代58位氨基酸亮氨酸(I58)也是有效的。 
Figure G04819882020060206D000631
<制备突变酮胺氧化酶> 
通过参考实施例所述相同方法纯化突变酮胺氧化酶并制备之。 
本发明突变果糖基胺氧化酶对各种底物的特异性显示在表16中。注意，各底物的浓度设定为1mM，而其它反应条件根据<筛选对FZK具有降低活性的突变酮胺氧化酶>中所述活性测定方法设定。结果显示，923-F2(之后也称作FOD923M)对FV具有最高反应性，并对FVH也具有高反应性，而其对FZK和FVL分别具有2.5％和0.5％反应性，由此相对于对FVH的反应性而言，几乎不具有反应性，这说明本发明酶是基本不对FZK和FVL产生作用的酶。 
表16 
  底物   FOD923   923-F1   923-F2
  FVH   100   100   100
  FZK   95   24   2.5
  FV   630   680   220
  FVL   2.6   -   0.5
<来源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶的突变体> 
来源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶(FOD474)与含有FOD923的酮胺氧化酶有高同源性，而且，如图1所示，其氨基酸序列在含有FOD923的I58的N末端区高度保守。使用pPOSFOD474，获得了FOD474的I58由不同氨基酸(苏氨酸)替代的FOD474突变株474-F1。表17显示FOD474和474-F1对各种底物的特异性。由于在FOD474中对FVH的底物特异性也得以提高，这说明，即使对于来源于其它微生物物种的酮胺氧化酶，58位氨基酸区域也是强烈地影响对FVH的特异性的位点。 
表17 
  底物   FOD474   474-F1
  FVH   100   100
  FZK   40   20
  FV   540   380
实施例8 
酮胺氧化酶FOD923、FOD474和FOD923M对FVH和FZK的活性的pH依赖性 
将20μl酶溶液加入200μl反应溶液(50mM缓冲液、0.1％TritonX-100、0.03％4-氨基安替比林、0.02％TOOS、5U/ml过氧化物酶、2mM底物)。整个在37℃温育5分钟，然后向其中加入500μl0.5％SDS，之后测定555nm吸光度。使用Tris-HCl(pH 7.5，8.0，8.5)、PIPES(pH 6.0，6.5，7.0)和Bistris-HCl(pH 5.0，5.5，6.0，6.5)作为缓冲液用于测定。此外，也使用不含底物的反应溶液测定吸光度。表18显示了分别使用FVH和FZK作为底物时的吸光度差和所用酶溶液中的酶浓度。表19显示将FVH和FZK分别用作底物时由(FZK/FVH)表示的比活性(％)。结果证实，当pH为大约6时，对FVH的特异性显著增加。 
实施例9 
酮胺氧化酶FOD923M的底物特异性 
使用<参考实施例：来源于Curvularia clavata YH923(FERMBP-10009)的酮胺氧化酶、来源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶和来源于尖孢镰孢的酮胺氧化酶(Asahi Kasei Pharma生产)的底物特异性>中所述相同的方法进行测定。表3显示结果。 
Figure G04819882020060206D000661
实施例10 
<测定血红蛋白A1c> 
为了产生校准曲线，在具有1cm光程长度的小池中，将324μl R1(-蛋白酶)和90μl R2加入36μl其中添加了FVH的血红蛋白Ac1标准溶液。整个在37℃温育200秒后，加入10μl R3并整个在37℃温育100秒。随后，向其中加入10μl R4，整个在37℃温育100秒。在该过程中，测定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1s)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2s)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3s)。类似地，使用未添加FVH的血红蛋白A1c标准溶液进行相同操作，也测定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1sb)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2sb)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3sb)。从吸光度差ΔAs＝(A3s-A2s)-(A3sb-A2sb)和FVH浓度的关系，构建了图15所示的校准曲线。 
接着，向各36μl低或高水平的血红蛋白A1c标准溶液加入324μlR1(+蛋白酶)。37℃温育60分钟后加入90μl R2。整个在具有1cm光程长度的小池中37℃温育200秒，之后加入10μl的R3并37℃温育100秒。随后，向其中加入10μl的R4，整个在37℃温育100秒。在该过程中，测定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3)。此外，除了用R1(-蛋白酶)替代R1(+蛋白酶)外，使用相同样品进行上述相同操作，并测定R2添加后180秒的730nm吸光度(A1b)、R3添加后90秒的730nm吸光度(A2b)和R4添加后90秒的730nm吸光度(A3b)。从吸光度差ΔA＝(A3-A2)-(A3b-A2b)和FVH浓度的关系，可以获得在各低或高水平血红蛋白A1c标准溶液中血红蛋白的糖化β链N末端的量。如表20所示，理论值和测定值十分相符。注意，吸光度差ΔAε＝(A2-A1)-(A2b-A1b)被认为与糖化血红蛋白中赖氨酸残基的糖化ε-氨基基团的量成比例。 
<R1(+蛋白酶)> 
20mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.1％Triton X-100 
150mM氯化钠 
2mM氯化钙 
2.1kU/ml来源于芽孢杆菌属种的中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产) 
<R1(-蛋白酶)> 
20mM Tris-HCl(pH 7.5) 
0.1％Triton X-100 
150mM氯化钠 
2mM氯化钙 
<R2> 
20mM Tris-HCl(pH 7.5) 
6.35mM WST3(Dojindo Laboratories生产) 
0.08mM DA-64(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产) 
25U/ml过氧化物酶(Sigma-Aldrich Corp.生产) 
(WST-3：2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑) 
(DA-64：N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)-二苯基胺) 
<R3> 
500U/ml FOD2 
<R4> 
500U/ml FOD923 
<低水平血红蛋白A1c标准溶液> 
为了进行制备，将可获得的具有低值(表示为血红蛋白A1c值(JDS值)：5.6％)的用于血红蛋白测定的校准剂冻干产品(用于HbA1c的测定对照：Kyowa Medex Co.，Ltd.生产)溶解在蒸馏水中至4mg/ml。 
使用“Rinsho Kensa，46(6)729-734，2002”描述的公式(JDS值)＝0.9259(IFCC值)+1.6697进行换算，该血红蛋白A1c值(IFCC值)经换算为4.2％。因此，当血红蛋白是由两条α链和两条β链组成的四 聚体并具有64,550分子量时，在该标准溶液中糖化β链N末端浓度的理论值将是0.0052mM。 
<高水平血红蛋白A1c标准溶液> 
为了进行制备，将可获得的具有高值(表示为血红蛋白A1c值(JDS值)：10.2％)的用于血红蛋白测定的校准剂冻干产品(用于HbA1c的测定对照：Kyowa Medex Co.，Ltd.生产)溶解在蒸馏水中至4mg/ml。 
使用“Rinsho Kensa，46(6)729-734，2002”描述的公式(JDS值)＝0.9259(IFCC值)+1.6697进行换算，该血红蛋白A1c值(IFCC值)经换算为9.2％。因此，当血红蛋白是由两条α链和两条β链组成的四聚体并具有64,550分子量时，在该标准溶液中糖化β链N末端浓度的理论值将是0.0114mM。 
<添加了FVH的血红蛋白A1c标准溶液> 
为了进行制备，向上述低水平血红蛋白A1c标准溶液中加入FVH(Peptide Institute Inc.生产)至0.030mM和0.015mM。 
<不添加FVH的血红蛋白A1c标准溶液> 
使用以上低水平的血红蛋白A1c标准溶液。 
实施例11 
<蛋白酶反应时间和血红蛋白A1c测定值之间的关系> 
在实施例10所用低和高血红蛋白A1c标准溶液中使蛋白酶的反应时间从30分钟到360分钟变化。图16显示获得的血红蛋白A1c的测定值。这说明，实施例10中理论值和测定值的相符并非是由于将蛋白酶反应时间限定为60分钟而偶然获得的。这也说明，当蛋白酶反应时间从30分钟至360分钟变化时，测定值随时间几乎是稳定的，因此利用本发明的测定方法可以测定糖化血红蛋白中糖化β链N末端的实际量。 
实施例12 
1)在芽孢杆菌属种来源的中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.)降解糖化血红 蛋白的反应中评价pH的影响 
1-a)蛋白酶反应后利用FOD2消化糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽并随后使用FOD923测定FVH的量的情况 
将30.4μl 20mM WST3和36μl糖化血红蛋白样品加入324μl R1反应溶液(20mM缓冲液、表面活性剂、氯化钠、2mM氯化钙、1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产))。60秒后，向其中加入44.6μlR2反应溶液(100mM缓冲液、50U/ml过氧化物酶、0.16mM DA-64)，再300秒后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH调节溶液。再50秒后，向其中加入10μl 1,500U/ml FOD2，再250秒后添加5μl 500U/mlFOD923，整个反应150秒。所有反应均在吸光计的小池中37℃进行。监测730nm吸光度，以获得加入FOD2后240秒的吸光度和加入FOD923后140秒的吸光度的差(A1)。图17显示了测定方案。 
在向R1反应溶液预先添加FVH至3.33μM的情况下进行相似操作，以获得吸光度差(A2)。此外，除了在添加糖化血红蛋白之前而非在添加R2反应溶液后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH调节溶液外，实施相同操作，由此获得空白反应的吸光度差(Ab)。 
蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的FVH可以利用这些吸光度差从公式“测定值(μM)＝(A1-Ab)/(A2-A1)×30”计算。注意，加入EDTA以终止或抑制蛋白酶反应。添加pH调节溶液以将酮胺氧化酶FOD2和FOD923反应时的pH调节为大约7.5。R1和R2反应溶液中使用的缓冲液、表面活性剂、氯化钠浓度和pH调节溶液的组合及其测定值显示在表21中。 
1-b)蛋白酶反应后不利用FOD2消化糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽而使用FOD923测定FVH的量的情况 
将30.4μl 20mM WST3加入324μl R1反应溶液(20mM缓冲液、表面活性剂、氯化钠、2mM氯化钙、1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产))，向其中加入36μl糖化血红蛋白样品。60秒后，向其中加入44.6μl R2反应溶液(100mM缓冲液、50U/ml过氧化物酶、0.16mM DA-64)，再300秒后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH调节溶液。再50秒后，向其中加入5μl 500U/ml FOD923，整个反应150秒。所有反应均在吸光计的小池中37℃进行。监测730nm吸光度，以获得加入0.5MEDTA和pH调节溶液后40秒的吸光度和加入FOD923后140秒的吸光度的差(A1)。图18显示了测定方案。 
在向R1反应溶液预先添加FVH至3.33μM的情况下进行相似操作，以获得吸光度差(A2)。此外，除了在添加糖化血红蛋白之前而非在添加R2反应溶液后加入5μl 0.5M EDTA和15μl pH调节溶液外，实施相同操作，由此获得空白反应的吸光度差(Ab)。蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的FVH可以利用这些吸光度差从公式“测定值(μM)＝(A1-Ab)/(A2-A1)×30”计算。注意，加入EDTA以终止或抑制蛋白酶反应。添加pH调节溶液以将酮胺氧化酶FOD2和FOD923反应时的pH调节为大约7.5。R1和R2反应溶液中使用的缓冲液、表面活性剂、氯化钠浓度和pH调节溶液的组合及其测定值显示在表21中。 
表20 
    ΔA   测定值  [mM]   理论值  [mM]
  低水平血红蛋 白A1c标准溶液   0.0172   0.0045   0.0052
  高水平血红蛋 白A1c标准溶液   0.0430   0.0107   0.0114
(2)在芽孢杆菌属种ASP842来源的蛋白酶降解糖化血红蛋白的反应中评价pH的影响 
2-a)蛋白酶反应后利用FOD2消化糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽并随后使用FOD923测定FVH的量的情况 
对于实施例12之1-a)中的R1反应溶液，向其中加入来源于芽孢杆菌属种ASP842的蛋白酶至0.85U/ml而非加入1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产))。使用表22中所示用于R1和R2反应溶液 中的缓冲液、表面活性剂、氯化钠浓度和pH调节溶液的组合，实施与1-a)相似的操作。表22也显示了测定结果。 
2-b)蛋白酶反应后不利用FOD2消化糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽而使用FOD923测定FVH的量的情况 
对于实施例12之1-b)中的R1反应溶液，向其中加入来源于芽孢杆菌属种ASP842的蛋白酶至0.85U/ml而非加入1.2kU/ml中性蛋白酶(Toyobo Co.，Ltd.生产)。使用表22中所示用于R1和R2反应溶液中的缓冲液、表面活性剂、氯化钠浓度和pH调节溶液的组合，实施与1-b)相似的操作。表22也显示了测定结果。 
(3)在产酶溶杆菌YK-366来源的蛋白酶降解糖化血红蛋白的反应中评价pH的影响 
将30.4μl 20mM WST3和36μl糖化血红蛋白样品及5μl蒸馏水加入R1反应溶液(20mM缓冲液、表面活性剂、氯化钠、2mM氯化钙、0.43U/ml产酶溶杆菌YK-366来源的蛋白酶)。60秒后，向其中加入44.6μl R2反应溶液(100mM缓冲液、50U/ml过氧化物酶、0.16mMDA-64)，再300秒后加入15μl pH调节溶液。50秒后，向其中加入5μl500U/ml FOD923，反应150秒。所有反应均在吸光计的小池中37℃进行。预先监测730nm吸光度，以获得加入pH调节溶液后40秒的吸光度和加入FOD923后140秒的吸光度的差(A1)。图19显示了测定方案。 
表21 
  pH  缓冲液   5.0  MES   5.5  Bistris   6.0  Bistris   6.5  Bistris   7.0  Tris   7.5  Tris
  表面活性剂   0.4％  Triton  X-100   0.3％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100   0.1％  Briji35   0.1％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100
  NaCl浓度   150mM   150mM   150mM   225mM   150mM   150mM
  pH调节溶  液   1M Tris  (pH 9.0)   1M Tris  (pH 9.0)   1M Tris  (pH 8.5)   1M Tris  (pH 8.5)   蒸馏水   蒸馏水
  1-a)测定值  [μM]   30.7   30.3   29.0   30.5   29.2   30.0
  1-b)测定值  [μM]   29.7   30.7   28.8   32.7   36.1   34.6
表22 
  pH  缓冲液   5.0  Bistris   5.5  Bistris   6.0  Bistris   7.0  Tris   7.5  Tris
  表面活性剂   0.4％  Triton  X-100   0.3％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100
  NaCl浓度   150mM   150mM   150mM   150mM   150mM
  pH调节溶  液   1M Tris  (pH 9.0)   1M Tris  (pH 9.0)   1M Tris  (pH 8.5)   蒸馏水   蒸馏水
  2-a)测定值  [μM]   29.5   28.2   29.2   29.3   31.4
  2-b)测定值  [μM]   29.2   31.6   27.7   35.3   34.2
表23 
  pH  缓冲液   5.5  Bistris   6.0  Bistris   6.5  Bistris   7.0  Tris   7.5  Tris
  表面活性剂   0.3％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100   0.1％  Triton  X-100   0.2％  Triton  X-100
  NaCl浓度   150mM   150mM   150mM   150mM   150mM
  pH调节溶  液   1M Tris  (pH 9.0)   1M Tris  (pH 8.5)   1M Tris  (pH 8.5)   蒸馏水   蒸馏水
 测定值[μM]   27.5   26.7   26.8   36.6   35.3
在向R1反应溶液预先添加FVH至3.33μM的情况下进行相似操作，以获得吸光度差(A2)。此外，使用95℃预先处理10分钟而失活的蛋白酶进行相似操作，以获得空白反应的吸光度差(Ab)。 
蛋白酶自糖化血红蛋白上切下的FVH可以利用这些吸光度差从公式“测定值(μM)＝(A1-Ab)/(A2-A1)×30”计算。 
使用表23中所示R1和R2反应溶液中使用的缓冲液、表面活性剂、氯化钠浓度和pH调节溶液的组合，进行与实施例12之1-b)相似的操作。其测定结果显示在表23中。 
使用就IFCC值而言5.9mg/ml为16.7％的糖化血红蛋白样品(糖化β链N末端的浓度的理论值为30.5μM)。表21至表23中所示结果说明：当蛋白酶反应中pH为5.0-6.0时，该蛋白酶不从糖化血红蛋白切下可以与FOD923反应的含有糖化赖氨酸的肽。因此，这些结果说明，不利用FOD2进行消化，已特异并精确地测定了FVH的量(糖化血红蛋白的糖化β链N末端的量)，即，精确测定了血红蛋白A1c的量。 
实施例13 
利用具有高特异性的突变酮胺氧化酶FOD923测定蛋白酶降解糖化血 红蛋白的降解产物中的FVH 
1-a)蛋白酶反应后利用FOD2消化糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽并随后使用FOD923M测定FVH的量的情况 
除了使用Tris-HCl(pH 7.5)作为R1反应溶液的缓冲液、使用0.1％Triton X-100作为表面活性剂和使用150mM的氯化钠浓度、及添加5μl 32U/ml FOD923M而非5μl 500U/ml FOD923外，实施与实施例12之1-a)相似的操作。根据测定，FVH的测定值为28.6μM。 
1-b)蛋白酶反应后不利用FOD2消化糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽而使用FOD923M测定FVH的量的情况 
除了使用Tris-HCl(pH 7.5)作为R1反应溶液的缓冲液、使用0.1％Triton X-100作为表面活性剂和使用150mM的氯化钠浓度、及添加5μl 32U/ml FOD923M而非5μl 500U/ml FOD923外，实施与实施例12之1-b)相似的操作。根据测定，FVH的测定值为30.0μM。 
从以上可以看出，使用高特异性的酮胺氧化酶可以在pH 7.5(即，蛋白酶从糖化血红蛋白切割糖化赖氨酸和含有糖化赖氨酸的肽的条件)下不经FOD2消化而特异地测定FVH的量(糖化血红蛋白的糖化β链N末端的量)，即，这允许精确测定血红蛋白A1c的量。 
工业实用性 
可以提供使用酶但不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法和包含测定试剂的试剂盒。 
[保藏的生物材料的信息] 
(1) 
i.保藏目的生物材料的保藏单位的名称和地址 
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(International Patent Organism Depository，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology) 
Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(邮政编码：305-8566) 
ii.向i的保藏单位提交生物材料保藏的日期 
2003年2月12日(原始保藏日) 
2004年4月12日(从原始保藏转为布达佩斯条约下的保藏的日期) 
iii.由i的保藏单位指定的保藏号 
FERM BP-10009 
(2) 
i.保藏目的生物材料的保藏单位的名称和地址 
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心 
Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(邮政编码：305-8566) 
ii.向i的保藏单位提交生物材料保藏的日期 
2004年2月24日(原始保藏日) 
iii.由i的保藏单位指定的保藏号 
FERM BP-08641 
(3) 
i.保藏目的生物材料的保藏单位的名称和地址 
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心 
Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(邮政编码：305-8566) 
ii.向i的保藏单位提交生物材料保藏的日期 
2004年1月30日(原始保藏日) 
2004年4月12日(从原始保藏转为布达佩斯条约下的保藏的日期) 
iii.由i的保藏单位指定的保藏号 
FERM BP-10010 
(4) 
i.保藏目的生物材料的保藏单位的名称和地址 
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心 
Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本(邮政编码：305-8566) 
ii.向i的保藏单位提交生物材料保藏的日期 
2004年2月24日(原始保藏日) 
iii.由i的保藏单位指定的保藏号 
FERM BP-08642 
序列表
<110>Asahi Kasei Pharma Corporation
ICHIBIKI Company Limited
<120>血红蛋白A1c测定方法和用于此目的的酶及其生产方法
<130>ASAHI-43
<140>PCT/JP2004/007341
<141>2004-05-21
<150>JP2003-143966
<151>2003-05-21
<150>JP2004-063100
<151>2004-03-05
<160>31
<210>1
<211>2212
<212>DNA
<213>Curvlar ia claveta
<220>
<221>CDS
<222>连接(471..752，808..1230，1280..1695，1751..1952)
<223>果糖基胺氧化酶
<400>1
ggtatcagat cagatacaag atagacccca gattttctgt tatcagcacg ctccgatatc  60
gacaaggcga aggtgcgttg agtgctccag tttaggagat acggacagcc cgtcttcgat 120
tgacgttgtg ctgacgtccg atgagctaac ttcgttggga tattataaca gtcaggatca 180
ccaagcgaga cccaggcgcc atcccatggc cgagcgtcgc ccccagtcag cggtacatgg 240
agcggaaggc ttcaattact caatcaaaac ttgttggagc tcgcaattga gcggggagta 300
tgcctcgcta tcgtatcatt gagctggtgg cgtgtgcaga cttcattgat acttaaccgg 360
cgggcgttga gcctgaccca ttgtggattg cttctgatca cggcttgcgc cttcgtccag 420
caaaacttca gccatccggg aatccgacca cacatcctcg tcatttcgac atg gcg    476
                                                       Met Ala
                                                       1
ccc tca aga gca aac act tct gtt atc gtt gtc ggt ggc ggt ggc act  524
Pro Ser Arg Ala Asn Thr Ser Val Ile Val Val Gly Gly Gly Gly Thr
          5                  10                  15
att ggc tct tca acc gct ctt cat cta gtc cgc tcg ggc tac aca cca  572
Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr Thr Pro
     20                  25                  30
tct aac atc acc gtt ctt gac aca tac cct atc cca tca gcg cag tca  620
Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln Ser
35                  40                  45                  50
gct gga aat gac ctg aat aag atc atg ggt atc cgc ttg cgg aac aag  668
Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg Asn Lys
                 55                  60                  65
gtc gat ctc caa ttg agt cta gaa gcc agg cag atg tgg aga gag gat  716
Val Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Arg Glu Asp
             70                  75                  80
gac cta ttc aaa gag tat ttc cac aac act gga aga gtatgtacag tcagca 768
Asp Leu Phe Lys Glu Tyr Phe His Asn Thr Gly Arg
         85                  90
gagtgactgt ttgaagattg gagctgacgg aagatgtag ctc gac tgt gca cat   822
                                           Leu Asp Cys Ala His
                                            95
ggg gaa gag gga ctt gca gat ttg aga cag gca tac cag gct ctg ctc  870
Gly Glu Glu Gly Leu Ala Asp Leu Arg Gln Ala Tyr Gln Ala Leu Leu
100                 105                 110                 115
gac gct aac gcg ggt ctc gaa gaa aca aca gaa tgg ctt gac tcc gaa  918
Asp Ala Asn Ala Gly Leu Glu Glu Thr Thr Glu Trp Leu Asp Ser Glu
                120                 125                 130
gac gaa att cta aag aaa atg ccg ctt ctg gac cgc gag caa atc aag  966
Asp Glu Ile Leu Lys Lys Met Pro Leu Leu Asp Arg Glu Gln Ile Lys
            135                 140                 145
ggc tgg aaa gcg gtt tac agc caa gac ggc ggc tgg ctg gct gca gca  1014
Gly Trp Lys Ala Val Tyr Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu Ala Ala Ala
        150                 155                 160
aaa gcc atc aat gct ata ggc gag tac ttg cga gac caa gga gtt aag  1062
Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Glu Tyr Leu Arg Asp Gln Gly Val Lys
    165                 170                 175
ttt ggt ttt ggt ggt gct gga tcg ttc aag cag cct ctt ttg gcc gag  1110
Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu Leu Ala Glu
180                 185                 190                 195
gga gtg tgc att ggc gta gag aca gtc gac ggg acg agg tac tac gcc  1158
Gly Val Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly Thr Arg Tyr Tyr Ala
                200                 205                 210
gat aaa gtt gtg ctt gca gct ggt gct tgg agt ccg gta ttg gtc gac  1206
Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Val Leu Val Asp
            215                 220                 225
ctg gaa gat caa tgc gtt tca aaa gtaggtcttt gtgacggtgc tgcttcatat 1260
Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys
        230                 235
gcaaatctaa ctttgttag gct tgg gta tat gct cac ata cag ctt acg cct 1312
                    Ala Trp Val Tyr Ala His I le Gln Leu Thr Pro
                                    240                 245
gag gaa gca gca gag tac aaa aac gtg cct gtg gta tac aac ggc gac  1360
Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Asn Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Asp
            250                 255                 260
gtc ggc ttc ttc ttc gag cct gac gag cac ggc gtt atc aag gtt tgt  1408
Val Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu His Gly Val Ile Lys Val Cys
        265                 270                 275
gac gaa ttt cca ggt ttt aca cgc ttc aag caa cat cag cca tat ggc  1456
Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys Gln His Gln Pro Tyr Gly
    280                 285                 290
gcc aaa gca ccg aaa cgt atc tcc gtg ccc aga tcg gca gcg aag cac  1504
Ala Lys Ala Pro Lys Arg Ile Ser Val Pro Arg Ser Ala Ala Lys His
295                 300                 305                 310
ccg acg gat act tac ccc gat gcg tcg gag aag agc atc cgc aag gcc  1552
Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala Ser Glu Lys Ser Ile Arg Lys Ala
                315                 320                 325
att gca act ttc ctg ccc aag ttc aca gag aag gag cta ttc aac cgg  1600
Ile Ala Thr Phe Leu Pro Lys Phe Thr Glu Lys Glu Leu Phe Asn Arg
            330                 335                 340
cat cta tgt tgg tgt acg gat acg gct gac gct gcg cta ttg atg tgt  1648
His Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys
        345                 350                 355
gag cat ccc gag tgg aag aac ttt gtg ctg gcg aca ggg gac agc gg gt 1697
Glu His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Val Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gl
    360                 365                 370
atgtatctca tcctttggtg ccagaacaac atgtactgac ctggtttgcc tag g cac 1754
                                                           y His
                                                             375
aca ttc aaa ctt ttg cca aat atc ggc aag cat gtg gtt gag ctt ctc  1802
Thr Phe Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu
            380                 385                 390
gag ggt aca ctc gcg gag gat ctg gca cat gca tgg aga tgg cgg cct  1850
Glu Gly Thr Leu Ala Glu Asp Leu Ala His Ala Trp Arg Trp Arg Pro
            395                 400                 405
ggt act ggc gat gcg ctg aaa tca aga aga gcg gca ccg gcg aag gat  1898
Gly Thr Gly Asp Ala Leu Lys Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp
        410                 415                 420
tta gca gat atg cct ggc tgg aag cat gac gat gtt gtc aag tcc aag  1946
Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys His Asp Asp Val Val Lys Ser Lys
    425                 430                 435
tta tag tgatggaaac tcgtcttgta gcgtgtctag gatagtaatc aaacgcgctc tc 2004
Leu Stop
440
tgtcttaagc aacggagatt tgttgtgcta gacgggaaga gtaaggagta accacaaaat 2064
aagcaacttg aattagtcgt gttgaccgga accatggtgc attttgtttc tgaacttagg 2124
atttcaccga agatggccat gatggcagag aaagggaagt cgcacagggc cagcttggtg 2184
cgactggtgc aggggaaaga atctgatc                                    2212
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P11引物
<400>2
aargcyatya acgcyatygg  20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P12引物
<400>3
acsacgtgct trccratgtt  20
<210>4
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P21引物
<400>4
cacacatcct cgtcatttcg ccatggcgcc ctcaagagca aac  43
<210>5
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P28引物
<400>5
cacgctacaa gacgagtttc gagctctata acttggactt gacaac  46
<210>6
<211>202
<212>DNA
<213>浅绿气球菌(Aerococcus viridans)
<220>
<223>丙酮酸氧化酶启动子的基因组DNA
<400>6
aaaagttctt gatttataag ggtttctgga cttcttactg tactagtaca atttcgcccc   60
ttgtaccatt tttctgatac agaaacaata ttgtactgaa aaaagggtat ttttggctaa  120
ttatggacct cacaaaggat atttgtggca attcattgga ataagctgtt ttaagtgcta  180
ttatttcaat tgtgatattt tt                                           202
<210>7
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P31引物
<400>7
ctagaggaat aacaccatgg ccgtcgacgc tagcatgcat ggatcccggg taccgagctc   60
g                                                                   61
<210>8
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P32引物
<400>8
aattcgagct cggtacccgg gatccatgca tgctagcgtc gacggccatg gtgttattcc   60
t                                                                   61
<210>9
<211>1323
<212>DNA
<213>Neocosmospora vasinfecta
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1323)
<223>果糖基胺氧化酶
<400>9
atg acc acc ccc cgc aaa gaa acc acc gtc ctc atc atc gga ggc ggc  48
Met Thr Thr Pro Arg Lys Glu Thr Thr Val Leu Ile Ile Gly Gly Gly
  1               5                  10                 15
ggc aca atc ggc tcc tcc acc gcc cta cac ctc ctc cgc gca ggc tac  96
Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr
             20                 25                  30
acc ccc tcc aac atc acc gtc ctc gac acc tac ccc atc ccg tca gct 144
Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala
          35                 40                 45
cag tcc gcc ggc aac gac cta aac aag atc atg ggc atc cgc ctg cgg 192
Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly lle Arg Leu Arg
     50                 55                 60
aac aaa gtc gac ctg cag ctc agc ctg gaa gcg cgg gac atg tgg cgc 240
Asn Lys Val Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Arg Asp Met Trp Arg
 65                  70                  75                  80
aac gac gcg ctg ttc cgg ccc ttt ttc cac aat acg ggc cgg ctg gac 288
Asn Asp Ala Leu Phe Arg Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Leu Asp
                 85                  90                  95
tgc gag agc agc gcg gag ggg gtg gag ggt ttg cgg agg gag tat cag 336
Cys Glu Ser Ser Ala Glu Gly Val Glu Gly Leu Arg Arg Glu Tyr Gln
            100                 105                 110
aag ctg gtt gag gcg ggt gtg ggg ttg gag gag acg cat gag tgg ctt 384
Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Gly Leu Glu Glu Thr His Glu Trp Leu
        115                 120                 125
gat agt gag gag gcg att ttg gag aag gca ccg ttg ttg cag agg gag 432
Asp Ser Glu Glu Ala lle Leu Glu Lys Ala Pro Leu Leu Gln Arg Glu
    130                 135                 140
gag atc gag ggg tgg aag gcg att tgg agt gag gag ggg ggt tgg ttg 480
Glu Ile Glu Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Glu Glu Gly Gly Trp Leu
145                 150                 155                 160
gct gct gct aag gcg att aac gcc atc ggg gag gag ttg cag cgg cag 528
Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Glu Glu Leu Gln Arg Gln
                165                 170                 175
ggg gtt agg ttt ggg ttt ggg ggt gct ggg tcc ttc aag cgg cct ttg 576
Gly Val Arg Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Arg Pro Leu
            180                 185                 190
ttt gct gat gat ggg aca act tgc atc ggt gtg gaa acg gtc gac ggg 624
Phe Ala Asp Asp Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly
        195                 200                 205
acc cag tac cat gcg gac aaa gtc gtc ctg gcc gct ggg gcg tgg agt 672
Thr Gln Tyr His Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser
     210                 215                 220
ccg gcc ctg gtc gac ctg gaa gag cag tgc tgc tcc aag gcg tgg gtg 720
Pro Ala Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val
225                 230                 235                 240
tac gca cac atg cag ctg acc ccg gag gaa gcg gcc gta tac aag ggc 768
Tyr Ala His Met Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Val Tyr Lys Gly
                245                 250                 255
tgt ccg gtt gtc tac cac ggc gat gtc ggc ttc ttc ttc gag ccg aac 816
Cys Pro Val Val Tyr Hi s Gly Asp Val Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn
            260                 265                 270
gag aac ggg gtg atc aaa gtc tgc gac gag ttc cct ggg ttc act cgg 864
Glu Asn Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg
        275                 280                 285
ttc aag cag cac cag ccg tac ggc gcg ccg gca ccg aag cct gtc tcg 912
Phe Lys Gln His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Pro Lys Pro Val Ser
    290                 295                 300
gtc ccg cgg tct cat gcc aaa cat ccc acc gac acg tac cca gac gcg 960
Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala
305                 310                 315                 320
tct gag gag agc atc aag cga gct gtt tcg acg ttc ctg ccg aga ttc 1008
Ser Glu Glu Ser Ile Lys Arg Ala Val Ser Thr Phe Leu Pro Arg Phe
                325                 330                 335
aag gac aag ccg ctg ttc aac cgg gcg ctg tgc tgg tgc acc gat aca 1056
Lys Asp Lys Pro Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr
            340                 345                 350
gcc gac tcg gcg ctg ctc atc tgt gag cat ccg aga tgg aag aac ttc 1104
Ala Asp Ser Ala Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Asn Phe
        355                 360                 365
atc ctg gcc acg ggc gac agc ggg cac agt ttt aag ctg ttg ccc att 1152
Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Ile
    370                 375                 380
att ggc aag cat gtt gtt gag ctg gtc gag ggc agg tta gct gat gat 1200
I le Gly Lys His Val Val Glu Leu Val Glu Gly Arg Leu Ala Asp Asp
385                 390                 395                 400
ttg gct gag gcg tgg agg tgg cgg ccc ggt cag ggg gat gcg cgc aag 1248
Leu Ala Glu Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gln Gly Asp Ala Arg Lys
                405                 410                 415
tcg atc cgt gct gcg ccg gca aag gat ctg gct gat atg ccc ggt tgg 1296
Ser Ile Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp
            420                 425                 430
aag cac gat cag gac agc gag tca aga                             1323
Lys His Asp Gln Asp Ser Glu Ser Arg
        435                 440
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P41引物
<400>10
ttttttcatg accacccccc gcaaagaaac caccgtcctc  40
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P42引物
<400>11
tttttgagct catcttgact cgctgtcctg atcgtgcttc  40
<210>12
<211>18
<212>PRT
<213>嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophia)
<400>12
Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly
1               5                   10                  15
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>嗜水气单胞菌
<400>13
Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His
1               5                   10
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>嗜水气单胞菌
<400>14
Phe Gly Asp Gly Ala Thr
1               5
<210>15
<211>20
<212>PRT
<213>产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)
<400>15
Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys Thr Gly Gln Tyr Glu Tyr Gly Thr
1               5                   10                  15                  20
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>产酶溶杆菌
<220>
<221>Unsure
<222>(3)..(3)
<223>Xaa表示任何氨基酸
<400>16
Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala
1               5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>产酶溶杆菌
<400>17
Phe Gly Asp Gly Ala Thr
1               5
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P51引物
<400>18
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<210>19
<211>35
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<220>
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<400>19
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<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>20
cgactctaga ggaataacac catggcgccc tc  32
<210>21
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<212>DNA
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<220>
<223>P54引物
<400>21
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat gaccttat  58
<210>22
<211>58
<212>DNA
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<220>
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<400>22
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<400>23
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<210>24
<211>58
<212>DNA
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<220>
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<400>24
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<220>
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<400>25
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<213>人工序列
<220>
<223>P60引物
<400>27
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat atacttat  58
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<220>
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<400>29
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<210>30
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>30
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<210>31
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>P64引物
<400>31
gcttctagac tcaattggag atcgaccttg ttccgcaagc ggatacccat ggccttat 58

Claims (17)

1.不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使用对糖化血红蛋白的β链N末端的糖化位点具有反应性而不实质性地从糖化血红蛋白的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的蛋白酶，从糖化血红蛋白的糖化β链N末端或其片段切割糖化氨基酸和/或糖化肽，
(i-1)而不实质性地从糖化血红蛋白的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽，其中所述措辞“不实质性地”表示：如果将从糖化血红蛋白的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反应性定义为100％时，对糖化血红蛋白的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反应性为10％或更低，
(i-2)而不实质性地切割与酮胺氧化酶反应的ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸和/或与酮胺氧化酶反应的包含ε-1-脱氧果糖基-L-赖氨酸的糖化肽；
所述蛋白酶选自以下1)至9)中的任一种：
1)羧肽酶B
2)羧肽酶W
3)可获自TOYOBO的中性蛋白酶
4)羧肽酶A
5)嗜热菌蛋白酶
6)源于登录号为FERM BP-08641的芽孢杆菌属种ASP-842的蛋白酶
7)源于登录号为FERM BP-10010产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶
8)源于嗜水气单胞菌NBRC3820的蛋白酶
9)源于枯草芽孢杆菌NBRC3037的蛋白酶
(ii)使用酮胺氧化酶测定源自糖化血红蛋白的糖化β链N末端的糖化氨基酸和/或糖化肽，与针对1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸的反应性相比，所述酮胺氧化酶对ε-1-脱氧果糖基-α-苄氧羰基-L-赖氨酸的反应性为30％或更低；
所述酮胺氧化酶选自
1)源于Curvularia clavata YH923的酮胺氧化酶
2)源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶。
2.根据权利要求1的方法，其中所述反应步骤(i)在反应条件pH5.0至6.0下进行。
3.根据权利要求1的方法，其中所述反应步骤(ii)在反应条件pH5.5至6.0下进行。
4.根据权利要求1的方法，其中从糖化血红蛋白的糖化β链N末端或者糖化血红蛋白的包含糖化β链N末端的片段切下的糖化肽是1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸。
5.根据权利要求1的方法，其中从糖化血红蛋白的糖化α链N末端或者糖化血红蛋白的包含糖化α链N末端的片段切下的糖化氨基酸和糖化肽分别是1-脱氧果糖基-L-缬氨酸和1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-亮氨酸。
6.根据权利要求1～5的方法，其中所述酮胺氧化酶具有以下性质(A)：
(A)与对1-脱氧果糖基-L-缬氨酰-L-组氨酸的反应性相比，对ε-1-脱氧果糖基-α-苄氧羰基-L-赖氨酸的反应性为5％或更低。
7.根据权利要求6的方法，其中所述酮胺氧化酶具有以下性质(B)和(C)：
(B)由与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少75％同源性的氨基酸组成；
(C)至少在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的位置58或62的氨基酸被其它氨基酸替代。
8.根据权利要求7的方法，其中在(C)所述氨基酸替代中，58位的氨基酸由缬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸替代；而62位的氨基酸由组氨酸替代。
9.用于根据权利要求1～5任一项的方法不经分离操作而特异地测定糖化血红蛋白的糖化β链N末端的试剂盒，其中至少包含用于权利要求1～5任一项中的蛋白酶。
10.在权利要求1～5中所定义的蛋白酶，其源于登录号为FERMBP-10010产酶溶杆菌YK-366的蛋白酶。
11.在权利要求1～5中所定义的蛋白酶，其来源于登录号为FERMBP-08641的芽孢杆菌属种ASP-842或嗜水气单胞菌NBRC 3820或源于枯草芽孢杆菌NBRC3037。
12.登录号为FERM BP-10010的产酶溶杆菌YK-366菌株。
13.登录号为FERM BP-08641的芽孢杆菌属种ASP-842。
14.制备在权利要求1-5任一项中所定义的蛋白酶的方法，其包含以下的步骤(a)和(b)：
(a)在培养液中培养属于登录号为FERM BP-10010的Lysobacterenzymogenes YK-366的细菌；和
(b)使用硫酸铵盐析法、离子交换层析法和疏水层析法从该培养液中提取蛋白酶。
15.制备在权利要求1-5任一项中所定义的蛋白酶的方法，其包含以下的步骤(a)和(b)：
(a)在培养液中培养登录号为FERM BP-08641的芽孢杆菌属种ASP-842或嗜水气单胞菌NBRC 3820；
(b)使用硫酸铵盐析法、离子交换层析法和疏水层析法从该培养液中提取蛋白酶。
16.筛选蛋白酶的方法，所述蛋白酶对糖化血红蛋白的β链N末端以糖化位点具有反应性而不实质性地从糖化血红蛋白的糖化α链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽，其中所述措辞“不实质性地”表示：如果将所述蛋白酶从糖化血红蛋白的糖化β链N末端切割糖化氨基酸和/或糖化肽的反应性定义为100％，反应性为10％或更低，其包含：
(a)使用长度为3～20个氨基酸的血红蛋白α链N末端糖化肽和长度为3～20个氨基酸的血红蛋白β链N末端糖化肽；
(b)使用源于登录号为FERM BP-10009的Curvularia clavataYH923或源于Neocosmospora vasinfecta 474的酮胺氧化酶。
17.根据权利要求16的筛选方法，其中所述血红蛋白α链N末端糖化肽和所述血红蛋白β链N末端糖化肽具有5个氨基酸长度。
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