KR102390390B1 - 헤모글로빈 A1c의 측정 방법 및 측정 키트 - Google Patents

헤모글로빈 A1c의 측정 방법 및 측정 키트 Download PDF

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Abstract

헤모글로빈 A1c(HbA1c)의 β쇄에 작용하여 과산화수소를 생성하는 것을 특징으로 하는 아마도리아제를 제공하고, 이를 이용한 HbA1c의 측정 방법 및 측정 시약 키트를 제공한다. αF6P에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지며 HbA1c의 β쇄 아미노 말단을 산화하여 과산화수소를 생성하는 것을 특징으로 하는 아마도리아제를 이용한 HbA1c의 측정 방법 및 이 아마도리아제를 포함하는 측정 시약 키트. HbA1c를 신속, 간편하고 정밀도 높게 정량할 수 있는 측정 방법, 측정 키트를 제공할 수 있다.

Description

헤모글로빈 A1c의 측정 방법 및 측정 키트{Hemoglobin A1c measurement method and measurement kit}
본 발명은 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법 및 그 측정 방법에 이용되는 측정용 시약 키트에 관한 것이다.
당화 단백질은 글루코오스 등의 알도오스(알데히드기를 잠재적으로 가지는 단당 및 그 유도체)의 알데히드기와 단백질의 아미노기가 비효소적으로 공유결합을 형성하여 아마도리 전이함으로써 생성한 것이다. 단백질의 아미노기로서는 아미노 말단의 α-아미노기, 단백질 중의 리신 잔기 측쇄의 ε-아미노기를 들 수 있다. 생체 내에서 발생하는 당화 단백질로서는 혈액 중의 헤모글로빈이 당화된 당화 헤모글로빈, 알부민이 당화된 당화 알부민 등이 알려져 있다.
이들 생체 내에서 발생하는 당화 단백질 중에서도 당뇨병의 임상 진단 분야에서 당뇨병 환자의 진단이나 증상 관리를 위한 중요한 혈당 컨트롤 마커로서 헤모글로빈 A1c(HbA1c)가 주목받고 있다. HbA1c는 헤모글로빈 「β쇄」의 N말단(아미노 말단)의 Val(발린)의 α-아미노기에 글루코오스가 결합된 단백질이다. 혈액 중의 HbA1c 농도는 과거 일정 기간의 평균 혈당치를 반영하기 때문에 HbA1c의 값은 당뇨병 증상의 진단이나 관리에 있어서 중요한 지표가 된다.
이 HbA1c를 신속하고 간편하게 측정하는 방법으로서 종래 아마도리아제를 이용하는 여러 종류의 효소적 방법이 알려져 있다.
아마도리아제는 산소의 존재 하에서 이미노이아세트산 혹은 그 유도체(「아마도리 화합물」이라고도 함)를 산화하여 글리옥실산 혹은 α-케토알데히드, 아미노산 혹은 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 총칭이다. 아마도리아제는 HbA1c를 효소적 방법에 의해 측정하기 위해 유용한 효소로서 알려져 있다. 아마도리아제에 의해 산화되는 기질로서는 예를 들어 α-프럭토실 발릴 히스티딘(이후, αFVH라고 나타냄)이 알려져 있다.
아마도리아제는 지금까지 세균, 효모, 진균으로부터 발견되어 있고, 예를 들어 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스로박터(Arthrobacter) 속 유래의 아마도리아제가 보고되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1, 6~15, 비특허문헌 1~9 참조). 이들 속을 본 명세서에서 코니오카에타(Coniochaeta) 속 등이라고 부르는 경우가 있다. 또, 상기 보고예 중에서 아마도리아제는 문헌에 따라서는 케토아민 옥시다아제나 프럭토실 아미노산 옥시다아제, 프럭토실 펩티드 옥시다아제, 프럭토실아민 옥시다아제 등의 표현으로 기재되어 있는 경우도 있다.
상술한 바와 같은 각종 아마도리아제를 이용하여 HbA1c를 신속하고 간편하게 측정하는 방법으로서는 프로테아제 또는 펩티다아제(이하, 프로테아제 등이라고 함)의 절단용 효소로 HbA1c를 분해하고, HbA1c의 β쇄 아미노 말단에서 특정의 측정용 물질을 유리시키고, 유리한 측정용 물질을 상술한 바와 같은 아마도리아제를 이용하여 정량하는 방법이 알려져 있다(예를 들어, 특허문헌 1~7 참조).
구체적으로 HbA1c를 특정의 프로테아제 등으로 분해하고, 그 β쇄 아미노 말단에서 αFVH를 유리시킨 후에 유리한 αFVH를 정량하는 방법이 알려져 있고, 이 측정 방법이 현재 HbA1c 효소적 측정법의 주류가 되어 있다.
나아가 아마도리아제를 이용한 HbA1c의 측정 방법으로서는 HbA1c를 Glu-C 프로테아제를 이용하여 소화하고, 당화된 β쇄 아미노 말단의 발린을 포함하는 6아미노산으로 이루어지는 α-프럭토실헥사펩티드(α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산, 이후 αF6P라고 나타냄)를 유리시킨 후에 유리한 αF6P를 정량하는 방법이 있다(예를 들어, 특허문헌 16, 17 참조). 이 방법은 IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)에 의해 정해진 HbA1c 측정법(비특허문헌 10 참조)에 따른 효소에 의한 HbA1c의 측정 방법이다.
그러나, 전술한 아마도리아제를 이용한 HbA1c의 측정 방법에서는 프로테아제 또는 펩티다아제(이하, 프로테아제 등이라고 함)에 의해 HbA1c를 소화하고, 그 β쇄 아미노 말단의 발린을 포함하는 당화 펩티드를 유리시키는 공정을 빠뜨릴 수는 없다. 따라서, HbA1c의 측정 시약 키트에는 반드시 프로테아제 등을 처방할 필요가 있는데, 이는 이하에 서술하는 이유에 의해 본래 바람직한 것은 아니다.
프로테아제 등은 단백질을 가수분해하는 작용을 나타내기 때문에 단백질인 효소도 프로테아제 등에 의해 가수분해된다. 따라서, 아마도리아제도 프로테아제에 의해 가수분해되어 실활되고, 그 결과 당화 펩티드와 산소를 소비하여 과산화수소를 생성하는 반응이 저해된다. 이에 대한 대처법으로서는 아마도리아제의 처방량을 늘려 아마도리아제가 완전히 실활되기 전에 측정을 끝내는 것을 생각할 수 있지만, 아마도리아제의 증량은 프로테아제 등이 HbA1c보다 아마도리아제를 우선적으로 가수분해하는 것으로 이어져 본래 바람직하지는 않다.
또한, 당화 펩티드에 아마도리아제를 작용시켜 생성하는 과산화수소를 정량하여 HbA1c를 측정하는 경우에는 과산화수소의 정량에 퍼옥시다아제를 이용하는 경우가 있다. 이 경우, 퍼옥시다아제도 프로테아제 등에 의해 가수분해되어 실활되기 때문에 바람직하지 않다.
또 다른 측면으로서 효소에 의한 HbA1c 측정에는 자동 분석 장치를 사용하는 것이 일반적이고, 이 경우 하나의 시료를 이용하여 HbA1c를 비롯한 다양한 생체 마커를 동시 측정한다. 이 때, 각 생체 마커는 효소 혹은 항체를 이용하여 측정하기 때문에 프로테아제 등이 컨태미네이션하면 각 생체 마커 측정 시약에 포함되는 효소 혹은 항체가 가수분해되어 HbA1c 이외의 생체 마커를 정확하게 측정할 수 없을 우려가 있다. 따라서, 자동 분석 장치에 세트하는 시약에는 본래 프로테아제 등이 포함되지 않는 것이 바람직하다.
이상의 이유에 의해 아마도리아제로 직접 HbA1c의 β쇄를 산화하여 과산화수소를 생성시키는 아마도리아제와 이를 이용한 HbA1c 측정법이 요구되었지만, 이러한 효소 활성을 나타내는 아마도리아제는 지금까지 발견하지 못하였다.
특허문헌 1: 국제공개 제2004/104203호 특허문헌 2: 국제공개 제2005/49857호 특허문헌 3: 일본공개특허 2001-95598호 공보 특허문헌 4: 일본공고특허 평05-33997호 공보 특허문헌 5: 일본공개특허 평11-127895호 공보 특허문헌 6: 국제공개 제97/13872호 특허문헌 7: 일본공개특허 2011-229526호 공보 특허문헌 8: 일본공개특허 2003-235585호 공보 특허문헌 9: 일본공개특허 2004-275013호 공보 특허문헌 10: 일본공개특허 2004-275063호 공보 특허문헌 11: 일본공개특허 2010-35469호 공보 특허문헌 12: 일본공개특허 2010-57474호 공보 특허문헌 13: 국제공개 제2010/41715호 특허문헌 14: 국제공개 제2010/41419호 특허문헌 15: 국제공개 제2011/15325호 특허문헌 16: 국제공개 제2004/38034호 특허문헌 17: 국제공개 제2008/108385호
비특허문헌 1: Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11, 2003 비특허문헌 2: Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010 비특허문헌 3: J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006 비특허문헌 4: Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-9, 2007 비특허문헌 5: Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996 비특허문헌 6: Mar. Biotechnol. 6, 625-32, 2004 비특허문헌 7: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002 비특허문헌 8: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002 비특허문헌 9: Biotechnol. Letters 27, 27-32, 2005 비특허문헌 10: Jeppsson JO, et al; Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood. Clin. Chem. Lab. Med. 40, 78-89, 2002
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 HbA1c의 β쇄를 산화하여 과산화수소를 생성시키는 아마도리아제를 발견하고, 이를 이용한 HbA1c 측정법을 구축하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제 해결을 위해 면밀히 연구를 거듭한 결과, 코니오카에타(Coniochaeta) 속 등에 유래하는 아마도리아제에 수개의 아미노산 치환이 도입된 개변형 아마도리아제가 HbA1c를 산화하여 과산화수소를 생성시키는 활성을 가지는 것을 발견하고, 이를 이용한 HbA1c 측정법을 실현하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소 혹은 소비되는 산소를 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
[2] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 것인, 1에 기재된 방법.
[3] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지며, 또한 이하의 (i)~(iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 아마도리아제,
(i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에서 상기 아마도리아제의 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지는 아마도리아제,
(a) 서열 번호 1의 62위,
(b) 서열 번호 1의 63위,
(c) 서열 번호 1의 102위,
(d) 서열 번호 1의 106위,
(e) 서열 번호 1의 110위,
(f) 서열 번호 1의 113위,
(g) 서열 번호 1의 355위,
(h) 서열 번호 1의 419위,
(i) 서열 번호 1의 68위,
(j) 서열 번호 1의 356위,
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위 및 356위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 아마도리아제,
(iii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제인, 1 또는 2에 기재된 방법.
[4] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제,
(a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
(b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌 또는 히스티딘이고,
(c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
(d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 리신 또는 아르기닌이고,
(e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
(f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
(g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
(h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
(i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
(j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌인, 3에 기재된 방법.
[5] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 2개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 4에 기재된 방법.
[6] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 3개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 5에 기재된 방법.
[7] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 4개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 6에 기재된 방법.
[8] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 5개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 7에 기재된 방법.
[9] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 6개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 8에 기재된 방법.
[10] 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속 또는 페니실리움(Penicillium) 속 유래인, 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
[11] 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 코니오카에타 에스피(Coniochaeta sp.), 유페니실리움 테레눔(Eupenicillium terrenum), 피레노케타 에스피(Pyrenochaeta sp.), 아르트리늄 에스피(Arthrinium sp.), 커벌라리아 클라바타(Curvularia clavata), 네오코스모스포라 바신펙타(Neocosmospora vasinfecta), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 페오스페리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans) 속, 울로클라디움 에스피(Ulocladium sp.) 또는 페니실리움 잔티넬룸(Penicillium janthinelum) 혹은 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) 유래인, 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
[12] 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아마도리아제인, 1에 기재된 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
(i) 서열 번호 141 또는 143에 나타내는 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 이루어진 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제.
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 141 또는 143의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 141의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제.
[13] 아마도리아제가 추가로 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하의 아미노산,
(i) 262위의 아스파라긴,
(ii) 257위의 발린,
(iii) 249위의 글루타민산,
(iv) 253위의 글루타민산,
(v) 337위의 글루타민,
(vi) 340위의 글루타민산,
(vii) 232위의 아스파라긴산,
(viii) 129위의 아스파라긴산,
(ix) 132위의 아스파라긴산,
(x) 133위의 글루타민산,
(xi) 44위의 글루타민산,
(xii) 256위의 글리신,
(xiii) 231위의 글루타민산 및
(xiv) 81위의 글루타민산
으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지며, 또한
경우에 따라 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실하고 있어도 되는, 3 내지 12 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.
[14] 이하 (1) 및 (2)의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정용 시약 키트.
(1) 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제.
(2) 과산화수소를 측정하기 위한 시약.
[15] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 것인, 14에 기재된 키트.
[16] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지며, 또한 이하의 (i)~(iii)로 이루어지는 군에서 선택되는 아마도리아제,
(i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에서 상기 아마도리아제의 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지는 아마도리아제,
(a) 서열 번호 1의 62위,
(b) 서열 번호 1의 63위,
(c) 서열 번호 1의 102위,
(d) 서열 번호 1의 106위,
(e) 서열 번호 1의 110위,
(f) 서열 번호 1의 113위,
(g) 서열 번호 1의 355위,
(h) 서열 번호 1의 419위,
(i) 서열 번호 1의 68위,
(j) 서열 번호 1의 356위,
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위 및 356위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 아마도리아제,
(iii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제인, 14 또는 15에 기재된 키트.
[17] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제,
(a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
(b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌 또는 히스티딘이고,
(c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
(d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 리신 또는 아르기닌이고,
(e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
(f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
(g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
(h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
(i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
(j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌인, 16에 기재된 키트.
[18] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 2개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 17에 기재된 키트.
[19] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 3개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 18에 기재된 키트.
[20] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 4개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 19에 기재된 키트.
[21] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 5개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 20에 기재된 키트.
[22] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 6개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기이고, 또한 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산(αF6P)에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는 아마도리아제인, 21에 기재된 키트.
[23] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속 또는 페니실리움(Penicillium) 속 유래인, 14 내지 22 중 어느 하나에 기재된 키트.
[24] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가,
(i) 서열 번호 141 또는 143에 나타내는 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 이루어진 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제, 또는
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 141 또는 143의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 141의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제인, 14 내지 23 중 어느 하나에 기재된 키트.
[25] 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가 추가로 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하의 아미노산,
(i) 262위의 아스파라긴,
(ii) 257위의 발린,
(iii) 249위의 글루타민산
(iv) 253위의 글루타민산,
(v) 337위의 글루타민,
(vi) 340위의 글루타민산,
(vii) 232위의 아스파라긴산,
(viii) 129위의 아스파라긴산,
(ix) 132위의 아스파라긴산,
(x) 133위의 글루타민산,
(xi) 44위의 글루타민산,
(xii) 256위의 글리신,
(xiii) 231위의 글루타민산 및
(xiv) 81위의 글루타민산
으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지며, 또한
경우에 따라 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실하고 있어도 되는, 16 내지 24 중 어느 하나에 기재된 키트.
[26] 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아마도리아제,
(i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이거나, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고, 또한 α-프럭토실헥사펩티드(αF6P)에 대한 활성을 가지는 아마도리아제,
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 68위 또는 356위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제,
(iii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이거나, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고, 또한 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제.
[27] 헤모글로빈 A1c가 변성한 헤모글로빈 A1c인, [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[28] 변성이 가열 처리, 계면활성제 처리, 산 혹은 염기 처리 또는 이들의 조합에 의한 것인, [27]에 기재된 방법.
본 명세서는 본원의 우선권 기초인 일본특허출원 2013-222774호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면 HbA1c를 신속, 간편하고 정밀도 높고 양호하게 정량할 수 있는 아마도리아제를 제공할 수 있다. 이러한 아마도리아제를 이용하면, 프로테아제 등을 처방하지 않고 HbA1c의 효소법에 따른 측정 방법, 측정 키트를 제공할 수 있다. 본 발명은 프로테아제 등을 처방할 필요가 없기 때문에 키트를 간소화할 수 있고 반응 효율이나 측정 정밀도를 높일 수 있고 나아가 프로테아제 등에 의한 다른 단백질 시약에의 바람직하지 않은 반응을 회피할 수 있다.
도 1은 각종 공지의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 동일성을 예시하는 첫번째 도면이다. Co(Coniochaeta sp.), Et(Eupenicillium terrenum), Py(Pyrenochaeta sp.), Ar(Arthrinium sp.), Cc(Curvularia clavata), Nv(Neocosmospora vasinfecta) 외에 Cn(Cryptococcus neoformans), Pn(Phaeosphaeria nodorum), An(Aspergillus nidulans), En(Emericella nidulans), Ul(Ulocladium sp.) 및 Pj(Penicillium janthinelum)를 얼라이먼트하였다.
도 2는 도 1의 연속이다.
도 3은 도 2의 연속이다.
도 4는 도 3의 연속이다.
도 5는 도 4의 연속이다.
도 6은 각종 공지의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 동일성 및 유사 아미노산을 예시하는 두번째 도면이다. Co, Et, Py, Ar, Cc, Nv 외에 Cn, Pn, An, En, Ul 및 Pj를 얼라이먼트하였다.
도 7은 도 6의 연속이다.
도 8은 도 7의 연속이다.
도 9는 도 8의 연속이다.
도 10은 도 9의 연속이다.
도 11은 개변형 아마도리아제를 사용하여 HbA1c를 측정한 경우의 시료 희석액(시약 A2)과 측정용 시약을 혼합하고 나서 경과 시간과 흡광도의 관계를 나타내는 도면이다. 300초가 경과한 시점에서 아마도리아제 용액이 첨가된다.
도 12는 HbA1c를 포함하는 시료를 n-도데실-β-D-말토시드 용액으로 희석하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 HbA1c를 포함하는 시료를 n-테트라데실-β-D-말토시드 용액으로 희석하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 개변형 아마도리아제를 사용하여 HbA1c를 측정한 경우의 시료 희석액(시약 D1)과 측정용 시약을 혼합하고 나서 경과 시간과 흡광도의 관계를 나타내는 도면이다. 300초가 경과한 시점에서 아마도리아제 용액이 첨가된다.
도 15는 HbA1c를 포함하는 시료를 염산을 포함하는 n-도데실-β-D-말토시드 용액(시약 D1)으로 희석하고 아마도리아제 25를 이용하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 HbA1c를 포함하는 시료를 염산을 포함하는 폴리옥시에틸렌(20) 세틸에테르 용액(시약 D2)으로 희석하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 HbA1c를 포함하는 시료를 염산을 포함하는 n-도데실-β-D-말토시드 용액(시약 D1)으로 희석하고 아마도리아제 28을 이용하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 개변형 아마도리아제를 사용하여 HbA1c를 측정한 경우의 시료 희석액(시약 G1)과 측정용 시약을 혼합하고 나서 경과 시간과 흡광도의 관계를 나타내는 도면이다. 300초가 경과한 시점에서 아마도리아제 용액이 첨가된다.
도 19는 HbA1c를 포함하는 시료를 테트라데실 트리메틸암모늄 브로마이드 용액(시약 G1)으로 희석하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 HbA1c를 포함하는 시료를 헥사데실 트리메틸암모늄 브로마이드 용액(시약 G2)으로 희석하여 HbA1c 측정을 행한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
(당화 단백질, 헤모글로빈 A1c)
본 발명에서의 당화 단백질이란 비효소적으로 당화된 단백질을 가리킨다. 당화 단백질은 생체 내외를 불문하고 존재하며, 생체 내에 존재하는 예로서는 혈액 중의 당화 헤모글로빈, 당화 알부민 등이 있고, 당화 헤모글로빈 중에서도 헤모글로빈의 β쇄 아미노 말단의 발린이 당화된 당화 헤모글로빈을 특히 헤모글로빈 A1c(HbA1c)라고 한다. 생체 밖에 존재하는 예로서는 단백질이나 펩티드와 당이 공존하는 액상 조미료 등의 음식품이나 수액 등이 있다.
(당화 펩티드, 프럭토실 펩티드)
본 발명에서의 당화 펩티드란 당화 단백질 유래의 비효소적으로 당화된 펩티드를 가리키고, 펩티드가 직접 비효소적으로 당화된 것이나 프로테아제 등에 의해 당화 단백질이 분해된 결과 발생한 것이나 당화 단백질을 구성하는 (폴리)펩티드가 당화된 것이 포함된다. 당화 펩티드를 프럭토실 펩티드라고 표기하는 경우도 있다. 당화 단백질에 있어서 당화를 받는 펩티드 측의 아미노기로서는 아미노 말단의 α-아미노기, 펩티드 내부의 리신 잔기 측쇄의 ε-아미노기 등을 들 수 있지만, 본 발명에서의 당화 펩티드란 보다 구체적으로 α-당화 펩티드(α-프럭토실 펩티드)이다. α-당화 펩티드는 N말단의 α-아미노산이 당화된 당화 단백질로부터 어떠한 수단, 예를 들어 프로테아제 등에 의한 한정 분해 등에 의해 유리시켜 형성된다. 예를 들어, 대상의 당화 단백질이 헤모글로빈 A1c(HbA1c)인 경우, 해당하는 α-당화 펩티드는 N말단이 당화되어 있는 HbA1c의 β쇄로부터 절단되는 당화된 펩티드를 가리킨다. 146잔기의 아미노산에 의해 구성되어 있는 HbA1c의 β쇄도 α-당화 펩티드에 해당한다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 HbA1c, 보다 구체적으로 HbA1c의 β쇄이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 HbA1c의 β쇄로부터 절단되는 αF6P이며, 구체적으로 α-프럭토실 발릴 히스티딜 로이실 트레오닐 프롤릴 글루타민산이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 αFVH(α-프럭토실 발릴 히스티딘) 또는 αFV(α-프럭토실 발린)이다.
(아마도리아제)
아마도리아제는 케토아민 옥시다아제, 프럭토실 아미노산 옥시다아제, 프럭토실 펩티드 옥시다아제, 프럭토실아민 옥시다아제라고도 하며, 산소의 존재 하에서 이미노이아세트산 혹은 그 유도체(아마도리 화합물)를 산화하여 글리옥실산 혹은 α-케토알데히드, 아미노산 혹은 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 말한다. 아마도리아제는 자연계에 널리 분포되어 있고, 미생물이나 동물 혹은 식물 기원의 효소를 탐색함으로써 얻을 수 있다. 미생물에 있어서 예를 들어 사상균, 효모 혹은 세균 등으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 아마도리아제는 HbA1c에 직접 작용한다. 본 명세서에서 아마도리아제가 HbA1c에 직접 작용한다는 것은 아마도리아제가 산소의 존재 하에서 HbA1c의 β쇄의 N말단의 프럭토실기에 작용하여 2-케토-D글루코오스 및 과산화수소, 헤모글로빈의 β쇄가 발생하는 것을 말한다. 단, 이는 상기 아마도리아제가 HbA1c의 β쇄 유래의 프럭토실 펩티드, 예를 들어 αF6P에 반응하는 것을 배제하는 것은 아니다. 즉, 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 HbA1c에 직접 작용할 뿐만 아니라 HbA1c의 β쇄 유래의 프럭토실 펩티드, 예를 들어 αF6P에 대해서도 반응성을 가진다.
(아마도리아제 개변체)
본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 54 또는 서열 번호 62 또는 서열 번호 89 또는 서열 번호 99에 나타내는 아미노산 서열을 가지는 야생형 아마도리아제에 기초하여 제작되는, αF6P에 대해 반응성을 가지며 HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제의 개변체를 제공한다. 본 명세서에서 개변체란 변이체와 교환 가능하게 이용되고, 아마도리아제의 아미노산 서열을 야생형 서열과 비교한 때에 일부 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 있는 것을 말한다. 여기서 말하는 부가에는 삽입도 포함되는 것으로 한다.
나아가 본 발명은 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123 또는 서열 번호 145 또는 서열 번호 149에 나타내는 아미노산 서열을 가지는 야생형 아마도리아제에 기초하여 αF6P에 대해 반응성을 가지며 HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제의 개변체를 제공한다.
또한, 본 발명의 지견에 기초하여 코니오카에타(Coniochaeta) 속 등에 유래하는 다른 야생형 아마도리아제에 기초하여 HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제의 개변체를 취득할 수 있다.
본 발명의 아마도리아제 개변체는 αF6P에 대해 반응성을 가지며 HbA1c에 직접 작용하는 한 효소의 다른 특성을 개변하는 변이를 더 가질 수 있다.
(Coniochaeta sp. NISL 9330 유래 아마도리아제에 기초하는 개변체)
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 가지는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제에 기초하여 제작된, HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제의 개변체이다.
서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155(단일 변이체), 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161 및 서열 번호 163(2중 변이체), 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173(3중 변이체), 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 175, 서열 번호 189(4중 변이체), 서열 번호 177, 서열 번호 179(5중 변이체), 서열 번호 143, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 187, 서열 번호 191(6중 변이체), 서열 번호 141 또는 서열 번호 185(7중 변이체)의 아미노산 서열과 높은 서열 동일성(예를 들어 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상)의 아미노산 서열을 가지며, 또한 αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제는 HbA1c에 직접 작용할 수 있다. 예를 들어 서열 번호 141의 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제는 αF6P에 대한 활성을 가지며 HbA1c에 직접 작용한다.
서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155(단일 변이체), 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161 및 서열 번호 163(2중 변이체), 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 165, 서열 번호 167, 서열 번호 169, 서열 번호 171, 서열 번호 173(3중 변이체), 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 175, 서열 번호 189(4중 변이체), 서열 번호 177, 서열 번호 179(5중 변이체), 서열 번호 143, 서열 번호 181, 서열 번호 183, 서열 번호 187, 서열 번호 191(6중 변이체), 서열 번호 141 또는 서열 번호 185(7중 변이체)의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 수개의 아미노산이 개변 혹은 변이 또는 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 가지며, 또한 αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제는 HbA1c에 직접 작용할 수 있다. 여기서 하나 또는 수개의 아미노산이란 전체길이가 400아미노산을 넘는 아미노산 서열에 대해 말하는 경우는 1~15개, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 보다 바람직하게는 1~4개, 보다 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산을 말한다. 또한, 하나 또는 수개의 아미노산이란 전체길이가 200~400아미노산의 서열에 대해 말하는 경우는 1~10개, 바람직하게는 1~7개, 바람직하게는 1~5개, 바람직하게는 1~4개, 보다 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산을 말한다. 하나 또는 수개의 아미노산이란 전체길이가 40아미노산 이상 200아미노산 미만의 서열에 대해 말하는 경우는 1~5개, 바람직하게는 1~4개, 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 하나 또는 2개의 아미노산을 말한다. 하나 또는 수개의 아미노산이란 전체길이가 40아미노산 미만의 서열에 대해 말하는 경우는 하나 또는 2개의 아미노산을 말한다.
또한, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156(단일 변이체), 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162 및 서열 번호 164(2중 변이체), 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 166, 서열 번호 168, 서열 번호 170, 서열 번호 172, 서열 번호 174(3중 변이체), 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 176, 서열 번호 190(4중 변이체), 서열 번호 178, 서열 번호 180(5중 변이체), 서열 번호 144, 서열 번호 182, 서열 번호 184, 서열 번호 188, 서열 번호 192(6중 변이체), 서열 번호 142 또는 서열 번호 186(7중 변이체)에 나타내는 염기 서열에 상보적인 서열과 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열에 의해 코드되고, 또한 αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제는 HbA1c에 직접 작용할 수 있다. 여기서 엄격한 조건 하에서의 하이브리다이제이션은 Sambrook 등 Molecular Cloning 제2판 (Cold Spring Harbor Laboratory press)나 Current protocols in molecular biology(Frederick M. Ausubel 등 편, 1987) 등에 기재되어 있다. 엄격한 조건으로서 예를 들어 하이브리다이제이션액(50% 포름아미드, 6~10×SSC(0.15~1.5M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0), 5×Denhardt 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10μg/ml의 변성 연어 정자 DNA, 50mM 인산 버퍼(pH7.5))을 이용하여 약 42℃~약 50℃에서 인큐베이트하고, 그 후 0.1×SSC, 0.1% SDS를 이용하여 약 65℃~약 70℃에서 세정하는 조건을 들 수 있다. 다른 엄격한 조건에 있어서 하이브리다이제이션액으로서 50% 포름아미드, 5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0), 1×Denhardt 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 황산, 10μg/ml의 변성 연어 정자 DNA, 50mM 인산 버퍼(pH7.5))를 이용하는 조건을 들 수 있다.
또, 본 발명의 변이체는 청구범위에 기재된 기질 특이성 및/또는 아미노산 서열에 관한 조건을 만족하는 한 예를 들어 유페니실리움 속, 피레노케타 속, 아르트리늄 속, 커벌라리아 속, 네오코스모스포라 속, 크립토코커스 속, 페오스페리아 속, 아스페르길루스 속, 에메리셀라 속, 울로클라디움 속, 페니실리움 속, 푸사리움 속, 아카에토미엘라 속, 아카에토미움 속, 티엘라비아 속, 카에토미움 속, 겔라시노스포라 속, 미크로아스커스 속, 렙토스페리아 속, 오피오볼러스 속, 플레오스포라 속, 코니오케티듐 속, 피치아 속, 코리네박테리움 속, 아그로박테리움 속 혹은 아스로박터 속과 같은 다른 생물종에 유래하는 아마도리아제에 기초하여 제작된 것으로도 된다.
Coniochaeta sp. NISL 9330 유래 아마도리아제(서열 번호 1)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다. 여기서, 아마도리아제 개변체에 관해 이용하는 하나 또는 복수의 아미노산 치환이란 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18의 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 말한다. 어떤 실시형태에서는 아마도리아제 개변체에 관해 이용하는 하나 또는 복수의 아미노산 치환은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환이다.
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 글루타민
(f) 113위의 알라닌
(g) 355위의 알라닌
(h) 419위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 356위의 알라닌
상기 Coniochaeta sp. NISL 9330 유래 아마도리아제(서열 번호 1)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘 또는 알라닌으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴산은 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환된다. 바람직하게는 (e) 110위의 글루타민은 류신 또는 티로신으로 치환된다. 바람직하게는 (f) 113위의 알라닌은 리신 또는 아르기닌으로 치환된다. 바람직하게는 (g) 355위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 419위의 알라닌은 리신으로 치환되어 있어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Phaeosphaeria nodorum 유래 아마도리아제(PnFX, 서열 번호 38)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 세린
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 리신
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 글리신
(f) 113위의 알라닌
(g) 351위의 알라닌
(h) 416위의 세린
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 352위의 알라닌
상기 Phaeosphaeria nodorum 유래 아마도리아제(서열 번호 38)에 있어서, 경우에 따라 (a) 62위의 세린은 치환되지 않아도 된다. 또한, (a) 62위의 세린은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 경우에 따라 (c) 102위의 리신은 치환되지 않아도 된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 글리신은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 알라닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 351위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 416위의 세린은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 352위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Neocosmospora vasinfecta 유래 아마도리아제(NvFX, 서열 번호 54)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 글리신
(e) 110위의 글루타민산
(f) 113위의 리신
(g) 355위의 세린
(h) 420위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 356위의 알라닌
상기 Neocosmospora vasinfecta 유래 아마도리아제(서열 번호 54)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 글리신은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 글루타민산은 류신으로 치환된다. 경우에 따라 113위의 리신은 치환되지 않아도 된다. 경우에 따라 355위의 세린은 치환되지 않아도 된다. 경우에 따라 (h) 420위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Aspergillus nidulans 유래 아마도리아제(AnFX, 서열 번호 62)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 61위의 아르기닌
(b) 62위의 류신
(c) 101위의 글루타민산
(d) 105위의 글리신
(e) 109위의 리신
(f) 112위의 세린
(g) 355위의 알라닌
(h) 420위의 알라닌
(i) 67위의 아스파라긴산
(j) 356위의 아스파라긴
상기 Aspergillus nidulans 유래 아마도리아제(서열 번호 62)에 있어서, 바람직하게는 (a) 61위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 62위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 101위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 105위의 글리신은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 109위의 리신은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 112위의 세린은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 355위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 420위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 67위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 아스파라긴은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Eupenicillium terrenum 유래 아마도리아제(서열 번호 40)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 아스파라긴
(e) 110위의 리신
(f) 113위의 트레오닌
(g) 355위의 알라닌
(h) 419위의 글리신
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 356위의 아스파라긴
상기 EFP-T5 유래 아마도리아제(서열 번호 40)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 리신은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 트레오닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 355위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 419위의 글리신은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 아스파라긴은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 또는 149)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 이소류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 세린
(e) 110위의 세린
(f) 113위의 알라닌
(g) 355위의 알라닌
(h) 420위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 356위의 아스파라긴
상기 Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(CnFX, 서열 번호 89 또는 149)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 이소류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 세린은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 세린은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 알라닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 355위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 420위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 아스파라긴은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 리신
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 알라닌
(f) 113위의 트레오닌
(g) 353위의 알라닌
(h) 418위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 354위의 알라닌
상기 Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 경우에 따라 (c) 102위의 리신은 치환되지 않아도 된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 알라닌은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 트레오닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 353위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 418위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 354위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 리신
(d) 106위의 알라닌
(e) 110위의 글루타민
(f) 113위의 트레오닌
(g) 356위의 알라닌
(h) 421위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 357위의 알라닌
상기 Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 경우에 따라 (c) 102위의 리신은 치환되지 않아도 된다. 바람직하게는 (d) 106위의 알라닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 글루타민은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 트레오닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 356위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 421위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 357위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 알라닌
(f) 113위의 알라닌
(g) 353위의 알라닌
(h) 418위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 354위의 알라닌
상기 Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌 또는 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 알라닌은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 알라닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 353위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 418위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 354위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117)와 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 케토아민 옥시다아제(Cc95FX, 서열 번호 99)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 알라닌
(f) 113위의 알라닌
(g) 353위의 알라닌
(h) 418위의 세린
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 354위의 알라닌
상기 Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117)와 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 케토아민 옥시다아제(서열 번호 99)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌 또는 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 알라닌은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 알라닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 353위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 418위의 세린은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 354위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 61위의 아르기닌
(b) 62위의 류신
(c) 101위의 글루타민산
(d) 105위의 리신
(e) 109위의 아르기닌
(f) 112위의 세린
(g) 355위의 알라닌
(h) 420위의 알라닌
(i) 67위의 아스파라긴산
(j) 356위의 아스파라긴
상기 Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에 있어서, 바람직하게는 (a) 61위의 아르기닌은 알라닌 또는 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 62위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 101위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 경우에 따라 (d) 105위의 리신은 치환되지 않아도 된다. 바람직하게는 109위의 아르기닌은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 112위의 세린은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 355위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 420위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 67위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 아스파라긴은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 리신
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 알라닌
(f) 113위의 알라닌
(g) 353위의 알라닌
(h) 418위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 354위의 알라닌
상기 Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌 또는 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 경우에 따라 (c) 102위의 리신은 치환되지 않아도 된다. 바람직하게는 (d) 106위의 아스파라긴산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 알라닌은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 알라닌은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 353위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 418위의 알라닌은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 354위의 알라닌은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에 기초하는 개변체는 이하의 위치에서 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 가지는 것일 수 있다:
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 세린
(e) 110위의 리신
(f) 113위의 아스파라긴산
(g) 355위의 알라닌
(h) 419위의 세린
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 356위의 아스파라긴
상기 Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에 있어서, 바람직하게는 (a) 62위의 아르기닌은 알라닌 또는 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로 치환될 수 있다. 바람직하게는 (b) 63위의 류신은 히스티딘으로 치환된다. 바람직하게는 (c) 102위의 글루타민산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 (d) 106위의 세린은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 110위의 리신은 류신으로 치환된다. 바람직하게는 113위의 아스파라긴산은 리신으로 치환된다. 바람직하게는 355위의 알라닌은 세린으로 치환된다. 경우에 따라 (h) 419위의 세린은 리신으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다. 경우에 따라 (j) 356위의 아스파라긴은 트레오닌으로 치환되어도 된다. Penicillium chrysogenum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에 대해서도 동일하다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제는 바람직하게는
기질로서 헤모글로빈 A1c의 β쇄를 인식하고,
작용으로서 헤모글로빈 A1c의 β쇄를 산화하여 과산화수소를 생성하며,
지적 pH 범위를 pH 6~8의 범위에 가지고,
작용 pH 범위를 pH 5~9의 범위에 가지며,
작용 온도가 25~40℃이고,
SDS-PAGE 상에서의 분자량이 약 45~55KDa, 예를 들어 약 48~50KDa인 것일 수 있다.
본 발명의 아마도리아제 변이체 또는 개변체에서는 HbA1c에 대한 활성을 전혀 나타내지 않는 아마도리아제는 제외하는 것으로 한다.
(아마도리아제를 코드하는 유전자의 취득)
이들 아마도리아제를 코드하는 유전자(이하, 단지 「아마도리아제 유전자」라고도 함)를 얻으려면 통상 일반적으로 이용되고 있는 유전자의 클로닝 방법이 이용된다. 예를 들어, 아마도리아제 생산능을 가지는 미생물 균체나 여러 가지 세포로부터 통상의 방법 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 1989)에 기재된 방법에 의해 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 나아가 mRNA를 주형으로 하고 cDNA를 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 염색체 DNA 또는 cDNA를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.
다음으로 상기 아마도리아제의 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프로브 DNA를 합성하고, 이를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 아마도리아제 유전자를 선발하는 방법, 혹은 상기 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프라이머 DNA를 제작하여 5'RACE법이나 3'RACE법 등의 적당한 폴리메라아제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR법)에 의해 아마도리아제를 코드하는 목적의 유전자 단편을 포함하는 DNA를 증폭시키고, 이들 DNA 단편을 연결시켜 목적의 아마도리아제 유전자의 전체길이를 포함하는 DNA를 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 아마도리아제를 코드하는 유전자의 바람직한 일례로서 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제 유전자(일본공개특허 2003-235585호 공보)를 들 수 있다.
또한, 다른 바람직한 예로서 Phaeosphaeria 속 유래의 아마도리아제 유전자, Neocosmospora 속 유래의 아마도리아제 유전자, Aspergillus 속 유래의 아마도리아제 유전자, Cryptococcus 속 유래의 아마도리아제 유전자, Curvularia 속 유래의 아마도리아제 유전자 및 Eupenicillium 속 유래의 아마도리아제 유전자를 들 수 있다.
이들 아마도리아제 유전자는 통상의 방법과 같이 각종 벡터에 연결되어 있는 것이 취급상 바람직하다. 예를 들어, Coniochaeta sp. NISL 9330주 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7(국제공개 제2007/125779호)로부터 GenElute Plasmid Miniprep Kit(Sigma-Alcrich사 제품)를 이용함으로써 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7를 추출, 정제하여 얻을 수 있다. 다른 생물 유래의 아마도리아제 유전자에 대해서도 당업자라면 관용법에 의해 동일한 순서로 DNA를 취득할 수 있다. 구체적으로 Eupenicillium terrenum ATCC 18547주 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5(국제공개 제2007/125779호)를 보유하는 대장균을 배양하고 GenElute Plasmid Miniprep Kit를 이용함으로써 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5를 세포로부터 추출, 정제하여 얻을 수 있다. 또한, Aspergillus nidulans FGSC A26주 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX(국제공개 제2012/018094호)를 보유하는 대장균을 배양하고 GenElute Plasmid Miniprep Kit를 이용함으로써 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX를 추출, 정제하여 얻을 수 있다. 또한, Cryptococcus neoformans 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pET22b-CnFX(국제공개 제2012/018094호)를 보유하는 대장균을 배양하고 GenElute Plasmid Miniprep Kit를 이용함으로써 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pET22b-CnFX를 추출, 정제하여 얻을 수 있다. 또한, Neocosmospora vasinfecta 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pET22b-NvFX(국제공개 제2012/018094호)를 보유하는 대장균을 배양하고 GenElute Plasmid Miniprep Kit를 이용함으로써 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합체 플라스미드 pET22b-NvFX를 추출, 정제하여 얻을 수 있다.
(벡터)
본 발명에서 이용할 수 있는 벡터로서는 상기 플라스미드에 한정되지 않고, 그 이외의 예를 들어 박테리오파지, 코스미드 등의 당업자에게 공지의 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 구체적으로 예를 들어 pBluescriptII SK+(Stratagene사 제품) 등이 바람직하다.
(아마도리아제 유전자의 변이 처리)
아마도리아제 유전자의 변이 처리는 기도하는 변이 형태에 따른 공지의 임의의 방법으로 행할 수 있다. 즉, 아마도리아제 유전자 혹은 그 유전자가 도입된 재조합체 DNA와 변이원이 되는 약제를 접촉·작용시키는 방법; 자외선 조사법; 유전자 공학적 수법; 또는 단백질 공학적 수법을 구사하는 방법 등을 널리 이용할 수 있다.
상기 변이 처리에 이용되는 변이원이 되는 약제로서는 예를 들어 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 아질산, 아황산, 히드라진, 포름산 혹은 5-브로모우라실 등을 들 수 있다.
이 접촉·작용의 여러 가지 조건은 이용하는 약제의 종류 등에 따른 조건을 채용하는 것이 가능하고, 현실에 원하는 변이를 아마도리아제 유전자에서 야기할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 통상 바람직하게는 0.5~12M의 상기 약제 농도에서 20~80℃의 반응 온도 하에서 10분간 이상, 바람직하게는 10~180분간 접촉·작용시킴으로써 원하는 변이를 야기 가능하다. 자외선 조사를 행하는 경우에도 상기와 같이 통상의 방법에 따라 행할 수 있다(현대화학, 024~30, 1989년 6월호).
단백질 공학적 수법을 구사하는 방법으로서는 일반적으로 Site-Specific Mutagenesis로서 알려진 수법을 이용할 수 있다. 예를 들어, Kramer법(Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)), Eckstein법(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)), Kunkel법(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488 (1985): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)) 등을 들 수 있다.
또한, 일반적인 PCR법으로서 알려진 수법을 이용할 수도 있다(Technique, 1, 11(1989) 참조). 또, 상기 유전자 개변법 외에 유기 합성법 또는 효소 합성법에 의해 직접 원하는 개변 아마도리아제 유전자를 합성할 수도 있다.
상기 방법에 의해 얻어지는 아마도리아제 유전자의 DNA 염기 서열의 결정 혹은 확인을 행하는 경우에는 예를 들어 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사 제품) 등을 이용함으로써 행할 수 있다.
(형질 전환·형질 도입)
상술한 바와 같이 얻어진 아마도리아제 유전자를 통상의 방법에 의해 박테리오파지, 코스미드 또는 원핵 세포 혹은 진핵 세포의 형질 전환에 이용되는 플라스미드 등의 벡터에 도입하고, 각각의 벡터에 대응하는 숙주를 통상의 방법에 의해 형질 전환 또는 형질 도입을 할 수 있다. 예를 들어, 숙주로서 에세리키아 속에 속하는 미생물, 예를 들어 얻어진 재조합체 DNA를 이용하여 예를 들어 대장균 K-12주, 바람직하게는 대장균 JM109주, 대장균 DH5α주(모두 다카라 바이오사 제품) 등을 형질 전환 또는 이들에 형질 도입하여 각각의 균주를 얻는다.
(아미노산 서열의 상동성, 동일성 또는 유사성)
아미노산 서열의 상동성, 동일성 또는 유사성은 GENETYX(GENETYX사 제품)의 맥시멈 매칭이나 서치 호몰로지 등의 프로그램 또는 DNASIS Pro(히타치 솔루션즈사 제품)의 맥시멈 매칭이나 멀티플 얼라이먼트 또는 CLUSTAL W의 멀티플 얼라이먼트 등의 프로그램에 의해 계산할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 계산하기 위해 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 그 2개 이상의 아마도리아제에서 동일한 아미노산의 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 동일 영역을 결정할 수 있다. 여기서 2개 이상의 아미노산 서열에 대해 동일성%란 Blosum62 등의 알고리즘을 이용하여 2개 이상의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 행하였을 때에 얼라인먼트 가능하였던 영역의 총 아미노산 수를 분모로 하고, 그 중 동일한 아미노산에 의해 차지하는 위치의 수를 분자로 하였을 때의 퍼센티지를 말한다. 따라서, 통상 2개 이상의 아미노산 서열에 동일성이 전혀 보이지 않는 영역이 있는 경우, 예를 들어 C말단에 동일성이 전혀 보이지 않는 부가 서열이 한쪽의 아미노산 서열에 있는 경우, 그 동일성이 없는 영역은 얼라인먼트 불가능하기 때문에 동일성%의 산출에는 이용되지 않는다.
또한, 2개 이상의 아마도리아제에서 유사한 아미노산의 위치를 조사할 수도 있다. 예를 들어 CLUSTALW를 이용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라이먼트할 수 있고, 이 경우 알고리즘으로서 Blosum62를 사용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라이먼트하였을 때에 유사(similar)하다고 판단되는 아미노산을 유사 아미노산이라고 부르는 경우가 있다. 본 발명의 변이체에 있어서, 아미노산 치환은 이러한 유사 아미노산 사이의 치환에 의한 것일 수 있다. 이러한 얼라이먼트에 의해 복수의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 동일한 영역 및 유사 아미노산에 의해 차지하는 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 상동성 영역(보존 영역)을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 「상동성 영역」이란 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 어떤 기준이 되는 아마도리아제와 비교 대상의 아마도리아제의 대응하는 위치에서의 아미노산이 동일하거나 유사 아미노산으로 이루어지는 영역으로서, 연속되는 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지는 영역을 말한다. 예를 들어, 도 1~도 5에서는 전체길이 아미노산 서열의 서열 동일성이 74% 이상인 아마도리아제를 얼라이먼트하였다. 이 중, 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제10위~32위는 동일 또는 유사 아미노산으로 이루어지고, 따라서 상동성 영역에 해당한다. 마찬가지로 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위는 상동성 영역에 해당할 수 있다.
바람직하게는 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11위~32위, 36~41위, 50~52위, 54~58위, 84~86위, 88~90위, 145~150위, 157~168위, 202~205위, 207~212위, 215~225위, 236~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 347~354위, 357~363위, 370~383위, 385~387위 및 405~410위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
더욱 바람직하게는 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11~18위, 20~32위, 50~52위, 54~58위, 266~268위, 270~273위, 277~286위 및 370~383위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 아마도리아제 변이체는 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제와 얼라이먼트하였을 때에 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 전체길이 아미노산 서열 동일성을 가지며, αF6P에 대해 높은 반응성을 가진다. 나아가 본 발명의 아마도리아제 변이체의 상동성 영역에서의 아미노산 서열은 서열 번호 1에서의 상동성 영역의 아미노산 서열과 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95%, 바람직하게는 98%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가진다.
어떤 실시형태에 있어서, 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 141의 아마도리아제를 기준으로 하여 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, 바람직하게는 제11위~32위, 36~41위, 50~52위, 54~58위, 84~86위, 88~90위, 145~150위, 157~168위, 202~205위, 207~212위, 215~225위, 236~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 347~354위, 357~363위, 370~383위, 385~387위 및 405~410위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, 더욱 바람직하게는 제11~18위, 20~32위, 50~52위, 54~58위, 266~268위, 270~273위, 277~286위 및 370~383위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는
(i) 서열 번호 141에 나타내는 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 이루어진 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제이거나 또는
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 141의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 141의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제이다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 상기 (ii)에 규정되는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제이다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 상기에 더하여 또는 상기와는 독립적으로 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하의 아미노산,
(i) 68위의 아스파라긴산 및
(ii) 356위의 알라닌
으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가진다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 상기에 더하여 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하의 아미노산,
(i) 262위의 아스파라긴,
(ii) 257위의 발린,
(iii) 249위의 글루타민산
(iv) 253위의 글루타민산,
(v) 337위의 글루타민,
(vi) 340위의 글루타민산,
(vii) 232위의 아스파라긴산,
(viii) 129위의 아스파라긴산,
(ix) 132위의 아스파라긴산,
(x) 133위의 글루타민산,
(xi) 44위의 글루타민산,
(xii) 256위의 글리신,
(xiii) 231위의 글루타민산 및
(xiv) 81위의 글루타민산
으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가진다. 추가적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 상기에 더하여 경우에 따라 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실하고 있어도 된다.
(아미노산에 대응하는 위치의 특정)
본 발명에 있어서, 어떤 기초가 되는 아미노산 서열 중의 특정 위치의 아미노산이 다른 유사한 아미노산 서열 중의 특정 위치의 아미노산과 대응하는 경우 이를 대응하는 아미노산이라고 하고, 그 아미노산의 위치를 대응하는 위치 또는 상당하는 위치라고 한다. 또한, 「아미노산의 위치에 대응하는 위치」를 특정하는 방법으로서는 예를 들어 리프만 피어슨법 등의 공지의 알고리즘을 이용하여 아미노산 서열을 비교하고, 각 아마도리아제의 아미노산 서열 중에 존재하는 저장 아미노산 잔기에 최대의 동일성을 부여함으로써 행하는 방법을 들 수 있다. 아마도리아제의 아미노산 서열을 이러한 방법으로 정렬시킴으로써, 아미노산 서열 중에 있는 삽입, 결실에 관계없이 상동 아미노산 잔기의 각 아마도리아제 서열에서의 서열 중의 위치를 결정하는 것이 가능하다. 상동 위치는 3차원 구조 중에서 같은 위치에 존재한다고 생각되며, 대상이 되는 아마도리아제의 특이적 기능에 관해 유사한 효과를 가지는 것을 추정할 수 있다.
또, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 62위의 아르기닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해, 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 62위의 아르기닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)에서는 62위의 세린, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 61위의 아르기닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 61위의 아르기닌이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 63위의 류신에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 63위의 류신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 63위의 류신에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 63위의 류신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149)에서는 63위의 이소류신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 62위의 류신이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 102위의 글루타민산에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 102위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해, 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 102위의 글루타민산에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 102위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 102위의 리신, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119), Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 101위의 글루타민산이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 106위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해, 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145)에서는 106위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 106위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에서는 106위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54)에서는 106위의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 106위의 세린, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 105위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 105위의 글리신이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 110위의 글루타민에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 110위의 글루타민에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해, 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 110위의 글루타민에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 110위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 110위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에서는 110위의 글루타민, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54)에서는 110위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149)에서는 110위의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)에서는 110위의 글리신, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 109위의 아르기닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 109위의 리신이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 113위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 113위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 113위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에서는 113위의 트레오닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 113위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54)에서는 113위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 112위의 세린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 113위의 아스파라긴산이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 355위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 355위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 355위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 355위의 알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 353위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에서는 356위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54)에서는 355위의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)에서는 351위의 알라닌이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 419위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 419위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 419위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145)에서는 419위의 글리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 418위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에서는 421위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 420위의 알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)에서는 416위의 세린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 419위의 세린, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 420위의 알라닌이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 68위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121), Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 68위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119) 및 Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 67위의 아스파라긴산이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 356위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 356위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 356위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 40 및 145)에서는 356위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 113)에서는 354위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 115)에서는 357위의 알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 117)에서는 354위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 54)에서는 356위의 알라닌, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 89 및 149)에서는 356위의 아스파라긴, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)에서는 352위의 알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 62 및 147)에서는 356위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 119)에서는 356위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 121)에서는 354위의 알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 123)에서는 356위의 아스파라긴이다.
본 발명의 아마도리아제 변이체는 단일 변이체이어도 되지만, 2개 이상의 아미노산 치환을 가지는 다중 변이체이어도 된다. 본 발명자들은 서열 번호 1의 아미노산 서열에서의 제62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위 및 355위에 대응하는 위치의 아미노산을 치환한 아마도리아제가 놀랍게도 HbA1c에 대한 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 나아가 본 발명자들은 서열 번호 1의 아미노산 서열에서의 제68위 및 356위에 대응하는 위치의 아미노산을 치환한 아마도리아제가 놀랍게도 αF6P에 대한 활성이 증대하는 것을 발견하였다.
본 명세서에서는 이들 위치(62/63/102/106/110/113/355/419 및 68/356)의 변이를 아마도리아제의 기질 특이성을 변화시키는 변이 또는 아마도리아제의 기질 특이성을 변화시키는 아미노산 치환이라고 부르는 경우가 있다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 αF6P에 대한 비활성(U/mg)이 0.1U/mg 이상, 0.2U/mg 이상, 0.3U/mg 이상, 0.4U/mg 이상, 0.5U/mg 이상, 0.6U/mg 이상, 0.7U/mg 이상, 0.8U/mg 이상, 0.9U/mg 이상, 예를 들어 1U/mg 이상이다. 이 아마도리아제는 기질 특이성을 변화시키는 아미노산 치환을 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 가질 수 있다. 이러한 본 발명의 아마도리아제는 HbA1c에 직접 작용하여 본 발명의 HbA1c 측정 방법에 이용할 수 있다.
어떤 실시형태에 있어서, αF6P에 대한 비활성(U/mg)이 0.1U/mg 이상인 본 발명의 아마도리아제는 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에
(a) 서열 번호 1의 62위의 아르기닌,
(b) 서열 번호 1의 63위의 류신,
(c) 서열 번호 1의 102위의 글루타민산,
(d) 서열 번호 1의 106위의 아스파라긴산,
(e) 서열 번호 1의 110위의 글루타민,
(f) 서열 번호 1의 113위의 알라닌,
(g) 서열 번호 1의 355위의 알라닌,
(h) 서열 번호 1의 419위의 알라닌,
(i) 서열 번호 1의 68위의 아스파라긴산 및
(j) 서열 번호 1의 356위의 알라닌
으로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 하나 또는 그 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 예를 들어 10개 치환된 것일 수 있다. 또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)에서는 62위의 세린이다. 이는 서열 번호 1의 아미노산 서열에서 보면 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이 된, 즉 세린으로 치환된 것과 동등하다. 따라서, 천연 아마도리아제로서 Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 38)와 같은 서열 번호 1의 아미노산 서열 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산이 세린인 아마도리아제도 편의상 본 명세서에서는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 (a) 서열 번호 1의 62위의 아르기닌에 대응하는 위치에 아미노산 치환을 가지는 아마도리아제에 포함하는 것으로 한다.
어떤 실시형태에 있어서, αF6P에 대한 비활성(U/mg)이 0.1U/mg 이상인 본 발명의 아마도리아제는 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 위치의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산의 하나 또는 그 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 예를 들어 10개가 이하의 각각에 기재되는 아미노산 잔기일 수 있다:
(a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
(b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌 또는 히스티딘이고,
(c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
(d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 리신 또는 아르기닌이고,
(e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
(f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
(g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
(h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
(i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
(j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이다.
(예비적인 치환에 대해)
아마도리아제는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 제60위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린인 경우 이를 글리신으로 치환함으로써, 치환 전에 αFVH 활성을 나타내지 않았던 효소가 치환 후에 αFVH 활성을 나타내게 되는 것이 보고되어 있다(일본공개특허 2010-35469호 공보, 국제공개 제2012/018094호 참조). 따라서, 본 발명에 이용하는 아마도리아제의 서열 번호 1의 제60위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린인 경우, 이를 미리 글리신으로 치환해 둘 수도 있다. 혹은 야생형에서 서열 번호 1의 60위에 대응하는 위치가 글리신인 아마도리아제를 이용하여 상기 서열 번호 1의 제62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위 및 419위에 대응하는 위치와 68위 및 356위에 변이를 도입해도 된다. 본 발명의 아마도리아제 변이체는 특별히 언급하지 않는 한 서열 번호 1의 제60위에 대응하는 위치의 아미노산이 글리신인 것을 포함한다. 예를 들어, Aspergillus nidulans 유래 아마도리아제는 서열 번호 1의 60위에 대응하는 서열 번호 147 중의 제59위의 아미노산이 야생형에서는 세린이지만, 이를 글리신으로 치환한 것(서열 번호 62)을 본 발명의 변이체를 위한 기가 되는 아마도리아제로서 이용해도 된다. Penicillium janthinellum(Pj) 유래 아마도리아제(서열 번호 123)에 대해서도 동일하다.
(추가적인 예비적인 치환에 대해-계면활성제 내성을 향상시키는 변이)
본 발명자들은 아마도리아제의 아미노산 잔기를 치환함으로써 그 계면활성제에 대한 내성을 향상시킬 수 있는 것을 확인하였다. 본 발명의 아마도리아제는 경우에 따라 추가로 이러한 아미노산 치환을 가질 수 있다.
계면활성제 내성의 향상을 가져오는 아미노산의 치환으로서 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하의 위치의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다.
(1) 262위의 아스파라긴의 치환, 예를 들어 히스티딘으로의 치환.
(2) 257위의 발린의 치환, 예를 들어 시스테인, 세린, 트레오닌으로의 치환.
(3) 249위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(4) 253위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(5) 337위의 글루타민의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(6) 340위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 프롤린으로의 치환.
(7) 232위의 아스파라긴산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(8) 129위의 아스파라긴산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(9) 132위의 아스파라긴산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(10) 133위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로의 치환.
(11) 44위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 프롤린으로의 치환.
(12) 256위의 글리신의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(13) 231위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
(14) 81위의 글루타민산의 치환, 예를 들어 리신, 아르기닌으로의 치환.
계면활성제 내성이 향상된 아마도리아제의 변이체는 상기 아미노산 치환을 적어도 하나 가지고 있으면 되고, 복수의 아미노산 치환을 가지고 있어도 된다. 예를 들어, 상기 아미노산 치환의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14를 가질 수 있다.
또, 본 명세서에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 44위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 44위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해, 상기 「상당하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 44위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 44위의 류신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 43위의 프롤린, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 43위의 프롤린, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 44위의 프롤린이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 81위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 81위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 81위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 히스티딘, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 아스파라긴, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 81위의 아스파라긴, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 80위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 80위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 81위의 아스파라긴이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 133위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 133위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 133위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 알라닌, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 133위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 131위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 132위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 133위의 리신, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 133위의 아스파라긴산이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 253위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 253위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 253위의 알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 251위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 253위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 251위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 253위의 발린, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 253위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 249위의 아르기닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 253위의 알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 253위의 알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 251위의 글루타민산, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 253위의 글루타민이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 256위의 글리신에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 256위의 글리신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 256위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 254위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 256위의 글리신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 254위의 아스파라긴, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 256위의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 256위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 252위의 아스파라긴, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 256위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 256위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 254위의 아스파라긴, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 256위의 아스파라긴산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 257위의 발린에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 257위의 발린에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 257위의 발린, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 255위의 트레오닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 257위의 시스테인, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 255위의 발린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 257위의 시스테인, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 257위의 시스테인, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 253위의 세린, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 257위의 트레오닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 257위의 트레오닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 255위의 발린, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 257위의 발린이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 262위의 아스파라긴에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 262위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 260위의 아스파라긴, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 262위의 히스티딘, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 260위의 아스파라긴, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 262위의 히스티딘, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 258위의 아스파라긴, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 260위의 아스파라긴, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 337위의 글루타민에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 337위의 글루타민에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 337위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 335위의 리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 338위의 글루타민, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 335위의 트레오닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 337위의 리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 337위의 리신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 333위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 337위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 337위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 335위의 트레오닌, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 337위의 리신이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 340위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 340위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 340위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 338위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 341위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 338위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 340위의 프롤린, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 336위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 338위의 글루타민산, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 129위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 129위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 129위의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 127위의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 128위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 128위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 129위의 글루타민산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 132위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 132위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 130위의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 131위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 131위의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 231위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정한 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 231위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 231위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 229위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 229위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 227위의 히스티딘, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 229위의 글루타민, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 232위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 232위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 230위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 230위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 232위의 글리신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 228위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 230위의 아스파라긴산, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 232위의 아스파라긴산이다.
나아가 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 249위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 249위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 249위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 247위의 리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 249위의 히스티딘, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 247위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 249위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 249위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 245위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 249위의 알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 249위의 알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 247위의 세린, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 249위의 글루타민이다.
본 명세서에서는 이들 위치(44위/133위/253위/257위/262위/337위/340위 및 249위/232위/129위/132위/256위/231위/81위)의 변이를 아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 변이 또는 아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 아미노산 치환이라고 부르는 경우가 있다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 기질 특이성을 변화시키는 변이에 더하여 계면활성제 내성을 향상시키는 변이를 가질 수 있다.
(추가적인 예비적인 결실에 대해-카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기의 결실)
본 발명자들은 이전에 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실시킴으로써 그 열 안정성을 향상시킬 수 있는 것을 보고하였다(국제공개 제2013/100006호 명세서를 참조. 참조에 의해 그 전체 내용을 본 명세서에 도입한다). 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 상기 치환에 더하여 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 더 결실하고 있어도 된다.
(카르복실 말단의 결실 개소에 대응하는 위치)
「서열 번호 1에 기재된 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」란 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 의미한다. Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에서 이 위치의 3잔기의 서열은 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신으로 이루어지고, 이들에 대응하는 위치의 아미노산 서열도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 히스티딘 및 437위의 류신으로 이루어지고, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 438위의 알라닌, 439위의 리신 및 440위의 류신으로 이루어지고, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 450위의 히스티딘, 451위의 리신 및 452위의 류신으로 이루어지고, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 438위의 세린, 439위의 리신 및 440위의 류신으로 이루어지고, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 아스파라긴 및 437위의 류신으로 이루어지고, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 436위의 알라닌, 437위의 리신 및 438위의 메티오닌으로 이루어지고, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 436위의 알라닌, 437위의 리신 및 438위의 메티오닌으로 이루어지고, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 439위의 알라닌, 440위의 리신 및 441위의 류신으로 이루어지고, Penicillium janthinelum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 리신 및 437위의 류신으로 이루어진다.
본 명세서에서는 아마도리아제에 관한 이들 카르복실 말단 아미노산 잔기의 결실을 아마도리아제의 열 안정성을 향상시키는 결실이라고 부르는 경우가 있다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 기질 특이성을 변화시키는 변이, 계면활성제 내성을 향상시키는 변이에 더하여 열 안정성을 향상시키는 결실을 가질 수 있다.
(아마도리아제의 생산)
상기와 같이 하여 얻어진 아마도리아제의 생산능을 가지는 균주를 이용하여 그 아마도리아제를 생산하려면 이 균주를 통상의 고체 배양법으로 배양해도 되지만, 액체 배양법을 채용하여 배양하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명은 아마도리아제의 생산능을 가지는 균주를 아마도리아제 단백질을 발현할 수 있는 조건 하에서 배양하는 공정 및 배양물 또는 배양액으로부터 아마도리아제를 단리하는 공정을 포함하는 아마도리아제의 제조 방법을 제공한다. 이 방법에는 본 발명의 아마도리아제를 코드하는 유전자를 도입한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 이용할 수 있다. 여기서 아마도리아제 단백질을 발현할 수 있는 조건이란 아마도리아제 유전자가 전사, 번역되고, 그 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드가 생산되는 것을 말한다.
또한, 상기 균주를 배양하는 배지로서는 예를 들어 효모 엑기스, 트립톤, 펩톤, 고기 엑기스, 옥수수 침지액 혹은 대두 또는 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에 염화 나트륨, 인산 2수소 칼륨, 인산 수소 2칼륨, 황산 마그네슘, 염화 마그네슘, 염화 제2철, 황산 제2철 혹은 황산 망간 등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고, 나아가 필요에 따라 당질 원료, 비타민 등을 적절히 첨가한 것이 이용된다.
또한, 배지에 상기 아마도리아제가 작용할 수 있는 기질이나 그 유사 화합물, 예를 들어 당화 아미노산, 당화 펩티드류, 당화 단백질 분해물 혹은 당화 헤모글로빈이나 당화 알부민 등의 당화 단백질을 첨가함으로써 목적하는 효소의 제조량을 향상시킬 수 있다.
배지의 초기 pH는 pH 7~9로 조정하는 것이 적당하다. 배양은 20~42℃의 배양 온도, 바람직하게는 25~37℃ 전후의 배양 온도로 4~24시간, 더욱 바람직하게는 25~37℃ 전후의 배양 온도로 8~16시간, 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 실시하는 것이 바람직하다.
배양 종료 후 그 배양물로부터 아마도리아제를 채취하려면 통상의 효소 채취 수단을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 통상의 방법에 의해 균체를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나 리소자임 등의 용균 효소를 이용하여 본 효소를 추출하거나 톨루엔 등의 존재 하에서 진탕 혹은 방치하여 용균을 행하게 하여 본 효소를 균체 밖으로 배출시킬 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심분리하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염, 프로타민 황산염 혹은 황산 망간 등에 의해 핵산을 제거한 후, 이에 황안, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고 침전물을 채취하여 아마도리아제의 조효소를 얻는다.
상기 아마도리아제의 조효소로부터 아마도리아제 정제 효소 표품을 얻으려면, 예를 들어 세파덱스, 슈퍼덱스 혹은 울트로겔 등을 이용하는 겔 여과법, 이온 교환성 담체, 소수성 담체, 히드록시 아파타이트를 이용하는 흡착 용출법, 폴리아크릴아미드겔 등을 이용하는 전기 영동법, 자당 밀도 기울기 원심법 등의 침강법, 어피니티 크로마토그래피법, 분자체막 혹은 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나 이들을 조합하여 실시함으로써 정제된 아마도리아제 효소 표품을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 원하는 아마도리아제를 얻을 수 있다.
(본 발명의 아마도리아제의 HbA1c에 대한 반응성)
상기와 같은 수단으로 얻어지는 아마도리아제는 유전자 개변 등에 의해 그 아미노산 서열에 변이를 일으킨 결과 HbA1c에 직접 작용할 수 있다.
또한, 본 발명의 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 αF6P에 대한 반응성이 향상되어 있어도 된다. 구체적으로 개변 전의 것과 비교하여 「αFVH에 대한 반응성」을 1로 하였을 때의 「αF6P에 대한 반응성」의 비율이 증대되어 있어도 된다.
예를 들어 본 발명의 아마도리아제에서의 αFVH에 대한 반응성을 1로 하였을 때의 αF6P에 대한 반응성의 비율을 나타내는 αF6P/αFVH는 개변 전에 대해 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상 향상되어 있어도 된다.
또한, 본 발명의 아마도리아제에서의 αFV에 대한 반응성을 1로 하였을 때의 αF6P에 대한 반응성의 비율을 나타내는 αF6P/αFV는 개변 전에 대해 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상 향상되어 있어도 된다. 또, 「αFV에 대한 반응성」은 「αFV 산화 활성」이라고 표기하는 경우도 있다.
HbA1c에 직접 작용하는 본 발명의 아마도리아제의 일례로서는 예를 들어 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H35)주에 의해 생산되는 아마도리아제를 들 수 있다. 이러한 아마도리아제는 프로테아제 등으로 HbA1c를 처리하지 않고도 HbA1c에 직접 작용하기 때문에 시료 중의 HbA1c를 직접 측정하는 효소 측정계의 실현을 가능하게 하여 산업 이용상 매우 유리하다.
(아마도리아제 활성의 측정 방법)
아마도리아제 활성의 측정 방법으로서는 여러 가지 방법을 이용할 수 있지만, 일례로서 이하에 본 발명에서 이용하는 아마도리아제 활성의 측정 방법에 대해 설명한다.
본 발명에서의 아마도리아제의 효소 활성의 측정 방법으로서는 효소의 반응에 의해 생성하는 과산화수소량을 측정하는 방법이나 효소 반응에 의해 소비하는 산소량을 측정하는 방법 등을 주요 측정 방법으로서 들 수 있다. 이하에 일례로서 과산화수소량을 측정하는 방법에 대해 나타낸다.
본 발명에서의 아마도리아제의 활성 측정에는 언급이 없는 한 αFV 혹은 αFVH 또는 αF6P를 기질로서 이용한다. 또, 효소력가는 αFV 혹은 αFVH 또는 αF6P를 기질로서 측정하였을 때 1분간 1μmol의 과산화수소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다.
또한, 비활성(U/mg)은 효소 1mg당 효소력가(U)이다. 예를 들어 어떤 효소의 αF6P에 대한 비활성이 0.1U/mg이면, 효소량을 10배로 함으로써 비활성이 1U/mg인 효소와 동일한 효소력가를 얻을 수 있게 된다.
본 명세서에서 아마도리아제에 대해 「αF6P에 대해 반응성을 가지며」라고 하는 경우, 특별히 언급하지 않는 한 이는 αF6P에 대한 비활성(U/mg)이 0.1U/mg 이상, 0.2U/mg 이상, 0.3U/mg 이상, 0.4U/mg 이상, 0.5U/mg 이상, 0.6U/mg 이상, 0.7U/mg 이상, 0.8U/mg 이상, 0.9U/mg 이상, 예를 들어 1U/mg 이상인 태양을 포함하는 것으로 한다. αFV, αFVH 등의 당화 펩티드는 예를 들어 사카우에 등의 방법에 기초하여 합성, 정제한 것을 이용할 수 있다(일본공개특허 2001-95598호 공보 참조). 예를 들어 당화 헤모글로빈(HbA1c)을 엔도프로테이나제 Glu-C로 처리함으로써, 당화 헤모글로빈(HbA1c)의 β쇄 서브유닛 유래의 α-당화 헥사펩티드(프럭토실 Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)가 유리한다(Clin.Chem., 43, 1994-1951(1997)). 이를 αF6P 기질로서 사용할 수 있다. 또한, 이 α-당화 헥사펩티드와 동일 물질인 합성 기질 프럭토실 Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu(펩티드 연구소 제품)를 이용할 수도 있다.
A: 시약의 조제
(아마도리아제의 αF6P, αFVH 또는 αFV에 대한 활성의 측정용 시약의 조제예)
(시약 1): 5U/ml 퍼옥시다아제, 0.49mM 4-아미노안티피린을 포함하는 0.1M 인산 완충액 pH 6.5
5.0kU의 퍼옥시다아제(기꼬만사 제품), 100mg의 4-아미노안티피린(와코 순약공업사 제품)을 0.1M의 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)에 용해하여 1000ml에 정용(定容)한다.
(시약 2): 15mM TOOS 용액
500mg의 TOOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘나트륨, 도진 화학 연구소 제품)를 이온 교환수에 용해하여 100ml에 정용한다.
(시약 3): 기질 용액(30mM; 종농도 1mM)
αF6P(펩티드 연구소 제품) 257.1mg 혹은 αFVH(기꼬만사 제품) 124.9mg 혹은 αFV(기꼬만사 제품) 83.8mg를 이온 교환수에 용해하여 10ml에 정용한다.
B: 활성 측정법
(아마도리아제의 αF6P, αFVH 또는 αFV에 대한 활성의 측정 방법의 예)
2.7ml의 시약 1, 100μl의 시약 2 및 100μl의 효소액을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 100μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010A, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 555nm에서의 흡광도의 경시 변화를 관측하여 555nm에서의 흡광도의 1분당 변화량(ΔAs)을 측정한다. 또, 대조액은 100μl의 시약 3 대신에 100μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 하여 555nm에서의 흡광도의 1분당 변화량(ΔA0)을 측정한다. 37℃에서 1분당 생성되는 과산화수소의 마이크로 몰수를 효소액 중의 활성 단위(U)로 하고, 하기 식에 따라 산출한다.
활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
39.2: 반응에 의해 생성되는 퀴논이민 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
0.5: 1mol의 과산화수소에 의해 생성되는 퀴논이민 색소의 mol수
df: 희석 계수
(열처리 HbA1c의 정량법의 예)
이하의 HbA1c 측정용 시약을 조제한다.
시료: HbA1c 용액
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 약 5.6%, 약 7.7%, 약 10.5%)
시약 A1: 시료 전처리액
5.0% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
시약 A2: 시료 전처리액
5.0% n-테트라데실-β-D-말토시드(시그마 알드리치사 제품)
시약 B: 류코 색소, 퍼옥시다아제 용액
150mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
0.30mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
15U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
시약 C1: 아마도리아제 용액
120mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
120U/ml의 본 발명의 아마도리아제(예를 들어 CFP-T7-H35 등).
(아마도리아제의 HbA1c에 대한 활성의 측정 방법의 예)
시약 A1 혹은 시약 A2로 30배 희석한 시료(본 명세서에서 시료 희석액이라고 표기하는 경우가 있음)를 고온에서 소정 시간 예를 들어 98℃에서 2분간 인큐베이트한 후, 시료 희석액 25μl를 50μl의 시약 B에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트하고, 그 후 25μl의 시약 C1을 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시킨다. 용액 중에 과산화수소가 생성되는 경우, 퍼옥시다아제의 작용에 의해 류코 색소가 발색하여 751nm의 광의 흡광도가 증가한다. 시료의 HbA1c 농도에 따라 얻어진 결과를 기초로 시료의 HbA1c 농도(NGSP값)와 과산화수소의 정량 반응 전후의 751nm의 광의 흡광도차(ΔA)를 그래프에 플롯할 수 있다.
또, ΔA는 하기 식에 따라 산출한다.
ΔA=(시약 C1 첨가 5분 후의 흡광도)-(시약 C1 첨가 직전의 흡광도×0.75)
상기 예에서는 시약 C1 첨가에 의해 반응액의 용적이 1.33배가 되기 때문에 시약 C1 첨가 직전의 흡광도에 0.75를 곱한 것을 시약 C1 첨가 직후의 흡광도로 본다.
(산처리 HbA1c의 정량법의 예)
이하의 조성을 가지는 HbA1c 측정용 시약을 조제하고 Bio Majesty JCA-BM1650(니혼 전자 제품)을 이용하여 HbA1c를 측정한다.
시료: HbA1c 용액
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 약 5.6%, 약 7.7%, 약 10.5%)
시약 D: 시료 전처리액
8.3% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품) 또는 폴리옥시에틸렌(20) 세틸에테르(Brij58, 와코 순약공업 제품)
0.1M 염산
시약 E: 류코 색소 용액
30mM Tris-인산 칼륨 완충액 pH 9.0
290mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
0.16mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
시약 F1: 퍼옥시다아제, 아마도리아제 용액
100mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
180U/ml의 본 발명 아마도리아제(예를 들어 CFP-T7-H35 등)
시약 D로 30배 희석한 시료 25μl를 125μl의 시약 E에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트 후, 50μl의 시약 F1을 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시킨다.
일례로서 ΔA는 하기 식에 따라 산출할 수 있다.
ΔA=(시약 F1 첨가 5분 후의 흡광도)-(시약 F1 첨가 직전의 흡광도×0.75)
(계면활성제 처리 HbA1c의 정량법의 예)
이하의 조성을 가지는 HbA1c 측정용 시약을 조제하고 Bio Majesty JCA-BM1650(니혼 전자 제품)을 이용하여 HbA1c를 측정한다.
시료: HbA1c 용액
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 약 5.6%, 약 7.7%, 약 10.5%)
시약 G1: 시료 전처리액
0.80% 테트라데실 트리메틸암모늄 브로마이드(도쿄 화성공업 제품)
시약 G2: 시료 전처리액
0.70% 헥사데실 트리메틸암모늄 브로마이드(도쿄 화성공업 제품)
시약 H1: 류코 색소 용액
120mM MOPS-NaOH 완충액 pH 6.5
1.6% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
0.16mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
시약 H2: 류코 색소 용액
120mM PIPES-NaOH 완충액 pH 6.5
1.6% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
0.16mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
시약 I1: 퍼옥시다아제, 아마도리아제 용액
100mM MOPS-NaOH 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
160U/ml 본 발명의 아마도리아제(예를 들어 CFP-DH2 등)
시약 I2: 퍼옥시다아제, 아마도리아제 용액
100mM PIPES-NaOH 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
160U/ml 본 발명의 아마도리아제(예를 들어 CFP-DH2 등)
시약 G1로 25배 희석한 시료 25μl를 125μl의 시약 H1에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트 후, 50μl의 시약 I1을 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시킨다. 또한, 시료를 시약 G2로 25배 희석한 경우는 희석 시료 25μl를 125μl의 시약 H2에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 50μl의 시약 I2를 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시켰다.
일례로서 ΔA는 하기 식에 따라 산출할 수 있다.
ΔA=(시약 I1 또는 I2 첨가 5분 후의 흡광도)-(시약 I1 또는 I2 첨가 직전의 흡광도×0.75)
(HbA1c의 측정)
HbA1c를 포함하는 시료에 HbA1c 옥시다아제(아마도리아제)를 작용시킨다. 작용 시간은 예를 들어 5초 이상, 10초 이상 또는 20초 이상, 180분 미만 또는 150분 미만, 예를 들어 0.5~120분간, 바람직하게는 0.5~60분간, 보다 바람직하게는 1~30분간으로 할 수 있다. 작용 시간이 너무 짧은 경우, 시료 중의 HbA1c를 충분히 측정할 수 없어 양호한 측정을 행할 수 없다. 한편, 작용 시간이 너무 긴 경우에는 측정 시간이 연장되어 측정 처리의 효율이 나쁘다는 문제에 더하여 시료 및 측정 시약이 측정 조건 하에 오래 노출되는 결과, 시료 중의 기질 혹은 시약 중의 성분의 분해, 변성을 초래하는 문제를 일으킨다. 나아가 특히 미량 측정계에서는 장시간 경과에 의한 건조에 기인하는 시료 용량의 감소에 따른 농도 변화 등도 오차의 원인이 될 수 있다. HbA1c 옥시다아제 작용 시간을 0.5~60분간, 보다 바람직하게는 1~30분간, 더욱 바람직하게는 1~10분간으로 함으로써 신속하고 양호하게 HbA1c를 측정할 수 있다. 작용 온도는 이용하는 효소의 지적 온도에도 따르는데, 예를 들어 20~45℃로서, 통상의 효소 반응에 이용되는 온도를 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 사용하는 아마도리아제의 적합한 사용량은 시료 용액 중에 포함되는 기질의 양에도 따르는데, 예를 들어 종농도가 0.1~50U/mL, 바람직하게는 0.2~10U/mL가 되도록 첨가하면 된다. 작용시킬 때의 pH는 아마도리아제의 지적 pH를 고려하여 반응에 적합한 pH가 되도록 완충제를 이용하여 조정하는 것이 바람직하지만, 작용 가능한 pH이면 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, pH 3~11, 특히 바람직하게는 pH 5~9, 예를 들어 pH 6~8이다.
본 발명의 측정 방법에서는 효소나 시약의 안정화나 반응성 향상 등의 목적으로 pH를 조절 및/또는 유지하기 위해 필요에 따라 적절히 각종 완충제를 사용하는 것이 바람직하다. 사용 가능한 완충제로서는 예를 들어 N-[트리스(히드록시메틸)메틸] 글리신, 인산염, 아세트산염, 탄산염, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 붕산염, 구연산염, 디메틸 글루타민산염, 트리신, HEPES, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, 프탈산, 주석산 등을 들 수 있다. 나아가 필요에 따라 용해 보조제, 안정화제, 반응성 향상제, HbA1c 변성제 등으로서 계면활성제(n-옥틸-β-D-글리코시드, n-옥틸-β-D-티오글리코시드, n-도데실-β-D-말토시드, n-테트라데실-β-D-말토시드, n-옥틸-β-D-말토시드, 1-도데실피리디늄염, 헥사데실트리메틸 암모늄염, 테트라데실트리메틸 암모늄염, 도데실트리메틸 암모늄염, 트리톤 X-100, 브리지 35, 브리지 58, 트윈 80, 콜산염, n-헵틸-β-D-티오글리코시드, 3-옥사트리데실-α-D-만노시드, n-노닐-β-D-티오말토시드, n-데실-β-D-말토시드, n-운데실-β-D-말토시드, 트레할로스 C8, 트레할로스 C10, 트레할로스 C12, 트레할로스 C14, 트레할로스 C16, BIGCHAP, deoxy-BIGCHAP, MEGA-8, MEGA-9, MEGA-10, 헥사데실피리디늄염, 옥타데실트리메틸 암모늄염, 데실트리메틸 암모늄염, 노닐트리메틸 암모늄염, 옥틸트리메틸 암모늄염, 헥실트리메틸 암모늄염, 도데실 황산 나트륨 등), 환원제(디티오트레이톨, 메르캅토에탄올, L-시스테인 등), 우혈청 알부민, 당류(글리세린, 젖당, 수크로스 등) 등을 적절히 첨가해도 된다.
본 발명에 이용하는 계면활성제로서는 본 발명의 HbA1c의 측정 방법을 가능하게 하는 계면활성제이면 특별히 제한은 없고, 비이온성 계면활성제나 이온성 계면활성제, 예를 들어 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 계면활성제라고 할 때, 특별히 언급하지 않는 한 이 표현은 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 것으로 한다.
비이온 계면활성제로서는 예를 들어 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 지방산 소르비탄에스테르, 알킬폴리글리코시드, 지방산 디에탄올아미드, 알킬모노글리세릴에테르 등을 들 수 있다.
양이온성 계면활성제로서는 예를 들어 알킬트리메틸 암모늄염, 디알킬디메틸 암모늄염, 알킬벤질디메틸 암모늄염, 피리디늄염, 예를 들어 알킬피리디늄염, 포스포늄염, 예를 들어 알킬포스포늄염, 이미다졸륨염, 예를 들어 알킬이미다졸륨염, 이소퀴놀리늄염, 예를 들어 알킬이소퀴놀리늄염 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 양이온성 계면활성제로서는 이하의 일반식에서 나타나는 제4급 암모늄염(I), 피리디늄염(II)이나 포스포늄염(III)을 들 수 있다.
Figure 112016048093690-pct00001
[식 중, R1~R4는 동일하거나 달라도 되고, 치환 혹은 비치환 C1~C20 알킬, 알케닐, 아릴 또는 벤질을 나타내고, Z-는 1가의 음이온을 나타낸다.]
Figure 112016048093690-pct00002
[식 중, R5는 치환 혹은 비치환 C1~C20 알킬을 나타내고, 각 Ra는 동일하거나 달라도 되고, 수소 원자 또는 치환 혹은 비치환 C1~C20 알킬, 알케닐, 아릴 또는 벤질을 나타내고, n은 1~5의 정수를 나타내고, Z-는 1가의 음이온을 나타낸다.]
Figure 112016048093690-pct00003
[식 중, R6~R9는 동일하거나 달라도 되고, 치환 혹은 비치환 C1~C20 알킬, 알케닐, 아릴 또는 벤질을 나타내고, Z-는 1가의 음이온을 나타낸다.]
제4급 암모늄염으로서는 예를 들어 옥틸트리메틸암모늄 클로리드(OTAC) 및 브로미드(OTAB), 데실트리메틸암모늄 클로리드 및 브로미드(DTAB), 도데실트리메틸암모늄 클로리드 및 브로미드, 테트라데실트리메틸암모늄 클로리드(TTAC) 및 브로미드(TTAB), 헥사데실트리메틸암모늄 클로리드(CTAC) 및 브로미드, 옥타데실트리메틸암모늄 클로리드 및 브로미드(STAB), 에이코실트리메틸암모늄 클로리드 및 브로미드, 벤질도데실디메틸암모늄 클로리드 및 브로미드(BDDAB), 벤질테트라데실디메틸암모늄 클로리드(BDTAC) 및 브로미드, 벤질세틸디메틸암모늄 클로리드(BCDAC) 및 브로미드, 디옥틸디메틸암모늄 클로리드 및 브로미드를 들 수 있다.
피리디늄염으로서는 예를 들어 1-데실피리디늄 클로리드 및 브로미드, 1-도데실피리디늄 클로리드(1-DPC) 및 브로미드, 1-테트라데실피리디늄 클로리드 및 브로미드, 1-헥사데실피리디늄 클로리드(1-CPC) 및 브로미드(1-CPB), N-세틸-2-메틸피리디늄 클로리드 및 브로미드, N-세틸-3-메틸피리디늄 클로리드 및 브로미드, N-세틸-4-메틸피리디늄 클로리드(4Me-1-CPC) 및 브로미드, 1-옥타데실피리디늄 클로리드 및 브로미드, 1-에이코실피리디늄 클로리드 및 브로미드를 들 수 있다.
포스포늄염으로서는 예를 들어 테트라에틸포스포늄 클로리드 및 브로미드, 트리부틸메틸포스포늄 클로리드 및 브로미드 및 요오디드, 테트라부틸포스포늄 클로리드 및 브로미드, 테트라-n-옥틸포스포늄 클로리드 및 브로미드, 트리부틸도데실포스포늄 클로리드 및 브로미드, 트리부틸헥사데실포스포늄 클로리드 및 브로미드(TBCPB), 메틸트리페닐포스포늄 클로리드 및 브로미드 및 요오디드, 테트라페닐포스포늄 클로리드 및 브로미드를 들 수 있다.
양이온성 계면활성제의 쌍이 되는 음이온 Z-는 예를 들어 Cl-, Br-, I- 등일 수 있다.
음이온성 계면활성제로서는 예를 들어 직쇄상 알킬벤젠설폰산염, 알킬황산염, 알파-올레핀설폰산염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염, α-술포지방산 에스테르염 및 천연 지방산의 알칼리 금속염 등을 들 수 있다. 이러한 계면활성제로서는 예를 들어 도데실 황산나트륨(SDS)을 들 수 있다.
양성 계면활성제로서는 예를 들어 알킬디메틸아민옥시드, 알킬카르복시베타인 등을 들 수 있다.
본 발명은 아마도리아제의 작용에 의한 생성물 또는 소비물을 측정함으로써 HbA1c를 측정하는 방법을 제공하는데, 측정이 용이한 생성물이고 측정 대상으로서 바람직한 것으로서 과산화수소를 들 수 있다. 아마도리아제의 작용에 의해 생성된 과산화수소는 발색 기질 등에 의해 검출해도 되고, 본 발명에 이용되는 발색 기질로서는 4-아미노안티피린 외에 예를 들어 ADOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-아니시딘), ALOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필) 아닐린), TOOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘나트륨), DA-67(10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-페노시아진), DA-64(N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)-디페닐아민) 등을 들 수 있다. ADOS, ALOS, TOOS는 4-아미노안티피린과 축합하였을 때에 발색한다. DA-64, DA-67은 4-아미노안티피린을 필요로 하지 않고 단독으로 처방하는 것만으로 발색한다. 어떤 경우도 발색 반응은 퍼옥시다아제에 의해 촉매된다. 과산화수소의 측정은 일반적으로 과산화수소를 생성하는 공정과 동시에 행하는 것이 바람직하고, 아마도리아제의 작용시와 동시에 진행시키는 것이 바람직하다. 또한, 측정하는 소비물로서는 용존 산소를 들 수 있고, 용존 산소계 등을 이용하여 반응액 중의 용존 산소량을 측정할 수 있다.
본 발명은 상술한 아마도리아제와 과산화수소의 측정용 시약, 이에 원하는 바에 따라 완충제 등을 첨가한 HbA1c 측정용 시약을 제공한다. 이 시약 중에는 각종 기존의 성분, 예를 들어 계면활성제, 염류, 완충제, pH 조제제나 방부제 등을 적절히 선택하여 첨가할 수 있다. 상술한 본 발명의 HbA1c 측정용 시약은 각 시약을 다른 용기에 포함하는 것으로서 조제하면 되고, 예를 들어 액상품 및 액상품의 동결물 혹은 동결 건조품으로서 제공할 수도 있다. 또한, 이들 측정용 시약은 건조물 또는 용해된 상태로 이용해도 되고, 박막 상의 담체, 예를 들어 시트 함침성의 종이 등에 함침시켜 이용해도 된다. 또한, 측정용 시약에 이용되는 효소류는 통상의 방법에 의해 고정화시켜 반복 사용할 수도 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 HbA1c 측정용 시약은 당화 단백질로부터 α-프럭토실 펩티드를 절단하기 위한 프로테아제 등을 포함하지 않는다.
본 발명의 HbA1c 측정용 시약의 사양이나 사용 조건은 그 함유 성분 등에 따라 최적의 것을 선택하면 되는데, 예를 들어 측정을 20~45℃에서 행하도록 설정할 수 있다. 측정에 필요로 하는 시간도 여러 가지 측정 조건에 따라 적절히 선택할 수 있는데, 예를 들어 0.5~60분간, 바람직하게는 0.5~30분간, 더욱 바람직하게는 1~10분간이 바람직하다. 예를 들어, 상기 측정 시약의 발색 정도(흡광도 변화량)를 분광 광도계에 의해 측정하고 표준 흡광도와 비교하여 시료 중에 포함되는 당화 펩티드 혹은 당화 단백질을 측정할 수 있다. 측정에는 통상의 자동 분석 장치를 이용할 수도 있다.
(HbA1c의 정량)
본 발명의 HbA1c 측정 방법은 정성적이어도 되지만, 정량적인 측정 방법으로 할 수도 있다. 여기서 HbA1c의 정량적 측정 방법이란 시료 중의 HbA1c의 농도를 결정하는 방법을 말한다. 즉, 본 발명의 일 실시형태는 아마도리아제를 사용하는 것을 포함하는 시료 중의 HbA1c의 정량법을 제공한다. 이 정량법은 HbA1c를 포함하는 시료와 본 발명의 아마도리아제를 접촉시키는 공정 및 그 아마도리아제의 HbA1c에 대한 작용에 의한 생성물 또는 소비물을 측정하는 공정을 포함한다. 여기서의 HbA1c는 천연 상태이어도 되고 변성된 상태이어도 된다. 이 정량법에 대해 이용하는 접촉이란 본 발명의 아마도리아제가 HbA1c의 산화 반응을 촉매할 수 있도록 그 아마도리아제와 시료를 물리적으로 같이 하는 모든 태양을 포함하고, 예를 들어 용액 중에서 유리의 효소와 HbA1c를 혼합하는 경우뿐만 아니라 고상 담체에 담지된 본 발명의 아마도리아제에 HbA1c를 포함하는 용액 시료를 첨가 또는 적하하는 태양도 포함한다.
본 발명의 HbA1c 측정 방법에 이용하는 시료는 당화 헤모글로빈을 포함할 가능성이 있는 모든 생물학적 시료, 예를 들어 혈액, 체액, 림프액 등에 유래하는 시료로 할 수 있다. 시료는 적절히 가공 처리된 것일 수 있다.
아마도리아제와 HbA1c의 반응 효율을 높이기 위해서는 변성된 HbA1c를 아마도리아제와의 반응에 이용해도 된다. 변성 HbA1c는 적당한 계면활성제와의 혼합에 의해 취득할 수 있고, 열처리에 의해 취득할 수 있고, 또는 계면활성제 첨가 및 열처리에 의해 취득할 수 있고, 혹은 산·알칼리에서의 변성 처리에 의해 취득할 수 있다. 변성 처리로서 계면활성제 첨가와 열처리를 둘 다 행하는 경우, 그 순서는 임의이다. 열처리는 HbA1c의 전부 또는 일부를 변성시키는 데에 충분한 온도 및 시간으로 행해질 수 있다. 처리 온도는 예를 들어 60℃ 이상, 70℃ 이상, 80℃ 이상, 90℃ 이상, 예를 들어 98℃로 할 수 있다. 처리 시간은 온도에도 따르는데, 예를 들어 10초 이상, 20초, 30초 이상, 1분 이상 또는 2분 이상일 수 있다. 계면활성제의 예는 상술한 바와 같고, 이들을 적당한 농도로 첨가할 수 있다.
이용하는 아마도리아제 변이체의 효소량 및 반응 시간(작용 시간)을 일정하게 하고 첨가하는 HbA1c의 양을 변화시킨 경우에, HbA1c 첨가량이 감소함에 따라 검출되는 발광 기질의 흡광도도 비례적으로 감소하는 HbA1c 농도 범위를 조사함으로써, 상기 아마도리아제를 이용한 경우의 검출 가능한 최저 HbA1c 농도를 결정할 수 있다. 이 농도를 본 명세서에서 검출 한계 농도라고 하는 경우가 있다. 본 발명의 HbA1c 정량법에서는 HbA1c의 검출 한계가 측정 시료 중의 HbA1c 농도 또는 혈중 당화 헤모글로빈 농도보다 낮아지도록 효소량 및 반응 시간을 설정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정량적 측정에서는 미리 농도를 알고 있는 HbA1c를 포함하는 대조의 흡광도 등의 측정값으로부터 최소제곱법 등의 회귀 분석을 행함으로써 검량선을 작성해 둘 수도 있다. 작성한 검량선에 대해 HbA1c 농도가 미지인 시료의 측정값을 플롯함으로써 그 시료 중의 HbA1c 농도를 정량할 수 있다.
본 발명자들은 Coniochaeta 유래 아마도리아제 변이체, 예를 들어 CFP-T7-H35를 이용하여 양호하게 시료 중의 HbA1c를 정량할 수 있는 것을 나타내었다. 이는 놀랄 만한 지견이다. 도 12 및 도 13을 참조하기 바란다. CFP-T7-H35는 또한 αF6P에 대한 활성을 나타낸다. 따라서, 당업자라면 이러한 지견에 기초하여 α-프럭토실 올리고펩티드, 예를 들어 αF6P에 대한 양호한 활성을 나타내는 다른 아마도리아제도 마찬가지로 HbA1c에 직접 작용하여 그 정량적 측정에 이용할 수 있을 가능성이 있다고 이해한다. 예를 들어 αF6P 등의 α-프럭토실 올리고펩티드에 대한 비활성이 높은 아마도리아제는 마찬가지로 HbA1c에 직접 작용하여 그 정량 측정용에 이용할 수 있을 개연성이 높다. 또한, 당업자라면 이러한 정량적 측정을 위한 효소량(효소 농도), 반응 시간 등의 조건을 적절히 설정할 수 있다.
(스크리닝 방법)
어떤 실시형태에 있어서, 상기 (HbA1c의 측정)에 기재된 방법을 이용하여 어떤 아마도리아제가 HbA1c에 직접 작용하는지 여부를 결정할 수 있다. 후보가 되는 아마도리아제로서는 여러 가지의 천연 아마도리아제 또는 이들의 개변체, 예를 들어 αFV 활성을 가지는 아마도리아제, αFVH 활성을 가지는 아마도리아제, αF6P 활성을 가지는 아마도리아제, α-프럭토실 펩티드에 대한 활성을 나타내는 아마도리아제 또는 이들의 개변체, 예를 들어 상기 (아마도리아제의 개변체)에 기재된 것을 들 수 있다. 스크리닝은 96 웰 플레이트 등을 이용하여 다수의 후보를 한 번에 처리하여 높은 스루풋으로 신속히 행할 수 있다. 후보 아마도리아제가 HbA1c에 직접 작용하는지 스크리닝할 수 있다. 또는 후보 아마도리아제에 대해 우선 αFV 활성, αFVH 활성, αF6P 활성 등을 가지는지 1차 선발을 행하고, 다음으로 해당 활성을 가지는 것에 대해 HbA1c에 직접 작용하는지 2차 선발해도 된다. 스크리닝은 생물 시료로부터 조제한 조효소 추출액 또는 그 정제물에 대해 행할 수 있다. 또한, α-프럭토실 펩티드에 대한 활성을 나타내는 아마도리아제의 유전자를 관용법에 의해 취득하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 효소를 제조하여 이를 선발에 이용해도 된다. 관용법이란 α-프럭토실 펩티드에 대한 활성을 나타내는 아마도리아제를 정제하고 그 아미노산 서열을 결정하며 그 서열 정보를 기초로 PCR용 프라이머를 설계하여 유전자를 취득하는 방법이나, 공지의 아마도리아제의 서열 정보를 기초로 PCR용 프라이머가 설계되어 있는 생물의 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리로부터 유전자를 취득하는 방법을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 (아마도리아제를 코드하는 유전자의 취득)도 참조하기 바란다. 취득한 아마도리아제 유전자에 대해 관용의 유전자 재조합 기술을 이용하여 적당한 변이를 도입하여 얻어진 변이체가 HbA1c에 직접 작용하는지 조사할 수 있다. 또한, 취득한 아마도리아제 유전자에 대해 유전자 재조합 기술을 이용하여 적당한 변이를 도입하여 쇄길이가 긴 α-프럭토실 펩티드, 예를 들어 αF6P에 대한 활성을 나타내는 개변체를 제작하고, 다음으로 이것이 예를 들어 αF6P에 대해 0.1U/mg 이상의 비활성을 가지는지를 조사하고 또한/또는 HbA1c에 직접 작용하는지 조사할 수도 있다. 이러한 개변체의 제작에 있어서는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 (a) 62위에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환하는 것, (b) 63위에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘 또는 알라닌으로 치환하는 것, (c) 102위에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환하는 것, (d) 106위에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환하는 것, (e) 110위에 대응하는 위치의 아미노산을 류신 또는 티로신으로 치환하는 것, (f) 113위에 대응하는 위치의 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하는 것, (g) 355위에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환하는 것 및/또는 (h) 419위에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환하는 것, (i) 68위에 대응하는 위치의 아미노산을 아스파라긴으로 치환하는 것 및/또는 (j) 356위에 대응하는 위치의 아미노산을 트레오닌으로 치환하는 것을 참고해도 되지만, 도입하는 변이는 이에 한정되지 않고, 랜덤 돌연변이를 도입하는 수법을 이용할 수도 있다. 변이 도입과 활성의 확인을 복수회 반복하여 보다 α-프럭토실 펩티드 또는 HbA1c에 대한 활성이 높은 변이체를 취득할 수도 있다. 상기 (아마도리아제 유전자의 변이 처리)도 참조하기 바란다.
이용하는 아마도리아제에는 상기 계면활성제 내성을 향상시키는 변이를 도입해도 되고, 또한/또는 상기 열 안정성을 향상시키는 결실을 행해도 된다. 또한, HbA1c에 대한 활성을 가지는 한 효소의 그 밖의 특성을 개변하는 변이를 도입할 수도 있다.
본 발명의 HbA1c 측정용 키트에는 상술한 HbA1c 측정용 시약에 더하여 필요에 따라 그 밖의 공지의 안정화제나 협잡 물질의 소거계 등을 포함해도 된다. HbA1c에 작용하는 프로테아제 등을 사용하여 HbA1c를 효소법에 의해 측정하는 것을 목적으로 한 종래의 각종 시약이나 키트에 이용되고 있는 기술을 적절히 개변하여 본 발명의 아마도리아제를 포함하는 HbA1c 측정용 키트에 이용할 수 있다. 단, 본 발명의 HbA1c 측정용 키트는 이러한 프로테아제 등을 필요로 하지 않는다. 즉, 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 HbA1c 측정용 키트는 HbA1c로부터 α-프럭토실 펩티드를 절단하기 위한 프로테아제 등을 포함하지 않는다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA의 조제
Coniochaeta 속 유래 아마도리아제 유전자(서열 번호 2)의 재조합체 플라스미드를 가지는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7)주(국제공개 제2007/125779호 참조)를 3ml의 LB-amp 배지[1%(w/v) 박토트립톤, 0.5%(w/v) 펩톤, 0.5%(w/v) NaCl, 50μg/ml 암피실린]에 접종하고 37℃에서 16시간 진탕 배양하여 배양물을 얻었다.
이 배양물을 10,000×g로 1분간 원심분리함으로써 집균하여 균체를 얻었다. 이 균체로부터 GenElute Plasmid Miniprep Kit(Sigma-Aldrich사 제품)를 이용하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7를 추출하고 정제하여 2.5μg의 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 얻었다.
(2) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA의 부위 특이적 개변 조작
얻어진 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 3, 4의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 이하의 조건으로 PCR 반응을 행하였다.
즉, 10×KOD-Plus- 완충액을 5μl, dNTP가 각 2mM이 되도록 조제된 dNTPs 혼합 용액을 5μl, 25mM의 MgSO4 용액을 2μl, 주형이 되는 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 50ng, 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 각각 15pmol, KOD-Plus-를 1Unit 가하여 멸균수에 의해 전체량을 50μl로 하였다. 조제한 반응액을 서멀 사이클러(에펜도르프사 제품)를 이용하여 94℃에서 2분간 인큐베이트하고, 이어서 「94℃, 15초」-「50℃, 30초」-「68℃, 6분」의 사이클을 30회 반복하였다.
반응액의 일부를 1.0% 아가로스 겔로 전기 영동하여 약 6,000bp의 DNA가 특이적으로 증폭되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA를 제한 효소 DpnI(NEW ENGLAND BioLabs사 제품)로 처리하고, 잔존하고 있는 주형 DNA를 절단한 후, 대장균 JM109를 형질 전환하여 LB-amp 한천 배지에 전개하였다. 생육한 콜로니를 LB-amp 배지에 접종하여 진탕 배양하고, 상기 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 단리하였다. 이 플라스미드 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열을 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사 제품)를 이용하여 결정하고, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 알라닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H1)를 얻었다.
(3) 각종 개변형 아마도리아제의 생산
pKK223-3-CFP-T7-H1를 형질 도입한 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H1)주를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에서 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM의 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H1)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
(4) αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV의 측정
상술한 CFP-T7-H1를 포함하는 효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7)주로부터 생산한 CFP-T7를 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 αFV, αFVH 및 αF6P에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV를 표 1에 나타낸다.
Figure 112016048093690-pct00004
표 1에 나타내는 바와 같이, CFP-T7은 αFV 산화 활성 및 αFVH 산화 활성은 나타내었지만 αF6P 산화 활성은 나타내지 못하였다. 이에 의해, CFP-T7은 α-프럭토실 디펩티드에 매우 특이성이 높고 α-프럭토실 헥사펩티드에는 작용하지 않는 것을 알 수 있었다.
한편, 변이체 CFP-T7-H1은 αFV, αFVH 산화 활성에 더하여 αF6P 산화 활성도 나타내었다.
즉, CFP-T7에 대해 R62A의 아미노산 치환을 도입함으로써 CFP-T7에 새로이 αF6P 산화 활성을 부여할 수 있고 αF6P에 대한 반응성(기질 특이성)이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H1 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 5~8의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 110위의 글루타민이 류신 또는 페닐알라닌 혹은 티로신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H2, pKK223-3-CFP-T7-H3, pKK223-3-CFP-T7-H4)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H2 또는 pKK223-3-CFP-T7-H3 혹은 pKK223-3-CFP-T7-H4를 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 각종 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H2, CFP-T7-H3, CFP-T7-H4)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
이와 같이 하여 조제한 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H1)주로부터 생산한 CFP-T7-H1를 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 αFV, αFVH 및 αF6P에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV를 표 2에 나타낸다.
Figure 112016048093690-pct00005
즉, CFP-T7-H2 및 CFP-T7-H4는 CFP-T7-H1과 비교하여 αF6P에 대한 반응성(기질 특이성)이 더욱 증대되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H2 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 4, 서열 번호 9~12의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 110위의 글루타민이 류신으로 치환되고, 62위의 아르기닌이 아스파라긴 또는 아스파라긴산 또는 글루타민 혹은 글루타민산으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H2-62N, pKK223-3-CFP-T7-H6, pKK223-3-CFP-T7-H2-62Q, pKK223-3-CFP-T7-H2-62E)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H2-62N 또는 pKK223-3-CFP-T7-H6 또는 pKK223-3-CFP-T7-H2-62Q 혹은 pKK223-3-CFP-T7-H2-62E를 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 각종 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H2-62N, CFP-T7-H6, CFP-T7-H2-62Q, CFP-T7-H2-62E)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
이와 같이 하여 조제한 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H2)주로부터 생산한 CFP-T7-H2를 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. CFP-T7-H2를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성을 100으로 한 경우의 각각의 아마도리아제를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성 비율은 표 3과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00006
즉, CFP-T7-H2-62N 및 CFP-T7-H6은 CFP-T7-H2보다 αF6P 산화 활성이 향상되어 있는 것이 명백해졌다. 또, 62위의 아미노산이 아르기닌인 야생형 효소는 표 1과 같이 αF6P에 대한 활성을 나타내지 못한다. 이러한 야생형 효소와 비교하면, 62위의 아르기닌을 글루타민 또는 글루타민산으로 치환한 변이체도 각각 αF6P에 대한 활성이 향상되어 있는 것을 알 수 있다. 제62위에 관해 αF6P에 대한 활성을 나타낸 치환 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민 및 글루타민산은 비교적 분자량이 작은 아미노산이다. 따라서, 62위를 마찬가지로 분자량이 작은 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 프롤린으로 치환함으로써 마찬가지로 αF6P 활성을 가지는 개변 아마도리아제를 얻을 수 있다고 생각된다. 본 명세서에서는 알라닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 프롤린을 총칭하여 분자량이 작은 아미노산이라고 부르는 경우가 있다.
CFP-T7-H2 또는 CFP-T7-H6을 포함하는 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 각 기질에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV는 표 4와 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00007
즉, CFP-T7-H6은 CFP-T7-H2보다 대폭으로 αF6P 산화 활성이 향상되고 αF6P에의 반응성(기질 특이성)이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H6 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 13~24의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 110위의 글루타민이 류신으로 치환되고, 64위의 아르기닌이 알라닌 또는 글루타민산 혹은 히스티딘으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H7, pKK223-3-CFP-T7-H8, pKK223-3-CFP-T7-H9) 및 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 110위의 글루타민이 류신으로 치환되고, 106위의 아스파라긴산이 알라닌 또는 리신 혹은 아르기닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H10, pKK223-3-CFP-T7-H11, pKK223-3-CFP-T7-H12) 및 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 110위의 글루타민이 류신으로 치환되고, 113위의 알라닌이 리신 혹은 아르기닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H13, pKK223-3-CFP-T7-H14)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H7 또는 pKK223-3-CFP-T7-H8 또는 pKK223-3-CFP-T7-H9 또는 pKK223-3-CFP-T7-H10 또는 pKK223-3-CFP-T7-H11 또는 pKK223-3-CFP-T7-H12 또는 pKK223-3-CFP-T7-H13 혹은 pKK223-3-CFP-T7-H14를 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 각종 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H7, CFP-T7-H8, CFP-T7-H9, CFP-T7-H10, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13, CFP-T7-H14)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
이와 같이 하여 조제한 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H6)주로부터 생산한 CFP-T7-H6을 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. CFP-T7-H6을 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성을 100으로 한 경우의 각각의 아마도리아제를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성은 표 5와 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00008
즉, CFP-T7-H10, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13 및 CFP-T7-H14는 CFP-T7-H6보다 전부 대폭으로 αF6P 산화 활성 비율이 향상되고 일부의 것에서는 비약적으로 향상되었다.
CFP-T7-H6, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13, CFP-T7-H14를 포함하는 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 각 기질에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV는 표 6과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00009
즉, 표 6에 나타내는 바와 같이 CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13 및 CFP-T7-H14는 CFP-T7-H6보다 αF6P에의 반응성(기질 특이성)이 대폭으로 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H11 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 21~24의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로 치환되고, 113위의 알라닌이 리신 혹은 아르기닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H20, pKK223-3-CFP-T7-H21)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H20 혹은 pKK223-3-CFP-T7-H21을 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 각종 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H20, CFP-T7-H21)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
CFP-T7-H11, CFP-T7-H20, CFP-T7-H21을 포함하는 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 각 기질에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV는 표 7과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00010
즉, CFP-T7-H20 및 CFP-T7-H21은 CFP-T7-H11보다 αF6P에 대한 반응성(기질 특이성)이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H20 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 25~29의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환되고, 63위의 류신이 알라닌 또는 아스파라긴산 또는 히스티딘 혹은 리신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H24, pKK223-3-CFP-T7-H25, pKK223-3-CFP-T7-H26, pKK223-3-CFP-T7-H27)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H24 또는 pKK223-3-CFP-T7-H25 또는 pKK223-3-CFP-T7-H26 혹은 pKK223-3-CFP-T7-H27을 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 각종 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H24, CFP-T7-H25, CFP-T7-H26, CFP-T7-H27)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
이와 같이 하여 조제한 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H20)주로부터 생산한 CFP-T7-H20을 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. CFP-T7-H20을 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성을 100으로 한 경우의 각각의 아마도리아제를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성은 표 8과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00011
즉, 표 8에 나타내는 바와 같이 CFP-T7-H24 및 CFP-T7-H26은 CFP-T7-H20보다 αF6P 산화 활성이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
CFP-T7-H20 또는 CFP-T7-H24 혹은 CFP-T7-H26을 포함하는 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 각 기질에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV는 표 9와 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00012
즉, 표 9에 나타내는 바와 같이 CFP-T7-H24 및 CFP-T7-H26은 CFP-T7-H20보다 αF6P에 대한 반응성(기질 특이성)이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H26 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 30~33의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환되고, 102위의 글루타민산이 리신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H28) 및 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환되고, 나아가 419위의 알라닌이 리신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H29)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H26 또는 pKK223-3-CFP-T7-H28 혹은 pKK223-3-CFP-T7-H29를 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 각종 개변형 아마도리아제(CFP-T7-H26, CFP-T7-H28, CFP-T7-H29)를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
이와 같이 하여 조제한 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H26)주로부터 생산한 CFP-T7-H26를 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. CFP-T7-H26를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성을 100으로 한 경우의 각각의 아마도리아제를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성은 표 10과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00013
즉, 표 10에 나타내는 바와 같이 CFP-T7-H28 및 CFP-T7-H29는 CFP-T7-H26보다 αF6P 산화 활성이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
CFP-T7-H26 또는 CFP-T7-H28 혹은 CFP-T7-H29를 포함하는 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 각 기질에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV는 표 11과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00014
즉, 표 11에 나타내는 바와 같이 CFP-T7-H28 및 CFP-T7-H29는 CFP-T7-H26보다 αF6P에 대한 반응성(기질 특이성)이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H28 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 34~35의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 102위의 글루타민산이 리신으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환되고, 355위의 알라닌이 세린으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H35)를 얻었다.
pKK223-3-CFP-T7-H35를 형질 도입한 대장균 JM109주를 상기 (3)에 기재된 방법으로 배양하여 개변형 아마도리아제인 CFP-T7-H35를 포함하는 조효소액 0.6ml를 조제하였다.
이와 같이 하여 조제한 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 또한, 비교를 위해 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H28)주로부터 생산한 CFP-T7-H20을 포함하는 효소액을 이용하여 동일한 측정을 행하였다. CFP-T7-H26을 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성을 100으로 한 경우의 각각의 아마도리아제를 포함하는 조효소액의 αF6P 산화 활성은 표 12와 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00015
즉, 표 12에 나타내는 바와 같이 CFP-T7-H35는 CFP-T7-H28보다 αF6P 산화 활성이 향상되어 있는 것이 명백해졌다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 4, 10의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-62D)를 얻었다. 이어서, pKK223-3-CFP-T7-62D를 형질 도입한 대장균 JM109주를 제작하였다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H35 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 193, 서열 번호 194의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 102위의 글루타민산이 리신으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환되고, 68위의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H36)를 얻었다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7-H36 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 195, 서열 번호 196의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 102위의 글루타민산이 리신으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글루타민이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환되고, 68위의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환되고, 356위의 알라닌이 트레오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-H37)를 얻었다.
CFP-T7-H36의 안정성을 향상시킨 변이체를 얻기 위해 안정성 향상 효과가 있는 변이를 도입하고, 또한 C말단으로부터 3아미노산을 제외한 서열 번호 199로 나타내는 434아미노산으로 이루어지는 개변형 CFP-T7-H36(이후, CFP-DH1이라고 부름)을 대장균으로 발현시키는 것을 시도하였다. 그래서, 서열 번호 199의 아미노산 서열을 코드하고, 대장균 발현용으로 코돈을 최적화한 서열 번호 200으로 나타내는 1305bp의 유전자(종결 코돈 TAA를 포함함)를 정법인 유전자 단편의 PCR에 의한 전체합성에 의해 취득하였다. 이 때, 서열 번호 200의 5'말단, 3'말단에는 각각 EcoRI 사이트와 HindIII 사이트를 부가하였다.
이어서, 취득한 CFP-DH1의 유전자를 대장균 발현용 플라스미드에 서브 클로닝하기 위해 이하의 순서를 행하였다. 우선, 상기에서 전체합성한 유전자 및 pKK223-3 Vector(노바젠사 제품)를 EcoRI 사이트와 HindIII(다카라 바이오사 제품)의 2종류의 제한 효소로 처리한 후에 라이게이션하고, pKK223-3 Vector의 멀티클로닝 사이트에 CFP-DH1의 유전자가 삽입된 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-DH1 DNA를 취득하였다. 얻어진 재조합체 플라스미드로 대장균 JM109를 형질 전환하여 LB-amp 한천 배지에 전개하였다. 생육한 콜로니를 LB-amp 배지에 접종하고 진탕 배양하여 상기 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 단리하였다. 이 플라스미드 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열을 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사 제품)를 이용하여 결정하고, 실제로 pKK223-3 벡터의 멀티클로닝 사이트에 CFP-DH1 유전자가 삽입된 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-DH1 DNA가 얻어진 것을 확인하였다.
이어서, 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-DH1 DNA를 주형으로 하고 서열 번호 201, 서열 번호 202의 올리고 뉴클레오티드 및 KOD-Plus-를 이용하여 상기 (2)와 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 199에 기재된 아미노산 서열의 356위의 알라닌이 트레오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-DH2)를 얻었다.
[실시예 2]
(각종 아마도리아제의 생산 및 정제)
(Coniochaeta 속 유래 개변형 아마도리아제의 생산 및 정제)
Coniochaeta 속 유래의 야생형 아마도리아제 및 상기와 같이 하여 얻어진 개변형 아마도리아제를 생산하는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7), 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-62D), 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H20) 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H21) 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H35)를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 120ml에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액 24ml를 조제하였다.
조제한 조효소액을 1.35M (NH4)2SO4를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 12ml의 Butyl Toyopearl 650C 수지(토소사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 120ml의 상기 완충액으로 수지를 세정하고, 이어서 84ml의 1.05M (NH4)2SO4를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 수지에 흡착되어 있던 아마도리아제를 용출시켜 회수하였다.
얻어진 아마도리아제를 포함하는 조효소액을 투석 튜브(Spectra/Por MWCO: 12,000-14,000)로 옮기고, 10배량의 5mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5) 중에서 투석하는 조작을 3번 반복하여 아마도리아제를 포함하는 조효소액으로부터 (NH4)2SO4를 완전히 제거하였다. 이어서, 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 HiScreen Capto Q ImpRes(GE 헬스케어사 제품)에 아마도리아제를 포함하는 조효소액을 어플라이하여 아마도리아제를 음이온 교환 수지에 결합시켰다. 그 후, 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)에 포함되는 NaCl 농도를 0mM에서 160mM까지 직선적으로 증가시킴으로써 수지에 결합한 단백질을 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 프랙션을 회수하였다. 얻어진 아마도리아제 활성을 나타내는 프랙션을 SDS-PAGE에 의한 분석에 의해 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하고, CFP-T7, CFP-T7-62D, CFP-T7-H20, CFP-T7-H21 및 pKK223-3-CFP-T7-H35의 정제 표품으로 하였다.
[실시예 1]에서 얻어진 개변형 아마도리아제를 생산하는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H36), 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7-H37) 및 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-DH2)를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 200ml에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액 40ml를 조제하였다. 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-DH2)의 배양 균체만 2mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액 40ml를 조제하였다.
Q-sepharose FF(GE 헬스케어사 제품)를 충전한 칼럼을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 후, 조제한 CFP-T7-H36 및 CFP-T7-H37을 포함하는 각 조효소액을 어플라이하여 아마도리아제를 음이온 교환 수지에 결합시켰다. 그 후, 30mM의 NaCl 농도를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 20칼럼 부피분 송액하여 협잡 단백질을 용출시킨 후, 80mM의 NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)으로 수지에 결합한 단백질을 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 프랙션을 회수하였다.
Q-sepharose FF(GE 헬스케어사 제품)를 충전한 칼럼을 2mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 평형화한 후, 조제한 CFP-DH2를 포함하는 조효소액을 어플라이하여 아마도리아제를 음이온 교환 수지에 결합시켰다. 그 후, 4mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)을 20칼럼 부피분 송액하여 협잡 단백질을 용출시킨 후, 30mM의 NaCl를 포함하는 4mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 수지에 결합한 단백질을 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 프랙션을 회수하였다.
얻어진 각각의 아마도리아제 활성을 나타내는 프랙션을 Amicon Ultra Ultracel-30K(밀리포어사 제품)에 의해 농축하고 HiLoad 26/60 Superdex200에 의해 정제하였다. 수지의 평형화, 용출에는 150mM의 NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)을 이용하였다. 용출한 각 프랙션의 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하고, 협잡 단백질을 포함하지 않는 프랙션을 회수하여 CFP-T7-H36, CFP-T7-H37 및 CFP-DH2의 정제 표품으로 하였다.
(Aspergillus oryzae RIB40 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제의 생산 및 정제)
서열 번호 36은 Aspergillus oryzae RIB40 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제(이후, FAOAo2라고 부름)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 36의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 37)를 삽입한 재조합체 플라스미드(이후, pUC19-FAOAo2라고 부름)를 대장균 DH5α로 발현시킴으로써 FAOAo2가 생산되고, FAOAo2가 프럭토실 헥사펩티드에 대해 작용하는 것이 나타나 있다(국제공개 제2008/108385호 공보 참조).
상기 FAOAo2 생산능을 가지는 대장균 DH5α(pUC19-FAOAo2)를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
조제한 조효소액을 10mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5)으로 평형화한 Q Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 50mM NaCl를 포함하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5)으로 수지를 세정하고, 이어서 100mM NaCl를 포함하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5)으로 수지에 흡착되어 있던 FAOAo2를 용출시켜 회수하였다.
얻어진 FAOAo2 조효소액을 150mM NaCl를 포함하는 20mM MES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/600 Superdex 200 칼럼에 어플라이하고 이 완충액으로 FAOAo2를 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 프랙션을 회수하였다. 얻어진 프랙션을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 FAOAo2의 정제 표품으로 하였다.
(Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제의 생산주 제작)
서열 번호 38은 Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제(이후, PnFX라고 부름)의 아미노산 서열이다(Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010 참조). 서열 번호 38의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 39)를 정법인 유전자 단편의 PCR에 의한 전체합성에 의해 cDNA를 전체합성함으로써 취득하였다. 이 때, 서열 번호 39의 5'말단, 3'말단에는 각각 NdeI 사이트와 BamHI 사이트를 부가하였다. 또한, 클로닝한 유전자 서열로부터 예상되는 아미노산 서열 전체길이는 도 1~도 5의 PnFX의 서열과 일치하는 것을 확인하였다.
이어서, 취득한 서열 번호 39의 유전자를 대장균으로 발현시키기 위해 이하의 순서를 행하였다. 우선, 상기에서 전체합성한 유전자를 NdeI 사이트와 BamHI(다카라 바이오사 제품)의 2종류의 제한 효소로 처리하고 pET-22b(+) Vector(노바젠사 제품)의 NdeI-BamHI 사이트에 삽입함으로써 재조합체 플라스미드 pET22b-PnFX를 취득하고, 상기와 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX)주를 얻었다.
(Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제의 생산 및 정제)
상기와 같이 하여 얻어진 PnFX 생산능을 가지는 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX)주를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
조제한 PnFX의 조효소액을 전술한 비특허문헌(Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010)에 기재된 방법에 따라 정제하였다. 즉, 조효소액을 황산 암모늄에 의해 분획하고, 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 투석하여 음이온 교환 크로마토그래피(본 실시예에서는 Q Sepharose Fast Flow를 이용함)에 의해 정제하고, 겔 여과 크로마토그래피(본 실시예에서는 HiLoad 26/600 Sueprdex 200을 이용함)에 의해 정제하였다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 PnFX의 정제 표품으로 하였다.
얻어진 CFP-T7, CFP-T7-62D, CFP-T7-H20, CFP-T7-H21, CFP-T7-H35 및 FAOAo2 및 PnFX의 정제 표품을 이용하여 αFV, αFVH, αF6P를 기질로 하였을 때의 비활성을 측정하였다. 결과를 표 13에 나타낸다. 또, 비활성 산출에 이용한 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도를 이용한 자외 흡수법에 의해 측정하였다(Protein Sci. 4, 2411-23, 1995 참조).
Figure 112016048093690-pct00016
얻어진 CFP-T7-H36, CFP-T7-H37 및 CFP-DH2의 정제 표품을 이용하여 αF6P를 기질로 하였을 때의 비활성을 측정하였다. 결과를 표 14에 나타낸다. 또, 비활성 산출에 이용한 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도를 이용한 자외 흡수법에 의해 측정하였다(Protein Sci. 4, 2411-23, 1995 참조).
Figure 112016048093690-pct00017
정제한 CFP-T7은 αFV, αFVH를 산화하는 활성을 나타내었지만, αF6P를 산화하는 활성은 나타내지 않았다. 이에 반해, CFP-T7-H35는 αFV, αFVH에 더하여 αF6P의 산화 활성도 나타내고, αF6P 산화 반응의 비활성은 4.27U/mg라는 높은 수준에 이르렀다.
CFP-T7-62D, CFP-T7-H20, CFP-T7-H21의 αF6P에 대한 비활성은 각각 0.018U/mg, 0.850U/mg, 0.795U/mg로서, 숙주인 대장균 유래의 프로테아제/펩티다아제의 영향을 배제한 측정 방법에서도 αF6P에 대한 충분히 높은 반응성이 나타났다.
또한, 이미 보고되어 있는 αF6P에 대해 반응성을 나타내는 아마도리아제인 FAOAo2(국제공개 제2008/108385호 참조) 및 PnFX(국제공개 제2011/15326호 참조, 이 문헌 중에서는 P.n FPOX라고 기재되어 있음)의 αF6P에 대한 비활성은 각각 0.0022U/mg, 0.0091U/mg이었다. 본 명세서에 기재된 순서로 제작한 Coniochaeta 속 유래 아마도리아제의 개변체는 이들 이미 보고되어 있는 αF6P에 대해 반응성을 나타내는 아마도리아제의 2배(아마도리아제 26/비교예 3)에서 1940배(아마도리아제 25/비교예 2)의 비활성을 나타내었다. 즉, 본 명세서에 기재된 순서로 αF6P에 대해 높은 반응성을 나타내는 아마도리아제를 얻을 수 있었다.
또, CFP-T7-H20, CFP-T7-H21이 나타내는 αF6P/αFVH의 값은 조효소액을 이용하여 측정한 경우와 정제 효소를 이용하여 측정한 경우 간에 큰 괴리는 확인할 수 없었다.
CFP-T7-H36, CFP-T7-H37의 αF6P에 대한 비활성은 각각 4.65U/mg, 7.19U/mg로서 아미노산 치환 도입 전의 CFP-T7-H35의 비활성(4.27U/mg)과 비교하면 아미노산 치환을 추가할 때마다 향상되었다. 또한, CFP-DH2도 CFP-T7-H35보다 높은 비활성(5.30U/mg)를 나타내었다(표 14).
또, CFP-DH2에 도입한 변이(E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P)에 대해 본 발명자들은 이것이 아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 것을 확인하였다. 구체적으로 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 중의 상기 아마도리아제에 0.04%의 테트라데실트리메틸암모늄 클로리드(TTAC)를 작용시켜도 변이를 가지지 않는 CFP 유래 효소의 잔존 활성이 29.2%가 되는 데에 반해, 변이(E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P)를 도입한 것이 100%의 잔존 활성을 가지는 것을 확인하였다. 이들 변이의 효과는 일본특허출원 2013-221515호 및 PCT/JP2014/071036호 명세서에 기재되어 있고, 이들 문헌은 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입하는 것으로 한다. 또한, CFP-DH2에서의 카르복실 말단의 아미노산 서열의 결실에 대해 본 발명자들은 이것이 아마도리아제의 열 안정성을 향상시키는 것을 보고하였다. 이 결실의 효과는 국제공개 제2013/100006호 명세서에 기재되어 있다.
이러한 변이를 가지지 않는 아마도리아제는 계면활성제 처리 후이어도 활성이 잔존하고 있고, 적절한 양의 효소를 이용하면 HbA1c를 측정할 수 있다. 또한, 계면활성제 내성이 향상된 아마도리아제나 열 안정성이 향상된 아마도리아제를 이용하면 측정에 필요한 효소량을 저감할 수도 있다.
[실시예 3]
(각종 아마도리아제에의 점변이 도입)
상기 변이를 도입함으로써 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 αF6P에 대한 반응성이 상승하였다. 이로부터 서열 동일성에 기초하는 공지의 정렬 처리에 의한 정보를 참고하여 그 밖의 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 대응하는 위치에 동일한 변이를 도입함으로써, 마찬가지로 αF6P에 대한 반응성의 상승을 기대할 수 있다. 그래서, 실제로 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제 이외의 복수의 아마도리아제에도 대응하는 위치에 변이를 도입하였다.
1. Eupenicillium terrenum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입
서열 번호 40은 Eupenicillium terrenum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제(이후, EFP-T5라고 부름)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 40의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 41)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있고, EFP-T5는 αFV 및 αFVH 산화 활성을 나타내는 것이 확인되었다(국제공개 제2007/125779호 공보 및 국제공개 제2008/018094호 공보 참조).
EFP-T5에 기질 특이성 개선형 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하고 서열 번호 42, 43의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 EFP-T5 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-62D)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pUTE100K'-EFP-T5-62D를 주형으로 하고 서열 번호 44, 45의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴이 리신으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K를 주형으로 하고 서열 번호 46, 47의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴이 리신으로, 110위의 리신이 류신으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K/110L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K/110L을 주형으로 하고 서열 번호 48, 49의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴이 리신으로, 110위의 리신이 류신으로, 113위의 트레오닌이 리신으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K/110L/113K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K/110L/113K를 주형으로 하고 서열 번호 50, 51의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴이 리신으로, 110위의 리신이 류신으로, 113위의 트레오닌이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K/110L/113K/355S)를 얻었다.
나아가 상기와 같이 하여 pUTE100K'-EFP-T5-62D/106K/110L/113K/355S를 주형으로 하고 서열 번호 52, 53의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 106위의 아스파라긴이 리신으로, 110위의 리신이 류신으로, 113위의 트레오닌이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S)를 얻었다.
2. Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입
서열 번호 54는 Neocosmospora vasinfecta 유래 케토아민 옥시다아제(이후, NvFX라고 부름)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 54의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 55)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pET22b-NvFX를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있고, NvFX는 αFV 및 αFVH 산화 활성을 나타내는 것이 확인되어 있다(국제공개 제2012/018094호 공보 참조).
NvFX에 기질 특이성 개선형 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pET22b-NvFX를 주형으로 하고 서열 번호 56, 57의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 NvFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환된 NvFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-NvFX-62D)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-NvFX-62D를 주형으로 하고 서열 번호 58, 59의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 글리신이 리신으로 치환된 NvFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-NvFX-62D/106K)를 얻었다.
나아가 상기와 같이 하여 pET22b-NvFX-62D/106K를 주형으로 하고 서열 번호 60, 61의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아르기닌이 리신으로, 110위의 글루타민산이 류신으로 치환된 NvFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-NvFX-62D/106K/110L)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-NvFX-62D/106K/110L)주를 얻었다.
3. Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입
서열 번호 62는 프럭토실 펩티드 옥시다아제 활성을 부여하기 위해 59위의 세린을 글리신으로 치환한 Aspergillus nidulans 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제(이후, AnFX라고 부름)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 63)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있고, AnFX는 αFV 및 αFVH 산화 활성을 나타내는 것이 확인되어 있다(국제공개 제2012/018094호 공보 참조).
AnFX에 기질 특이성 개선형 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX를 주형으로 하고 서열 번호 64, 65의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 AnFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX-61D를 주형으로 하고 서열 번호 66, 67의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 105위의 글리신이 리신으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D/105K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX-61D/105K를 주형으로 하고 서열 번호 68, 69의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 105위의 글리신이 리신으로, 109위의 리신이 류신으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D/105K/109L)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-AnFX-61D/105K/109L)주를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX-61D/105K/109L를 주형으로 하고 서열 번호 112, 70의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 105위의 글리신이 리신으로, 109위의 리신이 류신으로, 112위의 세린이 리신으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D/105K/109L/112K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX-61D/105K/109L/112K를 주형으로 하고 서열 번호 71, 72의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 105위의 글리신이 리신으로, 109위의 리신이 류신으로, 112위의 세린이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D/105K/109L/112K/355S)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX-61D/105K/109L/112K/355S를 주형으로 하고 서열 번호 73, 74의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 62위의 류신이 히스티딘으로, 105위의 글리신이 리신으로, 109위의 리신이 류신으로, 112위의 세린이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D/62H/105K/109L/112K/355S)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX-61D/62H/105K/109L/112K/355S를 주형으로 하고 서열 번호 75, 76의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 62에 기재된 아미노산 서열의 61위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 62위의 류신이 히스티딘으로, 101위의 글루타민산이 리신으로, 105위의 글리신이 리신으로, 109위의 리신이 류신으로, 112위의 세린이 리신으로, 355위의 알라닌이 세린으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)주를 얻었다.
4. Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입
PnFX에 기질 특이성 개선형 변이를 도입하기 위해 전술한 바와 같이 조제한 재조합체 플라스미드 pET22b-PnFX를 주형으로 하고 서열 번호 77, 78의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 PnFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 38에 기재된 아미노산 서열의 62위의 세린이 아스파라긴산으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-62D)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX-62D를 주형으로 하고 서열 번호 79, 80의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 38에 기재된 아미노산 서열의 62위의 세린이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-62D/106K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX-62D/106K를 주형으로 하고 서열 번호 81, 82의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 38에 기재된 아미노산 서열의 62위의 세린이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글리신이 류신으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-62D/106K/110L)를 얻었다.
나아가 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX-62D/106K/110L를 주형으로 하고 서열 번호 83, 84의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 38에 기재된 아미노산 서열의 62위의 세린이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글리신이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-62D/106K/110L/113K)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX-62D/106K/110L/113K)주를 얻었다.
나아가 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX-62D/106K/110L/113K를 주형으로 하고 서열 번호 85, 86의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 38에 기재된 아미노산 서열의 62위의 세린이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글리신이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로, 351위의 알라닌이 세린으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-62D/106K/110L/113K/351S)를 얻었다.
나아가 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX-62D/106K/110L/113K/351S를 주형으로 하고 서열 번호 87, 88의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 38에 기재된 아미노산 서열의 62위의 세린이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 글리신이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로, 351위의 알라닌이 세린으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S)주를 얻었다.
5. Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입
서열 번호 89는 Cryptococcus neoformans 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제(이후, CnFX라고 부름)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 89의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 90)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pET22b-CnFX를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있고, CnFX는 αFV 및 αFVH 산화 활성을 나타내는 것이 확인되어 있다(국제공개 제2012/018094호 공보 참조).
CnFX에 기질 특이성 개선형 변이를 도입하기 위해 전술한 바와 같이 조제한 재조합체 플라스미드 pET22b-CnFX를 주형으로 하고 서열 번호 91, 92의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 CnFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환된 CnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-CnFX-62D)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-CnFX-62D를 주형으로 하고 서열 번호 93, 94의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 세린이 리신으로 치환된 CnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-CnFX-62D/106K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-CnFX-62D/106K를 주형으로 하고 서열 번호 95, 96의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 세린이 리신으로, 110위의 세린이 류신으로 치환된 CnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-CnFX-62D/106K/110L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX-62D/106K/110L를 주형으로 하고 서열 번호 97, 98의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 세린이 리신으로, 110위의 세린이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환된 CnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-CnFX-62D/106K/110L/113K)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-CnFX-62D/106K/110L/113K)주를 얻었다.
6. Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제 유전자에의 점변이 도입
(Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제의 생산주 제작)
서열 번호 99는 Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제이다(이후, Cc95FX라고 부름). 서열 번호 99의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 100)를 정법인 유전자 단편의 PCR에 의한 전체합성에 의해 cDNA를 전체합성함으로써 취득하였다. 이 때, 서열 번호 100의 5'말단, 3'말단에는 각각 NdeI 사이트와 BamHI 사이트를 부가하였다.
이어서, 취득한 서열 번호 100의 유전자를 대장균으로 발현시키기 위해 이하의 순서를 행하였다. 우선, 상기에서 전체합성한 유전자를 NdeI 사이트와 BamHI(다카라 바이오사 제품)의 2종류의 제한 효소로 처리하고 pET-22b(+) Vector(노바젠사 제품)의 NdeI-BamHI 사이트에 삽입함으로써 재조합체 플라스미드 pET22b-Cc95FX를 취득하고, 상기와 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-Cc95FX)주를 얻었다.
(Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제 유전자에의 점변이 도입)
Cc95FX에 기질 특이성 개선형 변이를 도입하기 위해 전술한 바와 같이 조제한 재조합체 플라스미드 pET22b-Cc95FX를 주형으로 하고 서열 번호 101, 102의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 Cc95FX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로 치환된 Cc95FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-Cc95FX-62D)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-Cc95FX-62D를 주형으로 하고 서열 번호 103, 104의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로 치환된 Cc95FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-Cc95FX-62D/106K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-Cc95FX-62D/106K를 주형으로 하고 서열 번호 105, 106의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 알라닌이 류신으로 치환된 Cc95FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-Cc95FX-62D/106K/110L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-Cc95FX-62D/106K/110L을 주형으로 하고 서열 번호 107, 108의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 알라닌이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로 치환된 Cc95FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-Cc95FX-62D/106K/110L/113K)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-Cc95FX-62D/106K/110L/113K를 주형으로 하고 서열 번호 109, 110의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 알라닌이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로, 353위의 알라닌이 세린으로 치환된 Cc95FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-Cc95FX-62D/106K/110L/113K/353S)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-Cc95FX-62D/106K/110L/113K/353S를 주형으로 하고 서열 번호 111, 102의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌이 아스파라긴산으로, 63위의 류신이 히스티딘으로, 106위의 아스파라긴산이 리신으로, 110위의 알라닌이 류신으로, 113위의 알라닌이 리신으로, 353위의 알라닌이 세린으로 치환된 Cc95FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S)주를 얻었다.
[실시예 4]
(각종 아마도리아제의 생산 및 정제)
(Eupenicillium terrenum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제의 생산 및 정제)
야생형 EFP-T5 및 전술한 바와 같이 하여 얻어진 개변형 EFP-T5를 생산하는 대장균 JM109(pUTE100K'-EFP-T5), 대장균 JM109(pUTE100K'-EFP-T5-62D), 대장균 JM109(pUTE100K'-EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S)를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
조제한 야생형 또는 개변형 EFP-T5의 조효소액에 황산 암모늄을 35% 포화 농도가 되도록 첨가하여 교반하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 상청을 회수하였다. 이어서, 얻어진 상청에 황산 암모늄을 70% 포화 농도가 되도록 추가 첨가하여 교반하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 상청을 폐기하고 침전물을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해시켰다.
얻어진 야생형 또는 개변형 EFP-T5의 조효소액을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.5)으로 투석한 후, 이 완충액으로 평형화한 4ml의 Q Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사 제품)에 제공하고, 이 완충액으로 수지에 흡착되지 않은 단백질을 용출시켰다. 이어서, 얻어진 야생형 또는 개변형 EFP-T5M의 조효소액을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 투석한 후, 이 완충액으로 평형화한 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP 칼럼(GE 헬스케어사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 이 완충액으로 수지를 세정하고, 이어서 이 완충액 중의 NaCl의 농도를 0mM에서 100mM까지 직선적으로 증가시키면서 수지에 흡착되어 있던 야생형 또는 개변형 EFP-T5를 용출시켜 회수하였다.
얻어진 야생형 또는 개변형 EFP-T5를 포함하는 조효소액을 150mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/600 Superdex 200 칼럼에 어플라이하여 이 완충액으로 야생형 또는 개변형 EFP-T5를 용출시켜 프럭토실 아미노산 옥시다아제 활성(아마도리아제 활성)을 나타내는 프랙션을 회수하였다. 얻어진 프랙션을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 야생형 또는 개변형 EFP-T5의 정제 표품으로 하였다.
(Neocosmospora vasinfecta 유래 케토아민 옥시다아제의 생산 및 정제)
야생형 NvFX 및 전술한 바와 같이 하여 얻어진 개변형 NvFX를 생산하는 대장균 BL21(DE3)(pET22b-NvFX), 대장균 BL21(DE3)(pET22b-NvFX-62D/106K/110L)을 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
조제한 조효소액을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 평형화한 Q Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 20mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 수지를 세정하고, 이어서 300mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 수지에 흡착되어 있던 야생형 또는 개변형 NvFX를 용출시켜 회수하였다.
얻어진 야생형 NvFX 또는 개변형 NvFX를 포함하는 조효소액을 150mM NaCl를 포함하는 20mM MES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/600 Superdex 200 칼럼에 어플라이하여 이 완충액으로 야생형 NvFX 또는 개변형 NvFX를 용출시켜 프럭토실 아미노산 옥시다아제 활성(아마도리아제 활성)을 나타내는 프랙션을 회수하였다. 얻어진 프랙션을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 야생형 또는 개변형 NvFX의 정제 표품으로 하였다.
(Aspergillus nidulans 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제의 생산 및 정제)
야생형 AnFX 및 전술한 바와 같이 하여 얻어진 개변형 AnFX를 생산하는 대장균 BL21(DE3)(pET22b-AnFX-61D/105K/109L) 및 대장균 BL21(DE3)(pET22b-AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)을 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
조제한 조효소액을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 SP Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 20mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0)으로 수지를 세정하고, 이어서 100mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0)으로 수지에 흡착되어 있던 개변형 AnFX를 용출시켜 회수하였다.
얻어진 개변형 AnFX를 포함하는 조효소액을 150mM NaCl를 포함하는 20mM MES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/600 Superdex 200 칼럼에 어플라이하여 이 완충액으로 개변형 AnFX를 용출시켜 프럭토실 아미노산 옥시다아제 활성(아마도리아제 활성)을 나타내는 프랙션을 회수하였다. 얻어진 프랙션을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 개변형 AnFX의 정제 표품으로 하였다.
(Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제의 생산 및 정제)
전술한 바와 같이 하여 얻어진 개변형 AnFX를 생산하는 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX-62D/106K/110L/113K) 및 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S)을 전술한 야생형 PnFX의 정제 방법에 따라 정제하였다. HiLoad 26/600 Superdex 200 칼럼에 의한 정제 종료 후 SDS-PAGE에 의해 순도를 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 개변형 PnFX의 정제 표품으로 하였다.
(Cryptococcus neoformans 유래 케토아민 옥시다아제의 생산 및 정제)
야생형 CnFX 및 전술한 바와 같이 하여 얻어진 개변형 CnFX를 생산하는 대장균 BL21(DE3)(pET22b-CnFX), 대장균 BL21(DE3)(pET22b-CnFX-62D/106K/110L/113K)을 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
조제한 조효소액을 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 평형화한 Q Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 20mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 수지를 세정하고, 이어서 300mM NaCl를 포함하는 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 수지에 흡착되어 있던 야생형 또는 개변형 CnFX를 용출시켜 회수하였다.
얻어진 야생형 CnFX 또는 개변형 CnFX를 포함하는 조효소액을 150mM NaCl를 포함하는 20mM MES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/600 Superdex 200 칼럼에 어플라이하여 이 완충액으로 야생형 CnFX 또는 개변형 CnFX를 용출시켜 프럭토실 아미노산 옥시다아제 활성(아마도리아제 활성)을 나타내는 프랙션을 회수하였다. 얻어진 프랙션을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 다른 협잡 단백질을 포함하지 않는 순도까지 정제되어 있는 것을 확인하여 야생형 또는 개변형 CnFX의 정제 표품으로 하였다.
(Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제의 생산)
야생형 Cc95FX 및 전술한 바와 같이 하여 얻어진 개변형 Cc95FX를 생산하는 대장균 JM109(pET22b-Cc95FX) 및 대장균 JM109(pET22b-Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/355S)를 종농도 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지에 식균하고 25℃에서 16시간 배양하였다. 얻어진 각 배양 균체를 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정한 후, 이 완충액에 균체를 현탁하여 초음파 파쇄 처리를 행하고, 20,000×g로 10분간 원심분리하여 조효소액을 조제하였다.
얻어진 각종 아마도리아제의 야생형 효소 및 개변형 효소의 정제 표품을 이용하여 αF6P를 기질로 하였을 때의 비활성을 측정하였다. 결과를 표 15에 나타낸다. 또, 비활성 산출에 이용한 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도를 이용한 자외 흡수법에 의해 측정하였다(Protein Sci. 4, 2411-23, 1995 참조).
또한, Cc95FX 또는 Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/355S를 포함하는 조효소액을 이용하여 상기 B: 활성 측정법에 나타낸 방법에 의해 αFV, αFVH, αF6P에 대한 산화 활성을 측정하였다. 각각의 아마도리아제에 대해 αFVH 산화 활성을 100으로 한 경우의 각 기질에 대한 산화 활성과 αF6P/αFVH 및 αF6P/αFV는 표 16과 같이 되었다.
Figure 112016048093690-pct00018
Figure 112016048093690-pct00019
본 명세서에 기재된 순서로 제작한 Coniochaeta 유래 아마도리아제(CFP-T7; 비교예 1)와 비교하여 αF6P에 대한 반응성을 부여 또는 증강하는 아미노산 치환을 각종 아마도리아제에 도입한 결과, 예상대로 EFP-T5, NvFX, AnFX, CnFX에는 αF6P에 대한 반응성이 새로이 부여되었다. 또한, PnFX는 종래부터 αF6P에 대한 반응을 약간이지만 나타내었지만, 본 명세서에 기재된 아미노산 치환의 도입에 의해 αF6P에 대한 비활성이 13.7배 향상되었다.
또한, 본 명세서에 기재된 순서로 제작한 Coniochaeta 유래 아마도리아제(CFP-T7; 비교예 1)와 비교하여 αF6P에 대한 반응성을 부여 또는 증강하는 아미노산 치환을 본 명세서에 기재된 순서로 제작한 Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제(Cc95FX; 비교예 8)에 도입한 결과, 예상대로 Cc95FX에는 αF6P에 대한 반응성이 새로이 부여되고, Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/355S에서는 αF6P 산화 활성이 αFVH 산화 활성을 웃돌았다.
즉, 본 명세서에 기재된 Coniochaeta 유래 아마도리아제에 대해 αF6P에 대한 반응성을 부여 또는 증강하는 아미노산 치환의 효과는 Coniochaeta 유래 아마도리아제에 대해서만 한정되는 것은 아니고, 도 1~5 및 도 6~10에 도시된 바와 같은 Coniochaeta 유래 아마도리아제와 74% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제이면 보편적으로 마찬가지로 αF6P에 대한 반응성이 부여 또는 증강되었다.
표 15로부터, AnFX에 변이 61D/105K/110L를 도입한 아마도리아제 30은 αF6P에 대해 0.1 이상의 비활성을 나타내었다. 즉, 효소에 3중 변이를 도입함으로써 αF6P에 대해 0.1 이상의 비활성을 나타내는 개변 아마도리아제를 취득할 수 있었다. 또한, PnFX에 62D/106K/110L/113K를 도입한 아마도리아제 32도 αF6P에 대해 0.1 이상의 비활성을 나타내었다. 즉, 효소에 4중 변이를 도입함으로써 αF6P에 대해 0.1 이상의 비활성을 나타내는 개변 아마도리아제를 취득할 수 있었다. 또한, 변이를 더욱 도입함으로써 αF6P에 대한 비활성을 더욱 향상시킬 수 있었다.
본 명세서에서는 도입하는 치환의 효과가 누적되는 것을 나타내었다. 따라서, 아마도리아제의 αF6P에 대한 활성을 향상시키는 변이는 어느 특정의 변이에 한정되지 않고, 어느 특정의 조합에 한정되지 않으며, 본 명세서에 나타낸 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위 및 356위, 나아가 αF6P에 대한 활성을 향상시키는 그 이외의 위치의 변이가 임의의 조합으로서 사용 가능하다고 당업자라면 이해한다. 또한 실시예 5~7에서 후술하는 바와 같이, 이러한 αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제가 본 발명의 HbA1c 측정 방법에 사용할 수 있다고 당업자라면 이해한다.
이하의 표에 비교예와 본 발명의 변이체의 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위 및 419위의 아미노산 및 치환이 있으면 치환 후의 아미노산의 관계를 나타낸다.
Figure 112016048093690-pct00020
Figure 112016048093690-pct00021
Figure 112016048093690-pct00022
Figure 112016048093690-pct00023
Figure 112016048093690-pct00024
Figure 112016048093690-pct00025
[실시예 5]
(HbA1c의 정량)
이하의 조성을 가지는 HbA1c 측정용 시약을 조제하고, Bio Majesty JCA-BM1650(니혼 전자 제품)를 이용하여 하기와 같이 HbA1c의 측정을 실시하였다.
시료: HbA1c 용액
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423-8(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 5.56%, 7.74%, 10.48%)
시약 A1: 시료 전처리액
5.0% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
시약 A2: 시료 전처리액
5.0% n-테트라데실-β-D-말토시드(시그마 알드리치사 제품)
시약 B: 류코 색소, 퍼옥시다아제 용액
150mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
0.30mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
15U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
시약 C1: CFP-T7-H35 용액
120mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
120U/ml(28mg/ml) CFP-T7-H35(아마도리아제 25)
시약 C2: CFP-T7 용액
120mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
28mg/ml CFP-T7(비교예 1)
시약 A1 혹은 시약 A2로 30배 희석한 시료(이후, 시료 희석액이라고 표기함)를 98℃에서 2분간 인큐베이트한 후, 시료 희석액 25μl를 50μl의 시약 B에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 25μl의 시약 C1 또는 시약 C2를 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시켰다. 용액 중에 과산화수소가 생성된 경우, 퍼옥시다아제의 작용에 따라 류코 색소가 발색하여 751nm의 광의 흡광도가 증가한다. 일례로서 시약 A2와 시약 C1을 사용하여 측정을 행한 경우의 시료 희석액과 시약 B를 혼합하고 나서 경과 시간과 흡광도의 관계를 도 11에 나타내었지만, 이 경우 CFP-T7-H35 용액(시약 C1)의 첨가 직후부터 과산화수소의 생성에 따른 흡광도 상승을 확인할 수 있었다. 시료의 HbA1c 농도에 따라 얻어진 결과를 기초로 시료의 HbA1c 농도(NGSP값)를 가로축에, 과산화수소의 정량 반응 전후의 751nm의 광의 흡광도차 ΔA를 세로축에 플롯한 그래프를 작성하였다.
또, ΔA는 하기의 식에 따라 산출하였다.
ΔA=(시약 C1 또는 시약 C2 첨가 5분 후의 흡광도)-(시약 C1 또는 시약 C2 첨가 직전의 흡광도×0.75)
여기서는 시약 C1 또는 시약 C2 첨가에 의해 반응액의 용적이 1.33배가 되기 때문에 시약 C1 또는 시약 C2 첨가 직전의 흡광도에 0.75를 곱한 것을 시약 C1 또는 시약 C2 첨가 직후의 흡광도로 보았다. 시약 A1을 이용하여 시료를 희석한 경우의 결과를 도 12에, 시약 A2를 이용하여 시료를 희석한 경우의 결과를 도 13에 나타내었다.
시약 C1을 이용한 경우, HbA1c 농도와 ΔA의 사이에 양호한 상관 관계가 성립하였다. 이에 대조적으로 시약 C2를 이용한 경우 HbA1c 농도와 ΔA의 사이에 상관성은 인정받지 못하였다. 또한, 이 경향은 시약 전처리액(시약 A1, A2)의 종류에 따라 영향을 받는 일은 없었다. 따라서, αF6P 산화 활성을 나타내는 아마도리아제는 HbA1c의 β쇄에 대해서도 산화 활성을 나타내고, 프로테아제 등을 처방하지 않고 신속하고 정확하게 HbA1c의 정량을 행할 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 6]
(산으로 전처리한 HbA1c의 정량)
이하의 조성을 가지는 HbA1c 측정용 시약을 조제하고, Bio Majesty JCA-BM1650(니혼 전자 제품)을 이용하여 하기와 같이 HbA1c의 측정을 실시하였다. 본 실시예에서는 HbA1c 시료의 전처리액으로서 산성으로 조정한 비이온성 계면활성제 용액을 이용하였다.
시료: HbA1c 용액
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423-8(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 5.56%, 7.74%, 10.48%)
또는
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423-9 b(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 5.61%, 7.71%, 10.55%)
시약 D1: 시료 전처리액
8.3% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
0.1M 염산
시약 D2: 시료 전처리액
8.3% 폴리옥시에틸렌(20) 세틸에테르(Brij58, 와코 순약공업 제품)
0.1M 염산
시약 E: 류코 색소 용액
30mM Tris-인산 칼륨 완충액 pH 9.0
290mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
0.16mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
시약 F1: 퍼옥시다아제, CFP-T7-H35 용액
100mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
180U/ml(42mg/ml) CFP-T7-H35(아마도리아제 25)
시약 F2: 퍼옥시다아제, EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S
100mM 인산 칼륨 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
30U/ml(27mg/ml) EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S 용액(아마도리아제 28)
시약 D1 혹은 시약 D2로 30배 희석한 시료 25μl를 125μl의 시약 E에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 50μl의 시약 F1을 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시켰다. 또한, 시약 D1로 30배 희석한 시료 25μl를 125μl의 시약 E에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 50μl의 시약 F2를 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시켰다. 일례로서 시약 D1로 희석한 시료와 시약 E를 혼합하고 나서 경과 시간과 흡광도의 관계를 도 14에 나타내었지만, 이 경우 CFP-T7-H35 용액(시약 F1)의 첨가 직후부터 과산화수소의 생성에 따른 흡광도 상승을 확인할 수 있었다. 각 HbA1c 시료의 측정 결과로부터 시료의 HbA1c 농도(NGSP값)를 가로축에, 과산화수소의 정량 반응 전후의 751nm의 광의 흡광도차 ΔA를 세로축에 플롯한 그래프를 작성하였다.
또, ΔA는 하기의 식에 따라 산출하였다.
ΔA=(시약 F1 또는 F2 첨가 5분 후의 흡광도)-(시약 F1 또는 F2 첨가 직전의 흡광도×0.75)
여기서는 시약 F1 또는 F2 첨가에 의해 반응액의 용적이 1.33배가 되기 때문에 시약 F1 또는 F2 첨가 직전의 흡광도에 0.75를 곱한 것을 시약 F1 또는 F2 첨가 직후의 흡광도로 보았다. 시약 D1 및 F1를 이용하여 시료를 측정한 경우의 결과를 도 15에, 시약 D2 및 F1를 이용하여 시료를 측정한 경우의 결과를 도 16에, 시약 D1 및 F2를 이용하여 시료를 측정한 경우의 결과를 도 17에 나타내었다.
시료의 희석에 시약 D1 및 시약 D2 중 어느 것을 이용한 경우에도 HbA1c 농도와 ΔA의 사이에 양호한 상관관계가 성립하였다. 따라서, αF6P 산화 활성을 나타내는 아마도리아제를 이용하여 변성시킨 HbA1c를 측정하는 경우에는 HbA1c를 산처리에 의해 변성시켜도 신속하고 정확하게 HbA1c의 정량을 행할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 변성용 산성 용액 중에 비이온성 계면활성제를 공존시키는 경우 비이온성 계면활성제의 종류는 한정되지 않는 것도 나타났다. 나아가 다른 종에 유래하는 개변 아마도리아제를 이용하여 HbA1c를 직접 측정할 수 있기 때문에 HbA1c를 직접 측정하기 위한 아마도리아제는 αF6P에 대해 일정한 반응성을 나타내는 것이면 특별히 한정되지 않는 것도 나타났다.
[실시예 7]
(이온성 계면활성제로 전처리한 HbA1c의 정량)
이하의 조성을 가지는 HbA1c 측정용 시약을 조제하고, Bio Majesty JCA-BM1650(니혼 전자 제품)을 이용하여 하기와 같이 HbA1c의 측정을 실시하였다. 본 실시예에서는 HbA1c 시료의 전처리액으로서 이온성 계면활성제 용액을 이용하였다.
시료: HbA1c 용액
HbA1c 인증 실용 표준 물질 JCCRM423-9b(검사 의학 표준 물질 기구 제품)
총 헤모글로빈 농도 133g/l,
HbA1c 농도 3레벨(NGSP값 5.61%, 7.71%, 10.55%)
시약 G1: 시료 전처리액
0.80% 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드(도쿄 화성공업 제품)
시약 G2: 시료 전처리액
0.70% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(도쿄 화성공업 제품)
시약 H1: 류코 색소 용액
120mM MOPS-NaOH 완충액 pH 6.5
1.6% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
0.16mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
시약 H2: 류코 색소 용액
120mM PIPES-NaOH 완충액 pH 6.5
1.6% n-도데실-β-D-말토시드(도진 화학 연구소 제품)
0.16mM N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨(DA-64, 와코 순약공업 제품)
시약 I1: 퍼옥시다아제, CFP-DH2 용액
100mM MOPS-NaOH 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
160U/ml(51mg/ml) CFP-DH2(아마도리아제 39)
시약 I2: 퍼옥시다아제, CFP-DH2 용액
100mM PIPES-NaOH 완충액 pH 6.5
40U/ml 퍼옥시다아제(기꼬만 제품)
160U/ml CFP-DH2
시약 G1로 25배 희석한 시료 25μl를 125μl의 시약 H1에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 50μl의 시약 I1을 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시켰다. 또한, 시료를 시약 G2로 25배 희석한 경우는 희석 시료 25μl를 125μl의 시약 H2에 첨가하여 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 50μl의 시약 I2를 첨가하여 HbA1c의 β쇄 아미노 말단의 산화에 의해 생성되는 과산화수소의 정량 반응을 37℃에서 5분간 진행시켰다. 일례로서 시약 G1로 희석한 시료를 시약 H1을 혼합하고 나서 경과 시간과 흡광도의 관계를 도 18에 나타내었지만, 이 경우 CFP-DH2 용액(시약 I1)의 첨가 직후부터 과산화수소의 생성에 따른 흡광도 상승을 확인할 수 있었다. 각 HbA1c 시료의 측정 결과로부터, 시료의 HbA1c 농도(NGSP값)를 가로축에, 과산화수소의 정량 반응 전후의 751nm의 광의 흡광도차 ΔA를 세로축에 플롯한 그래프를 작성하였다.
또, ΔA는 하기의 식에 따라 산출하였다.
ΔA=(시약 I1 또는 I2 첨가 5분 후의 흡광도)-(시약 I1 또는 I2 첨가 직전의 흡광도×0.75)
여기서는 시약 I1 또는 I2의 첨가에 의해 반응액의 용적이 1.33배가 되기 때문에 시약 I1 또는 I2 첨가 직전의 흡광도에 0.75를 곱한 것을 시약 I1 또는 I2 첨가 직후의 흡광도로 보았다. 시약 G1을 이용하여 시료를 희석한 경우의 결과를 도 19에, 시약 G2를 이용하여 시료를 희석한 경우의 결과를 도 20에 나타내었다.
시료의 희석에 시약 G1 및 시약 G2 중 어느 것을 이용한 경우에도 HbA1c 농도와 ΔA의 사이에 양호한 상관관계가 성립하였다. 따라서, αF6P 산화 활성을 나타내는 아마도리아제를 이용하여 변성시킨 HbA1c를 측정하는 경우에는 HbA1c를 이온성 계면활성제에 의해 변성시켜도 신속하고 정확하게 HbA1c의 정량을 행할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 본 측정을 실시할 때에는 HbA1c의 변성에 이용하는 이온성 계면활성제의 종류는 한정되지 않는 것도 나타났다.
상기와 같이 CFP-T7-H35는 야생형 효소(CFP-T7)에서는 기질로 할 수 없었던 펩티드 쇄길이가 긴 당화 펩티드(αF6P)도 기질로 하였다. 이 CFP-T7-H35를 이용하여 HbA1c로부터 αF6P를 절단하기 위한 프로테아제 등으로의 처리 공정을 거치지 않고 HbA1c의 직접 측정을 시도한 바, 놀랍게도 실시예 5에 기재된 바와 같이 시료 중의 HbA1c 농도를 결정할 수 있었다. HbA1c에 직접 작용하는 아마도리아제는 현재까지 발견되지 않았고 그 보고예는 전혀 없다. 따라서, αF6P를 기질로 하는 아마도리아제가 HbA1c에 직접 작용하는 것은 놀랄 만한 지견이다.
그러나, αF6P를 기질로 하는 아마도리아제가 HbA1c에 직접 작용하는 예가 상기 실시예에서 실증된 이상, CFP-T7-H35와 마찬가지로 αF6P에 대한 활성을 가지는 다른 아마도리아제도 직접 HbA1c의 β쇄를 기질로 할 가능성이 시사된다. 특히 αF6P에 대한 비활성이 높은 아마도리아제이면 본 발명의 아마도리아제와 같이 HbA1c에 직접 작용하고, 따라서 HbA1c의 정량 측정에 이용할 수 있을 개연성이 높다고 생각된다.
이를 검증한 바, 실시예 6에 나타내는 바와 같이 αF6P에 대한 비활성이 높은 EFP-T5 유래의 아마도리아제 28을 이용한 결과, 이 효소도 HbA1c에 직접 작용하였다(도 17). 이에 따라, αF6P에 대한 활성이 높은 본 발명의 아마도리아제와 같이 HbA1c에 직접 작용하고, 따라서 HbA1c의 정량 측정에 이용할 수 있는 것이 실증되었다. 다른 αF6P에 대한 비활성이 높은 아마도리아제에 대해서도 동일하다고 생각된다. 상기에서는 실험의 편의상 비활성이 1.0U/mg 이상인 효소를 이용하였지만, 당업자라면 0.1U/mg의 비활성 효소를 10배량으로 사용할 수도 있다고 이해된다.
또한, 본 발명의 지견은 αF6P 활성을 가지는 아마도리아제가 HbA1c에 직접 작용할 수 있는 것을 나타내는 데에 그치는 것은 아니고, 마찬가지로 α-프럭토실 올리고펩티드, 예를 들어 αF3P, αF4P, αF5P, αF7P, αF8P, αF10P, αF16P 등에 대한 활성을 나타내는 아마도리아제이면 마찬가지로 HbA1c에 직접 작용할 가능성이 있다.
이상과 같이 본 발명의 아마도리아제를 이용한 HbA1c 측정 방법은 HbA1c의 프로테아제 등으로의 처리를 필요로 하지 않고 HbA1c를 신속, 간편하며 정밀도 높고 양호하게 정량할 수 있다. 또한, 변성시킨 HbA1c를 측정하는 경우, HbA1c를 변성시키는 수법은 특별히 제한을 받는 일은 없다. 이에 의해 효소법에 따른 HbA1c의 직접 측정이 실현되어 산업상 이용가치가 기대된다.
서열표의 간단한 설명
서열 번호 1 Coniochaeta sp. NISL 9330 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 2 서열 번호 1의 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 3-33 PCR 프라이머
서열 번호 34 PCR 프라이머
서열 번호 35 PCR 프라이머
서열 번호 36 Aspergillus oryzae RIB40(FAOAo2) 아미노산 서열
서열 번호 37: FAOAo2 염기 서열
서열 번호 38 Phaeosphaeria nodorum(PnFX) 아미노산 서열
서열 번호 39 PnFX 염기 서열
서열 번호 40 Eupenicillium terrenum(EFP-T5) 아미노산 서열
서열 번호 41 EFP-T5 염기 서열
서열 번호 42-53 PCR 프라이머
서열 번호 54 Neocosmospora vasinfecta(NvFX) 아미노산 서열
서열 번호 55 NvFX 염기 서열
서열 번호 56-61 PCR 프라이머
서열 번호 62 S59G 치환 Aspergillus nidulans(AnFX) 아미노산 서열
서열 번호 63 AnFX 염기 서열
서열 번호 64-88 PCR 프라이머
서열 번호 89 Cryptococcus neoformans(CnFX) 아미노산 서열
서열 번호 90 CnFX 염기 서열
서열 번호 91-98 PCR 프라이머
서열 번호 99 Curvularia clavata 케토아민 옥시다아제와 95%의 서열 동일성을 나타내는 아마도리아제(Cc95FX) 아미노산 서열
서열 번호 100 Cc95FX 염기 서열
서열 번호 101-112 PCR 프라이머
서열 번호 113 Pyrenochaeta sp.(Py) 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 114 Pyrenochaeta sp.(Py) 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 115 Arthrinium sp.(Ar) 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 116 Arthrinium sp.(Ar) 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 117 Curvularia clavata(Cc) 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 118 Curvularia clavata(Cc) 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 119 Emericella nidulans(En) 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 120 Emericella nidulans(En) 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 121 Ulocladium sp.(Ul) 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 122 Ulocladium sp.(Ul) 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 123 Penicillium janthinellum(Pj) 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 124 Penicillium janthinellum(Pj) 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 125 Aspergillus fumigatus Amadoriase I의 아미노산 서열
서열 번호 126 Amadoriase I 염기 서열
서열 번호 127 Aspergillus oryzae FAOAo1 아미노산 서열
서열 번호 128 FAOAo1 염기 서열
서열 번호 129 Aspergillus fumigatus Amadoriase II 아미노산 서열
서열 번호 130 Amadoriase II 염기 서열
서열 번호 131 Aspergillus terreus FAOD-A 아미노산 서열
서열 번호 132 FAOD-A 염기 서열
서열 번호 133 CFP-T7-H20(R62D, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 134 CFP-T7-H20 염기 서열
서열 번호 135 PnFPOX(S62D, D106K, G110L, A113K) Phaeosphaeria nodorum 아미노산 서열
서열 번호 136 서열 번호 135의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 137 (아마도리아제 29) NvFX-62D/106K/110L(R62D, G106K, E110L) Neocosmospora vasinfecta 아미노산 서열
서열 번호 138 서열 번호 137의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 139 (아마도리아제 30) AnFX-61D/105K/109L(S59G, R61D, G105K, K1091L) Aspergillus nidulans 아미노산 서열
서열 번호 140 서열 번호 139의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 141 (아마도리아제 25) CFP-T7-H35(R62D, L63H, E102K, D106K, Q110L, A113K, A355S) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 142 CFP-T7-H35 염기 서열
서열 번호 143 (아마도리아제 28) EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S Eupenicillium terrenum 아미노산 서열
서열 번호 144 서열 번호 143의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 145 Eupenicillium terrenum 야생형 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 146 Eupenicillium terrenum 야생형 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 147 AnFX 야생형 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 148 AnFX 야생형 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 149 CnFX 야생형 아마도리아제의 아미노산 서열
서열 번호 150 CnFX 야생형 아마도리아제의 염기 서열
서열 번호 151 (아마도리아제 1) CFP-T7-H1(R62A) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 152 CFP-T7-H1 염기 서열
서열 번호 153 (아마도리아제 26) CFP-T7-62D(R62D) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 154 CFP-T7-62D 염기 서열
서열 번호 155(아마도리아제 27) EFP-T5-R62D(R62D) Eupenicillium terrenum 아미노산 서열
서열 번호 156 EFP-T5-R62D 염기 서열
서열 번호 157 (아마도리아제 2) CFP-T7-H2(R62A, Q110L) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 158 CFP-T7-H2 염기 서열
서열 번호 159 (아마도리아제 4) CFP-T7-H4(R62A, Q110Y) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 160 CFP-T7-H4 염기 서열
서열 번호 161 (아마도리아제 5) CFP-T7-H2-62N(R62N, Q110L) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 162 CFP-T7-H2-62N 염기 서열
서열 번호 163 (아마도리아제 6) CFP-T7-H6(R62D, Q110L) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 164 CFP-T7-H6 염기 서열
서열 번호 165 (아마도리아제 12) CFP-T7-H10(R62D, D106A, Q110L) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 166 CFP-T7-H10 염기 서열
서열 번호 167 (아마도리아제 13) CFP-T7-H11(R62D, D106K, Q110L) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 168 CFP-T7-H11 염기 서열
서열 번호 169 (아마도리아제 14) CFP-T7-H12(R62D, D106R, Q110L) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 170 CFP-T7-H12 염기 서열
서열 번호 171 (아마도리아제 15) CFP-T7-H13(R62D, Q110L, A113K) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 172 CFP-T7-H13 염기 서열
서열 번호 173 (아마도리아제 16) CFP-T7-H14(R62D, Q110L, A113R) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 174 CFP-T7-H14 염기 서열
서열 번호 175 (아마도리아제 18) CFP-T7-H21(R62D, D106K, Q110L, A113R) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 176 CFP-T7-H21 염기 서열
서열 번호 177 (아마도리아제 19) CFP-T7-H24(R62D, L63A, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 178 CFP-T7-H24 염기 서열
서열 번호 179 (아마도리아제 21) CFP-T7-H26(R62D, L63H, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 180 CFP-T7-H26 염기 서열
서열 번호 181 (아마도리아제 23) CFP-T7-H28(R62D, L63H, E102K, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 182 CFP-T7-H28 염기 서열
서열 번호 183 (아마도리아제 24) CFP-T7-H29(R62D, L63H, D106K, Q110L, A113K, A419K) Coniochaeta sp. 아미노산 서열
서열 번호 184 CFP-T7-H29 염기 서열
서열 번호 185 (아마도리아제 31) (AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S) Aspergillus nidulans 아미노산 서열
서열 번호 186 서열 번호 185의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 187 (아마도리아제 33) (PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S) Phaeosphaeria nodorum 아미노산 서열
서열 번호 188 서열 번호 187의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 189 (아마도리아제 34) (CnFX-62D/106K/110L/113K) Cryptococcus neoformans 아미노산 서열
서열 번호 190 서열 번호 189의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 191 (아마도리아제 35) (Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S) Curvularia clavata 아미노산 서열
서열 번호 192 서열 번호 191의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 193-198 PCR 프라이머
서열 번호 199 CFP-DH1(Coniochaeta sp. NISL 9330 유래) (개변형 아마도리아제 36, CFP-T7-H36) (CFP-T7-R62D/L63H/D68N/E102K/D106K/Q110L/A113K/A355S/E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P/ΔP435/ΔK436/ΔL437)의 아미노산 서열
서열 번호 200 서열 번호 199의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열
서열 번호 201-202 PCR 프라이머
서열 번호 203 CFP-DH2(Coniochaeta sp. NISL 9330 유래) (아마도리아제 39)의 아미노산 서열
서열 번호 204 서열 번호 203의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> Method for determining hemoglobin A1c and kit thereof <130> PH-6001-PCT <150> JP 2013-222774 <151> 2013-10-25 <160> 204 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 1 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Gln Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Gly 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Gln Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys Tyr Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Pro Lys Leu 435 <210> 2 <211> 1314 <212> DNA <213> Coniochaeta sp. <400> 2 atgacgtcga atcgtgcaga tacaagggtg attgtcgtcg gtggcggagg aacgattggt 60 tcctcgacag cgctgcatct tgtgaggagt ggttatgctc ccgcaaatat cacggtcttg 120 gacacatttg agattccatc ggctcaatca gccggccatg atctcaacaa gatcatggga 180 atacgactgc gcaacaaggt ggacctgcaa atgagtctag aggctagaca gatgtggaag 240 gaggatgagt tattccagcc cttctttcac aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgaggacct gaaaaagcag taccaggcac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 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Artificial <220> <223> primer <400> 31 gcgaacacac gcctaagggt atcgagaaac 30 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 acgtctagac ttgagtgcat cgcctcctg 29 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 tcaagtctag acgtaaggca ccgccaaaag 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 acagacactg cggactctgc tctcttgatg 30 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 gtccgcagtg tctgtacacc agcacaag 28 <210> 36 <211> 436 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 36 Met Thr Val Thr Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly Thr 1 5 10 15 Trp Gly Ala Ser Thr Ala Leu His Leu Gly Arg Arg Gly Tyr Thr Asn 20 25 30 Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Thr Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly 35 40 45 Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Asn Lys Lys 50 55 60 Asp Glu Ile Glu Val Asn Glu Ile Leu Ala Glu Glu Ala Phe Lys Gly 65 70 75 80 Trp Thr Thr Asp Pro Leu Phe Lys Pro Tyr Tyr His Asp Thr Gly 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ggtccgctca ggctataccc cgtcgaacat tacggttctg 120 gatgcatacc cgattccgag ctctcagagc gctggcaacg acctgaataa aatcatgggt 180 atccgtctgc gtaataaggt ggatctgcag ctgtctctgg aagcgcgcca aatgtggcgc 240 gaagacgatc tgttcaagga gtatttccat aacaccggcc gtctggattg cgcgcacggt 300 gaagaaggtc ttgccgacct gcgtcaagcc tatcaggctc tgctggatgc gaatgcgggt 360 ctggaagaga cgaccgaatg gctggatagt gaagacgaaa tcctgaaaaa aatgccgctg 420 ctgtcccgcg atcaaattaa aggctggaag gcggtgtatt cacaggacgg tggttggctg 480 gcagcagcaa aggcaattaa tgcaattggt gaatatctgc gtgctcaggg cgtcaaattc 540 ggttttggcg gcgccggttc tttcaaacaa ccgctgctgg ctgaaggcgt ctgcatcggt 600 gtcgaaaccg tggatggcac gcgctattac gcagacaaag tggttctggc tgcaggtgca 660 tggtcgccga ccctggttga actgcatgaa cagtgtgtga gcaaagcgtg ggtttacggc 720 cacattcaac tgacgccgga agaagccgca gaatataaga acagcccggt cgtgtacaat 780 ggcgatgtgg gctttttctt tgaaccgaac gaacatggcg ttatcaaagt ctgcgatgaa 840 tttccgggtt ttacccgctt caagatgcac cagccgtttg gtgccaaagc accgaagcgt 900 attagtgtgc cgcgctccca tgccaaacac ccgaccgata cgatcccgga tgcaagtgaa 960 aaatccattc gtaaagctat cgcgaccttt ctgccgaagt tcacggagaa agagctgttc 1020 aaccgtcatc tgtgctggtg taccgatacg gccgacgctg cgctgctgat ttgtgaacat 1080 ccggaatgga aaaactttgt tctggcgacc ggcgattcag gtcattcgtt caaactgctg 1140 ccgaatatcg gcaagcacgt tgtcgaactg ctggagggta cgctggcaga tgacctggca 1200 cacgcatggc gttggcgtcc gggtagtggt gatgcactga aaagccgtcg ctctgctccg 1260 gcgaaagacc tggctgatat gccgggctgg aaacatgacg atgtggtgaa aagcaaactg 1320 taa 1323 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 101 atcatgggta tcgatctgcg taataaggtg 30 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 102 cagagacagc tgcagatcca ccttattacg 30 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 103 gaaggtcttg ccaaactgcg tcaagcctat 30 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 104 atccagcaga gcctgatagg cttgacgcag 30 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 105 cttgccaaac tgcgtcaact gtatcaggct 30 <210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 106 acccgcattc gcatccagca gagcctgata 30 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 107 cgtcaactgt atcagaaact gctggatgcg 30 <210> 108 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 108 ctcttccaga cccgcattcg catccagcag 30 <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 109 gatacggccg acagcgcgct gctgatttgt 30 <210> 110 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 110 ccattccgga tgttcacaaa tcagcagcgc 30 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 111 atcatgggta tcgatcatcg taataaggtg 30 <210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 112 aagctgtacc agaaacttct cgacgcaggc 30 <210> 113 <211> 440 <212> PRT <213> Pyrenochaeta sp. <400> 113 Met Ala Ala Ser Arg Ala Lys Thr Thr Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu 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DNA <213> Pyrenochaeta sp. <400> 114 atggccgctt cacgagcaaa gacgacagtg atcgtcgtgg gtggcggcgg taccattggg 60 tcatcaacag cgctccacct tctacgttca ggttatactc catcgaatat cacagttttg 120 gacacatatc caattccttc attacagtcc gcgggcaatg atttaaacaa gattatgggc 180 attcgcttgc gaaacaaagt cgacctccaa ttgagtttag aggctaggga gatgtggaga 240 gaagatgaac tttttagaga tttttttcac aatactgggc gactggattg tgcccatggc 300 gaaaaaggaa tcaatgatct taggcaggca tatcaaacac tactcgacgc caatgccggt 360 ttggaagaga cgaacgagtg gctggactct gaggacgaaa ttctggcaag aatgccgctc 420 ttgagtcgag agcagatcaa gggctggaaa gcggtcttca gccgagacgg cggttggctc 480 gccgcaggta aggccatcaa tgcaattggc gagtatctgc gcaaggaagg agtcaagttt 540 ggctttggcg gcgcgggatc gttccagcag ccgcttcttg cagagggtat ttgcattggc 600 gtggaaacaa cggatggaac tagatactac gccgacaaag ttgtcctggc agctggtgca 660 tggagtcctg cattggtgga cttggaagac cagtgtgttt caaaagcatg ggtctatgct 720 cacatgcagc tcaccccgaa ggaggctgcg gcatacaaag acacaccagt agtctacaat 780 ggcgatctgg gatttttctt tgaaccaaac gagcatggcg tgatcaaagt ctgcgacgag 840 ttcccaggct tcacacgttt taagaagcat caaccatttg gtgcaagggc accaaaacgg 900 atatcggttc ccagatctca tgccaaacac cctactgata cttatcctca cgcatccgaa 960 gccagtatca agaaagctat tgcggcattc ttaccacagt tcaaggacaa ggagctgttc 1020 aaccgcgcaa tgtgctggtg cacagataca gctgatgcag ccttgttgat ctgcgaacac 1080 ccgcaatgga agaatttcat gcttgctact ggagacagcg ggcactcatt taagctctta 1140 ccaaatatcg gcaagcatgt agttgaactg attgaaggca ctctggcggc agatcttgcc 1200 catgcttgga ggtggcgacc tgggattggt gacgctttgc agtcaaggcg agcggcacct 1260 gcgaaggatc tggcggacat gccaggatgg aatcatgatg aatctcctag ggcgaaattg 1320 taa 1323 <210> 115 <211> 452 <212> PRT <213> Arthrinium sp. <400> 115 Met Ala Ala Ser Arg Lys Thr Thr Lys Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Ala Thr Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Pro Val Asp Lys Gln Leu Ser Leu Glu Ala Gln Asp Met 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gacacctacc ccatcccctc ggcgcagtcg gccggcaacg acctgaacaa gattatgggg 180 atccgcctgc ggaacccggt cgacaagcag ctcagccttg aagcccagga catgtggtgc 240 catgacgagc tcttcaagcc ctacttccac aacaccggca ggatggactg cgagggcacc 300 gagaagggca tcgcggcgct caagcagcag taccagacct tgcttgacgc cgacgtgggc 360 ctcgagaaga cgacggagtg gctcgacagt gaggatgcca tcctggcaaa gatgccactc 420 ctggagcgcg accaaatcaa aggatggaaa gcgatattta gccaggacgg cggttggctg 480 gccgcagcta aagccatcaa cgcgataggc gaggaactga agaggcaggg cgtcaacttc 540 gggttcggcg gggcgggcgc cttcaagaag ccccttttcg ccccggacgg atccacctgc 600 atcggcgtcg agacggtgga tggaaccaag tactacggcg acaaggtcgt cctggccgcg 660 ggcgcgtgga gccctgcgct ggtcgacctg gaagagcagt gctgctccaa ggcctgggtg 720 tacgcccaca tgcagctgac gccgcacgag gcagccgagt accagggctg tccggtcgtg 780 taccacggcg acctcggctt cttcttcgag cccaacgagc acggcgtcat caaggtgtgc 840 gacgagttcc ccggcttcac gcggttcctc gagcagcacc agtcgtacgg cgcgccggcg 900 ccgacgcgcg tctcggtgcc ccggtcgcac gcgaagcacc ccaccgacac atacccggac 960 gcgtcggagc 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gtatttccac aacactggaa gactcgactg tgcacatggg 300 gaagagggac ttgcagattt gagacaggca taccaggctc tgctcgacgc taacgcgggt 360 ctcgaagaaa caacagaatg gcttgactcc gaagacgaaa ttctaaagaa aatgccgctt 420 ctggaccgcg agcaaatcaa gggctggaaa gcggtttaca gccaagacgg cggctggctg 480 gctgcagcaa aagccatcaa tgctataggc gagtacttgc gagcccaagg agttaagttt 540 ggttttggtg gtgctggatc gttcaagcag cctcttttgg ccgagggagt gtgcattggc 600 gtagagacag tcgacgggac gaggtactac gccgataaag ttgtgcttgc agctggtgct 660 tggagtccgg tattggtcga cctggaagat caatgcgttt caaaagcttg ggtatatgct 720 cacatacagc ttacgcctga ggaagcagca gagtacaaaa acgtgcctgt ggtatacaac 780 ggcgacgtcg gcttcttctt cgagcctgac gagcacggcg ttatcaaggt ttgtgacgaa 840 tttccaggtt ttacacgctt caagcaacat cagccatatg gcgccaaagc accgaaacgt 900 atctccgtgc ccagatcggc agcgaagcac ccgacggata cttaccccga tgcgtcggag 960 aagagcatcc gcaaggccat tgcaactttc ctgcccaagt tcacagagaa ggagctattc 1020 aaccggcatc tatgttggtg tacggatacg gctgacgctg cgctattgat gtgtgagcat 1080 cccgagtgga agaactttgt gctggcgaca 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480 cgcaatgcac tcgtggctgc tgcaagggag gctcagagaa tgggcgtgaa gttcgtaact 540 ggcactcctc agggcagagt agtcactcta atatttgaga ataacgatgt caaaggtgcc 600 gttaccggag acggcaagat ttggcgtgca gagcgcacat tcctctgcgc cggtgccagc 660 gctggtcagt tcctcgactt caagaatcag ttgcgtccaa cggcatggac gctggttcat 720 attgctctga agcctgagga gcgggctctt tacaagaata tcccagttat cttcaacatt 780 gagagggggt tcttcttcga accagatgag gagcgcggtg agattaagat ctgcgacgaa 840 catccggggt ataccaatat ggtacagtct gccgacggca cgatgatgag cattcctttt 900 gaaaagactc agattcctaa agaagccgag acgagggtta gagctctgct taaagagacg 960 atgccacagc ttgcagaccg tccattcagt ttcgccagga tttgctggtg cgccgacact 1020 gccaaccggg agttcttgat cgatcgccat cctcagtacc attcgcttgt gctgggctgc 1080 ggcgcttccg gcagaggatt caaatatcta ccttcaattg gcaatctcat cgttgatgct 1140 atggaaggca aggtccctca aaagatccac gaactgatta aatggaaccc agatattgct 1200 gccaatcgca actggaggga tactttgggg agattcgggg gtcccaacag agtaatggac 1260 ttccacgacg tcaaggagtg gacaaatgta caatatagag atatttccaa gttataa 1317 <210> 131 <211> 437 <212> PRT <213> Aspergillus terreus <400> 131 Met Pro Val Thr Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly Thr 1 5 10 15 Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr Asn 20 25 30 Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly 35 40 45 Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Ser Lys Lys 50 55 60 Asp Glu Val Glu Val Asn Glu Ile Ile Ala Glu Gln Ala Phe Asn Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asn Asp Pro Ile Phe Lys Pro Tyr Tyr His Asp Thr Gly Val 85 90 95 Val Met Ser Ala Thr Thr Gln Glu Gly Leu Glu Arg Leu Gly Val Arg 100 105 110 Val Arg Pro Glu Asp Glu Pro Asp Val Ala Glu Leu Thr Arg Pro Glu 115 120 125 Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly 130 135 140 Trp Arg Gly Tyr His Ile Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg 145 150 155 160 Asn Ala Leu Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Leu Gly Val Arg 165 170 175 Phe Val Ala Gly Ser Pro Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu 180 185 190 Asn Asn Asp Val Lys Gly Ala Val Thr Ala 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ggaccaactg cgtcccactg cgtggactct ggtccacatc 720 cagttgaagc cggaagagcg tgcccagtat aaaaacatgc cggtggtctt caacatcgag 780 aaggggttct tcttcgagcc ggatgaggag cgtggtgaaa tcaagatctg cgacgaacac 840 cccgggtaca cgaatatgac cacgggggcc gacggccgcg tgaggagcat tcccttcgag 900 aagacgcagg ttcctcgaga agcggagatg cgcgtccgca agcttctgtc tgaaacgatg 960 cctcagcttg cggaccggcc gttcagtttc gcaaggatct gctggtgtgc ggataccccc 1020 aatcgcgagt ttatcattga ccgtcatccc gaatacccgt cgcttgttct tgggtgtggt 1080 gcttcaggac gaggcttcaa atatcttccc tcgatcggaa gcatcatcgc agacgccatg 1140 gaggacaaaa ccccggcaaa aatccacaag ctgatccgct ggagcccgga aatcgcgatc 1200 aaccgtaact ggggggacag attaggtcga tttggagggc ccaaccgggt catggatttc 1260 aatgaagtga aggagtggac taatgtcacc caaagggaca tctcgaagtt atag 1314 <210> 133 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 133 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe 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900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 135 <211> 437 <212> PRT <213> Phaeosphaeria nodorum <400> 135 Met Ala Pro Ser Arg Ala Asn Thr Ser Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Val Thr Val Leu Asp Ala Tyr Pro Ile Pro Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Val Asp Leu Arg 50 55 60 Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Asn 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Lys Lys Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Leu Asp 85 90 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gctggaatct gaagatgaga tcctcgccaa agcgccgaat 420 ttcacgcgtg aacaagtcaa ggggtggaaa ggcttatttt gcactgatgg aggctggctt 480 gctgcagcca aggctatcaa tgcgatcgga attttcctcc aggacaaagg tgtcaagttt 540 ggctttggag gtgctggaac atttcagcaa cctctgttcg ccgctgatgg aaaaacttgc 600 atcggacttg aaactacaga cggaaccaag tactttgctg acaaggttgt cttggctgct 660 ggtgcgtgga gtcccacctt ggtggatcta gaagatcagt gtgtttcaaa ggcctgggtt 720 ttcgctcata ttcaactcac acccaaagaa gcggacgcgt acaagaatgt gcctgtggtc 780 tatgatggtg aatatgggtt cttttttgag cccaacgagt atggggtgat caaagtctgt 840 gacgagttcc ctggtttctc tcgcttcaaa ctgcatcaac cgtacggggc tgcatctccc 900 aagatgatat ccgtaccgcg atcacacgcc aagcatccca cagataccta ccctgatgcc 960 tccgaagtca ccatacgcaa agcgatcgca aggttcctgc cagaatttaa agacaaggag 1020 ctcttcaacc gtaccatgtg ctggtgtaca gatacggccg atgctaactt attgatttgc 1080 gaacacccga agtggaagaa tttcattctg gccactggag atagcggaca ttccttcaag 1140 ctgttgccaa acatcgggaa acacgttgtt gagcttttag agggatctct atcgcaggaa 1200 atggctggtg cctggagatg gagacccgga ggtgatgctc ttagatctag acgcggtgct 1260 ccggcaaagg atcttgctga gatgccggga tggaagcatg atgcacattt gtga 1314 <210> 147 <211> 438 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 147 Met Thr Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr 20 25 30 Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Cys Pro Ile Pro Ser Ala Gln 35 40 45 Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Met Ser Ile Arg Leu Arg Asn 50 55 60 Lys Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Leu Asp Met Trp Lys Asn 65 70 75 80 Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Met Ile Asp Val 85 90 95 Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Glu Gly Leu Arg Lys Lys Tyr Gln Ser 100 105 110 Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Met Leu Glu 115 120 125 Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Gln Glu Gln 130 135 140 Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln Gly 165 170 175 Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Lys Lys Pro Leu Phe 180 185 190 Ala Asp Ala His Glu Lys Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Thr Pro Val Ile Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu Asn Gly Ile Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr His 275 280 285 Phe Lys Met His Gln Pro Tyr Gly Ser Pro Ala Pro Lys Pro Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Lys Lys Ala Ile Asn Arg Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Asn Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Val Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly 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atgcccacga gaagacgtgc 600 atcggcgtcg agactgtaga cggcacaaag tactacgccg acaaggtcgt tctagcagct 660 ggtgcctgga gttcgacgtt ggtcgatctg gaggagcagt gcgtttcaaa ggcctgggtc 720 tttgcccaca tccaactgac gcccgctgaa gcagccgcgt ataagaacac tcctgttata 780 tacgacggtg actatgggtt tttctttgag ccgaatgaaa acggcatcat aaaagtctgt 840 gacgaattcc ctggcttcac gcatttcaaa atgcaccagc cgtacggctc gccggcgccc 900 aaacccatct ctgtgcctcg ttcccatgcg aagcacccca cagatacata cccgcacgcg 960 tcggaggtca cgatcaaaaa ggctatcaac cggttcctgc cgaggttcaa tgacaaggaa 1020 ctgtttaaca gggccatgtg ctggtgcacc gataccgcgg atgcaaatct gcttgtttgt 1080 gagcatccac gctggaaggg gttttatctt gcaacagggg acagtgggca ttcgttcaag 1140 ttgctgccga atattggaaa gcatgttgtc gagttattgg aggagaggct ggaaagtgtg 1200 tttaaggatg cttggaggtg gaggcctggc agtggggatg cattaaaaag tagacgggct 1260 gcgcctgcga aggacctggc ggatatgccg gggtggagga atgaggcaaa gatgtag 1317 <210> 149 <211> 477 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans <400> 149 Met Pro Pro Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Ile Val Ile Gly Gly 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agacagttga tggtacgcaa tattttgccg acaaggtcgt tctggctgcc 660 ggagcttgga gtcctaccct cgtggatttg gaagggcaat gctgttcaaa ggcttgggtt 720 tacgcccata tgcaattgac accagaagag gctgccgaat acaaggagtg tcctgtggtg 780 tacaactctg aacttgggtt cttcttcgag cccaatgaaa aaggagtcat caaagtgtgc 840 gacgaattcc cagggttcac ccgtttcaag caacatcaac cttacggcgc ctcctctact 900 aaacacatct ctttcccgcg ctcccatgcc aaacacccta ccgataccat tccggacgag 960 tcggacgcat ctatccgccg tgctatctct gcctttttac cgagattcaa agaaaaagaa 1020 ctgttcaaca gagcactgtg ctggtgtaca gataccgccg atgccaatct tttgatatgc 1080 gaacatccca aatggaaaaa ttttatctta gctacagggg atagtggaca ttcattcaaa 1140 attcttccca atatcggtaa acatgtcgtt gaacttatag aaggtaccct tgccgaggac 1200 ttggctgaga gctggagatg gagacctgga agcggtgacc ccctgatctc tcgtcgggca 1260 gcccctgcaa gggatcttgc tgatcttcca ggatggaacc atgatgagcc ctcggatgac 1320 gatatggatg taaaggatgt cgctgtatcg cttgcttctg tgaaaattgg cgaaaacatc 1380 ggggagaagg ttgtggaaga tggagcacga gtcggagtca aagttctagc ttag 1434 <210> 151 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 151 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Ala Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Gln Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 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ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 153 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 153 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln 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atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 155 <211> 437 <212> PRT <213> Eupenicillium terrenum <400> 155 Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln 65 70 75 80 Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Lys 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caagtgggca tgattgattg ttcgtcatcc 300 aaagagggta ttgaaaatct tcgacgaaaa taccagaccc tcctcgatgc gggcattggg 360 ctggagaaga cgaacgtttg gctggaatct gaagatgaga tcctcgccaa agcgccgaat 420 ttcacgcgtg aacaagtcaa ggggtggaaa ggcttatttt gcactgatgg aggctggctt 480 gctgcagcca aggctatcaa tgcgatcgga attttcctcc aggacaaagg tgtcaagttt 540 ggctttggag atgctggtac ctttcagcaa cctctgttcg ccgctgatgg aaaaacttgc 600 atcggacttg aaactacaga cggaaccaag tactttgctg acaaggttgt cttggctgct 660 ggtgcgtgga gtcccacctt ggtggatcta gaagatcagt gtgtttcaaa ggcctgggtt 720 ttcgctcata ttcaactcac acccaaagaa gcggacgcgt acaagaatgt gcctgtggtc 780 tatgatggtg aatatgggtt ctttttcgaa cccgacgagt atggggtgat caaagtctgt 840 gacgagttcc ctggtttctc tcgcttcaaa ctgcatcaac cgtacggggc tgcatctccc 900 aagatgatat ccgtaccgcg atcacacgcc aagcatccca cagataccta ccctgatgcc 960 tccgaagtca ccatacgcaa agcgatcgca aggttcctgc cagaatttaa agacaaggag 1020 ctcttcaacc gtaccatgtg ctggtgtaca gatacggccg atgctaactt attgatttgc 1080 gaacacccga agtggaagaa tttcattctg gccactggag atagcggaca ttccttcaag 1140 ctgttgccaa acatcgggaa atacgtagtt gagcttttag agggatctct atcgcaggaa 1200 atggctggtg cctggagatg gagacccgga ggtgatgctc ttagatctag acgcggtgct 1260 ccggcaaagg atcttgctga gatgccggga tggaagcatg atgcacattt gtga 1314 <210> 157 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 157 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Ala Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Leu Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile 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gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 159 <211> 437 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cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 163 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 163 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr 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aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgaggacct gaaaaagctg taccaggcac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 165 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 165 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Ala Leu Lys Lys Leu Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile 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gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 167 <211> 437 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cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 171 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 171 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr 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gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 175 <211> 437 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gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 177 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 177 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 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cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 179 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 179 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp His Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr 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aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgagaaact gaaaaagctg taccagaaac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 181 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 181 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp His Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Lys Gly Ile Glu Lys Leu Lys Lys Leu Tyr Gln 100 105 110 Lys Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile 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gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 183 <211> 437 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Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Leu Ala Glu Gly Val Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly Thr Arg 195 200 205 Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Thr 210 215 220 Leu Val Glu Leu His Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val Tyr Gly 225 230 235 240 His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Asn Ser Pro 245 250 255 Val Val Tyr Asn Gly Asp Val Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn Glu His 260 265 270 Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys 275 280 285 Met His Gln Pro Phe Gly Ala Lys Ala Pro Lys Arg Ile Ser Val Pro 290 295 300 Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Ile Pro Asp Ala Ser Glu 305 310 315 320 Lys Ser Ile Arg Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Lys Phe Thr Glu 325 330 335 Lys Glu Leu Phe Asn Arg His Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr Ala Asp 340 345 350 Ser Ala Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Val Leu 355 360 365 Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gly 370 375 380 Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Thr Leu Ala Asp Asp Leu Ala 385 390 395 400 His Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys Ser Arg 405 410 415 Arg Ser Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys His 420 425 430 Asp Asp Val Val Lys Ser Lys Leu 435 440 <210> 192 <211> 1323 <212> DNA <213> Curvularia clavata <400> 192 atggccccgt cgcgtgctaa tacgtcggtc attgtggttg gtggtggtgg tacgattggc 60 tcatctacgg ctctgcatct ggtccgctca ggctataccc cgtcgaacat tacggttctg 120 gatgcatacc cgattccgag ctctcagagc gctggcaacg acctgaataa aatcatgggt 180 atcgatcatc gtaataaggt ggatctgcag ctgtctctgg aagcgcgcca aatgtggcgc 240 gaagacgatc tgttcaagga gtatttccat aacaccggcc gtctggattg cgcgcacggt 300 gaagaaggtc ttgccaaact gcgtcaactg tatcagaaac tgctggatgc gaatgcgggt 360 ctggaagaga cgaccgaatg gctggatagt gaagacgaaa tcctgaaaaa aatgccgctg 420 ctgtcccgcg atcaaattaa aggctggaag gcggtgtatt cacaggacgg tggttggctg 480 gcagcagcaa aggcaattaa tgcaattggt gaatatctgc gtgctcaggg cgtcaaattc 540 ggttttggcg gcgccggttc tttcaaacaa ccgctgctgg ctgaaggcgt ctgcatcggt 600 gtcgaaaccg tggatggcac gcgctattac gcagacaaag tggttctggc tgcaggtgca 660 tggtcgccga ccctggttga actgcatgaa cagtgtgtga gcaaagcgtg ggtttacggc 720 cacattcaac tgacgccgga agaagccgca gaatataaga acagcccggt cgtgtacaat 780 ggcgatgtgg gctttttctt tgaaccgaac gaacatggcg ttatcaaagt ctgcgatgaa 840 tttccgggtt ttacccgctt caagatgcac cagccgtttg gtgccaaagc accgaagcgt 900 attagtgtgc cgcgctccca tgccaaacac ccgaccgata cgatcccgga tgcaagtgaa 960 aaatccattc gtaaagctat cgcgaccttt ctgccgaagt tcacggagaa agagctgttc 1020 aaccgtcatc tgtgctggtg taccgatacg gccgacagcg cgctgctgat ttgtgaacat 1080 ccggaatgga aaaactttgt tctggcgacc ggcgattcag gtcattcgtt caaactgctg 1140 ccgaatatcg gcaagcacgt tgtcgaactg ctggagggta cgctggcaga tgacctggca 1200 cacgcatggc gttggcgtcc gggtagtggt gatgcactga aaagccgtcg ctctgctccg 1260 gcgaaagacc tggctgatat gccgggctgg aaacatgacg atgtggtgaa aagcaaactg 1320 taa 1323 <210> 193 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 193 caccttgttg cgatgatcta ttcccatg 28 <210> 194 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 194 cgcaacaagg tgaacctgca aatgagtc 28 <210> 195 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 195 agagtccgca gtgtctgtac accagcac 28 <210> 196 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 196 acactgcgga ctctactctc ttgatgtgtg 30 <210> 197 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 197 aaaaaaaaaa 10 <210> 198 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 198 cccccccccc 10 <210> 199 <211> 434 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. NISL 9330 <400> 199 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Pro Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp His Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asn Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Lys Gly Ile Glu Lys Leu Lys Lys Leu Tyr Gln 100 105 110 Lys Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Ala Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Lys Tyr Lys Gly 245 250 255 Cys Pro Val Val Tyr His Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Lys Asp Lys Pro Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ser Ala Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys Tyr Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp <210> 200 <211> 1305 <212> DNA <213> Coniochaeta sp. NISL 9330 <400> 200 atgacctcaa accgtgctga tacccgtgtt attgttgttg gtggtggtgg tacgattggc 60 tcctcgaccg ctctgcatct ggtgcgtagt ggctatgctc cggcgaacat taccgtcctg 120 gatacgtttc cgatcccgag cgcccagtct gcaggccatg atctgaataa aattatgggt 180 atcgaccacc gtaacaaagt taatctgcag atgagcctgg aagcgcgcca aatgtggaaa 240 gaagatgaac tgttccagcc gtttttccat aacaccggcc gtatggactg cgaacacacg 300 ccgaaaggta tcgaaaaact gaaaaaactg taccaaaaac tgcatgatgc cggcgcaggt 360 ctggaaaaaa cccacgcctg gctggataac gaagacgcaa ttctgagcaa aatgccgctg 420 ctgcagcgtg atcagattca aggttggaaa gccatctggt ctcaagacgg cggttggctg 480 gcagcagcaa aagctattaa tgcgatcggc cagtttctga aagaacgcgg cgtgaaattc 540 ggttttggcg gtgcaggttc ttttaaacaa ccgctgttcg atgacgaagg caccacgtgt 600 atcggtgttg aaaccgctga tggcacgaaa tattacgcgg acaaagtggt tctggctgca 660 ggtgcatgga gtccgaccct ggtcgatctg gaagaccagt gctgttccaa agcgtgggtg 720 tatgcgcata ttcaactgac gccggaagaa gccgcaaaat ataaaggctg cccggtcgtg 780 taccacggcg aatttggctt tttctttgaa ccggatgaat ttggcgtgat caaagtttgt 840 gacgaatttc cgggtttttc acgtttcaaa gaacatcagc cgtatggtgc gccgtcgccg 900 aaacgtatta gcgttccgcg ctctcatgcc aaacacccga ccgatacgta cccggacgca 960 agtgaagtct ccattaagaa agcgatcgcg acctttctgc cgcgtttcaa agataaaccg 1020 ctgtttaatc gcgcactgtg ctggtgtacc gatacggccg acagcgcact gctgatgtgc 1080 gaacatccga aatggaaaaa ctttattctg gcgaccggcg attcaggtca ctcgttcaaa 1140 atcctgccga atgtgggcaa atatgttgtc gaactgattg aaggtcgcct gccggaagaa 1200 atggcttacc agtggcgttg gcgtccgggc ggtgatgccc tgaaaagtcg ccgtgctgct 1260 ccgccgaaag acctggctga tatgccgggc tggaaacatg actaa 1305 <210> 201 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 201 gctgtcggcc gtatcggtac accagcacag 30 <210> 202 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 202 atacggccga cagcacactg ctgatgtgcg 30 <210> 203 <211> 434 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 203 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Pro Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Asp His Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asn Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Lys Gly Ile Glu Lys Leu Lys Lys Leu Tyr Gln 100 105 110 Lys Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Ala Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Lys Tyr Lys Gly 245 250 255 Cys Pro Val Val Tyr His Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Lys Asp Lys Pro Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ser Thr Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys Tyr Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp <210> 204 <211> 1305 <212> DNA <213> Coniochaeta sp. <400> 204 atgacctcaa accgtgctga tacccgtgtt attgttgttg gtggtggtgg tacgattggc 60 tcctcgaccg ctctgcatct ggtgcgtagt ggctatgctc cggcgaacat taccgtcctg 120 gatacgtttc cgatcccgag cgcccagtct gcaggccatg atctgaataa aattatgggt 180 atcgaccacc gtaacaaagt taatctgcag atgagcctgg aagcgcgcca aatgtggaaa 240 gaagatgaac tgttccagcc gtttttccat aacaccggcc gtatggactg cgaacacacg 300 ccgaaaggta tcgaaaaact gaaaaaactg taccaaaaac tgcatgatgc cggcgcaggt 360 ctggaaaaaa cccacgcctg gctggataac gaagacgcaa ttctgagcaa aatgccgctg 420 ctgcagcgtg atcagattca aggttggaaa gccatctggt ctcaagacgg cggttggctg 480 gcagcagcaa aagctattaa tgcgatcggc cagtttctga aagaacgcgg cgtgaaattc 540 ggttttggcg gtgcaggttc ttttaaacaa ccgctgttcg atgacgaagg caccacgtgt 600 atcggtgttg aaaccgctga tggcacgaaa tattacgcgg acaaagtggt tctggctgca 660 ggtgcatgga gtccgaccct ggtcgatctg gaagaccagt gctgttccaa agcgtgggtg 720 tatgcgcata ttcaactgac gccggaagaa gccgcaaaat ataaaggctg cccggtcgtg 780 taccacggcg aatttggctt tttctttgaa ccggatgaat ttggcgtgat caaagtttgt 840 gacgaatttc cgggtttttc acgtttcaaa gaacatcagc cgtatggtgc gccgtcgccg 900 aaacgtatta gcgttccgcg ctctcatgcc aaacacccga ccgatacgta cccggacgca 960 agtgaagtct ccattaagaa agcgatcgcg acctttctgc cgcgtttcaa agataaaccg 1020 ctgtttaatc gcgcactgtg ctggtgtacc gatacggccg acagcacact gctgatgtgc 1080 gaacatccga aatggaaaaa ctttattctg gcgaccggcg attcaggtca ctcgttcaaa 1140 atcctgccga atgtgggcaa atatgttgtc gaactgattg aaggtcgcct gccggaagaa 1200 atggcttacc agtggcgttg gcgtccgggc ggtgatgccc tgaaaagtcg ccgtgctgct 1260 ccgccgaaag acctggctga tatgccgggc tggaaacatg actaa 1305

Claims (26)

  1. 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 개변 아마도리아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소 혹은 소비되는 산소를 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법으로서,
    개변 전의 아마도리아제는 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제이고,
    개변 후의 아마도리아제는 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에서 해당 아마도리아제의 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지는 개변된 아마도리아제이고,
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌 또는 히스티딘이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 리신 또는 아르기닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌인 방법.
  2. 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소 혹은 소비되는 산소를 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법으로서,
    여기서 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 이하의 개변 아마도리아제이고,
    서열 번호 147 및 서열 번호 185와 90% 이상의 전체길이 서열 동일성을 가지는 아마도리아제로서, 상기 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재된 아미노산 잔기이고,
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 알라닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신인 방법.
  3. 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소 혹은 소비되는 산소를 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법으로서,
    여기서 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 이하의 개변 아마도리아제이고,
    서열 번호 38, 서열 번호 135 또는 서열 번호 187과 90% 이상의 전체길이 서열 동일성을 가지는 아마도리아제로서, 상기 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재된 아미노산 잔기이고,
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 알라닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신인 방법.
  4. 시료에 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제를 작용시키고, 그 작용에 의해 발생하는 과산화수소 혹은 소비되는 산소를 측정하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법으로서,
    여기서 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 이하의 개변 아마도리아제이고,
    서열 번호 89, 서열 번호 149 또는 서열 번호 189와 90% 이상의 전체길이 서열 동일성을 가지는 아마도리아제로서, 상기 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재된 아미노산 잔기이고,
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 알라닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 2개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 3개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 4개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 5개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 6개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속 또는 페니실리움(Penicillium) 속 유래인 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 코니오카에타 에스피(Coniochaeta sp.), 유페니실리움 테레눔(Eupenicillium terrenum), 피레노케타 에스피(Pyrenochaeta sp.), 아르트리늄 에스피(Arthrinium sp.), 커벌라리아 클라바타(Curvularia clavata), 네오코스모스포라 바신펙타(Neocosmospora vasinfecta), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 페오스페리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans) 속, 울로클라디움 에스피(Ulocladium sp.) 또는 페니실리움 잔티넬룸(Penicillium janthinelum) 혹은 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) 유래인 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아마도리아제인 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정 방법:
    (i) 서열 번호 141 또는 143에 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상의 전체길이 아미노산 서열 동일성을 가지는 아마도리아제,
    (ii) 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 141 또는 143의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 141의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제.
  13. 이하 (1) 및 (2)의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정용 시약 키트:
    (1) 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 개변 아마도리아제,
    (2) 과산화수소를 측정하기 위한 시약,
    여기서 개변 전의 아마도리아제는 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지고,
    개변 후의 아마도리아제는 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 이하 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에서 해당 아마도리아제의 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환을 가지고,
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌 또는 히스티딘이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 리신 또는 아르기닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌인 키트.
  14. 이하 (1) 및 (2)의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정용 시약 키트:
    (1) 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제,
    (2) 과산화수소를 측정하기 위한 시약,
    여기서 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가 이하의 (I)~(II)로 이루어진 군에서 선택되는 개변 아마도리아제로서,
    (I) 서열 번호 147 및 서열 번호 185와 90% 이상의 전체길이 서열 동일성을 가지는 아마도리아제로서, 상기 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재된 아미노산:
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 알라닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (II) 서열 번호 185의 아미노산 잔기를 가지는 아마도리아제로서, 추가적으로 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 62위, 106위, 110위, 63위, 355위, 68위, 356위, 102위, 113위 및 419위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 아마도리아제인 키트.
  15. 이하 (1) 및 (2)의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정용 시약 키트:
    (1) 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제,
    (2) 과산화수소를 측정하기 위한 시약,
    여기서 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가 이하의 (I)~(II)로 이루어진 군에서 선택되는 개변 아마도리아제로서,
    (I) 서열 번호 38, 135 및 서열 번호 187과 90% 이상의 전체길이 서열 동일성을 가지는 아마도리아제로서, 상기 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재된 아미노산 잔기:
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 알라닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (II) 서열 번호 135 또는 서열 번호 187의 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제로서, 추가적으로 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 62위, 106위, 110위, 63위, 355위, 68위, 356위, 102위, 113위 및 419위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 아마도리아제인 키트.
  16. 이하 (1) 및 (2)의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c의 측정용 시약 키트:
    (1) 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제,
    (2) 과산화수소를 측정하기 위한 시약,
    여기서 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가 이하의 (I)~(II)로 이루어진 군에서 선택되는 개변 아마도리아제로서,
    (I) 서열 번호 89, 서열 번호 149 또는 서열 번호 189와 90% 이상의 전체길이 서열 동일성을 가지는 아마도리아제로서, 상기 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 이하의 각각에 기재된 아미노산 잔기:
    (a) 서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 세린, 트레오닌 또는 프롤린이고,
    (d) 서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신, 아르기닌 또는 알라닌이고,
    (e) 서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신 또는 티로신이고,
    (b) 서열 번호 1의 63위에 대응하는 위치의 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌이고,
    (g) 서열 번호 1의 355위에 대응하는 위치의 아미노산이 세린이고,
    (i) 서열 번호 1의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이고,
    (j) 서열 번호 1의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고,
    (c) 서열 번호 1의 102위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (f) 서열 번호 1의 113위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신 또는 아르기닌이고,
    (h) 서열 번호 1의 419위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신이고,
    (II) 서열 번호 189의 아미노산 서열을 가지는 아마도리아제로서, 추가적으로 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 62위, 106위, 110위, 63위, 355위, 68위, 356위, 102위, 113위 및 419위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 아마도리아제인 키트.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 2개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 키트.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 3개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 키트.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 4개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 키트.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 5개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 키트.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하는 아마도리아제가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 기재된 아미노산의 (a)부터 (j)로 이루어지는 군에서 선택되는 6개 이상의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 상기 (a)부터 (j) 각각에 기재되는 아미노산 잔기인 키트.
  22. 청구항 13에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속 또는 페니실리움(Penicillium) 속 유래인 키트.
  23. 청구항 13에 있어서, 상기 헤모글로빈 A1c에 직접 작용하여 과산화수소를 생성하는 작용을 가지는 아마도리아제가,
    (i) 서열 번호 141 또는 143에 나타내는 아미노산 서열과 90% 이상의 전체 길이 아미노산 서열 동일성을 가지는 아마도리아제, 또는
    (ii) 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 141 또는 143의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 141의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아마도리아제인 키트.
  24. 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아마도리아제:
    (i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이거나, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고, 또한 α-프럭토실헥사펩티드(αF6P)에 대한 활성을 가지는 아마도리아제,
    (ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 68위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴이거나, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 356위에 대응하는 위치의 아미노산이 트레오닌이고, 또한 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며, αF6P에 대한 활성을 가지는 아마도리아제,
    여기서 상기 아마도리아제는 추가적으로 이하의 아미노산 치환,
    서열 번호 1의 62위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴산이고,
    서열 번호 1의 110위에 대응하는 위치의 아미노산이 류신이고, 및
    서열 번호 1의 106위에 대응하는 위치의 아미노산이 리신인 것을 가지는 것인 아마도리아제.
  25. 삭제
  26. 삭제
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