JP5665081B2 - 新規フルクトシルペプチドオキシダーゼ - Google Patents

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Description

本発明は、新規フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該蛋白質の製造方法、並びに、該蛋白質を用いる糖化蛋白質の測定方法及び該蛋白質を含む糖化蛋白質測定用試薬に関する。
糖化蛋白質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、最近、臨床診断分野において、血液中の糖化蛋白質であるヘモグロビンA1c（非特許文献１）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている。このヘモグロビンA1cを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる機器分析的方法（非特許文献２）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（例えば、非特許文献３）等が知られていたが、近年、酵素的測定法が開発されており、例えば、プロテアーゼとフルクトシルペプチドオキシダーゼとを用いる方法（特許文献１）が開発されている。酵素的測定法は、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なことから開発が盛んになっている。
酵素的測定法で用いられるフルクトシルペプチドオキシダーゼは、グルコースのヘミアセタールとペプチドのＮ末端のアミノ基とが反応して生成するグルコシルアミンがアマドリ転位して生成するケトース誘導体におけるＣ−Ｎ結合を、酸素分子の存在下で酸化的に開裂し、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。
酵素的測定法の場合、図１に示したように、まずヘモグロビンA1cをプロテアーゼで分解し、ヘモグロビンのβ−鎖のＮ末端からα-フルクトシルバリルヒスチジン(以下、α−FVHと記す)を生成させる。次に、生成したα−FVHにフルクトシルペプチドオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼの存在下でキノン系色素の酸化的縮合を起こさせ、その生成量を分光光度計で比色定量する方法が知られている（特許文献１）。
しかしながら、プロテアーゼ処理によりε−フルクトシルリジンおよびそれを含有する糖化ペプチドが副生し、フルクトシルペプチドオキシダーゼがそれらに作用すると、実際のヘモグロビンA1c値よりも高い測定値となる危険性が指摘されている（特許文献２）。
フルクトシルペプチドオキシダーゼは、細菌、真菌、植物から見出されている。例えば、アカエトミエラ属、カエトミウム属（特許文献３）、カーブラリア属（特許文献２）、バラ科、ブドウ科、セリ科（特許文献４）、ショウガ科（特許文献５）等由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼが知られている。
しかしながら、これまでに報告されているフルクトシルペプチドオキシダーゼは、
(1)α−糖化アミノ酸（例えば、α−フルクトシルバリン）に比べて、α−糖化ジペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジン）に対する活性は、必ずしも高くないこと、
(2)上述のように、Ｎ末端のα−糖化ジペプチド以外にも、リジンのε−アミノ基に糖が結合したε−糖化アミノ酸（ε−フルクトシルリジン）にも作用し、ヘモグロビンA1c測定における実測値を増加させること、
(3)酵素を用いる測定法の場合、測定時や保存時において酵素が不安定となる、
等の欠点があった。
これらの欠点を克服するため、フルクトシルペプチドオキシダーゼに人為的に変異を導入することにより、ε−フルクトシルリジンに対する反応性が低下した酵素（特許文献４）や、同じく変異の導入により耐熱性が増加した酵素（非特許文献４）等が報告されている。しかしながら、上記(1)〜(3)の欠点を同時に高いレベルで克服した酵素の存在はまだ知られていない。
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，第36巻，p.299-308 (1998). Chromatogr. Sci.，第10巻，p.659 (1979). 日本臨床検査自動化学会会誌、第18巻、第4号、p.620 (1993). Appl. Microbiol. Biotechnol., 第78巻、第5号、p.775-781 (2008). 特開2001-95598号公報 国際公開第2004/104203号パンフレット 特開2003-235585号公報 国際公開第2004/038033号パンフレット 国際公開第2004/038034号パンフレット
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、α−糖化ジペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジン）に対する特異性が高く、安定性に優れたフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質を提供することにある。また、本発明の別の目的は、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換え体DNA、該組換え体DNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いたフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質の製造方法、並びに、該蛋白質を用いる糖化蛋白質の測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化蛋白質測定用試薬を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１） 以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質
［４］寄託番号FERM BP-11026として寄託された大腸菌XL1-Blue MRF'株が担持する発現プラスミドによってコードされるフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質
（２） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、（１）に記載の蛋白質。
（３） 以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のDNA。
［１］（１）記載の蛋白質をコードするDNA
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するDNA
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
（４） 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、（３）に記載のDNA。
（５） 配列番号４で表される塩基配列からなる、（３）に記載のDNA。
（６） （３）〜（５）のいずれかに記載のDNAを含有する組換え体DNA。
（７） （６）記載の組換え体DNAを有する形質転換体。
（８） （７）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する（１）又は（２）記載の蛋白質の製造方法。
（９） 試料を蛋白質分解酵素と反応させて糖化ペプチドを生成させ、次いで、生成した糖化ペプチドを（１）又は（２）記載の蛋白質と反応させ、当該糖化ペプチドと当該蛋白質との反応により生成した物質又は当該糖化ペプチドと当該蛋白質との反応において消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化蛋白質の測定方法。
（１０） 糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビンである（９）記載の測定方法。
（１１） 糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンA1cである（１０）記載の測定方法。
（１２） 蛋白質分解酵素、（１）又は（２）記載の蛋白質を含む糖化蛋白質測定用試薬。
（１３） さらに、（１）又は（２）記載の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む（１２）記載の試薬。
（１４） 生成物が、過酸化水素である（１３）記載の試薬。
（１５） 糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビンである（１２）〜（１４）のいずれかに記載の試薬。
（１６） 糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンA1cである（１５）記載の試薬。
（１７） 寄託番号FERM BP-11026として寄託された大腸菌XL1-Blue MRF'株。
本発明により、α−糖化ジペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジン）に対する特異性が高く、安定性に優れたフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該蛋白質の製造方法、並びに、該蛋白質を用いる糖化蛋白質の測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化蛋白質測定用試薬が提供される。
ヘモグロビンA1cの酵素的測定スキームを示す図である。 FPOX-9のアミノ酸配列を示す図である。尚、その上に丸印が付されたアミノ酸は、フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産菌（遺伝子源）のアミノ酸配列に対する変異箇所を表す。 FPOX-9のDNA配列を示す図である。尚、その上に丸印が付された塩基は、フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産菌（遺伝子源）のDNA配列に対する変異箇所を表す。 FPOX-15のアミノ酸配列を示す図である。尚、その上に丸印が付されたアミノ酸は、フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産菌（遺伝子源）からの変異箇所を、下線が施されたアミノ酸は、FPOX-9のアミノ酸配列に対する変異箇所を表す。 FPOX-15のDNA配列を示す図である。尚、その上に丸印が付された塩基は、フルクトシルペプチドオキシダーゼ生産菌（遺伝子源）のDNA配列に対する変異箇所を、下線が施された塩基は、FPOX-9のDNA配列に対する変異箇所を表す。
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質、
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質、および、
［４］寄託番号FERM BP-11026として寄託された大腸菌XL1-Blue MRF'株が担持する発現プラスミドによってコードされるフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質
を挙げることができる。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたときは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸を挙げることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。
本発明の蛋白質としては、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を示すことができる。
本発明の蛋白質がフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばDNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、α−FVHを基質として用い、当該基質との反応により生成する過酸化水素を測定することにより行なうことができる。
本発明の蛋白質は、以下の性質を有する。
(a) 作用：分子状酸素を用いて、糖化ペプチドを酸化して、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド及び過酸化水素を生成する。
(b) 基質特異性：α−FVHに対する反応性が高く、かつε-フルクトシルリジン(以下、ε−FKと略記する)に対する反応性が低い。
本発明の蛋白質が、α−FVHに対して活性が高く、ε−FKに対して反応性が低いことは、例えば、基質として、α−FVHとε−FKを用い、ε−FKに対するα−FVHの活性比（α−FVH/ε−FK）を測定することにより確認することができる。
本発明の蛋白質のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性の至適pH及び安定pH範囲は、特に制限はないが、至適pHは6.0〜7.0付近が好ましく、安定pHは、40℃、10分間の処理で、pH6.0〜9.0が好ましい。
作用適温の範囲については、特に制限はないが、30〜50℃付近が好ましい。耐熱性は、高い方が好ましく、例えば、50℃、15分間の熱処理後の残存活性が、25%以上のものが好ましく用いられる。
フルクトシルペプチドオキシダーゼの活性の測定は、下記の方法で行い、α−FVHより、1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1単位(U)とする。
（活性測定用の試薬の調製）
Ａ液：発色液
Ａ−１液：４−アミノアンチピリンを2.4 mmol/L濃度になるように、イオン交換水に溶解する。
Ａ−２液：Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)を32 mmol/L濃度になるように、イオン交換水に溶解する。
Ｂ液：パーオキシダーゼ溶液
パーオキシダーゼ（110 U/mg、東洋紡績社製）を2 mg/mL濃度になるように、0.1 mol/Lリン酸緩衝液(pH 7.0)に溶解する。
Ｃ液：基質溶液
α−FVHまたはε−FK（ペプチド研究所製）を10 mmol/L濃度になるように、0.1 mol/Lリン酸緩衝液(pH 7.0)に溶解する。
（測定手順）
Ａ−１液 50μL、Ａ−２液 50μL、Ｂ液 2μL、Ｃ液 20μLを混合し、水で200μLにフィルアップした後、30℃にて5分間プレインキュベーションした後、酵素液 1μLを添加し、30℃で30分間反応させ、プレートリーダー（infinite F200、Tecan社製）で550 nmにおける吸光度を測定した。なお、ブランク値は、基質溶液（Ｃ液）の代わりにイオン交換水を用いたものを測定する。
そして前記の測定系に、種々の量の過酸化水素を添加して、550 nmの吸光度を測定し、過酸水素の量と吸光度の関係を表わす検量曲線を作成し、そこから酵素の単位数（酵素力価）を求める。
また、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を発現するプラスミド（発現プラスミド）を担持する大腸菌XL1-Blue MRF'株(Escherichia coli XL1-Blue MRF'/pTrcFPOX-9)は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号305-8566）
(b)受領日（寄託日）：２００８年９月１９日
(c)受領番号（寄託番号）： FERM BP-11026
上記寄託番号FERM BP-11026として寄託された大腸菌XL1-Blue MRF'株、該菌株が担持する発現プラスミド、および該プラスミドによってコードされるフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質もまた本発明に含まれる。
２．本発明のDNA
本発明のDNAとしては、
［１］上記１の［１］〜［３］の本発明の蛋白質をコードするDNA、
［２］配列番号２で表される塩基配列を有するDNA、および
［３］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA、
を挙げることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部に対象のDNAがハイブリダイズすることを意味する。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のDNAを挙げることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のDNAであってもよい。
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750 mmol/Lの塩化ナトリウム、75 mmol/Lのクエン酸ナトリウム）、50 mmol/Lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/Lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3 mol/Lの塩化ナトリウム、0.2 mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.02 mol/LのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/Lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件を挙げることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件を挙げることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを挙げることができる。
上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、α−FVHを基質として用い、当該基質との反応により生成する過酸化水素を測定することにより行なうことができる。
本発明のDNAとしては、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA、配列番号４で表される塩基配列からなるDNA等を示すことができる。
３．本発明の形質転換体
本発明の形質転換体としては、上記２のDNAを含む組換え体DNAを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体を挙げることができ、宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌、より好ましくは原核細胞、より好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を挙げることができる。
４．本発明のDNAの調製
本発明のDNAは、例えば、配列番号２で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、糸状菌等の微生物、好ましくはAspergillus属、Emericella属等に属する微生物、特に好ましくはEmericella nidulans等に属する微生物により取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法により本発明のDNA、または本発明の製造法に用いられるDNAを取得することもできる。
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいは373A・DNAシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
本発明のDNAを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などを挙げることができる。
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などを挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等を挙げることができる。
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等を挙げることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号２で表される塩基配列を有するDNAを挙げることができる。
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体の製造法
本発明のDNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐ trp ）、lacプロモーター（Ｐ lac ）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体DNAとしては、例えばpET21-plu1440を挙げることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Batillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.） ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等を挙げることができる。
組換え体DNAの原核生物への導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等を挙げることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイセス（Schwanniomyces）属、ピチア（Pichia）属、またはキャンディダ（Candida）属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）等を挙げることができる。
組換え体DNAの酵母への導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等を挙げることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはナマルバ KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等を挙げることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等を挙げることができる。
組換え体DNAの動物細胞への導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を挙げることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等を挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Bombyx mori）N4等を挙げることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等を挙げることができる。
組換えベクターの植物細胞への導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等を挙げることができる。
６．本発明の蛋白質の製造法
上記５の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物を挙げることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle）のMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、DMEM培地[Virology, 8, 396 (1959)]、199培地[Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法[Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996)、Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のDNAまたは本発明の製造法に用いられるDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭63-309192）、卵等を挙げることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするDNAを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF（GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
７．本発明の蛋白質を用いる糖化蛋白質の測定方法
本発明の蛋白質は、糖化蛋白質に蛋白質分解酵素が作用して糖化蛋白質より生成する糖化ペプチドに作用し、過酸化水素を生成する性質を有することから、各種試料中の糖化蛋白質の測定に用いることができる。具体的には、試料を蛋白質分解酵素と反応させて糖化ペプチドを生成させ、生成した糖化ペプチドと、本発明の蛋白質とを反応させ、当該糖化ペプチドと本発明の蛋白質との反応により生成する物質又は当該糖化ペプチドと本発明の蛋白質との反応において消費される物質を測定することにより、試料中の糖化蛋白質を測定することができる。試料中の糖化蛋白質の測定に係る反応は、後述の水性媒体中で行われてもよい。本発明における糖化蛋白質としては、例えばヘモグロビンA1c等の糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等が挙げられ、糖化ヘモグロビンが好ましく、ヘモグロビンA1cが特に好ましい。
以下、本発明の測定方法について説明する。
（試料及び測定対象物）
本発明の測定方法に用いられる試料としては、糖化蛋白質を含む試料であれば特に制限はなく、例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料、及び食品等が挙げられる。試料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましく、全血液、血球等が特に好ましい。なお、全血液には、全血液由来の血球分画に血漿が混合している試料も含まれる。これらの試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。
ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２本のポリペプチドからなる分子量６４，５００の４量体である。ヘモグロビンのα鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリンであり、β鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシンである。ヘモグロビンA1cは、β鎖のＮ末端バリンが糖化されたものと定義されている。また、ヘモグロビンは分子内に複数の糖化部位を有することが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127）。
糖化ヘモグロビンを含む試料に蛋白質分解酵素を作用させることにより、β鎖Ｎ末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するα−フルクトシルバリン（以下、α−FVと略記する）及びα−FVH、α鎖Ｎ末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するα−FV及びα−フルクトシルバリルロイシン（以下、α−FVLと略記する）、α鎖及び／又はβ鎖の内部のリジン残基のε−アミノ基の糖化に由来するε−FK等の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが生成する。
さらに試料が全血液の場合、例えば糖化アルブミン等、全血液中の糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質からも例えばε−FK等の糖化アミノ酸が生成する。
即ち、精製ヘモグロビンを含む試料又は全血液を含む試料に蛋白質分解酵素を作用させると、例えばα−FVH、α−FV、ε−FK、α−FVL等が生成し、α−FVH及びα−FVLは糖化ヘモグロビンに由来し、α−FVHはヘモグロビンA1cに特異的に由来する。
従って、ヘモグロビンA1cを測定する場合は、α−FVHを特異的に測定すればよい。本発明の蛋白質は、α−FVHに対する反応性が高く、かつε−FKに対する反応性が低いため、ヘモグロビンA1cを効果的に測定することができる。
（蛋白質分解酵素）
本発明に使用しうる蛋白質分解酵素は、試料中に含まれる測定すべき糖化蛋白質に作用するものであればいかなるものを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ等が挙げられる。
動物由来のプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ（Elastase）、トリプシン（Trypsin)、キモトリプシン（Chymotrypsin）、ペプシン（Pepsin）、牛膵臓プロテアーゼ、ブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼ、カテプシン（Cathepsin）、カルパイン（Calpain)、プロテアーゼタイプ−I 、プロテアーゼタイプ−XX（以上、シグマ社製）、アミノペプチダーゼＭ（Aminopeptidase Ｍ）、カルボキシペプチダーゼＡ（Carboxypeptidase Ａ）（以上、ベーリンガー・マンハイム社製）、パンクレアチン（Pancreatin：和光純薬社製、シグマ社製）等が挙げられる。
植物由来のプロテアーゼとしては、例えばカリクレイン（Kallikrein）、フィシン（Ficin)、パパイン（Papain）、キモパパイン（Chymopapain)、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼＷ（以上、シグマ社製）、パパインW-40、ブロメラインF （以上、天野エンザイム社製）等が挙げられる。
微生物由来のプロテアーゼとしては、例えば下記(1)〜(14)が挙げられる。
(1) バチルス（Bacillus）属由来プロテアーゼ；ズブチリシン(Subtilisin)、プロテアーゼ−タイプ-VIII、プロテアーゼ−タイプ-IX、プロテアーゼ−タイプ-X、プロテアーゼ−タイプ-XV、プロテアーゼ−タイプ-XXIV、プロテアーゼ−タイプ-XXVII、プロテアーゼ−タイプ-XXXI、プロテイナーゼTypeVII、バチルスリケニフォルミス由来プロテアーゼ(以上、シグマ社製)、サーモリシン(和光純薬工業社製)、オリエンターゼ-90N、オリエンターゼ-10NL、オリエンターゼ-22BF、オリエンターゼ-Y、オリエンターゼ-5BL、ヌクレイシン（以上、エイチビィアイ株式会社製）、プロレザーFG-F、プロテアーゼNL「アマノ」、プロテアーゼS「アマノ」G、プロテアーゼN「アマノ」G（以上、天野エンザイム社製）、GODO-BNP、GODO-BAP、GODO高純度プロテアーゼ（以上、合同酒清社精製）、プロチン-AC10F、プロチン-NL10、プロチン-NC25、プロチン-NY10、プロチン-PC10F、プロチン−PS10、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ-PC10F、サーモリシン（以上、大和化成社製）、トヨチームNEP、中性プロテアーゼ（以上、東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、NUE、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム-FM、ボラン（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、エンチロン-NBS、エンチロン-SA(以上、洛東化成工業社製)、ナガーゼ（Nagarse）、ビオプラーゼAPL-30、ビオプラーゼSP-4FG、ビオプラーゼXL-416F、ビオプラーゼAL-15FG、ペクチナーゼXP-534(以上、ナガセケムテックス社製)、アロアーゼAP-10、プロテアーゼYB、（以上、ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ-N、コロラーゼ-7089、ベロンW（以上、樋口商会社製）、キラザイム P-1、ディスパーゼ(以上、ロシュ社製)、サチライシン（ベーリンガー・マンハイム社製）、プロテイナーゼＮ、プロテイナーゼBacterial Subtilisin（以上、フルカ社製）、プロナーゼＥ（科研製薬社製）等。
(2) アスペルギルス（Aspergillus)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ-XIII、-XIX、-XXIII（以上、シグマ社製）、スミチーム-MP、スミチーム-AP、スミチーム-LP L、スミチーム-LP20、スミチーム-FP、エンザイム P-3（以上、新日本化学工業株式会社製）、オリエンターゼ-20A、オリエンターゼ-ONS、オリエンターゼ-ON5、テトラーゼS（以上、エイチビィアイ株式会社製）、ウマミザイムG、ニューラーゼA、ニューラーゼF3G、プロテアーゼA「アマノ」G、プロテアーゼK「アマノ」、プロテアーゼM「アマノ」G、プロテアーゼP「アマノ」3G（以上、天野エンザイム社製）、アルカリプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、モルシン、AOプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、プロチン-F、プロチン-FN、プロチン-FA(以上、大和化成社製）、デナプシン2P、デナチーム-SA-7、デナチーム-AP、デナザイムAP (以上、ナガセケムテックス社製）、プロテアーゼYP-SS、パンチダーゼ-NP-2、パンチダーゼ-P (以上、ヤクルト薬品工業社製）、サカナーゼ（科研製薬社製）、フレーバーザイム (ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、ベロンPS（樋口商会社製）、プロテイナーゼ６（フルカ社製）、プロテアーゼA5（協和化成社製）等。
(3) リゾパス（Rhizopus）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVIII(シグマ社製）、ペプチダーゼR、ニューラーゼF（以上、天野エンザイム社製）、XP-415（ナガセケムテックス社製）等。
(4) ペニシリウム（Penicillium）由来プロテアーゼ；PD酵素（キッコーマン社製）、プロテアーゼＢ「アマノ」（天野エンザイム社製）、デオキシン１（ナガセケムテックス社製）等。
(5) ストレプトマイセス（Streptomyces）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXIV（別称Pronase）、プロテアーゼ-XXI（以上、シグマ社製）、アクチナーゼ-AS、アクチナーゼ-AF、アクチナーゼ-E（以上、科研製薬社製）、Alkalofilic Proteinase（東洋紡社製）、プロナーゼE（ロシュ社製、カルビオケム−ノバイオケム社製、シグマ社製）、プロナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(6) スタフィロコッカス（Staphylococcus）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVII（シグマ社製）、エンドプロテイナーゼGlu-C（ベーリンガー・マンハイム社製）、V8プロテアーゼ（タカラ社製、和光純薬社製）等。
(7) クロストリジウム（Clostridium)由来プロテアーゼ；クロストリパイン、ノンスペシフィックニュートラルプロテアーゼ、コラゲナーゼType1A(以上、シグマ社製）等。
(8) リソバクター（Lysobacter）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼLys-C（シグマ社製）等。
(9) グリフォラ（Grifola)由来プロテアーゼ；メタロエンドペプチダーゼ（Metalloendopeptidase ；シグマ社製）等。
(10) 酵母（Yeast)由来プロテアーゼ；プロテイナーゼA（Proteinase A ；シグマ社製）、カルボキシペプチダーゼY（Carboxypeptidase Y；ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(11) トリチラチウム（Tritirachium）由来プロテアーゼ；プロテイナーゼK (Proteinase K；シグマ社製、ロシュ社製、和光純薬社製）等。
(12) サーマス（Thermus)由来プロテアーゼ；アミノペプチダーゼＴ(AminopeptidaseT ；ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(13) シュードモナス（Pseudomonas)由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼAsp-N (Endoproteinase Asp-N；和光純薬社製)等。
(14) アクロモバクター（Achromobacter）由来プロテアーゼ；リジルエンドペプチダーゼ（Lysylendopeptidase）、アクロモペプチダーゼ（以上、和光純薬社製）、AP-1(タカラ社製)等。
本発明の測定方法においては、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大きいので好ましく、特にバチルス属由来のプロテアーゼが好ましい。
メタロプロテアーゼとしては、例えばサーモリシン、プロテアーゼN等が挙げられる。エンドプロテアーゼとしては、例えばサーモリシン、パパイン、ズブチリシン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。エキソプロテアーゼとしては、例えばアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる。セリンプロテアーゼとしては、サーミターゼ、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ等が挙げられる。システインプロテアーゼとしては、パパイン、カスパーゼ等が挙げられる。酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、カテプシンＤ等が挙げられる。アルカリ性プロテアーゼとしては、オリエンターゼ２２ＢＦ等が挙げられる。チオールプロテアーゼは、例えばパパイン、フィシン、ブロメライン等が挙げられる。
蛋白質分解酵素の濃度としては、反応液中で0.01〜100,000 U/mLの濃度であることが好ましく、0.1〜10,000 U/mLであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
また本発明に使用する蛋白質分解酵素は着色していないものが好ましく、例えば該蛋白質分解酵素の1,000 U/mLの水溶液において波長300〜800 nmの吸光度が100 mAbs以下であるものが好ましく0〜10 mAbsがより好ましい。蛋白質分解酵素は各種クロマトグラム、塩析、透析、活性炭処理等で精製し上述の吸光度を減少させたものを使用するのが好ましい。
本発明の測定方法において、本発明の蛋白質である酵素の濃度としては、反応液中で0.01〜1,000 U/mLの濃度であることが好ましく、0.1〜100 U/mLであることがより好ましい。
（測定方法）
本発明の試料中の測定すべき糖化蛋白質の測定は、下記(i)〜(iii)の工程を順次行うことによって行うことができる。
(i)試料を蛋白質分解酵素と反応させて糖化ペプチドを生成させる工程、
(ii)生成した糖化ペプチドを本発明の蛋白質と反応させる工程、及び、
(iii)(ii)の工程で生成した物質、又は、消費された物質を測定する工程。
上記工程(i)〜(iii)は、水性媒体中で行われても良い。水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（トリス緩衝剤）、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0 mol/Lが好ましく、0.005〜1.0 mol/Lがより好ましい。
各工程の反応の反応温度としては、例えば10〜50℃で、好ましくは20〜40℃であり、反応時間としては、1秒間〜60分間、好ましくは1〜10分間である。
蛋白質分解酵素は、工程(ii)の反応に影響を及ぼさなければ、工程（i）を行った後に、特に失活させなくともよいが、加熱、冷却、遠心分離、膜濾過、阻害剤の添加等によって該酵素が工程(ii)で作用することがないようにすることもできる。
工程（ii）において、糖化ペプチドと、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質との反応により反応液中に生じる生成物としては、過酸化水素、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド等が挙げられる。また、工程(ii)において、糖化ペプチドと、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質との反応により消費される物質としては、例えば酸素分子等が挙げられる。工程(ii)において消費される酸素分子は、例えば酸素電極を用いた電気化学的測定法により測定される。
本発明の工程（ii）において生成する過酸化水素は、例えば光学的手法又は電気化学的手法を用いて測定することができる。光学的手法としては、例えば吸光度法、発光法等が挙げられる。具体的には、過酸化水素測定試薬を用いた光学的測定法、過酸化水素電極を用いた電気化学的測定法等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光等が挙げられるが、色素が好ましい。
検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。
検出可能な物質が光の場合には、過酸化水素測定試薬は、化学発光物質を含む。化学発光物質としては、生物発光物質も含まれ、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、シュウ酸エステル等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成し、生成した色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、過酸化水素を測定することができる。
酸化カップリング型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。酸化カップリング型色原体の具体例は、４−アミノアンチピリン等のカプラー、フェノール系又はアニリン系水素供与体等が挙げられる。カプラーとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、酸化カップリングし、色素を生成する。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フェノール系水素供与体としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
アニリン系水素供与体としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン（Ｅｔ−ＭＡＳＥ）等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’,Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、1〜100 U/mLが好ましく、2〜50 U/mLがより好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10 g/Lが好ましく、0.02〜5 g/Lがより好ましい。
過酸化水素を過酸化水素電極を用いて測定する場合、使用する電極は、過酸化水素との間で電子を授受する材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられる。測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができる。オキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定することもできる。
電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定することができる。
工程（ii）においては、過酸化水素と共に糖オソン（α−ケトアルデヒド体）が生成するので、生成した糖オソン（α−ケトアルデヒド体）を測定することによっても、試料中のヘモグロビンA1cを測定することができる。α−ケトアルデヒド体にグルコースオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を併せて測定することにより、高感度に測定することができる（特開２０００−３３３６９６）。
（試料の調製方法）
測定すべき糖化蛋白質を含む試料は、必要に応じて生体試料から分離することができる。分離方法としては、遠心、濾過、血球分離膜を用いた方法等が挙げられる。例えば遠心による分離方法は、全血液を血球、血漿もしくは血清に分離することができる。必要に応じて、該血球を生理食塩水等の等張液で洗浄することで、血漿由来の成分を除去した洗浄血球を得ることもできる。
試料として血球を用いる場合は、全血液、血球、洗浄血球等の血球を含む試料を低張液で希釈して溶血することができる。低張液としては、血球を溶血させることができれば如何なる溶液でもよいが、水、緩衝液等が挙げられ、界面活性剤等の添加剤を含むのが好ましい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
洗浄血球の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、25℃で5分間、遠心分離(3,000 rpm)を行う。遠心分離後、上澄みの血漿は除去する。下層部分の血球層１容に対して、４容の生理食塩水を追加し、転倒混和後、25℃で5分間、遠心分離(3,000 rpm)を行う。遠心分離後、上澄みの生理食塩水を除去する。この洗浄操作を３回繰り返した後、洗浄された血球層１容に対して９容の蒸留水を添加し、洗浄血球を得ることができる。
（糖化蛋白質測定用試薬及び測定用キット）
本発明の糖化蛋白質測定用試薬及び測定用キットは、本発明の糖化蛋白質の測定方法に使用することができる。本発明の糖化蛋白質測定用試薬は、保存、運搬、流通に適した形態として、キットの形態をとり得る。キットの形態としては、２試薬系、３試薬系等が挙げられる。
本発明の糖化蛋白質測定用試薬は、蛋白質分解酵素、及び、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質を含む。さらに、本発明の糖化蛋白質測定用試薬は、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含んでもよい。本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物としては、過酸化水素、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド等が挙げられる。本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬としては、例えば過酸化水素測定用試薬、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）測定用試薬、ペプチド（Ｖａｌ−Ｈｉｓ）測定用試薬等が挙げられるが、過酸化水素測定用試薬が好ましい。
本発明の測定すべき糖化蛋白質測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられる。
・キット１（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬。
・キット２（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬。
・キット３（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬。
・キット４（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬。
・キット５（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬；及び、
（３）本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬。
・キット６（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬；及び、
（３）本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬。
・キット７（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬；及び、
（３）本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬。
・キット８（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット。
（１）蛋白質分解酵素、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬；及び、
（３）本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む試薬。
本発明の測定用試薬及び測定用キットにおいて使用される蛋白質分解酵素、本発明の蛋白質、糖化蛋白質、本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。
本発明の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬が過酸化水素測定用試薬である場合、過酸化水素測定用試薬としては、例えば前述の過酸化水素測定用試薬等が挙げられる。過酸化水素測定用試薬として、酸化カップリング型色原体を用いる場合、カップラーと、フェノール系若しくはアニリン系水素供与体とは、同一の試薬中に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、さらに、標準蛋白質等の測定用標準物質が含有されてもよい。
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、それぞれ緩衝剤、安定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、非特異反応抑制剤、界面活性剤等が含有されてもよい。緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アルブミン、デキストラン、酢酸カルシウム等の塩類等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質除去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合物等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
本発明の測定用試薬及び測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、当該キットは前述の水性媒体又は反応液に溶解して使用することができる。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、必要に応じて、該キットに凍結乾燥試薬を溶解するための試薬等が含有されてもよい。
本発明の測定用キットにおける蛋白質分解酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜1,000,000 U/mLとなる含量が好ましく、0.1〜100,000 U/mLとなる含量がより好ましい。
本発明の測定キットにおける本発明の蛋白質の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜10,000 U/mLとなる含量が好ましく、0.1〜1,000 U/mLとなる含量がより好ましい。
過酸化水素測定試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が1〜600 U/mL、0.5〜40 g/Lとなる含量が好ましく、2〜150 U/mL、1〜20 g/Lとなる含量がより好ましい。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書内に組み入れられる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子の発現系の構築
α−FVHに対する活性が比較的高く、かつε−FKに対する活性が低い酵素を生産する菌として、Emericella nidulans KY125株を選択した。
次に、E. nidulansの類縁の菌で、かつその全ゲノム配列が解読されているAspergillus nidulans FGSC A4株のDNA配列（Nature, 438, 1105 (2005)）を参考にしたプライマー（配列番号５、配列番号６）を用いて、フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子の全長をPCR法を用いて増幅した。そのDNA配列をDNA シークエンサーを用いて解読したところ、KY125株のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子は、6個のエキソンの間に、5個のイントロンを含んでいた。そこで、オーバーラップPCR法（Nucleic Acids Res., 16, 7351 (1988)）によってエキソン部分のみを増幅し、それらを結合し、エキソンのみからなる成熟型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子を造成した。そしてそのDNA配列を解読したところ、成熟型のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子は、1317 bp、438アミノ酸からなることが判明した。
E. nidulans KY125株のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子の発現系を構築するために、発現ベクターpTrc99A（4,176-bp、GEジャパン製）のNcoIとBamHIの制限酵素サイトに上記で得られたフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子を挿入した。その組換え体DNA（プラスミド）(pTrcFPOX-1）を用いてE. coli XL1-Blue（フナコシ社製）を形質転換した。この形質転換体をアンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地で終夜培養することにより、その菌体内にフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質が得られた。
〔実施例２〕フルクトシルペプチドオキシダーゼの造成
実施例１で得られたフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子に対してランダム変異を導入した。ランダム変異の導入は、Stratagene社の「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」を用いて行った。pTrcFPOX-1をテンプレートDNAとし、そのフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子の5’-側上流と3’-側下流に相当する領域に対応するプライマー（配列番号５、配列番号６）を用いるPCR法により、塩基置換の導入と全長の増幅を同時に行った。
PCR産物は、NcoIとBamHIで切断後、PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen社)で精製し、pTrc99AのNcoIとBamHIのサイトへのライゲーションを行い、その後E. coli XL1-Blue株を形質転換した。
アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地を含むプレートでの終夜培養で生育してきたコロニー（形質転換体）をピックアップした。それらをアンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地を2 mL含む24ウエル培養プレート（住友ベークライト社製）を用いて、30℃で18時間培養した。培養液にBugBuster（Novagen社製）を添加して、溶菌、遠心分離後、その上清液を酵素源として２種類の基質(ε−FK、α−FVH)に対する酵素活性を測定した。
一方、各形質転換体からプラスミドを調製し、フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子部分の塩基配列をDNAシークエンサーを用いて解読した。そして、酵素活性、耐熱性及び基質特異性の変化と塩基配列（アミノ酸配列）の変化とを関係づけた。
そのなかで、α−FVH活性または耐熱性の増加したフルクトシルペプチドオキシダーゼとして、実施例１で得られたフルクトシルペプチドオキシダーゼにおいて、71番目のSerをTyrに置換し、109番目のLysをArgに置換し、94番目のIleをMetに置換し、269番目のPheをIleに置換し、104番目のGluをLysに置換したフルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下、FPOX-9と称する）を得た。FPOX-9のアミノ酸配列を配列番号１に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に示した。
次にFPOX-9において、59番目のSerをGlyに置換したFPOX-10、該FPOX-10の58番目のMetをPheに置換し、105番目のGlyをLysに置換したFPOX-11を、該FPOX-11の183番目のGlyをGluに置換したFPOX-13、該FPOX-13の302番目のProをLeuに置換したFPOX-14をそれぞれ得た。さらに、該FPOX-14の272番目のAsnをAspに置換したFPOX-15を得た。FPOX-15のアミノ酸配列を配列番号３に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号４にそれぞれ示した。
これらの操作により、置換が累積するに従って、表１に示すようにα−FVHに対する活性は順次増加した。FPOX-15のα−FVH活性はFPOX-9の約4倍に増加した。また、FPOX-15のε−FKに対する活性は逆にFPOX-9の約70%に減少した。従って、FPOX-15のα−FVH/ε−FK比は、約7.3となり、FPOX-9の値に比べて約5.6倍に増加した。また、FPOX-15は50℃、15分間の熱処理のあとでも、約80%の酵素活性を保持し、熱安定性も大幅に向上していた。
Figure 0005665081
尚、上記表１は、各種変異型フルクトシルペプチドオキシダーゼの基質選択性と耐熱性を表す。上記表１において、α−FVH活性およびε−FK活性は、FPOX-9のε−FK活性を1.00としたときの相対値を表し、付加変異の数は、FPOX-9からの置換の数を表す。
〔実施例３〕変異型フルクトシルペプチドオキシダーゼの取得
実施例２で得られたFPOX-9を保有するE. coli XL1-Blue株をアンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地を10 mL含む試験管10本に植菌し、30℃で、24時間振とう培養した。これらの培養液をアンピシリン50 mg/LとIPTG20 mg/Lを含有するLB培地を300 mL含む三角フラスコ10個にそれぞれ移しかえ、30℃で、24時間振とう培養した。
約3,000 mLの培養液を集めて、10,000 x gで15分間の遠心分離により、菌体を集めた。菌体を約50 mLの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH 7.0)に懸濁し、超音波破砕機を用いて、氷冷下で1分間破砕した。同条件での破砕をさらに9回繰り返した。その菌体破砕液を10,000 x gで15分間の遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素抽出液とした。
粗酵素抽出液に、固形硫安を60%飽和になるように添加し、氷冷下で2時間攪拌放置し、目的酵素蛋白質を充分沈殿させた。そして、10,000 x gで15分間の遠心分離により沈殿物を回収した。その沈殿物を約20 mLの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH 7.0)で溶解し、その溶液を5,000 mLの同緩衝液に対して冷所で１夜透析した。
透析した酵素液を、DEAE-Toyopearl（東洋紡績社製）を10 x 100 cmのカラムにつめ、10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH 7.0)であらかじめ平衡化したカラムに通塔し、同緩衝液でさらに洗浄した。目的酵素は、カラムに吸着されず素通りした。一方、大部分の夾雑蛋白質はカラムに吸着された。その結果、表２に示したように、目的酵素は、収率31%で約50倍に精製された。同様に、実施例２で得られたFPOX-15を保有するE. coli XL1-Blue株を一連の精製工程に供し、精製FPOX-15の溶液を得た。
Figure 0005665081
上記表２は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9の精製の各工程におけるFPOX-9の状態を示す。
〔実施例４〕フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9のKm値
実施例２で得られた新規FPOX-9の糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸への基質特異性を、以下の第１試薬〜第３試薬を用いて測定した。
第１試薬
トリス緩衝液（pH7.5） 100 mmol/L
第２試薬
トリス緩衝液（pH7.5） 100 mmol/L
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9 2μL
４−アミノアンチピリン 0.5 mmol/L
TOOS 0.2 mmol/L
パーオキシダーゼ（西洋わさび由来） 10 U/mL
ここで、FPOX-9溶液は、実施例３で調製したものを使用した。
第３試薬
トリス緩衝液（pH7.5） 100 mmol/L
α−FVH，α−FV又はε−FK X mmol/L
（α−FVH又はα−FVを用いた場合は、Ｘ＝0，0.05，0.1，0.5，1，2，5，10）
（ε−FKを用いた場合は、Ｘ＝0，1，2，5，10，20，40, 50, 80, 100）
基質として、糖化ペプチドα−FVH、並びに、糖化アミノ酸ε−FK及びα−FVを用いた。
α−FVH溶液、及び、α−FV溶液は、第３試薬中において0，0.05，0.1，0.5，1，2，5，10 mmol/Lの各濃度となるようにトリス緩衝液を用いて調製した。ε−FK溶液は、第３試薬中において0，1，2，5，10，20，40, 50, 80, 100 mmol/Lの各濃度となるようにトリス緩衝液を用いて調製した。
第１試薬10μLに、第２試薬170μLを添加し、37℃で5分間反応させた後、第３試薬20μLを添加して、更に37℃で5分間、計10分間反応させた。0 mmol/Lにおける反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／800 nm（副波長）における吸光度をＡ０’（Ａｂｓ）、各々の基質濃度における反応開始5.4分の546 nm（主波長）／800 nm（副波長）における吸光度をＡ０ ｘ（Ａｂｓ）として、式（Ｉ）に従い、ΔＡ０を算出した。
（数１）
ΔＡ０＝Ａ０ ｘ- Ａ０’（Ａｂｓ） （Ｉ）
また、0 mmol/Lにおける反応開始6.6分後の546 nm（主波長）／800 nm（副波長）における吸光度をＡｓ’（Ａｂｓ）、各々の基質濃度における反応開始6.6分後の546 nm（主波長）／800 nm（副波長）における吸光度をＡｓ ｘ（Ａｂｓ）として、式（ＩＩ）に従い、ΔＡｓを算出した。
（数２）
ΔＡｓ＝Ａｓ ｘ- Ａｓ’（Ａｂｓ） （ＩＩ）
得られたΔＡ０およびΔＡｓ、総反応液量0.2 mL、ＴＯＯＳの分子吸光係数39,200、反応時間1.2分、反応キュベットの光路長0.5 cmを式（ＩＩＩ）に代入して、各々の基質濃度における酵素活性(U/mL)を算出した。
（数３）
酵素活性(U/mL)＝｛（ΔＡｓ―ΔＡ０）×総反応液量(mL)｝／｛分子吸光係数ε/1000×酵素液量(mL)×0.5×反応時間(min)×光路長(cm)｝ （ＩＩＩ）
α−FVH，ε−FK，α−FVの各々の基質について、横軸に基質濃度(mmol/L)、縦軸に対応する酵素活性(U/mL)をプロットし、最大の酵素活性の１／２に相当する基質濃度をKm値（ミカエリス定数）として算出した。その結果を表３に示す。
Figure 0005665081
上記表３は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9の各種基質に対するKm値を表す。表３から明らかなように、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼは、α−FVHおよびα−FVに基質特異性が高く、ε−FKには反応しにくい酵素であることが示された。
〔実施例５〕フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9の変異と、変異体における基質特異性
pTrcFPOX-9をテンプレートDNAとし、そのフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子の５’−側上流と３’−側下流に相当する領域に対応するプライマー（配列番号５、配列番号６）を用いて、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」を用いるPCR法により、塩基置換の導入と全長の増幅を同時に行った。
PCR産物は、NcoIとBamHIで切断後、PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen社)で精製し、pTrc99AのNcoIとBamHIのサイトへのライゲーションを行い、その後E. coli XL1-Blue株を形質転換した。
アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地を含むプレートでの終夜培養で生育してきたコロニー（形質転換体）をピックアップした。それらをアンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地を2 mL含む24ウエル培養プレート（住友ベークライト社製）を用いて、30℃で18時間培養した。培養液にBugBuster（Novagen社製）を添加して、溶菌、遠心分離後、その上清液を酵素源として２種類の基質(ε−FK、α−FVH)に対する酵素活性を測定した。
一方、各形質転換体からプラスミドを調製し、フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子部分の塩基配列を、DNAシークエンサーを用いて解読した。そして、基質特異性の変化と塩基配列（アミノ酸配列）との変化を関係づけた。結果を表４に示す。
Figure 0005665081
尚、上記表において、α−FVH活性およびε−FK活性は、FPOX-9のε−FK活性を1.00としたときの相対値を表す。表４から、FPOX-9のアミノ酸に変異を入れた場合でも、変異体のε−FK活性に対するα−FVH活性の活性比(FVH/FK)は、FPOX-9に比較して変わらないか、または、向上することが明らかとなった。
〔実施例６〕フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-15のKm値
実施例２で得られたFPOX-15の糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸への基質特異性を、以下の第１試薬〜第３試薬を用いて測定した。
第１試薬
リン酸二水素ナトリウム（pH8.0） 100 mmol/L
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-15 2μL
ここで、FPOX-15溶液は、実施例３で得られた溶液を４倍希釈したものを用いた。
第２試薬
リン酸二水素ナトリウム(pH6.0またはpH7.0またはpH8.0) 100mmol/L
パーオキシダーゼ（西洋わさび由来） 3U/mL
４−アミノアンチピリン 0.5mmol/L
EMSE 0.4mmol/L
第３試薬
α−FVH、α−FV又はε−FK X mmol/L
（α-FVH又はα−FVを用いた場合は、X＝0, 2, 2.5, 3, 3.66）
（ε−FKを用いた場合は、X＝0, 20, 30, 40, 50）
基質として、糖化ペプチドα−FVH、並びに、糖化アミノ酸ε−FK及びα−FVを用いた。
α−FVH溶液、及び、α−FV溶液は、第３試薬中において0, 2, 2.5, 3, 3.66 mmol/Lの各濃度となるように精製水を用いて調製した。ε−FK溶液は、第３試薬中において0, 20, 30, 40, 50mmol/Lの各濃度となるように精製水を用いて調製した。
第１試薬5μLに、第２試薬150μLを添加し、37℃で5分間反応させた後、第３試薬20μLを添加して、更に37℃で5分間、計10分間反応させた。0 mmol/Lにおける反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡ０’（Ａｂｓ）、各濃度の基質における反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡ０ Ｘ（Ａｂｓ）として、式（Ｉ）に従い、ΔＡ０を算出した。
（数１）
ΔＡ０＝Ａ０ Ｘ−Ａ０’（Ａｂｓ） （Ｉ）
また、0 mmol/Lにおける反応開始6.6分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡＳ’（Ａｂｓ）、各々の基質濃度における反応開始6.6分後の546 nm（主波長／700 nm（副波長）における吸光度をＡＳ Ｘ（Ａｂｓ）として、式（ＩＩ）に従い、ΔＡＳを算出した。
（数２）
ΔＡＳ＝ＡＳ Ｘ−ＡＳ’（Ａｂｓ） （ＩＩ）
得られたΔＡ０およびΔＡＳ、総反応液量0.2 mL、ＥＭＳＥの分子吸光係数33,800、反応時間1.2分、反応キュベットの光路長0.5 cmを式（ＩＩＩ）に代入して、各々の基質濃度における酵素活性(U/mL)を算出した。
（数３）
酵素活性(U/mL)＝｛（ΔＡＳ―ΔＡ０）×総反応液量(mL)｝／｛分子吸光係数ε/1000×酵素液量(mL)×0.5×反応時間(min)×光路長(cm)｝ （ＩＩＩ）
α−FVH，ε−FK，α−FVの各々の基質について、横軸に基質濃度(mmol/L)、縦軸に対応する酵素活性(U/mL)をプロットし、最大の酵素活性の1/2に相当する基質濃度をKm値（ミカエリス定数）として算出した。その結果を表５に示す。
Figure 0005665081
上記表５は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-15の各種基質に対するKm値を表す。表５から明らかなように、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼは、α−FVHおよびα−FVに対する基質特異性が高く、ε−FKに対する基質特異性が低い酵素であることが示された。
〔実施例７〕フルクトシルペプチドオキシダーゼ（FPOX-9及びFPOX-15）の等電点pI
FPOX-9及びFPOX-15の1 mg/mLリン酸緩衝液(pH7.0)溶液の各溶液(3μL)を、Phast System（全自動電気泳動システム、GE Healthcare社）の等電点電気泳動ゲルにアプライし、操作手順に従って、電気泳動、染色、脱色操作を行い、各フルクトシルペプチドオキシダーゼのpIを決定した。その結果を表６に示す。
Figure 0005665081
表６に示すとおり、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9およびFPOX-15のpI値が弱アルカリ側であることが分かった。
〔実施例８〕フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の安定性に対するpHの影響
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の安定性に対するpHの影響を、以下の第１試薬〜第３試薬を用いて評価した。評価に際して、第１試薬として、調製直後の試薬、調製後３０℃にて２４時間（１日）保存した試薬、調製後３０℃にて５日間保存した試薬を用いた。
第１試薬
Bis-Tris（pH5.0またはpH6.0またはpH7.0またはpH8.0） 100 mmol/L
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9またはFPOX-15 2μL
ここで、FPOX-9溶液は、実施例３で得られた溶液を２０倍希釈したもの、FPOX-15溶液は、実施例３で得られた溶液を２０倍希釈したものを用いた。
第２試薬
リン酸二水素ナトリウム(pH6.0またはpH7.0またはpH8.0) 100 mmol/L
パーオキシダーゼ（西洋わさび由来） 3 U/mL
４−アミノアンチピリン 0.5 mmol/L
EMSE 0.4 mmol/L
第３試薬
α−FG（フルクトシルグリシン） 0または15 mmol/L
基質として、糖化アミノ酸α−FGを用いた。
第１試薬5μLに、第２試薬150μLを添加し、37℃で5分間反応させた後、第３試薬20μLを添加して、更に37℃で5分間、計10分間反応させた。0 mmol/Lにおける反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡ０’（Ａｂｓ）、基質15 mmol/Lにおける反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡ０ Ｘ（Ａｂｓ）として、式（Ｉ）に従い、ΔＡ０を算出した。
（数１）
ΔＡ０＝Ａ０ Ｘ−Ａ０’（Ａｂｓ） （Ｉ）
また、0 mmol/Lにおける反応開始6.6分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡＳ’（Ａｂｓ）、15 mmol/Lにおける反応開始6.6分後の546 nm（主波長／700 nm（副波長）における吸光度をＡＳ Ｘ（Ａｂｓ）として、式（ＩＩ）に従い、ΔＡＳを算出した。
（数２）
ΔＡＳ＝ＡＳ Ｘ−ＡＳ’（Ａｂｓ） （ＩＩ）
得られたΔＡ０およびΔＡＳ、総反応液量0.2 mL、ＥＭＳＥの分子吸光係数33,800、反応時間1.2分、反応キュベットの光路長0.5 cmを式（ＩＩＩ）に代入して、基質15 mmol/Lにおける酵素活性(U/mL)を算出した。
（数３）
酵素活性(U/mL)＝｛（ΔＡＳ―ΔＡ０）×総反応液量(mL)｝／｛分子吸光係数ε/1000×酵素液量(mL)×0.5×反応時間(min)×光路長(cm)｝ （ＩＩＩ）
この一連の操作を、調製直後の試薬、３０℃で２４時間（１日）保存後の試薬、３０℃で５日間保存後の試薬それぞれについて行い、調製直後の試薬における酵素活性Ｅ０ｄａｙ、３０℃で２４時間保存後の試薬における酵素活性Ｅ１ｄａｙ、３０℃で５日間保存後の試薬における酵素活性Ｅ５ｄａｙから、式（ＩＶ)に従い、調製直後の試薬に対する、３０℃で２４時間（１日）保存後の試薬、及び、３０℃で５日間保存後の試薬の酵素活性残存率（％）Ｅ’を算出した。その結果を表７及び表８に示す。
（数４）
酵素活性残存率Ｅ'(％)＝（Ｅ１ｄａｙ、又は、Ｅ５ｄａｙ）／Ｅ０ｄａｙ×100 （ＩＶ）
Figure 0005665081
Figure 0005665081
表７は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-９の安定性に対するpHの影響を、表８は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-15の安定性に対するpHの影響を示すものである。表７及び表８からも明らかなように、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼFAOX-9及びFPOX-15は、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0のいずれのpH下でも安定であることが判明した。
〔実施例９〕フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の安定性に対する金属の影響
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9及びFPOX-15の安定性に対する金属の影響を、以下の第１試薬〜第３試薬を用いて評価した。評価に際して、第１試薬として、調製直後の試薬、調製後５℃にて２４時間（１日）保存した試薬、調製後３０℃にて２４時間（１日）保存した試薬を用いた。
第１試薬
Bis-Tris（pH7.0） 100 mmol/L
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-9またはFPOX-15 2μL
金属イオン X mmol/L
（金属イオンがNa+、K+、Li+の場合：X＝100；金属イオンがMg2+、Ca2+の場合：X＝10；金属イオンがCr3+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Cd2+、Pb2+、Ba2+、Al3+、Sr2+の場合：X＝0.1）
ここで、FPOX-9溶液は、実施例３で得られた溶液を２０倍希釈したもの、FPOX-15溶液は、実施例３で得られた溶液を１００倍希釈したものを用いた。
第２試薬
リン酸二水素ナトリウム（pH8.0） 100 mmol/L
パーオキシダーゼ（西洋わさび由来） 3 U/mL
４−アミノアンチピリン 0.5 mmol/L
EMSE 0.4 mmol/L
第３試薬
α−FG（フルクトシルグリシン） 0または15 mmol/L
基質として、糖化アミノ酸α−FGを用いた。
第１試薬5μLに、第２試薬150μLを添加し、37℃で5分間反応させた後、第３試薬20μLを添加して、更に37℃で5分間、計10分間反応させた。0 mmol/Lにおける反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡ０’（Ａｂｓ）、基質15 mmol/Lにおける反応開始5.4分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡ０ Ｘ（Ａｂｓ）として、式（Ｉ）に従い、ΔＡ０を算出した。
（数１）
ΔＡ０＝Ａ０ Ｘ−Ａ０’（Ａｂｓ） （Ｉ）
また、0 mmol/Lにおける反応開始6.6分後の546 nm（主波長）／700 nm（副波長）における吸光度をＡＳ’（Ａｂｓ）、15 mmol/Lにおける反応開始6.6分後の546 nm（主波長／700 nm（副波長）における吸光度をＡＳ Ｘ（Ａｂｓ）として、式（ＩＩ）に従い、ΔＡＳを算出した。
（数２）
ΔＡＳ＝ＡＳ Ｘ−ＡＳ’（Ａｂｓ） （ＩＩ）
得られたΔＡ０およびΔＡＳ、総反応液量0.2 mL、EMSEの分子吸光係数33,800、反応時間1.2分、反応キュベットの光路長0.5 cmを式（ＩＩＩ）に代入して、基質15 mmol/Lにおける酵素活性(U/mL)を算出した。
（数３）
酵素活性(U/mL)＝｛（ΔＡＳ―ΔＡ０）×総反応液量(mL)｝／｛分子吸光係数ε/1000×酵素液量(mL)×0.5×反応時間(min)×光路長(cm)｝ （ＩＩＩ）
この一連の操作を、調製直後の試薬、５℃で２４時間（１日）保存後の試薬、３０℃で２４時間（１日）保存後の試薬それぞれについて行い、調製直後の試薬における酵素活性Ｅ’０ｄａｙ、５℃又は３０℃で２４時間（１日）保存後の試薬における酵素活性Ｅ’１ｄａｙから、式（Ｖ)に従い、調製直後の試薬に対する、５℃又は３０℃で２４時間（１日）保存後の試薬の酵素活性残存率（％）Ｅ’’を算出した。その結果を表９及び表１０に示す。
（数５）
酵素活性残存率Ｅ''(％)＝（Ｅ’１ｄａｙ／Ｅ’０ｄａｙ）×100 （Ｖ）
Figure 0005665081
Figure 0005665081
表９は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-９の安定性に対する金属の影響を、表１０は、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-15の安定性に対する金属の影響を示す。表９及び表１０から明らかなように、本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼFAOX-9及びFPOX-15は、各種金属の共存下においても安定であることが判明した。
本発明により、糖尿病等の生活習慣病の診断に有用な新規な蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該蛋白質の製造方法、並びに、該蛋白質を用いる糖化蛋白質の測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化蛋白質測定用試薬が提供される。
配列番号５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号６−人工配列の説明：合成DNA

Claims (17)

  1. 以下の［１］〜［４］のいずれかに記載の蛋白質。
    ［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
    ［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、71番目のTyr、109番目のArg、94番目のMet、269番目のIle、および104番目のLys以外の部位の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質であって、α−フルクトシルバリルヒスチジン(α−FVH)に対するpH7.5、37℃でのKm値(mmol/L)が0.5以下であり、かつ、ε−フルクトシルリジン(ε−FK)に対するpH7.5、37℃でのKm値(mmol/L)が4.0以上である、蛋白質
    ［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列の71番目のTyr、109番目のArg、94番目のMet、269番目のIle、および104番目のLysのアミノ酸残基が保持された、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質であって、α−フルクトシルバリルヒスチジン(α−FVH)に対するpH7.5、37℃でのKm値(mmol/L)が0.5以下であり、かつ、ε−フルクトシルリジン(ε−FK)に対するpH7.5、37℃でのKm値(mmol/L)が4.0以上である、蛋白質
    ［４］寄託番号FERM BP-11026として寄託された大腸菌XL1-Blue MRF'株が担持する発現プラスミドによってコードされるフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質
  2. 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の蛋白質。
  3. 以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のDNA。
    ［１］請求項１記載の蛋白質をコードするDNA
    ［２］配列番号２で表される塩基配列を有するDNA
    ［３］配列番号２で表される塩基配列と９８％以上の同一性を有するDNAであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列の71番目のTyr、109番目のArg、94番目のMet、269番目のIle、および104番目のLysのアミノ酸残基が保持されたフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAであり、ここで、該蛋白質のα−フルクトシルバリルヒスチジン(α−FVH)に対するpH7.5、37℃でのKm値(mmol/L)が0.5以下であり、かつ、ε−フルクトシルリジン(ε−FK)に対するpH7.5、37℃でのKm値(mmol/L)が4.0以上である、DNA
  4. 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、請求項３に記載のDNA。
  5. 配列番号４で表される塩基配列からなる、請求項３に記載のDNA。
  6. 請求項３〜５のいずれかに記載のDNAを含有する組換え体DNA。
  7. 請求項６記載の組換え体DNAを有する形質転換体。
  8. 請求項７記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１又は２記載の蛋白質の製造方法。
  9. 試料を蛋白質分解酵素と反応させて糖化ペプチドを生成させ、次いで、生成した糖化ペプチドを請求項１又は２記載の蛋白質と反応させ、当該糖化ペプチドと当該蛋白質との反応により生成した物質又は当該糖化ペプチドと当該蛋白質との反応において消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化蛋白質の測定方法。
  10. 糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビンである請求項９記載の測定方法。
  11. 糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンA1cである請求項１０記載の測定方法。
  12. 蛋白質分解酵素、請求項１又は２記載の蛋白質を含む糖化蛋白質測定用試薬。
  13. さらに、請求項１又は２記載の蛋白質と糖化蛋白質から生成する糖化ペプチドとの反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む請求項１２記載の試薬。
  14. 生成物が、過酸化水素である請求項１３記載の試薬。
  15. 糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビンである請求項１２〜１４のいずれかに記載の試薬。
  16. 糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンA1cである請求項１５記載の試薬。
  17. 寄託番号FERM BP-11026として寄託された大腸菌XL1-Blue MRF'株。
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