JP7094655B2 - アニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、界面活性剤耐性に優れたアマドリアーゼ、例えばアニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡならびに界面活性剤耐性に優れたアマドリアーゼの製造法に関する。また本発明は、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得るアマドリアーゼに関する。
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリシン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα－フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）もしくはα－フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１～７参照。）。実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、正確な測定値が得られないという課題があり、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸またはα－ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Coniochaeta）属、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、ピレノケータ（Pyrenochaeta）属、アルスリニウム（Arthrinium）属、カーブラリア（Curvularia）属、ネオコスモスポラ（Neocosmospora）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、フェオスフェリア（Phaeosphaeria）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、エメリセラ（Emericella）属、ウロクラディウム（Ulocladium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、アカエトミエラ（Achaetomiella）属、アカエトミウム（Achaetomium）属、シエラビア（Thielavia）属、カエトミウム（Chaetomium）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属、ミクロアスカス（Microascus）属、レプトスフェリア（Leptosphaeria）属、オフィオボラス（Ophiobolus）属、プレオスポラ（Pleospora）属、コニオケチジウム（Coniochaetidium）属、ピチア（Pichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６～１５、非特許文献１～１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
ＨｂＡ１ｃを測定する際に、測定用の試薬組成物中にはアマドリアーゼが過剰に含有されていることが知られている。例えば、終濃度０．３６μＭのＨｂＡ１ｃを測定する際に、アマドリアーゼは１．４ｋＵ／Ｌ、すなわち１分間当たり１．４ｍＭの基質を反応させることができる濃度を用いている（特許文献１６参照。）。アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定は、自動分析装置を用いた手法が主流となっており、そのアマドリアーゼの基質との反応時間は５分～２５分程度で測定を行うことが多い。アマドリアーゼを過剰量で含有させる理由は、上記のような短時間の測定時間の中で基質に対し十分に反応させるためであり、また、アマドリアーゼの反応性や安定性に大きな負の影響を与え得る物質が測定用組成物中に共存する場合には、この影響への対策として、アマドリアーゼを過剰に配合せざるを得ないためである。
アマドリアーゼを用いて全血または赤血球からＨｂＡ１ｃを測定するための前処理方法として、界面活性剤を用いて溶血する事例が挙げられている（例えば、特許文献２、１６～１８参照。）。ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼで分解する際に、反応促進剤として界面活性剤が用いられることもある（例えば、特許文献１９参照。）。したがって、アマドリアーゼを用いてＨｂＡ１ｃを測定するにあたり、界面活性剤は必要とされているが、界面活性剤およびプロテアーゼで処理したＨｂＡ１ｃ溶液とアマドリアーゼ溶液を混合してからＨｂＡ１ｃ定量反応を開始する際に、また、界面活性剤とアマドリアーゼを混合して保存した際に、界面活性剤がアマドリアーゼを変性させる可能性が極めて高い。現在のＨｂＡ１ｃ測定用キットは、アマドリアーゼを必要量より多分に処方し、かつ、安定化剤を処方しているために正確な測定を成し得ているが、多量の試薬を用いているために高コストになることは避けられない。また、現行より効果の強い界面活性剤を使用できるならば、ＨｂＡ１ｃのプロテアーゼ分解効率がより改善され、ＨｂＡ１ｃの測定感度が向上する可能性が高い。さらに、界面活性剤にはヘモグロビンやＨｂＡ１ｃ由来の不溶性ペプチド断片の可溶化効果もあるため、濁りの発生を防止し、測定精度の向上に寄与する。したがって、アマドリアーゼを糖尿病の臨床診断用酵素としてキット試薬に処方する上で要望される性質のひとつに、界面活性剤を含んだ溶液中における良好な安定性があるといえる。
実際の測定条件は個々に異なるが、公知の文献中に各種アマドリアーゼの液状における安定性に関する開示がみられる：Coniochaeta sp. NISL 9330株由来アマドリアーゼを含んだ溶液に、５ｍＭのエチレンジアミン４酢酸および３％のグリシンを添加した際は、３０℃、７日間後において７９％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献２０参照。）。また、Fusarium oxysporum IFO-9972株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含んだ溶液に、３％のＬ－アラニン、３％のグリシンまたは３％のザルコシンを添加した際は、３７℃、２日間後において１００％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献２１参照）。しかしながら、上述のようなアマドリアーゼタンパク質を含んだ溶液には界面活性剤は添加されておらず、界面活性剤の影響を低減する記述は一切ない。
アマドリアーゼに変異を導入し界面活性剤耐性を向上させたことが報告されている（例えば、特許文献２２参照）。特許文献２２には、カチオン性界面活性剤の存在下でのアマドリアーゼの残存活性を向上する変異が記載されており、変異が蓄積されたCFP-D7はカチオン性界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドが0.04%存在下で残存活性が100%であり、変異導入前のCFP-Dは12.7%であった。一方、0.04%のドデシル硫酸ナトリウム存在下では、CFP-Dの残存活性は、11.3%であり、CFP-D7は3.92%と、むしろ低下した。したがって、カチオン性界面活性剤耐性が向上してもアニオン性界面活性剤耐性が向上するとはいえない。またアニオン性界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する安定化剤や緩衝剤は報告されていない。
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上述のように従来、アマドリアーゼは、測定時間中に基質に対し十分に反応するよう過剰量で使用されてきた。本発明者らは、界面活性剤がアマドリアーゼの安定性に顕著に負の影響を与え得る成分であることを見いだした。よって、従来のアマドリアーゼよりも、さらに優れた界面活性剤耐性を有する酵素を作製すれば、酵素およびキットの流通における利便性向上や、キットに処方するアマドリアーゼや安定化剤の量を低減できることによる低コスト化、さらには強力な界面活性剤が処方可能になることによるＨｂＡ１ｃの測定感度向上等において多大に貢献することが期待される。したがって本発明が解決しようとする課題は、従来のアマドリアーゼと比較して界面活性剤耐性が優れたアマドリアーゼを提供すること、並びに界面活性剤存在下でも、ＨｂＡ１ｃまたはそれに由来する糖化ペプチドの定量が可能な試薬組成物を提供することにある。
酵素に界面活性剤耐性を付与するための情報はほとんど開示されていない現状の中で、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼに対して、特定のアミノ酸残基の置換を導入することにより、また、界面活性存在下でも活性が残存するアマドリアーゼを試薬組成物に含有することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１] 以下からなる群より選択される、界面活性剤に対する耐性を有するアマドリアーゼ、
（i）ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、ドデシル硫酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して２０％以上残存しており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(iii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
(v) 前記(iv)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
(vi) 前記(ii)～(v)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されているアマドリアーゼ及び当該位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてドデカノイルサルコシン酸ナトリウムを終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）同士の数値比較において、前記アミノ酸置換を有しないアマドリアーゼと比較して３％以上、残存活性が向上しているアマドリアーゼ。
[１] 以下からなる群より選択される、界面活性剤に対する耐性を有するアマドリアーゼ、
（i）ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、ドデシル硫酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して２０％以上残存しており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(iii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
(v) 前記(iv)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
(vi) 前記(ii)～(v)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されているアマドリアーゼ及び当該位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてドデカノイルサルコシン酸ナトリウムを終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）同士の数値比較において、前記アミノ酸置換を有しないアマドリアーゼと比較して３％以上、残存活性が向上しているアマドリアーゼ。
[２]アマドリアーゼが以下からなる群、
（a） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
（b） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
（c） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンである、
（d） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
（e） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
（f） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
（g） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
（h） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
（i） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンである、
（j） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
（k） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
（l） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
（m） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
（n） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン若しくはトリプトファンである、
（o） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
（p） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
（q） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、
（r） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、並びに
（s） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
より選択される1以上を有する、１に記載のアマドリアーゼ。
（a） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
（b） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
（c） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンである、
（d） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
（e） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
（f） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
（g） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
（h） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
（i） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンである、
（j） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
（k） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
（l） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
（m） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
（n） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン若しくはトリプトファンである、
（o） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
（p） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
（q） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、
（r） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、並びに
（s） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
より選択される1以上を有する、１に記載のアマドリアーゼ。
[３] アマドリアーゼが、以下からなる群、
（a） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
（b） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン若しくはシステインである、
（c） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、リシン若しくはヒスチジンである、
（d） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
（e） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
（f） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはロイシンである、及び
（g） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
（h） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
（i） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン若しくはバリンである、
（j） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはメチオニンである、
（k） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
（l） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
（m） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（n） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（o） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
（p） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
（q） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
より選択される１以上を有する、２に記載のアマドリアーゼ。
（a） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
（b） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン若しくはシステインである、
（c） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、リシン若しくはヒスチジンである、
（d） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
（e） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
（f） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはロイシンである、及び
（g） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
（h） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
（i） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン若しくはバリンである、
（j） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはメチオニンである、
（k） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
（l） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
（m） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（n） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（o） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
（p） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
（q） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
より選択される１以上を有する、２に記載のアマドリアーゼ。
[４] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位に対応する位置のアミノ酸及び７１位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、１に記載のアマドリアーゼ。
[５]配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
４に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
４に記載のアマドリアーゼ。
[６] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
５に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
５に記載のアマドリアーゼ。
[７] さらに、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、４～６のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[８] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸である、６または７に記載のアマドリアーゼ。
[９] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、８に記載のアマドリアーゼ。
[１０] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位に対応する位置のアミノ酸及び１７２位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、１～９のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１１] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸である、
１０に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸である、
１０に記載のアマドリアーゼ。
[１２] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
１１に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
１１に記載のアマドリアーゼ。
[１３] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位に対応する位置のアミノ酸及び２８位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、１～１２のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１４] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
１３に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
１３に記載のアマドリアーゼ。
[１５] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
１４に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
１４に記載のアマドリアーゼ。
[１６] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位に対応する位置のアミノ酸、９位に対応する位置のアミノ酸、１３位に対応する位置のアミノ酸、３位に対応する位置のアミノ酸及び４位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、１～１５のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１７] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
１６に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
１６に記載のアマドリアーゼ。
[１８] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
１７に記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
１７に記載のアマドリアーゼ。
[１９] 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、１～１８のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[２０] さらに、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
１～１９のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
１～１９のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[２１] 界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、１～２０のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[２２] 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、１～２１のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[２３] 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号９４又は配列番号１１０に示すアミノ酸配列を有し、１～２０のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、１～２１のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[２４] １～２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼをコードするアマドリアーゼ遺伝子。
[２５] 以下の工程：
（ｉ）２４に記載の遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
（ｉ）２４に記載の遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
[２６] １～２３のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。
[２７] １以上のアニオン性界面活性剤を含む、２６に記載の組成物。
[２７] １以上のアニオン性界面活性剤を含む、２６に記載の組成物。
[２８] 界面活性剤が、２５℃において１３０ｍM以下の臨界ミセル濃度を有するものである、２７記載の組成物。
[２９] アニオン性界面活性剤が、以下からなる群、
次の一般式(I)で表される硫酸エステル化合物、
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式（II)で表されるベンゼンスルホン酸塩化合物、
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式（III)で表されるアシルサルコシン酸塩化合物、
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式（IV)で表されるホスホン酸塩化合物、
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式（V)で表されるスルホコハク酸塩化合物、
[式中、R1及びR2は、それぞれ独立に、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式（VI)で表されるカルボン酸塩化合物、
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式（VII)で表されるスルホン酸塩化合物、
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール又はC7～C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
コール酸塩、デオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩及びタウロデオキシコール酸塩、アシルグルタミン酸塩、アシルメチルアラニン塩、アシルグリシン塩、アシルメチルタウリン塩並びにこれらの誘導体、
より選択される１以上のアニオン性界面活性剤である、２７又は２８に記載の組成物。
次の一般式(I)で表される硫酸エステル化合物、
次の一般式（II)で表されるベンゼンスルホン酸塩化合物、
次の一般式（III)で表されるアシルサルコシン酸塩化合物、
次の一般式（IV)で表されるホスホン酸塩化合物、
次の一般式（V)で表されるスルホコハク酸塩化合物、
次の一般式（VI)で表されるカルボン酸塩化合物、
次の一般式（VII)で表されるスルホン酸塩化合物、
コール酸塩、デオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩及びタウロデオキシコール酸塩、アシルグルタミン酸塩、アシルメチルアラニン塩、アシルグリシン塩、アシルメチルタウリン塩並びにこれらの誘導体、
より選択される１以上のアニオン性界面活性剤である、２７又は２８に記載の組成物。
[３０] １～２３のいずれかに記載のアマドリアーゼを用いる、糖化ヘモグロビンの測定方法。
[３１] コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムを含む、２６に記載の組成物。
[３２] コール酸ナトリウムを終濃度０．５～１．５％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後のアマドリアーゼの残存活性（％）が、コール酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して１００％以上である、又は
デオキシコール酸ナトリウムを終濃度０．３～２．０％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後のアマドリアーゼの残存活性（％）が、デオキシコール酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して１００％以上である、３１に記載の組成物。
デオキシコール酸ナトリウムを終濃度０．３～２．０％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後のアマドリアーゼの残存活性（％）が、デオキシコール酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して１００％以上である、３１に記載の組成物。
[３３] コール酸ナトリウム及びアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物。
[３４] コール酸ナトリウムを終濃度０．５～１．５％（ｗ／ｖ）となるよう添加してから、３０℃、５分後のアマドリアーゼの残存活性（％）が、コール酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して１００％以上である、３３に記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-227548号の開示内容を包含する。
本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼおよびそれをコードする遺伝子等を提供することができる。このアマドリアーゼを用いると、高濃度の界面活性剤の存在下でも糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアマドリアーゼは糖化タンパク質や糖化ペプチドを基質としうる。
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα－アミノ基、ペプチド内部のリシン残基側鎖のε－アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α－糖化ペプチド（α－フルクトシルペプチド）である。α－糖化ペプチドは、Ｎ末端のα－アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα－糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα－糖化ペプチドに該当する（αＦ１４６Ｐ）。
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα－アミノ基、ペプチド内部のリシン残基側鎖のε－アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α－糖化ペプチド（α－フルクトシルペプチド）である。α－糖化ペプチドは、Ｎ末端のα－アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα－糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα－糖化ペプチドに該当する（αＦ１４６Ｐ）。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質（基質）は、ＨｂＡ１ｃ、より具体的にはＨｂＡ１ｃのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出されるα－糖化ペプチド、例えばαＦＶ～αＦ１２８Ｐ、αＦＶ～αＦ６４Ｐ、αＦＶ～αＦ３２Ｐ、αＦＶ～αＦ１６Ｐ、例えばαＦ６Ｐ（α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸）である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαＦＶＨ（α－フルクトシルバリルヒスチジン）又はαＦＶ（α－フルクトシルバリン）である。本発明のアマドリアーゼは、上記の基質の１以上に作用しうる。本明細書ではこれを総称して糖化基質に対する活性、または糖化基質に対する酸化活性と呼ぶことがある。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα－ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα－ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するConiochaeta属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号９４に示されるアミノ酸配列を有するCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ（CcFX）に基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有するEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ（En42FX）に基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
このような変異体の例としては、配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０と高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。
なお、本発明のアマドリアーゼは例えば、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などのの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。これらの中でも界面活性剤耐性を有し、かつ／又はアミノ酸配列が上記のように配列番号１と高い配列同一性を有するものが好ましい。
アニオン性界面活性剤耐性が改変されたアマドリアーゼの変異体（改変体）は、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する、または付加する、または欠失させることによって得ることができる。
アニオン性界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。本明細書では、これらの位置への置換を、アマドリアーゼのアニオン性界面活性剤に対する耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
（a） ８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、
（b） ７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換、
（c） １７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンへの置換、
（d） １７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンへの置換、
（e） ２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン若しくはシステインへの置換、
（f） １２位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、
（g） ９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換、
（h） ７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンへの置換、
（i） ３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、スレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンへの置換、
（j） ２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインへの置換、
（k） １３位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、
（l） ３位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニンへの置換、
（m） ４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばプロリンへの置換、
（n） ２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばチロシン若しくはトリプトファンへの置換、
（o） ２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換、
（p） ３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換、
（q） ４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン若しくはヒスチジンへの置換、
（r） ３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン若しくはヒスチジンへの置換、並びに
（s） １９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換。
（a） ８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、
（b） ７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換、
（c） １７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンへの置換、
（d） １７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンへの置換、
（e） ２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン若しくはシステインへの置換、
（f） １２位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、
（g） ９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換、
（h） ７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンへの置換、
（i） ３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、スレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンへの置換、
（j） ２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインへの置換、
（k） １３位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、
（l） ３位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニンへの置換、
（m） ４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばプロリンへの置換、
（n） ２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばチロシン若しくはトリプトファンへの置換、
（o） ２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換、
（p） ３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換、
（q） ４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン若しくはヒスチジンへの置換、
（r） ３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン若しくはヒスチジンへの置換、並びに
（s） １９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換。
界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９を有している。
その中でも、配列番号１のアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置にアミノ酸置換を有している変異体が好ましい。
71/80変異：８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、及び７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを71/80変異（置換）と呼び、これを有する変異体を71/80変異体と呼ぶことがある。71/80変異体としては例えば71L/80R変異体、71L/K80N変異体、71A/K80R変異体、71A/K80N変異体がある。
71/77/80変異：８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換及び７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを71/77/80変異と呼び、これを有する変異体を71/77/80変異体と呼ぶことがある。71/77/80変異体としては例えば71L/77D/80R変異体、71L/77D/K80N変異体、71A/77D/K80R変異体、71A/77D/K80N変異体がある。
172/175変異：１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばグルタミン酸若しくはアスパラギン酸への置換、及び１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを172/175変異と呼び、これを有する変異体を172/175変異体と呼ぶことがある。172/175変異体としては例えば172E/175Rがある。
28/30変異：３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、スレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンへの置換及び２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30変異と呼び、これを有する変異体を28/30変異体と呼ぶことがある。28/30変異体としては、例えば28L/30A変異体がある。
3/4/9/12/13変異：１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換、１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、３位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニンへの置換、及び４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばプロリンへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを3/4/9/12/13変異と呼び、これを有する変異体を3/4/9/12/13変異体と呼ぶことがある。3/4/9/12/13変異体としては例えば3T/4P/9T/12I/13I変異体がある。
上記の変異の組み合わせ同士を組み合わせることもできる。例えば以下の変異体が好ましい。
28/30/172/175変異：上記の28/30変異及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30/172/175変異と呼び、これを有する変異体を28/30/172/175変異体と呼ぶことがある。28/30/172/175変異体としては、例えば28L/30A/172E/175R変異体がある。
28/30/71/80変異：上記の28/30変異及び71/80変異の組み合わせである。これを有する変異体を28/30/71/80変異体と呼ぶことがある。28/30/71/80変異体としては、例えば28L/30A/71L/80R変異体、28L/30A/71L/K80N変異体、28L/30A/71A/K80R変異体、28L/30A/71A/K80N変異体がある。
28/30/71/77/80変異：上記の28/30変異及び71/77/80変異の組み合わせである。これを有する変異体を28/30/71/77/80変異体と呼ぶことがある。28/30/71/77/80変異体としては、例えば28L/30A/71L/77D/80R変異体、28L/30A/71L/77D/K80N変異体、28L/30A/71A/77D/K80R変異体、28L/30A/71A/77D/K80N変異体がある。
71/80/172/175変異：上記の71/80変異及び172/175変異の組み合わせである。これを有する変異体を71/80/172/175変異体と呼ぶことがある。71/80/172/175変異体としては、例えば71L/80R/172E/175R変異体、71L/K80N/172E/175R変異体、71A/K80R/172E/175R変異体、71A/K80N/172E/175R変異体がある。
71/77/80/172/175変異：上記の71/77/80変異及び/172/175変異の組み合わせである。これを有する変異体を71/77/80/172/175変異体と呼ぶことがある。71/77/80/172/175変異体としては、例えば71L/77D/80R/172E/175R変異体、71L/77D/K80N/172E/175R変異体、71A/77D/K80R/172E/175R変異体、71A/77D/K80N/172E/175R変異体がある。
28/30/71/80/172/175変異：上記の28/30変異、71/80変異、及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30/71/80/172/175変異と呼び、これを有する変異体を28/30/71/80/172/175変異体と呼ぶことがある。28/30/71/80/172/175変異体としては、例えば28L/30A/71L/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71L/80N/172E/175R変異体、28L/30A/71A/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71A/80N/172E/175R変異体がある。
28/30/71/77/80/172/175変異：上記の28/30変異、71/77/80変異、及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30/71/77/80/172/175変異と呼び、これを有する変異体を28/30/71/77/80/172/175変異体と呼ぶことがある。28/30/71/77/80/172/175変異体としては、例えば28L/30A/71L/77D/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71L/77D/80N/172E/175R変異体、28L/30A/71A/77D/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71A/77D/80N/172E/175R変異体がある。
3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異：上記の3/4/9/12/13変異、28/30変異、71/77/80変異、及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異と呼び、これを有する変異体を3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異体と呼ぶことがある。3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異体しては、例えば3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80R/172E/175R変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80N/172E/175R変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80R/172E/175R変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80N/172E/175R変異体がある。
3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175/286変異：上記の3/4/9/12/13変異、28/30変異、71/77/80変異、172/175変異及び286変異の組み合わせである。これを有する変異体を3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175/286変異体と呼ぶことがある。3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175/286変異体しては、例えば3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80R/172E/175R/286Y変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80N/172E/175R/286Y変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80R/172E/175R/286Y変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80N/172E/175R/286Y変異体がある。
本発明の界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼ変異体は、配列番号１、配列番号９４、又は配列番号１１０に示すアミノ酸配列において、上記の界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換を有し得る。さらに、本発明の界面活性剤耐性アマドリアーゼ変異体は、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個（例えば１～１５個、例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されていてもよい。さらに本発明は、上記の界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換変異、基質特異性等、界面活性剤耐性以外の性質を向上させるアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１または３、又は配列番号９４又は配列番号１１０に示すアミノ酸配列における前記置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、アマドリアーゼ活性を有し、界面活性剤耐性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開2007/125779号においてpKK223-3-CFP-T7と称する組換え体プラスミド（寄託番号：FERM BP-10593）を保持する大腸菌が生産するConiochaeta属由来のアマドリアーゼ（CFP-T7）であり、先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである。このCFP-T7は、天然型のConiochaeta属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である。
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
（さらなる置換）
（アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその基質特異性を変化させることができることを以前に報告した（例えば国際公開２０１３／１６２０３５号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
（アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその基質特異性を変化させることができることを以前に報告した（例えば国際公開２０１３／１６２０３５号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸の置換として配列番号１のアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
場合により６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン、プロリンへと置換されてもよい。場合により（ｂ）６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジン又はアラニンへと置換されてもよい。場合により（ｃ）１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸は、リシンへと置換されてもよい。場合により（ｄ）１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、リシン、又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により（ｅ）１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はロイシン又はチロシンへと置換されてもよい。場合により（ｆ）１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリシン又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により（ｇ）３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換されてもよい。場合により（ｈ）４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリシンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はスレオニンへと置換されてもよい。
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
場合により６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン、プロリンへと置換されてもよい。場合により（ｂ）６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジン又はアラニンへと置換されてもよい。場合により（ｃ）１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸は、リシンへと置換されてもよい。場合により（ｄ）１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、リシン、又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により（ｅ）１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はロイシン又はチロシンへと置換されてもよい。場合により（ｆ）１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリシン又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により（ｇ）３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換されてもよい。場合により（ｈ）４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリシンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はスレオニンへと置換されてもよい。
本明細書では、これらの位置（62/63/68/102/106/110/113/355/419/356）への置換をアマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
（アマドリアーゼのカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのカチオン性界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している（特願２０１３－２２１５１５号及びＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１０３６号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書参照、これらは参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする）。
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのカチオン性界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している（特願２０１３－２２１５１５号及びＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１０３６号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書参照、これらは参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする）。
アマドリアーゼのカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸
場合により２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸はヒスチジンへと置換されてもよい。場合により２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸はシステイン、セリン、スレオニンへと置換されてもよい。場合により２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。場合により２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアラニン、メチオニン、リシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。場合により２５６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により２３１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により８１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。
本明細書では、これらの位置（262/257/249/253/337/340/232/129/132/133/44/256/231/81）への置換をアマドリアーゼのカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。特に、44位をプロリンとする変異及び340位をプロリンとする変異はカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換である。
（アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上／オキシダーゼ活性の低減をもたらす置換）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのデヒドロゲナーゼ活性を向上及び／又はオキシダーゼ活性を低減させることができることを確認している。例えば特願２０１４－２１７４０５号明細書を参照のこと（参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする）。
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのデヒドロゲナーゼ活性を向上及び／又はオキシダーゼ活性を低減させることができることを確認している。例えば特願２０１４－２１７４０５号明細書を参照のこと（参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする）。
アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（１）２８０位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、スレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
（２）２６７位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
（３）２６９位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
（４）５４位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
（５）２４１位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
（１）２８０位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、スレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
（２）２６７位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
（３）２６９位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
（４）５４位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
（５）２４１位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
本明細書においてこれらの位置（280/267/269/54/241）への置換をアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換と呼ぶことがある。
（アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸欠失又はアミノ酸置換について）
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。本明細書においてカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失を、熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。本明細書においてカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失を、熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。
また本発明者らは以前に、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを確認している（国際公開第２０１３／１００００６号パンフレット参照）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにアマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸置換を有しうる。
アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１のアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（ｂ）１５１位のアラニン；
（ｃ）４３位のフェニルアラニン；
（ｄ）５３位のヒスチジン；
（ｅ）２６７位のフェニルアラニン；
（ｆ）３５０位のスレオニン；
（ｇ）１８５位のアラニン；
（ｈ）１９６位のグルタミン酸；
（ｉ）２９９位のセリン；
（ｊ）３２３位のバリン
場合により１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はシステインに置換されてもよい。場合により４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸はチロシンに置換されてもよい。場合により５３位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸はアスパラギン、チロシンに置換されてもよい。場合により２６７位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸はチロシンに置換されてもよい。場合により３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸はアラニンに置換されてもよい。場合により１８５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンに置換されてもよい。場合により１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギン酸に置換されてもよい。場合により２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸はスレオニンに置換されてもよい。場合により３２３位のバリンに対応する位置のアミノ酸はグルタミン酸に置換されてもよい。
（ｂ）１５１位のアラニン；
（ｃ）４３位のフェニルアラニン；
（ｄ）５３位のヒスチジン；
（ｅ）２６７位のフェニルアラニン；
（ｆ）３５０位のスレオニン；
（ｇ）１８５位のアラニン；
（ｈ）１９６位のグルタミン酸；
（ｉ）２９９位のセリン；
（ｊ）３２３位のバリン
場合により１５１位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はシステインに置換されてもよい。場合により４３位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸はチロシンに置換されてもよい。場合により５３位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸はアスパラギン、チロシンに置換されてもよい。場合により２６７位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸はチロシンに置換されてもよい。場合により３５０位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸はアラニンに置換されてもよい。場合により１８５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンに置換されてもよい。場合により１９６位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギン酸に置換されてもよい。場合により２９９位のセリンに対応する位置のアミノ酸はスレオニンに置換されてもよい。場合により３２３位のバリンに対応する位置のアミノ酸はグルタミン酸に置換されてもよい。
本明細書においてこれらの位置（151/43/53/267/350/185/196/299/323）への置換をアマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブDNAを合成して、これを用いて染色体DNAまたはcDNAのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、5’RACE法や3’RACE法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３－２３５５８５号公報）の例などが挙げられる。
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするDNAがpKK223-3 Vector（ＧＥヘルスケア社製）に挿入された組換え体プラスミドpKK223-3-CFP（特開２００３－２３５５８５号公報）が挙げられる。
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(STRATAGENE社製）等が好ましい。
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(STRATAGENE社製）等が好ましい。
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または5-ブロモウラシル等を挙げることができる。
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４～３０、１９８９年６月号）。
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法(Nucleic Acids Res.,12,9441(1984):Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985):Methods Enzymol.,154,367(1987))等が挙げられる。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社， EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製， Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など）の利用が挙げられる。
また、一般的なPCR法（ポリメラーゼチェインリアクション、Polymerase Chain Reaction）として知られる手法を用いることもできる（Technique,1,11(1989)）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
（形質転換・形質導入）
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（ニッポンジーン社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（ニッポンジーン社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
（アミノ酸配列の同一性又は類似性）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域、保存性領域）を決定できる。
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位～３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位は相同性領域に該当しうる。
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位～３２位、３６～４１位、５０～５２位、５４～５８位、８４～８６位、８８～９０位、１４５～１５０位、１５７～１６８位、２０２～２０５位、２０７～２１２位、２１５～２２５位、２３６～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、３４７～３５４位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、及び４０５～４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１～１８位、２０～３２位、５０～５２位、５４～５８位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７７～２８６位、及び３７０～３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、アニオン性界面活性剤に対する耐性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントしたが、このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として比較すると図１に示す他のアマドリアーゼとの相同性領域におけるアミノ酸配列同一性は９０％以上である。
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置（相当する位置）」とは、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置（相当する位置）」とは、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
図１に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。図１からConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図１には、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号３）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号４）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号６）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１０）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２）およびPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１３）のアミノ酸配列を示してある。
（置換箇所に対応する位置）
（本発明のアニオン性界面活性剤耐性向上変異の対応位置）
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８０位のリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８０位のリシンに対応する位置を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基（相当する位置のアミノ酸残基）」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
（本発明のアニオン性界面活性剤耐性向上変異の対応位置）
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８０位のリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８０位のリシンに対応する位置を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基（相当する位置のアミノ酸残基）」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは８０位のグルタミン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８０位のアルギニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８０位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは８０位のアルギニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは８０位のアルギニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７９位のリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは７９位のリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のリシンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの７１位のメチオニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７１位のロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは７０位のロイシンである。
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１７５位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１７５位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１７５位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１７５位のリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１７５位のアルギニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１７５位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１７５位のアルギニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７５位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１７３位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７４位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１７４位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７５位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７５位のセリンである。
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１７２位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１７２位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１７２位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１７２位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１７２位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１７２位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１７２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７２位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１７０位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７１位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１７１位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７２位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１７２位のフェニルアラニンである。
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２７９位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２７９位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２７９位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２７７位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２７９位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２７７位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２７９位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７９位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２７５位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７９位のバリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２７９位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７７位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７９位のバリンである。
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１２位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１２位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１２位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１２位のイソロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１位のバリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２位のイソロイシンである。
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の９位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの９位のアルギニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは９位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９位のリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは９位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは９位のスレオニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９位のリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８位のリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８位のリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９位のリシンである。
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の７７位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの７７位のグルタミンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは７７位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは７７位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは７７位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは７７位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは７７位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７７位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは７７位のグルタミン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７６位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは７６位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７７位のグルタミン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７７位のアスパラギン酸である。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の３０位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の３０位のセリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３０位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３０位のセリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３０位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３０位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３０位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３０位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２９位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０位のセリンである。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の２８位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２８位のイソロイシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８位のロイシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８位のロイシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２８位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２８位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８位のロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７位のロイシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２７位のロイシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８位のイソロイシンである。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の３位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３位のセリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３位のヒスチジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３位のプロリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３位のスレオニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３位のプロリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３位のプロリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３位のプロリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３位のヒスチジンである。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の４位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４位のアスパラギンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４位のセリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは４位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは４位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４位のセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４位のセリンである。なお、図１より、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは、配列番号１のアマドリアーゼの４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸が欠失している。しかしながら、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼにおいて、配列番号１のアマドリアーゼの４位のアスパラギンに対応する位置（欠失位置）にアミノ酸を挿入することは可能である。本明細書では便宜上、配列番号１のアマドリアーゼの４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸が欠失している場合、当該欠失位置へのアミノ酸の挿入も、配列番号１のアマドリアーゼの４位のアスパラギンに対応する位置へのアミノ酸置換に含めるものとする。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１３位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３位のイソロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３位のイソロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２位のバリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３位のバリンである。
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２８６位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２８６位に対応する位置を意味する。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２８６位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８４位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８６位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２８４位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２８６位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８６位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８２位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８６位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８６位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８４位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８６位のフェニルアラニンである。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の２０４位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２０４位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２０４位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２０２位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２０４位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２０２位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２０４位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２０４位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２００位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２０４位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２０４位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２０２位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２０４位のグルタミン酸である。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の３３８位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３３８位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３３８位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３９位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３６位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３４位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３８位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３６位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のアスパラギン酸である。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４４位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４４位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４４位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のプロリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリンである。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３４０位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３４０位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３４１位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３４０位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３６位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸である。
さらに本発明において「配列番号１記載のアミノ酸配列の１９４位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１９４位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１９４位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１９４位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１９４位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１９４位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１９４位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９４位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１９２位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９３位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１９３位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９４位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９４位のアラニンである。
（デヒドロゲナーゼ活性向上／オキシダーゼ活性低減変異の対応位置）
なお、本明細書において「配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２８０位のシステインに対応する位置を意味するものである。これは上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
なお、本明細書において「配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２８０位のシステインに対応する位置を意味するものである。これは上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２８０位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２７８位のシステイン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２７８位のシステイン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２７６位のシステイン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステイン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７８位のシステイン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステインである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６７位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６３位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６９位のイソロイシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の５４位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の５４位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは５４位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは５３位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４１位のチロシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４１位のチロシンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２４１位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３９位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４１位のチロシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２３９位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２４１位のチロシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４１位のチロシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３７位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４１位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４１位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３９位のチロシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４１位のフェニルアラニンである。
（基質特異性改変変異の対応位置）
本明細書において「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これは上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
本明細書において「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これは上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６１位のアルギニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のロイシンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０２位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０１位のグルタミン酸である。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０５位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０５位のグリシンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、１０９位のリシンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５１位のアラニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１９位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４２０位のアラニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６８位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６８位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６７位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５６位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５４位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５７位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３５４位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５２位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５４位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギンである。
（カチオン性界面活性剤耐性向上変異の対応位置）
「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸に対応する位置」は、上記に説明したとおりである。
「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸に対応する位置」は、上記に説明したとおりである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８１位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは８１位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３３位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５３位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミンである。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５６位のグリシンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５２位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５７位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５７位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５５位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリンである。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６２位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６２位のアスパラギンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５８位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３３７位のグルタミンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３３７位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３３７位のリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３３位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリシンである。
「配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸に対応する位置」は、上記に説明したとおりである。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１２９位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１２９位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２７位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１３２位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３０位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３１位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２３１位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２７位のヒスチジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２２９位のグルタミン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３２位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２３２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２８位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４９位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２４９位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４５位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４７位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミンである。
（熱安定性向上欠失及び熱安定性向上アミノ酸置換の対応位置）
本明細書において「配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を意味する。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリシン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
本明細書において「配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を意味する。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリシン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジン及び４３７位のロイシンからなり、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリシン及び４４０位のロイシンからなり、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリシン及び４５２位のロイシンからなり、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリシン及び４４０位のロイシンからなり、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギン及び４３７位のロイシンからなり、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリシン及び４３８位のメチオニンからなり、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリシン及び４３８位のメチオニンからなり、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリシン及び４４１位のロイシンからなり、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリシン及び４３７位のロイシンからなる。
さらに「配列番号１記載のアミノ酸配列の４３位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４３位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４３位のチロシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは４３位のチロシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のチロシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４２位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のチロシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のチロシンである。
また、「配列番号１記載のアマドリアーゼの５３位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の５３位のヒスチジンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは５３位のヒスチジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５２位のチロシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のチロシンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１５１位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１５１位のアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１５１位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１５１位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５１位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１４９位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５０位のグリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５１位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５１位のグリシンである。
また、「配列番号１記載のアマドリアーゼの１８５位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１８５位のアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１８５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１８５位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８５位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１８３位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８４位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８５位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１８５位のアラニンである。
また、「配列番号１記載のアマドリアーゼの１９６位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１９６位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のグリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のグリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１９４位のグリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９５位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９６位のグリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１９６位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２９９位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２９９位のセリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２９９位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２９７位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３００位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２９７位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２９９位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９９位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２９５位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９９位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９７位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９９位のセリンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３２３位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３２３位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３２３位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３２１位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３２４位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３２１位のリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３２３位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２３位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３１９位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２３位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２１位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３２３位のグルタミン酸である。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５０位のスレオニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５０位のスレオニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３５０位のスレオニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３４８位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５１位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３４８位のスレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５０位のスレオニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５０位のスレオニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４６位のスレオニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５０位のスレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４８位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５０位のスレオニンである。
（復帰変異について）
本明細書では便宜上、配列番号１のアミノ酸配列を基準として、ある位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を説明した。しかしながら、天然のアマドリアーゼの中には、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントしたときに、あるアミノ酸の位置に対応する位置に、本発明のアミノ酸置換に相当するアミノ酸を既に有するものがある。例えば配列番号１の８０位のアミノ酸はリシンであり、これをアルギニンに置換することは本発明の変異に該当する。ところがPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、配列番号１の８０位に対応する位置のアミノ酸は既にアルギニンである。このようなアマドリアーゼに関し、配列番号１の８０位に対応する当該位置のアルギニンのリシンへの置換は、配列番号１から見ると一種の復帰変異に相当し、特定の実施形態では、これは本発明のアミノ酸置換に包含されない。逆にこのようなアマドリアーゼに関し、配列番号１の８０位に対応する当該位置のアミノ酸がアルギニンであることは、配列番号１から見ればリシンがアルギニンとなった、すなわちアルギニンに置換されたものと同等である。したがってある実施形態において、天然のアマドリアーゼとしてPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのような、配列番号１のアミノ酸配列の８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンであるアマドリアーゼも、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに配列番号１の８０位のリシンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
本明細書では便宜上、配列番号１のアミノ酸配列を基準として、ある位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を説明した。しかしながら、天然のアマドリアーゼの中には、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントしたときに、あるアミノ酸の位置に対応する位置に、本発明のアミノ酸置換に相当するアミノ酸を既に有するものがある。例えば配列番号１の８０位のアミノ酸はリシンであり、これをアルギニンに置換することは本発明の変異に該当する。ところがPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、配列番号１の８０位に対応する位置のアミノ酸は既にアルギニンである。このようなアマドリアーゼに関し、配列番号１の８０位に対応する当該位置のアルギニンのリシンへの置換は、配列番号１から見ると一種の復帰変異に相当し、特定の実施形態では、これは本発明のアミノ酸置換に包含されない。逆にこのようなアマドリアーゼに関し、配列番号１の８０位に対応する当該位置のアミノ酸がアルギニンであることは、配列番号１から見ればリシンがアルギニンとなった、すなわちアルギニンに置換されたものと同等である。したがってある実施形態において、天然のアマドリアーゼとしてPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのような、配列番号１のアミノ酸配列の８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンであるアマドリアーゼも、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに配列番号１の８０位のリシンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
このような本発明の界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換に包含されるアミノ酸を以下に例示する。
配列番号１のアミノ酸配列の３位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではスレオニンである。ある実施形態においてこれを配列番号１の３位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のセリンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の４位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではプロリンである。ある実施形態においてこれを配列番号１の４位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の９位に対応する位置のアミノ酸はPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではスレオニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではセリンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の９位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のアルギニンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の１２位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ及びPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではイソロイシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の１２位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のバリンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の１３位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、及びCryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではイソロイシンである。ある実施形態においてこれを配列番号１の１３位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のバリンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の２８位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではイソロイシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではロイシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではロイシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではロイシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではロイシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではイソロイシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の２８位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のバリンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の３０位に対応する位置のアミノ酸は、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではアラニンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の３０位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のセリンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の４４位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではリシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の４４位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の７１位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではロイシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の７１位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のメチオニンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の７７位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアスパラギン酸である。ある実施形態においてこれらを配列番号１の７７位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のグルタミンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の８０位に対応する位置のアミノ酸は、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、及びCryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアルギニンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の８０位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のリシンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の１７２位に対応する位置のアミノ酸は、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ及びNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではグルタミン酸である。ある実施形態においてこれらを配列番号１の１７２位に対応する位置のアミノ酸置換に含めるものとする。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の１７５位に対応する位置のアミノ酸は、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではアルギニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではアルギニンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の１７５位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を含まない。
配列番号１のアミノ酸配列の３４０位に対応する位置のアミノ酸は、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではリシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号１の３４０位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を含まない。
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
上記のようにして得られた界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。
また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、２０～４２℃の培養温度、好ましくは３０℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは３０℃前後の培養温度で８～１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の基質特異性が改善されたアマドリアーゼを得ることができる。
（本発明における界面活性剤）
本発明における界面活性剤としては、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられるが、特にカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤が好ましい。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の界面活性剤を包含するものとする。
本発明における界面活性剤としては、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられるが、特にカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤が好ましい。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の界面活性剤を包含するものとする。
本発明における界面活性剤は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が２５℃において、１３０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４．５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下又は１ｍＭ以下のものであり得る。ある実施形態において本発明の界面活性剤の臨界ミセル濃度は２５℃において、０．１ｍＭ又は０．０１ｍＭ以上であり得る。好ましくは、臨界ミセル濃度は５０ｍＭ以下であり、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、最も好ましくは１０ｍＭ以下である。臨界ミセル濃度とは界面活性剤が溶液中でミセルを形成する臨界濃度であり、これよりも低濃度ではミセルは形成されない。一般に臨界ミセル濃度が低い方が、低濃度の界面活性剤でもミセル形成し、界面活性剤としての作用は強くなる傾向がある。当業者であれば、慣用の手法により所望の界面活性剤の臨界ミセル濃度を決定することができる。例えば界面活性剤と相互作用する蛍光試薬の蛍光変化を利用して、界面活性剤の臨界ミセル濃度を測定する市販のキット等を用いることができる（例えばPFP社のDetergent Critical Micelle Concentration(CMC) Assay Kit等）。
例えば、オクチル硫酸ナトリウムのＣＭＣは１３０ｍＭであり（ＢＵＬＬ.ＣＨＥＭ.ＳＯＣ.ＪＡＰＡＮ,３８,１７００(１９６５)参照）、デシル硫酸ナトリウムのＣＭＣは３０ｍＭであり（Ｊ.ＣＯＬＬＯＩＤ.ＤＣＩ,１６,４８４（１９６１）参照）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のＣＭＣは８．３ｍＭであり（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社カタログデータ参照）、テトラデシル硫酸ナトリウムのＣＭＣは２ｍＭであり（Ｊ.ＣＯＬＬＯＩＤ.ＤＣＩ,１６,４８４（１９６１）参照）、ヘキサデシル硫酸ナトリウムのＣＭＣは０．５ｍＭであり（Ｊ.ＣＯＬＬＯＩＤ.ＤＣＩ,１６,４８４（１９６１）参照）、オクタデシル硫酸ナトリウムのＣＭＣは０．６ｍＭである（界面活性剤便覧，産業図書株式会社版（１９６０）参照）。ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム（ＳＤＤＳ）のＣＭＣは１４．４ｍＭである（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社カタログデータ参照）。４－オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウムのＣＭＣは１０．６ｍＭであり、４－デシルベンゼンスルホン酸ナトリウムのＣＭＣは３．７ｍＭであり、４－ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムのＣＭＣは１．２ｍＭである（界面活性剤便覧，産業図書株式会社版（１９６０）参照）。カプリル酸カリウムのＣＭＣは３９０ｍＭであり、カプリン酸カリウムのＣＭＣは９８ｍＭであり、ラウリン酸カリウムのＣＭＣは２５．５ｍＭであり、ミリスチン酸カリウムのＣＭＣは６．６ｍＭであり、パルミチン酸カリウムのＣＭＣは１．８ｍＭであり、ステアリン酸カリウムのＣＭＣは０．４５ｍＭである（界面活性剤便覧，産業図書株式会社版（１９６０）参照）。コール酸ナトリウムのＣＭＣは１４ｍＭである（日本化学雑誌，９０（５），４６３－４６６（１９６９）参照）。デオキシコール酸ナトリウムのＣＭＣは４．８ｍＭである（オレオサイエンス，１（１２），１１２７－１１３２（２００１） 参照）。臨界ミセル濃度は適宜％（ｗ／ｖ）に換算することができる。例えば１．０４ｍＭのＳＤＳは、０．０３％に相当する。
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
（アニオン性界面活性剤）
アニオン性界面活性剤は、その親水性頭部において、カルボン酸、スルホン酸、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩などのアニオン性官能基を有する界面活性剤である。対となるカチオンとしては、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、銀、銅、ニッケル、亜鉛、カリウム等のカチオンが挙げられる。スルホン酸系界面活性剤の例としては直鎖若しくは分岐鎖のアルキル硫酸エステル塩、環状のアルキル硫酸エステル塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルキルスルホン酸塩、環状のアルキルスルホン酸塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルケニルスルホン酸塩、環状ののアルケニルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリーレンスルホン酸塩、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキルベンゼンスルホン酸塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルケニルベンゼンスルホン酸塩、アリール若しくはアリーレンにより修飾されたベンゼンスルホン酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩が挙げられ、カルボン酸を有する界面活性剤の例としては脂肪酸塩やコール酸塩、アルキルアミノ酸塩が挙げられ、リン酸系界面活性剤としてはモノアルキルリン酸エステル塩、アルキルホスホン酸エステル塩が挙げられる。またアニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩なども挙げられる。さらに、こうした界面活性剤の誘導体、例えばフッ素置換誘導体等も包含される。アルキル基やアルケニル基は直鎖又は分岐鎖であってもよく、環状であってもよく、これらやアリール基、アリーレン基はさらに置換されていてもよく、又は非置換でありうる。置換は、一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C6アルコキシ基により行うことができる。
アニオン性界面活性剤は、その親水性頭部において、カルボン酸、スルホン酸、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩などのアニオン性官能基を有する界面活性剤である。対となるカチオンとしては、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、銀、銅、ニッケル、亜鉛、カリウム等のカチオンが挙げられる。スルホン酸系界面活性剤の例としては直鎖若しくは分岐鎖のアルキル硫酸エステル塩、環状のアルキル硫酸エステル塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルキルスルホン酸塩、環状のアルキルスルホン酸塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルケニルスルホン酸塩、環状ののアルケニルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリーレンスルホン酸塩、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキルベンゼンスルホン酸塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルケニルベンゼンスルホン酸塩、アリール若しくはアリーレンにより修飾されたベンゼンスルホン酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩が挙げられ、カルボン酸を有する界面活性剤の例としては脂肪酸塩やコール酸塩、アルキルアミノ酸塩が挙げられ、リン酸系界面活性剤としてはモノアルキルリン酸エステル塩、アルキルホスホン酸エステル塩が挙げられる。またアニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩なども挙げられる。さらに、こうした界面活性剤の誘導体、例えばフッ素置換誘導体等も包含される。アルキル基やアルケニル基は直鎖又は分岐鎖であってもよく、環状であってもよく、これらやアリール基、アリーレン基はさらに置換されていてもよく、又は非置換でありうる。置換は、一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C6アルコキシ基により行うことができる。
硫酸エステル塩化合物は次の一般式(I)で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキル硫酸エステル塩としては、オクチル硫酸エステル塩、例えばオクチル硫酸ナトリウム、デシル硫酸エステル塩、例えばデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸エステル塩、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸エステル塩、例えばテトラデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸エステル塩、例えばヘキサデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸エステル塩、例えばオクタデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。
ベンゼンスルホン酸塩化合物は次の一般式(II)で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、4-オクチルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-デシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-デシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-ドデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-テトラデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-テトラデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-ヘキサデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-ヘキサデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-オクタデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-オクタデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。
アシルサルコシン酸塩化合物は次の一般式で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アシルサルコシン酸塩としては、オクトイルサルコシン酸塩、例えばオクトイルサルコシン酸ナトリウム、ドデカノイルサルコシン酸塩、例えばドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、デカノイルサルコシン酸塩、例えばデカノイルサルコシン酸ナトリウムが挙げられる。
ホスホン酸エステル塩化合物は次の一般式(IV)で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルホスホン酸エステル塩としては、オクチルホスホン酸エステル塩、例えばオクチルホスホン酸ナトリウム、デシルホスホン酸エステル塩、例えばデシルホスホン酸ナトリウム、ドデシルホスホン酸エステル塩、例えばドデシルホスホン酸ナトリウム、テトラデシルホスホン酸エステル塩、例えばテトラデシルホスホン酸ナトリウム、ヘキサデシルホスホン酸エステル塩、例えばヘキサデシルホスホン酸ナトリウム、オクタデシルホスホン酸エステル塩、例えばオクタデシルホスホン酸ナトリウムが挙げられる。
スルホコハク酸塩化合物は次の一般式で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1及びR2は、それぞれ独立に、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルスルホコハク酸塩としては、スルホコハク酸ジオクチル塩、例えばスルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホコハク酸ジ(2-エチルヘキシル)塩、例えばスルホコハク酸ジ(2-エチルヘキシル)ナトリウム、スルホコハク酸ジオクタデシル塩、例えばスルホコハク酸ジオクタデシルナトリウムが挙げられる。
カルボン酸塩化合物は次の一般式で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]。
カルボン酸塩としては、C1～C20アルキルを有する脂肪酸塩が挙げらる。脂肪酸塩としては、例えばオクタン酸塩、例えばオクタン酸ナトリウム、ノナン酸塩、デカン酸塩、例えばデカン酸ナトリウム、ラウリン酸塩、例えばラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸塩、例えばミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸塩、例えばパルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸塩、例えばステアリン酸ナトリウムなどが挙げられる。さらに、カルボン酸塩誘導体も包含し、カルボン酸誘導体としてフッ素置換された誘導体、例えばペルフルオロオクタン酸塩、例えばペルフルオロオクタン酸ナトリウム、ペルフルオロノナン酸塩、例えばペルフルオロノナン酸ナトリウム等や、ココイルグルタミン酸塩、例えばココイルグルタミン酸ナトリウム[HOOCCH2CH2CH(NHCOR)COONa、式中RはC11～C17]等が挙げられる。
スルホン酸塩化合物は次の一般式で表される。
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1～C20アルキル、C3～C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8～C18アルキル、C3～C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C18アルケニル、C3～C18環状アルケニル、C6～C18アリール、C7～C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルスルホン酸塩としては、オクチルスルホン酸塩、例えばオクチルスルホン酸ナトリウム、デシルスルホン酸塩、例えばデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸塩、例えばドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸塩、例えばテトラデシルスルホン酸ナトリウム、ヘキサデシルスルホン酸塩、例えばヘキサデシルスルホン酸ナトリウム、オクタデシルスルホン酸塩、例えばオクタデシルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。
また、置換基を含むスルホン酸塩として、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩、例えばアルファスルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム[CH3(CH2)nCH(SO3Na)COOCH3)、式中nは8～18]が挙げられる。
また、置換基を含むスルホン酸塩として、アシルイセチオン酸塩が挙げられる（R1CO-O-CH2-CH2-SO3
-:Z+、式中、Z+は対イオンであり、R1はC1-C30、例えばC1-C11アルキルでありうる）。例えば、ステアロイルイセチオン酸ナトリウム、パルミトイルイセチオン酸ナトリウム、ミリストイルイセチオン酸ナトリウム、ココイルイセチオン酸ナトリウム、ラウロイルイセチオン酸ナトリウム、カプロイルイセチオン酸ナトリウム、オクタノイルイセチオン酸ナトリウム等が挙げられる。
コール酸塩としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、例えばデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸塩、例えばグリココール酸ナトリウム、タウロコール酸塩、例えばタウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸塩、例えばタウロデオキシコール酸ナトリウムが挙げられるがこれに限らない。
さらに、アミノ酸を基盤とした界面活性剤として、アシルグルタミン酸塩、アシルメチルアラニン塩、アシルグリシン塩、アシルメチルタウリン塩が挙げられる。ここでのアシル基（R1CO-）は、R1が置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1-C30アルキル又は環状のC2-C30アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C30アルケニル、C3～C30環状アルケニル、C6～C30アリール、C7～C30アリーレンでありうる。これらのR1は場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基により置換されていてもよい。例えば、ステアロイルグルタミン酸ナトリウム、パルミトイルグルタミン酸ナトリウム、ミリストイルグルタミン酸ナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム, ラウロイルグルタミン酸ナトリウム, カプロイルグルタミン酸ナトリウム、パルミトイルメチルタウリンナトリウム、ミリストイルメチルタウリンナトリウム、ココイルメチルタウリンナトリウム, カプロイルメチルタウリンナトリウム、ココイルメチルタウリンカリウム, ココイルメチルタウリンマグネシウム, ラウロイルメチルタウリンナトリウム, ステアロイルメチルタウリンナトリウム, ミリストイルメチルタウリンナトリウム,パルミトイルメチルアラニンナトリウム、ミリストイルメチルアラニンナトリウム、ココイルメチルアラニンナトリウム, ラウロイルメチルアラニンナトリウム,カプロイルメチルアラニンナトリウム、パルミトイルグリシンナトリウム、ミリストイルグリシンナトリウム、ココイルグリシンナトリウム, ラウロイルグリシンナトリウム、カプロイルグリシンナトリウム、ココイルグリシンカリウムが挙げられるが、これに限らない。上記には対イオンの種類の異なる均等物も包含される。
また、アニオン性界面活性剤として、上記に記載されている化合物の誘導体も挙げられる。例えば化合物中の水素をフッ素に置換した誘導体、アミノ酸を構造中に含む誘導体なども本発明における界面活性剤に包含される。
フッ素置換誘導体としては、上記化合物中の水素をフッ素に置換したあらゆる化合物が挙げられ、例えばペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロノナン酸などが例示されるがこれに限らない。
アミノ酸を構造中に含む誘導としては、アシル化アミノ酸塩、例えばN-アセチルグルタミン酸塩、N-アセチルアラニン酸塩、N-アセチルグリシン酸塩、N-アセチルアスパラギン酸塩、N-アセチルグルタミン酸塩、N-アルキルアミノプロピオン酸塩等が挙げられるがこれに限らない。
（カチオン性界面活性剤）
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
またカチオン性界面活性剤としては、以下の一般式で表される第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩やホスホニウム塩が挙げられる。
［式中、R1～R4は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、例えばC1～C20アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレンを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。R1～R4は場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。］
［式中、R5は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、例えばC1～C20アルキルを表し、各Raは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のC1～C30アルキル、例えばC1～C20アルキル、C3～C30環状アルキル、C2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレンを表し、ｎは１～５の整数を表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。R5及び各Raは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。］
［式中、R6～R9は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルキル、例えばC1～C20アルキル、C3～C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2～C20アルケニル、C3～C20環状アルケニル、C6～C20アリール、C7～C20アリーレンを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。R6～R9は場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1～C30アルコキシ基、C1～C30アシルオキシ基、C2～C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。］
第四級アンモニウム塩としては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、が挙げられる。
ピリジニウム塩としては、例えば、１－デシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－ドデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－テトラデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－ヘキサデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ－セチル－２－メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ－セチル－３－メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ－セチル－４－メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－オクタデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－エイコシルピリジニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド及びブロミド、テトラ－ｎ－オクチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
カチオン性界面活性剤の対となるアニオンZ-は例えばCl-、Br-、I-等でありうる。
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
（本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキット）
本発明はアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む糖化ヘモグロビン測定用キットを提供する。界面活性剤は非イオン性又はイオン性界面活性剤とすることができる。また、アマドリアーゼと界面活性剤とは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。一般に、同一の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤はアマドリアーゼを失活させない濃度で含まれるのが好ましい。別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤は測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。このストック溶液を適宜希釈して、測定に用いる溶液を調製する。界面活性剤を含む溶液は、水、純水、緩衝溶液又は有機溶剤中に界面活性剤を溶解させて調製することができる。例えば水への溶解性の低い界面活性剤等は、まずジメチルスルホキシド（DMSO）等の有機溶剤中に溶解させ、次いでこれを測定に用いる溶液に添加することができる。
本発明はアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む糖化ヘモグロビン測定用キットを提供する。界面活性剤は非イオン性又はイオン性界面活性剤とすることができる。また、アマドリアーゼと界面活性剤とは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。一般に、同一の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤はアマドリアーゼを失活させない濃度で含まれるのが好ましい。別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤は測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。このストック溶液を適宜希釈して、測定に用いる溶液を調製する。界面活性剤を含む溶液は、水、純水、緩衝溶液又は有機溶剤中に界面活性剤を溶解させて調製することができる。例えば水への溶解性の低い界面活性剤等は、まずジメチルスルホキシド（DMSO）等の有機溶剤中に溶解させ、次いでこれを測定に用いる溶液に添加することができる。
本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットは、さらにαＦＶＨ等の糖化基質測定用試薬、αＦＶＨ等の糖化基質を切り出すためのプロテアーゼまたはペプチダーゼ、その他公知の安定化剤や緩衝溶液を含み得る。αＦＶＨを測定するための各種キットに用いられている技術を、本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットの製造に適宜用いることができる。すなわち本発明は、適当なアマドリアーゼ及び界面活性剤を用意するステップを含む、アマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットの製造方法を提供する。このとき、アマドリアーゼ及び界面活性剤は同一又は別個の成分として用意することができる。キット中に別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とが提供される場合、これらはαＦＶＨ等の糖化基質測定の直前に混合され得る。
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、好ましくはキットに含まれる界面活性剤を終濃度に調製したものを添加してから５分後の残存活性（％）が、添加しない場合と比較して例えば１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９％以上である。残存活性については下記に説明する。
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、好ましくは測定時における終濃度として、界面活性剤０．００３２％（ｗ／ｖ）当たり１１０μｇ／ｍｌ以下、例えば１００μｇ／ｍｌ以下、９０μｇ／ｍｌ以下、８０μｇ／ｍｌ以下、７０μｇ／ｍｌ以下、６０μｇ／ｍｌ以下、又は５０μｇ／ｍｌ以下である。また、キットに含まれる界面活性剤は、測定時における終濃度として、０．００３％（ｗ／ｖ）以上、例えば０．００３２％（ｗ／ｖ）以上、０．００３５％（ｗ／ｖ）以上、０．００４％（ｗ／ｖ）以上、０．００４５％（ｗ／ｖ）以上、０．００５％（ｗ／ｖ）以上、０．００６％以上、０．００７％（ｗ／ｖ）以上、０．００８％（ｗ／ｖ）以上、０．００９％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１５％（ｗ／ｖ）以上、０．０２％（ｗ／ｖ）以上、０．０２５％（ｗ／ｖ）以上、０．０３％（ｗ／ｖ）以上、０．０３５％（ｗ／ｖ）以上、０．０３６％（ｗ／ｖ）以上、０．０４％（ｗ／ｖ）以上、０．０４５％（ｗ／ｖ）以上、０．０５％（ｗ／ｖ）以上、０．０６％（ｗ／ｖ）以上、０．０７％（ｗ／ｖ）以上、０．０８％（ｗ／ｖ）以上、０．０９％（ｗ／ｖ）以上、０．１％（ｗ／ｖ）以上、０．１１％（ｗ／ｖ）以上、０．１２％（ｗ／ｖ）以上、０．１３％（ｗ／ｖ）以上、０．１４％（ｗ／ｖ）以上、０．１５％（ｗ／ｖ）以上、０．１６％（ｗ／ｖ）以上、０．１７％（ｗ／ｖ）以上、０．１８％（ｗ／ｖ）以上、０．１９％（ｗ／ｖ）以上、０．２％（ｗ／ｖ）以上、０．２１％（ｗ／ｖ）以上、０．２２％（ｗ／ｖ）以上、０．２３％（ｗ／ｖ）以上、０．２４％（ｗ／ｖ）以上、０．２５％（ｗ／ｖ）以上、０．２６％（ｗ／ｖ）以上、０．２７％（ｗ／ｖ）以上、０．２８％（ｗ／ｖ）以上、０．２９％（ｗ／ｖ）以上、０．３％（ｗ／ｖ）以上、０．３５％（ｗ／ｖ）以上、０．４％（ｗ／ｖ）以上、０．４５％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以上、０．６％（ｗ／ｖ）以上、０．７％（ｗ／ｖ）以上、００．８％（ｗ／ｖ）以上、０．９％（ｗ／ｖ）以上、１．０％（ｗ／ｖ）以上、１．０５％（ｗ／ｖ）以上、１．１％（ｗ／ｖ）以上、１．１５％（ｗ／ｖ）以上、１．２％（ｗ／ｖ）以上、１．２５％（ｗ／ｖ）以上、１．３％（ｗ／ｖ）以上、１．３５％（ｗ／ｖ）以上、１．４％（ｗ／ｖ）以上、１．４５％（ｗ／ｖ）以上、１．５％（ｗ／ｖ）以上、１．６％（ｗ／ｖ）以上、１．７％（ｗ／ｖ）以上、１．８％（ｗ／ｖ）以上、１．９％（ｗ／ｖ）以上、２．０％（ｗ／ｖ）以上、２．１％（ｗ／ｖ）以上、２．２％（ｗ／ｖ）以上、２．３％（ｗ／ｖ）以上、２．４％（ｗ／ｖ）以上、２．５％（ｗ／ｖ）以上、又は３．０％（ｗ／ｖ）以上である。ここで、測定時における終濃度、とは最終的に成分を希釈して糖化ヘモグロビン測定を行うときの濃度をいう。したがってキット中では、測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。
ある実施形態において本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ又はこれに基づき作製された、界面活性剤耐性が向上した変異体であり得る。該変異体は、配列番号１、配列番号９４又は配列番号１１０と例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し得る。
また本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などに由来する天然のアマドリアーゼ又はそれらの変異体であり得る。こうした変異体は、上記のアミノ酸置換を１以上、有しうる。
当業者であれば、本明細書の教示に従って、あるアマドリアーゼが本発明のキットに使用可能か、すなわち所望の界面活性剤耐性を有するか適宜に調べることができる。
ある実施形態において、本発明のキットはアマドリアーゼ及びコール酸ナトリウムを含む。キットに含まれるアマドリアーゼは、天然アマドリアーゼや既知のアマドリアーゼであってもよく、また本発明の変異を有するアマドリアーゼであってもよい。アマドリアーゼとコール酸ナトリウムとは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。ある実施形態において、本発明のキットに含まれるコール酸ナトリウムは、アマドリアーゼ溶液中での濃度又は糖化ヘモグロビン測定時の終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以上、０．２％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以上、１．０％（ｗ／ｖ）以上、２．０％（ｗ／ｖ）以下、１．８％（ｗ／ｖ）以下、１．５％（ｗ／ｖ）以下、例えば０．１～２．０％（ｗ／ｖ）、０．５～１．５％（ｗ／ｖ）となるようにすることができる。
ある実施形態において、本発明のキットはアマドリアーゼ及びデオキシコール酸ナトリウムを含む。キットに含まれるアマドリアーゼは、天然アマドリアーゼや既知のアマドリアーゼであってもよく、また本発明の変異を有するアマドリアーゼであってもよい。アマドリアーゼとデオキシコール酸ナトリウムとは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。ある実施形態において、本発明のキットに含まれるデオキシコール酸ナトリウムは、アマドリアーゼ溶液中での濃度又は糖化ヘモグロビン測定時の終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以上、０．２％（ｗ／ｖ）以上、０．３％（ｗ／ｖ）以上、０．４％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以上、１．０％（ｗ／ｖ）以上、２．０％（ｗ／ｖ）以下、１．８％（ｗ／ｖ）以下、１．５％（ｗ／ｖ）以下、例えば０．１～２．０％（ｗ／ｖ）、０．２～２．０％（ｗ／ｖ）、例えば０．５～１．５％（ｗ／ｖ）となるようにすることができる。
当業者であれば、本明細書の教示に従って、アマドリアーゼを含む本発明のキットに用いるコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムの濃度を適宜、決定することができる。
（緩衝剤）
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるｐＨ５．０～ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．０～ｐＨ８．０の範囲で緩衝能を有する緩衝剤または緩衝液を適宜加えて良い。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は１以上の緩衝剤を包含するものとする。
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるｐＨ５．０～ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．０～ｐＨ８．０の範囲で緩衝能を有する緩衝剤または緩衝液を適宜加えて良い。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は１以上の緩衝剤を包含するものとする。
本発明のキット（組成物）に用いることのできる緩衝剤（緩衝液）としては、例えば、ホウ酸及び／又はその塩を含むホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸及び／又はその塩を含むリン酸緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤又はリン酸ナトリウム緩衝剤、有機酸緩衝剤及び／又はその塩を含む有機酸緩衝剤、例えばトリカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むトリカルボン酸緩衝剤、例えばクエン酸及び／又はその塩を含むクエン酸緩衝剤、モノカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むモノカルボン酸緩衝剤、例えば酢酸緩衝剤及び／又はその塩を含む酢酸緩衝剤、並びにグッド緩衝剤等の緩衝剤が挙げられる。
緩衝剤は、適当な濃度で本発明のキットまたは組成物に用いることができる。通常、本発明のキットまたは組成物に添加する緩衝剤の量は、測定溶液での終濃度に基づいて算出することができる。ある実施形態において測定溶液における緩衝剤の終濃度は、好ましくは当該測定溶液に生じうるpH変化を緩衝するのに十分な濃度である。緩衝剤の終濃度は、例えば1mM以上、5mM以上、10mM以上、20mM以上、例えば50mM以上、1M以下、500mM以下、400mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下、例えば1mM～1M、5mM～500mM、10mM～300mM、例えば50mM～100mMであり得る。
（本発明のアマドリアーゼにおける界面活性剤耐性の向上）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して界面活性剤耐性が向上していることを特徴とする。具体的には、ある実施形態において、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、本発明の改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、０．１～０．２％、例えば０．１５～０．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＤＳ又は０．０３％、０．０３６％、若しくは０．０４％のＳＤＳを添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、向上していることを特徴とする。またある実施形態において、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、本発明の改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、終濃度１．０～２．０％（ｗ／ｖ）となるオクチル硫酸ナトリウム、終濃度０．００３２～０．００６４％（ｗ／ｖ）となるテトラデシル硫酸ナトリウム、終濃度０．００２～０．００３２％（ｗ／ｖ）となるオクタデシル硫酸ナトリウム、終濃度０．００５～０．００１％（ｗ／ｖ）となる4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、終濃度１．０～２．０％（ｗ／ｖ）となるコール酸ナトリウム又は終濃度０．６０～１．２％（ｗ／ｖ）となるデオキシコール酸ナトリウムを添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、向上していることを特徴とする。ここで、残存活性（％）とは、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合をパーセンテージ（％）で表したものである。なお、本明細書において界面活性剤の濃度をパーセンテージで記載する場合、特に断らない限りこれは％（ｗ／ｖ）を意味するものとする。
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して界面活性剤耐性が向上していることを特徴とする。具体的には、ある実施形態において、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、本発明の改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、０．１～０．２％、例えば０．１５～０．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＤＳ又は０．０３％、０．０３６％、若しくは０．０４％のＳＤＳを添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、向上していることを特徴とする。またある実施形態において、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、本発明の改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、終濃度１．０～２．０％（ｗ／ｖ）となるオクチル硫酸ナトリウム、終濃度０．００３２～０．００６４％（ｗ／ｖ）となるテトラデシル硫酸ナトリウム、終濃度０．００２～０．００３２％（ｗ／ｖ）となるオクタデシル硫酸ナトリウム、終濃度０．００５～０．００１％（ｗ／ｖ）となる4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、終濃度１．０～２．０％（ｗ／ｖ）となるコール酸ナトリウム又は終濃度０．６０～１．２％（ｗ／ｖ）となるデオキシコール酸ナトリウムを添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、向上していることを特徴とする。ここで、残存活性（％）とは、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合をパーセンテージ（％）で表したものである。なお、本明細書において界面活性剤の濃度をパーセンテージで記載する場合、特に断らない限りこれは％（ｗ／ｖ）を意味するものとする。
本発明の改変アマドリアーゼの残存活性（％）の向上度合は限定されないが、例えば、本発明の変異を導入したアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性（％）が好ましくは５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９％以上である改変アマドリアーゼが本発明に包含される。例えばアニオン性界面活性剤で処理した後の残存活性が２０％である改変アマドリアーゼがこれに該当する。
ある実施形態において、本発明の改変アマドリアーゼの残存活性（％）は、界面活性剤処理を行った後に１００％を超えうる。したがって本発明の変異を導入したアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性（％）が、１００％以上、１０５％以上、１１０％以上、１１５％以上、１２０％以上、１２５％以上、１３０％以上、１３５％以上、１４０％以上、１４５％以上、例えば１５０％以上である改変アマドリアーゼが本発明に包含される。本発明の変異を導入することにより界面活性剤処理を行った後の残存活性（％）が１００％を超える変異体については、当該変異が界面活性剤に対する耐性を向上させるのみならずアマドリアーゼ活性を増強させているといえる。こうした変異も、界面活性剤に対する耐性を向上させる変異に含まれる。すなわち、本発明の界面活性剤に対する耐性を向上させる変異は、界面活性剤存在下でアマドリアーゼ活性を増強する変異も包含する。界面活性剤存在下でアマドリアーゼ活性を増強する変異とは、界面活性剤処理後の残存活性（％）が１００％を超えるアマドリアーゼをもたらす変異をいう。
また、本発明の変異を有しないアマドリアーゼ及び本発明の変異を有するアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性（％）同士の数値比較において、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０%以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、１００％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、例えば１４０％以上残存活性が向上している改変アマドリアーゼが本発明に包含される。例えば、アニオン性界面活性剤で処理した後の残存活性が変異導入前のアマドリアーゼについて１８％、変異導入後の改変アマドリアーゼについて２０％であれば、これらの残存活性（％）同士の数値比較において、残存活性が２％向上していると言うことができ、このような改変アマドリアーゼは本発明に包含される。アニオン性界面活性剤で処理した後の残存活性が変異導入後のアマドリアーゼについて１５３％、変異導入前の改変アマドリアーゼについて９％であれば、これらの残存活性（％）同士の数値比較において、残存活性が１４４％向上していると言うことができ、このような改変アマドリアーゼも本発明に包含される。
ある実施形態では、本発明のアマドリアーゼの界面活性剤耐性を、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を終濃度０．０３％となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）にて評価する。このときSDSを添加しない場合の残存活性を１００％とする。この条件下で、あるアマドリアーゼの残存活性（％）が２０％である場合、本明細書ではこれを「ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度０．０３％となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）が、ドデシル硫酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して２０％残存している」と表現する。
また、この条件下で、本発明の変異を有しないアマドリアーゼと有するアマドリアーゼとの界面活性剤処理後の残存活性（％）同士を比較し、本発明の変異を有するアマドリアーゼの残存活性が２．５％向上している場合、本明細書ではこれを「ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度０．０３％となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性が２．５％向上している」と表現する。
ある実施形態では、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行うと活性が全て消失することがある。このような場合、本発明の変異を導入した後のアマドリアーゼの残存活性（％）の向上を見るには、界面活性剤処理によっても活性が全て消失しない基準となるアマドリアーゼを用い、基準となるアマドリアーゼの界面活性剤処理後の残存活性と、変異導入後のアマドリアーゼの界面活性剤処理後の残存活性とを比較してもよい。
実際には、測定時の温度条件に加えて、変異導入前のアマドリアーゼの界面活性剤耐性の程度によっても相対的な評価結果は異なってくるため、残存活性（％）や残存活性比率数値の大小のみを比較して、各変異体の絶対的な界面活性剤耐性を評価することは難しい場合がある。ただし、本発明における実施例の条件を踏襲することで、各変異体の界面活性剤耐性を絶対的に評価することが可能である。また、本発明のアマドリアーゼの選抜を容易にする意図から変異導入前のアマドリアーゼの残存活性（％）が十分に低く算出される界面活性剤処理条件を選択することにより、一般的には、残存活性（％）の向上度合および残存活性比率が高く算出される傾向を有する。
例えば、本発明に包含される、大腸菌ＪＭ１０９（pKK223-3-CFP-T7/K80R）株が生産する本発明のアマドリアーゼを、０．０３％のＳＤＳと混合して、３０℃、５分間に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるCFP-T7の残存活性が１８．９％であるのに対し、本発明の変異導入後のアマドリアーゼ４は残存活性が４６．２％となり、ＳＤＳに対する安定性が向上した。また、大腸菌ＪＭ１０９（pKK223-3-CFP-T7/M71L）株が生産する本発明のアマドリアーゼを、０．０３％のＳＤＳと混合して、３０℃、５分間に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるCFP-T7の残存活性が１８．９％であるのに対し、本発明の変異導入後のアマドリアーゼ３は残存活性が３４．０％となり、ＳＤＳに対する安定性が向上した。このようにアニオン性界面活性剤に対する耐性が向上した本発明のアマドリアーゼは、該酵素含有製品等における保存性が著しく向上し、また、ＨｂＡ１ｃのプロテアーゼ分解効率を向上させ、測定感度を高めるために強い界面活性剤を使用する場合にも安定であるため、産業上非常に有利である。
ある実施形態において本発明は、０．０３％若しくは０．０３６％SDSの存在下でHbA1c測定が可能な改変アマドリアーゼを提供する。この改変アマドリアーゼはそのアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されている。置換アミノ酸は上記に例示したとおりである。この改変マドリアーゼ及び前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてSDSを終濃度０．０３％若しくは０．０３６％となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）同士の数値比較において、この本発明の改変アマドリアは、前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼと比較して例えば２％以上、３％以上、４％以上、５%以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１５％以上、例えば２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、例えば５０％以上残存活性が向上している。
ある実施形態において本発明は、０．１％又は０．１５％SDDSの存在下でHbA1c測定が可能な改変アマドリアーゼを提供する。この改変アマドリアーゼはそのアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、３位、４位、２８６位、２０４位、３３８位、４４位、３４０位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されている。置換アミノ酸は上記に例示したとおりである。この改変マドリアーゼ及び前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてSDDSを終濃度０．１％又は０．１５％となるよう添加してから、３０℃、５分後の残存活性（％）同士の数値比較において、この本発明の改変アマドリアは、前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼと比較して例えば２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１５％以上、例えば２０％以上、２５％以上、例えば３０％以上、残存活性が向上している。
このような本発明の改変アマドリアーゼは、HbA1cを変性させる界面活性剤、例えば０．０３％若しくは０．０３６％SDSまたは０．１％若しくは０．１５％SDDSの存在下でも活性が残存し、HbA1c測定に用いることができる。
（ハイスループットスクリーニング）
アマドリアーゼはさらに、機能性アマドリアーゼ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したアマドリアーゼ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異アマドリアーゼの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーゼバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際には界面活性剤存在下でのアマドリアーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
アマドリアーゼはさらに、機能性アマドリアーゼ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したアマドリアーゼ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異アマドリアーゼの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーゼバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際には界面活性剤存在下でのアマドリアーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
以下、本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特開２００１－９５５９８号参照）。なお、これは測定方法の説明のための便宜であって、本発明に用いるアマドリアーゼの基質特異性はフルクトシルバリンに何ら限定されるものではない。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ－４－ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４－アミノアンチピリン（東京化成工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（１）試薬１：ＰＯＤ－４－ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４－アミノアンチピリン（東京化成工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度 ５ｍＭ）
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１，１００μｌの試薬２、および１００μｌの試薬３を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、酵素液を１００μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ－３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ ｛（ΔＡｓ－ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）
ΔＡｓ ： 反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０ ： 対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２： 反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数（ｍＭ－１・ｃｍ－１）
０．５ ： １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ ： 希釈係数
２．７ｍｌの試薬１，１００μｌの試薬２、および１００μｌの試薬３を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、酵素液を１００μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ－３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ ｛（ΔＡｓ－ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）
ΔＡｓ ： 反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０ ： 対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２： 反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数（ｍＭ－１・ｃｍ－１）
０．５ ： １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ ： 希釈係数
（界面活性剤耐性測定方法）
アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約１．０Ｕ／ｍｌとなるように、３０ｍＭ ＭＥＳ／２１ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、ＳＤＳ（例えば、和光純薬工業社製）を終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）または０．０４％となるように添加後、３０℃にて５分間加温する。加温後、０．１５％のＢＳＡを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、上述のＢ．の方法を用いて界面活性剤処理前と界面活性剤処理後のサンプルの酵素活性を測定し、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求めることにより、界面活性剤耐性を評価する。
アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約１．０Ｕ／ｍｌとなるように、３０ｍＭ ＭＥＳ／２１ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、ＳＤＳ（例えば、和光純薬工業社製）を終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）または０．０４％となるように添加後、３０℃にて５分間加温する。加温後、０．１５％のＢＳＡを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、上述のＢ．の方法を用いて界面活性剤処理前と界面活性剤処理後のサンプルの酵素活性を測定し、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求めることにより、界面活性剤耐性を評価する。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（界面活性剤耐性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの調製
CFP-T7遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株（国際公開２００７／１２５７７９号参照）を、LB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin］2.5mlに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
（界面活性剤耐性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの調製
CFP-T7遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株（国際公開２００７／１２５７７９号参照）を、LB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin］2.5mlに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を7,000rpmで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりQIAGEN tip-100（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7を抽出して精製し、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7のDNA2.5μgを得た。
（２）組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（東洋紡社製）を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
得られた組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（東洋紡社製）を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
すなわち、10×KOD-Plus-緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるpKK223-3-CFP-T7 DNAを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加えて、滅菌水により全量を50μlとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約6,000bpのDNAが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたDNAを制限酵素DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドDNAを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９位のアルギニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-R9T）を得た。
同様の手順で、配列番号１６、１７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V12I）を得た。
同様の手順で、配列番号６１、６２の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２位のバリンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V12L）を得た。
同様の手順で、配列番号１８、１９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-M71L）を得た。
同様の手順で、配列番号７１、７２の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-M71I）を得た。
同様の手順で、配列番号７１、７３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-M71A）を得た。
同様の手順で、配列番号７１、７４の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンがバリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-M71V）を得た。
同様の手順で、配列番号７１、７５の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７１位のメチオニンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-M71C）を得た。
同様の手順で、配列番号２０、２１の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の８０位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-K80R）を得た。
同様の手順で、配列番号８１、８２の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の８０位のリシンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-K80N）を得た。
同様の手順で、配列番号８１、８３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の８０位のリシンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-K80Q）を得た。
同様の手順で、配列番号８１、８４の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の８０位のリシンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-K80H）を得た。
同様の手順で、配列番号２２、２３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-F172E）を得た。
同様の手順で、配列番号８５、８６の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７２位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-F172D）を得た。
同様の手順で、配列番号８５、８７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７２位のフェニルアラニンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-F172Y）を得た。
同様の手順で、配列番号８５、８８の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７２位のフェニルアラニンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-F172Q）を得た。
同様の手順で、配列番号２４、２５の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７５位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E175R）を得た。
同様の手順で、配列番号８９、９０の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７５位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E175K）を得た。
同様の手順で、配列番号８９、９１の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７５位のグルタミン酸がヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E175H）を得た。
同様の手順で、配列番号２６、２７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の２７９位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V279I）を得た。
同様の手順で、配列番号９２、９３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の２７９位のバリンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V279C）を得た。
同様の手順で、配列番号２８、２９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８位のバリンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V28L）を得た。
同様の手順で、配列番号６５、６６の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V28I）を得た。
同様の手順で、配列番号６５、６７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８位のバリンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V28M）を得た。
同様の手順で、配列番号３０、３１の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の３０位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-S30A）を得た。
同様の手順で、配列番号６８、６９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の３０位のセリンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-S30T）を得た。
同様の手順で、配列番号６８、７０の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の３０位のセリンがバリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-S30V）を得た。
同様の手順で、配列番号３２、３３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７７位のグルタミンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-Q77D）を得た。
同様の手順で、配列番号７６、７７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７７位のグルタミンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-Q77E）を得た。
同様の手順で、配列番号７６、７９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７７位のグルタミンがリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-Q77K）を得た。
同様の手順で、配列番号７６、８０の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の７７位のグルタミンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-Q77N）を得た。
同様の手順で、配列番号６３、６４の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３位のバリンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-V13L）を得た。
これらのプラスミドについて、上記と同様に当該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、変異導入を確認した。
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
（４）各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDSの終濃度を0.03%として、またはSDDS（東京化成工業社製）の終濃度を0.15%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表１に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表１において、CFP-T7は、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼであるCFP-T7を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、CFP-T7に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDSの終濃度を0.03%として、またはSDDS（東京化成工業社製）の終濃度を0.15%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表１に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表１において、CFP-T7は、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼであるCFP-T7を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、CFP-T7に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
表１に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性は０．１５％ＳＤＤＳ処理後に７３．０％となり、０．０３％ＳＤＳ処理後に１８．９％となった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた７の変異体、すなわち、CFP-T7の９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、７１位のメチオニンがロイシンに、８０位のリシンがアルギニンに、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、２７９位のバリンがイソロイシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれもCFP-T7と比較して、ＳＤＤＳについては４％～１６．９％、ＳＤＳについては８．６％～２７．３％向上した。またCFP-T7の７７位のグルタミンがアスパラギン酸に置換されたアマドリアーゼにおいては、残存活性がCFP-T7と比較してＳＤＳについて２．５％向上した。さらにCFP-T7の１２位のバリンがロイシンに、71位のメチオニンがアラニン又はバリン又はシステインに、８０位のリシンがアスパラギン又はグルタミンに、１７２位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に、１７５位のグルタミン酸がリシンに、２８位のバリンがイソロイシン又はメチオニンに、３０位のセリンがスレオニン又はバリンに、１３位のバリンがロイシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、ＳＤＳ存在下での残存活性がいずれもCFP-T7と比較して向上した。したがって、これらの各変異点が、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異点であることが確認された。
９位については、スレオニン、アスパラギン、及びグルタミンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく極性の側鎖を有するアミノ酸であるセリンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また１２位については、イソロイシン及びロイシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくバリンよりも分子量が大きいアミノ酸であるメチオニン、システインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また７１位については、ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン及びシステインへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくメチオニンよりも分子量の小さいアミノ酸であるグリシン、への置換により同様の結果が得られると考えられる。
８０位については、アルギニン、アスパラギン、及びグルタミン及びヒスチジンへの置換により良好な結果が得られた。
また１７２位についてはグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン及びグルタミンへの置換により良好な結果が得られたこ。
また１７５位についてはアルギニン、リシン及びヒスチジンへの置換により良好な結果が得られた。
また２７９位については、イソロイシン及びシステインへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくバリンよりも分子量の大きいアミノ酸であるメチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また２８位については、イソロイシン及びメチオニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく疎水性の側鎖を有するアミノ酸であるアラニン、及び同じくバリンよりも分子量の大きいアミノ酸であるシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また３０位については、スレオニン及びバリンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく疎水性の側鎖を有するアミノ酸であるロイシン、イソロイシンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また７７位については、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン及びアスパラギンへの置換により良好な結果が得られた。
また１３位については、ロイシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくバリンよりも分子量の大きいアミノ酸であるイソロイシン、システイン及びメチオニンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
本発明のこれらの変異点は、単独変異として有効であるのみならず、既に知られている各種公知の変異と組み合わせ、また、本発明の変異同士を組み合わせることによって、実用上の利点を有する変異体を創出することに貢献することが期待される。
［実施例２］
（アニオン性界面活性剤耐性向上型変異の蓄積）
実施例１で見出された界面活性剤耐性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらに界面活性剤耐性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、多重変異体の作製による界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を試みた。
（アニオン性界面活性剤耐性向上型変異の蓄積）
実施例１で見出された界面活性剤耐性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらに界面活性剤耐性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、多重変異体の作製による界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を試みた。
実施例１と同様にして、pKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型とし、配列番号３４、３５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P DNAを鋳型とし、配列番号３６、３７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P/H53N)を得た。
続いて、PCT/JP2014/071036号（国際公開第2015/020200号）に示されているカチオン性界面活性剤耐性向上型アマドリアーゼであるCFP-T7-E44Pを発現するプラスミドであるpKK223-3-CFP-T7-E44P DNAを鋳型とし、配列番号３８、３９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、４４位のグルタミン酸がプロリンに、３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E44P/E340P)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-F172E DNAを鋳型とし、配列番号２５、４０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F172E/E175R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-V28L DNAを鋳型とし、配列番号３１、４１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V28L/S30A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-M71L DNAを鋳型とし、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71L/Q77D/K80R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-V28L DNAを鋳型とし、配列番号３１、４１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V28L/S30A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-M71L DNAを鋳型とし、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71L/Q77D/K80R)を得た。
なお、43Y、53N、184Dは酵素の熱安定性を向上させることが報告されている変異である（国際公開第2013/100006号パンフレット）。また44P、340Pはカチオン性界面活性剤耐性を向上させる変異である（PCT/JP2014/071036号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書参照）。
実施例１と同様に上記の多重変異体を生産させ、得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、実施例１と同様に、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表２に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
表２に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性は０．１５％ＳＤＤＳ処理後に７３．０％となり、０．０３％ＳＤＳ処理後に１８．９％となった。これと比較して、作製した本発明の二重変異体及び三重変異体はアニオン性界面活性剤での処理後の残存活性が向上していた。
具体的には、172E/175R変異を導入したアマドリアーゼ１５の０．０３％ＳＤＳ処理後の残存活性は５１．２％であり、CFP-T7の残存活性１８．９％と比較して顕著に向上した。
172E/175R変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの１７２位を酸性アミノ酸であるグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換し、同時に、１７５位を塩基性アミノ酸であるアルギニン、ヒスチジン又はリシンに置換することにより、同様の結果が得られると考えられる。
また、28L/30A変異を導入したアマドリアーゼ１６の０．０３％ＳＤＳ処理後の残存活性は３７．３％であり、CFP-T7の残存活性１８．９％と比較して有意に向上した。
28L/30A変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの２８位を疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、アラニンへと置換し、同時に、３０位をセリンよりも分子量の小さいアミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン又はセリンと構造の類似するアミノ酸であるスレオニンへと置換することにより同様の結果が得られると考えられる。特に２８位をロイシン又はイソロイシンに置換し、同時に、３０位をアラニンに置換する組み合わせは同様の結果が得られると考えられる。
また、71L/77D/80R変異を導入したアマドリアーゼ１７の０．０３％ＳＤＳ処理後の残存活性は５６．３％であり、CFP-T7の残存活性１８．９％と比較して顕著に向上した。
したがって、これらの本発明の変異の組み合わせが、より強力な変性条件下においてもアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させることが確認された。
したがって、これらの本発明の変異の組み合わせが、より強力な変性条件下においてもアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させることが確認された。
71L/77D/80R変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの７１位をメチオニンよりも分子量の小さいアミノ酸であるロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン又はシステインへと置換し、同時に７７位を酸性アミノ酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸へと置換し、同時に８０位を塩基性アミノ酸であるアルギニン又はヒスチジンへと置換することにより同様の結果が得られると考えられる。
また酵素の熱安定性を向上させることが報告されている変異43Y及び53N、並びにカチオン性界面活性剤耐性を向上させる変異44P及び340Pについても表２の組み合わせによる残存活性の向上が見られた。
本発明のこれらの変異の組み合わせの効果が示されたことから、当該組み合わせ同士を蓄積させることによって、さらに界面活性剤に対する耐性を向上させうると期待される。
（さらなる変異の蓄積）
続いて、pKK223-3-CFP-T7-R9T DNAを鋳型とし、配列番号４４、４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I)を得た。
続いて、pKK223-3-CFP-T7-R9T DNAを鋳型とし、配列番号４４、４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I DNAを鋳型とし、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I DNAを鋳型とし、配列番号３１、４１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I/V28L/S30A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I DNAを鋳型とし、配列番号３１、４１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I/V28L/S30A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P/H53N DNAを鋳型とし、配列番号１８、１９、３１、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R DNAを鋳型とし、配列番号４８、４９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D DNAを鋳型とし、配列番号５０、５１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H DNAを鋳型とし、配列番号２５、４０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R DNAを鋳型とし、配列番号５２、５３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失（ΔＰＴＳ１）した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1 DNAを鋳型とし、配列番号５４、５５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失（ΔＰＴＳ１）した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1/E98A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1/E98A DNAを鋳型とし、配列番号１２１、１２２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、５３位のヒスチジンがアスパラギンに、７１位のメチオニンがロイシンに、７７位のグルタミンがアスパラギン酸に、８０位のリシンがアルギニンに、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに、２８６位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失（ΔＰＴＳ１）した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1/E98A/F286Y)を得た。このプラスミドによりコードされるアマドリアーゼを、アマドリアーゼ25-F286Yとよぶことがある。
続いて、ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１０３６号（国際公開第2015/020200号）に示されているカチオン性界面活性剤耐性向上型アマドリアーゼであるCFP-D4(CFP-T7-F43Y/E44P/E98A/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1)を発現するプラスミドであるpKK223-3-CFP-D4 DNAを鋳型とし、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失（ΔＰＴＳ１）した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1 DNAを鋳型とし、配列番号２５、４０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失（ΔＰＴＳ１）した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R DNAを鋳型とし、配列番号３１、４１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、３位のセリンがスレオニンに、４位のアスパラギンがプロリンに、９位のアルギニンがスレオニンに、１２位のバリンがイソロイシンに、１３位のバリンがイソロイシンに、２８位のバリンがロイシンに、３０位のセリンがアラニンに、４３位のフェニルアラニンがチロシンに、４４位のグルタミン酸がプロリンに、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギン酸に、１７２位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、１７５位のグルタミン酸がアルギニンに、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に、２５７位のバリンがシステインに、２６２位のアスパラギンがヒスチジンに３４０位のグルタミン酸がプロリンに置換され、カルボキシル末端の３アミノ酸残基が欠失（ΔＰＴＳ１）した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た。
また98A、154Dは基質特異性を改変することが報告されている変異である（国際公開第2012/018094号パンフレット）。また257C、262Hはカチオン性界面活性剤およびSDSに対する耐性を向上させることが報告されている変異である（PCT/JP2014/071036号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書）。またΔPTS1は熱安定性を向上させることが報告されているカルボキシル末端の３アミノ酸の欠失である（国際公開第2013/100006号パンフレット）。
得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、より厳しい条件である０．０４％のＳＤＳの混合に変更し、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表３に示す。なお加温後のサンプルをＢＳＡ溶液で２倍希釈してから３０分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
表３に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性はわずか４．８％であった。このように過酷なアニオン性界面活性剤条件下においては、従来のアマドリアーゼは、ほとんど活性を失うことが確認された。
これに対し、実施例１で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種多重変異体においては、残存活性が顕著に向上した。
具体的には、71L/77D/80R変異を導入したアマドリアーゼ１７の残存活性は７．１％であり、CFP-T7の残存活性４．８％と比較して向上した。また71L/77D/80R変異及び28L/30A変異及び3T/4P/R9T/12I/13I変異を導入したアマドリアーゼ２０の残存活性は２２．８％であり、CFP-T7と比較して有意に向上しており、変異導入前のアマドリアーゼ１２、１７、１８、１９それぞれと比較して向上した。
また172E/175R変異を導入したアマドリアーゼ２３の残存活性は５５．２％であり、変異導入前のアマドリアーゼ２２の残存活性４７．９％と比較して向上した。また172E/175R変異を導入したアマドリアーゼ２７の残存活性は４０．６％であり、変異導入前のアマドリアーゼ２６の残存活性２８．９％と比較して向上した。
28L/30A変異を導入したアマドリアーゼ１９の残存活性は５．９％であり、CFP-T7の残存活性４．８％と比較して向上した。また28L/30A変異を導入したアマドリアーゼ２８の残存活性は８１．９％であり、変異導入前のアマドリアーゼ２７の残存活性４０．６％やアマドリアーゼ２６の残存活性２８．９％と比較して顕著に向上した。
3T/4P/R9T/12I/13I変異を導入したアマドリアーゼ１８の残存活性は８．９％であり、アマドリアーゼ２６の残存活性は２８．９％であり、それぞれ、CFP-T7と比較して耐性が向上した。
3T/4P/R9T/12I/13I変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの３位を極性の側鎖を有するアミノ酸であるスレオニンへと置換し、同時に、４位をプロリンへと置換し、９位を極性の側鎖を有するアミノ酸であるスレオニン、セリン、アスパラギン又はグルタミンへと置換し、同時に、１２位をバリンよりも分子量が大きいアミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、メチオニン又はシステインへと置換し、同時に１３位をバリンよりも分子量が大きいアミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、メチオニン又はシステインへと置換することにより、同様の結果が得られると考えられる。
また、これらの多重変異を累積させたアマドリアーゼ２０～２５及び２７～２８は残存活性がCFP-T7と比較して顕著に向上した。特に本発明のアマドリアーゼ２２、２３、２４、２５、２７、２８はアマドリアーゼ１２、１７、１８、２６と比較すると、アニオン性界面活性剤に対する耐性が顕著に向上しており、これらの変異が相乗効果を有することが分かる。例えばアマドリアーゼ２０は3T/4P/R9T/12I/13I変異、28L/30A変異、及び71L/77D/80R変異を累積させた変異体であり、これらを有しないアマドリアーゼ１２と比較して残存活性が有意に向上している。またアマドリアーゼ２６、２７、２８は、3T/4P/R9T/12I/13I変異、172E/175R変異、及び28L/30A変異を段階的に組み合わせたものであるが、変異の累積によりアニオン性界面活性剤に対する耐性が段階的に向上しており、変異の累積的な効果が確認された。よって実施例１で確認された本発明の変異点を適宜組み合わせることによって、一層優れた界面活性剤耐性を有するアマドリアーゼが作出され得ることが明らかとなった。
さらに、9位、12位及び13位の変異がそれぞれ、単独でもアマドリアーゼの界面活性剤耐性の向上に寄与しているか否かを調べるために、アマドリアーゼ２８から出発して当該位置の変異後のアミノ酸を野生型のアミノ酸に戻した復帰変異体を作製し、そのアニオン性界面活性剤耐性を測定した。
具体的には、上記と同じ手順で、ただしpKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30Aを鋳型とし、配列番号５６、５７の合成オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、鋳型における９位のスレオニンをアルギニンに復帰変異させた改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(CET/E98A/G184D/ΔPTS1/F43Y/E44P/S154D/V257C/N262H/E340P/S3T/N4P/V12I/V13I/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た（T9R復帰変異）。
また、上記と同じ手順で、ただしpKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30Aを鋳型とし、配列番号５８、５９の合成オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、鋳型における１２位のイソロイシンをバリンに復帰変異させた改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(CET/E98A/G184D/ΔPTS1/F43Y/E44P/S154D/V257C/N262H/E340P/S3T/N4P/R9T/V13I/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た（I12V復帰変異）。
また、上記と同じ手順で、ただしpKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30Aを鋳型とし、配列番号５９、６０の合成オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、鋳型における１３位のイソロイシンをバリンに復帰変異させた改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(CET/E98A/G184D/ΔPTS1/F43Y/E44P/S154D/V257C/N262H/E340P/S3T/N4P/R9T/V12I/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た（I13V復帰変異）。
実施例１と同様に上記の多重変異体を生産させ、得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件は、0.04%のSDSの混合とし、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表４に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
表４に示す通り、R9T/V12I/V13Iを全て有するアマドリアーゼ２８の残存活性８１．９％と比較して、９位のみをアルギニンに復帰させたアマドリアーゼ２９は残存活性が６３．３％へと低下した。逆に言えば、アマドリアーゼ２９から出発して９位のアルギニンをスレオニンとする本発明の単独変異はアマドリアーゼ２８をもたらし、この１つの変異によって１８．６％に相当する残存活性の向上、すなわち界面活性剤に対する耐性をもたらす。
またR9T/V12I/V13Iを全て有するアマドリアーゼ２８の残存活性８１．９％と比較して、１２位のみをバリンに復帰させたアマドリアーゼ３０は残存活性が５５．１％へと低下した。逆に言えば、アマドリアーゼ３０から出発して１２位のバリンをイソロイシンとする本発明の単独変異はアマドリアーゼ２８をもたらし、この１つの変異によって２６．８％に相当する残存活性の向上、すなわち界面活性剤に対する耐性をもたらす。
またR9T/V12I/V13Iを全て有するアマドリアーゼ２８の残存活性８１．９％と比較して、１３位のみをバリンに復帰させたアマドリアーゼ３１は残存活性が５８．０％へと低下した。逆に言えば、アマドリアーゼ３１から出発して１３位のバリンをイソロイシンとする本発明の単独変異はアマドリアーゼ２８をもたらし、この１つの変異によって２３．９％に相当する残存活性の向上、すなわち界面活性剤に対する耐性をもたらす。
したがってこれらの結果から、9位、12位及び13位の変異がそれぞれ、単独でもアマドリアーゼの界面活性剤耐性の向上に寄与していることが示された。
［実施例３］
（CFP-T7、および各種変異型アマドリアーゼの精製）
実施例１，２で得たCFP-T7、CFP-T7-M71A、アマドリアーゼ２１、アマドリアーゼ２４、およびアマドリアーゼ２５-F286Yの粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で平衡化した4mlのQ Sepharose Fast Flow樹脂（GEヘルスケア社製）に吸着させ、次に80mlの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて100mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
（CFP-T7、および各種変異型アマドリアーゼの精製）
実施例１，２で得たCFP-T7、CFP-T7-M71A、アマドリアーゼ２１、アマドリアーゼ２４、およびアマドリアーゼ２５-F286Yの粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で平衡化した4mlのQ Sepharose Fast Flow樹脂（GEヘルスケア社製）に吸着させ、次に80mlの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて100mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Amicon Ultra-15, 30K NMWL（ミリポア社製）で濃縮した。その後、150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pg（GEヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。得られた精製標品はSDS-PAGEによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。
精製したCFP-T7は実施例２の条件でアニオン性界面活性剤処理を行い、残存活性を測定したところ、０％であった。これに対して精製した本発明のアマドリアーゼ２４について、実施例２の条件でアニオン性界面活性剤処理を行い、残存活性を測定したところ、６７．２％と顕著な向上が見られた。
［実施例４］（様々な界面活性剤に対する耐性試験）
実施例３で得た各種アマドリアーゼの精製酵素をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表５、６に示す。ただし、評価に用いた界面活性剤の終濃度は表５、６に記載の通りとした。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
実施例３で得た各種アマドリアーゼの精製酵素をサンプルとし、上記（４）に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表５、６に示す。ただし、評価に用いた界面活性剤の終濃度は表５、６に記載の通りとした。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
表５に示すとおり、M71A変異体は種々の界面活性剤の存在下でも、未変異のCFP-T7と比較して、残存活性が向上した。なお、未変異のCFP-T7アマドリアーゼと１．０％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウムとの組み合わせは、コール酸ナトリウムを添加しない場合（１００％）と比較して、有意の活性増加を示した。すなわちこの条件下では、コール酸ナトリウムはアマドリアーゼ活性を向上させた。また、M71A変異体と１．０％コール酸ナトリウムとの組み合わせは、当該変異を有しないアマドリアーゼの場合と比較して、活性がさらに増加していた。したがってM71A変異はコール酸ナトリウムに対する耐性を向上させるか、又はコール酸ナトリウム存在下でアマドリアーゼ活性をさらに増強するといえる。M71A変異はまた、０．６％デオキシコール酸ナトリウム存在下で、界面活性剤に対する耐性を向上させるのみならず、デオキシコール酸ナトリウム不在下の場合と比較して、アマドリアーゼ活性をさらに増強した。
また表６に示すとおり、アマドリアーゼ２１は、未変異のCFP-T7と比較して、２．０％オクチル硫酸ナトリウム、０．４％ＳＤＳ、０．０１０％4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、及び１．２％デオキシコール酸ナトリウム存在下で、残存活性が向上した。さらに、アマドリアーゼ２５にＦ２８６Ｙ変異を導入した変異体は、試験した全ての種類の界面活性剤について、CFP-T7と比較して、残存活性が向上していた。アマドリアーゼ25-F286Y変異体はまた、１．２％デオキシコール酸ナトリウム存在下で、界面活性剤に対する耐性を向上させるのみならず、デオキシコール酸ナトリウム不在下の場合と比較して、アマドリアーゼ活性をさらに増強した。
また２８６位については、チロシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく分子量の大きい疎水性アミノ酸であるトリプトファンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
［実施例５］
（CFP-T7に対する界面活性剤耐性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの部位特異的改変操作
実施例１に記載の方法に従って、配列番号１２３、１２４の合成オリゴヌクレオチドを使用し、組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7）を鋳型としてPCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E44K）を得た。
（CFP-T7に対する界面活性剤耐性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの部位特異的改変操作
実施例１に記載の方法に従って、配列番号１２３、１２４の合成オリゴヌクレオチドを使用し、組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7）を鋳型としてPCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E44K）を得た。
同様の手順で、配列番号１２５、１２６の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１９４位のアスパラギン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-D194K）を得た。
同様の手順で、配列番号１２５、１２７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の１９４位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-D194A）を得た。
同様の手順で、配列番号１２８、１２９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の２０４位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E204A）を得た。
同様の手順で、配列番号１３０、１３１の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の３３８位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-D338A）を得た。
同様の手順で、配列番号１３２、１３３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-E340K）を得た。
これらのプラスミドについて、上記と同様に当該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、変異導入を確認した。
（２）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
（３）各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDSの終濃度を0.036%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表７に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDSの終濃度を0.036%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表７に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
表７において、CFP-T7は、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼであるCFP-T7を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、CFP-T7に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
表７に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性は０．０３６％ＳＤＳ処理後に９．６％となった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた６の変異体、すなわち、CFP-T7の４４位のグルタミン酸がリシンに、１９４位のアスパラギン酸がリシンに、２０４位のグルタミン酸がアラニンに、３３８位のアスパラギン酸がアラニンに、３４０位のグルタミン酸ががリシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれもCFP-T7と比較して、ＳＤＳについては２．９％～３７．７％向上した。またCFP-T7の１９４位のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアマドリアーゼにおいては、残存活性がCFP-T7と比較してＳＤＳについて１．３％向上した。したがって、これらの各変異点が、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異点であることが確認された。
４４位については、リシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく塩基性のアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また１９４位については、リシン及びアラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく塩基性のアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジンへの置換、および分子量の小さい疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また２０４位については、アラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく分子量の小さい疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また３３８位については、アラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく分子量の小さい疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また３４０位についてはリシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく塩基性のアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
本発明のこれらの変異点は、単独変異として有効であるのみならず、既に知られている各種公知の変異と組み合わせ、また、本発明の変異同士を組み合わせることによって、実用上の利点を有する変異体を創出することに貢献することが期待される。
［実施例６］（各種アマドリアーゼの部位特異的改変操作）
（組換え体プラスミドpKK223-3-CcFX DNAの調製）
配列番号９４はＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（CcFX）のアミノ酸配列である（国際公開第ＷＯ２００４／１０４２０３号）。配列番号９４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号９５）を挿入した組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを保持する大腸菌により生産できる（国際公開第２０１５／０２０２００号公報参照）。pKK223-3-CcFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例１ （１）組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pKK223-3-CcFXを抽出、精製した。
（組換え体プラスミドpKK223-3-CcFX DNAの調製）
配列番号９４はＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（CcFX）のアミノ酸配列である（国際公開第ＷＯ２００４／１０４２０３号）。配列番号９４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号９５）を挿入した組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを保持する大腸菌により生産できる（国際公開第２０１５／０２０２００号公報参照）。pKK223-3-CcFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例１ （１）組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pKK223-3-CcFXを抽出、精製した。
（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
CcFXに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを鋳型にして、配列番号９６、９７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のCcFX変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９４記載のアミノ酸配列の28位のバリンがロイシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-V28L）を得た。
CcFXに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを鋳型にして、配列番号９６、９７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のCcFX変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９４記載のアミノ酸配列の28位のバリンがロイシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-V28L）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号９６，９８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の28位のバリンがメチオニンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-V28M）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号９９，１００の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の71位のロイシンがアラニンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-L71A）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号９９，１０１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の71位のロイシンがバリンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-L71V）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号１０２，１０３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の80位のアルギニンがアスパラギンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-R80N）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号１０２，１０４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の80位のアルギニンがグルタミンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-R80Q）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号１０５，１０６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の172位のチロシンがグルタミン酸に置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-Y172E）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号１０５，１０７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の172位のチロシンがアスパラギン酸に置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-Y172D）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号１０８，１０９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９４記載のアミノ酸配列の175位のアラニンがリシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-A175K）を得た。
（Emericella nidulans由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
配列番号１１０はEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ（En42FX）のアミノ酸配列である（国際公開第ＷＯ２０１５／００５２５８号）。配列番号１１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１１１）を定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した（終止コドンＴＡＡを含む）。続いて、取得した配列番号１１１の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.製)のユーザーマニュアルに従って、配列番号１１１の遺伝子を含む断片を、配列番号１１２, １１３の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。平行して、pET22bを含む断片を、配列番号１１３、１１５の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。続いて、In-fusion反応により、配列番号１１１の遺伝子を含む断片を、pET22bを含む断片にサブクローニングし、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109 (pET22b-En42FX)株を得た。
配列番号１１０はEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ（En42FX）のアミノ酸配列である（国際公開第ＷＯ２０１５／００５２５８号）。配列番号１１０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１１１）を定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した（終止コドンＴＡＡを含む）。続いて、取得した配列番号１１１の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.製)のユーザーマニュアルに従って、配列番号１１１の遺伝子を含む断片を、配列番号１１２, １１３の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。平行して、pET22bを含む断片を、配列番号１１３、１１５の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。続いて、In-fusion反応により、配列番号１１１の遺伝子を含む断片を、pET22bを含む断片にサブクローニングし、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109 (pET22b-En42FX)株を得た。
En42FXに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを鋳型にして、配列番号１１６，１１７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のEn42FX変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１１０記載のアミノ酸配列の70位のロイシンがバリンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-L70V）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号１３４，１３５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１１０記載のアミノ酸配列の171位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-F171D）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号１３６，１３７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１１０記載のアミノ酸配列の174位のグルタミン酸がアルギニンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-E174R）を得た。
そして、得られたプラスミドを用いて、大腸菌JM109株の形質転換と同様の条件で大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、大腸菌BL21(DE3) (pET22b-En42FX)株、大腸菌BL21(DE3)（pET22b-En42FX-L70V）株、大腸菌BL21(DE3)（pET22b-En42FX-F171D）株、大腸菌BL21(DE3)（pET22b-En42FX-E174R）株を得た。
（各種改変型アマドリアーゼの生産）
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株、もしくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株、もしくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
（各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価）
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDDS（東京化成工業社製）の終濃度を0.1%または0.15%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を下記の表に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表８において、CcFXは、大腸菌JM109(pKK223-3-CcFx)株由来のアマドリアーゼを示す。表９において、En42Fxは、大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX)株由来のアマドリアーゼであるEn42Fxを変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、En42Fxに既に導入済みの各種変異点は含めていない。
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDDS（東京化成工業社製）の終濃度を0.1%または0.15%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を下記の表に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表８において、CcFXは、大腸菌JM109(pKK223-3-CcFx)株由来のアマドリアーゼを示す。表９において、En42Fxは、大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX)株由来のアマドリアーゼであるEn42Fxを変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、En42Fxに既に導入済みの各種変異点は含めていない。
上記のとおり、CcFXについては、全ての変異が単独でSDDSに対する耐性向上をもたらした。またL71V変異はSDDSを添加しない場合（１００％）と比較して、有意の活性増加を示した。したがってL71V変異はSDDSに対する耐性を向上させるのみならず、0.1%SDDS存在下でのアマドリアーゼ活性をさらに増強するといえる。CcFX-L71V変異体はSDDS存在下での活性が、SDDS不在下での活性（１００％）を上回ったことから、SDSに対する耐性も調べたところ、未変異のCcFXは0.036%のSDSの存在下での残存活性が16.6%であるのに対して、CcFX-L71V変異体は0.036%のSDSの存在下で20.9%の残存活性を示し、SDS耐性が向上した。
またEn42Fxについては、L70V変異、F171D変異、及びE174R変異によりSDDSに対する耐性向上が見られた。これは、前述のアミノ酸置換によるアニオン性界面活性剤耐性の向上効果が、アマドリアーゼの由来を問わず発揮されることを意味する。
配列の簡単な説明
配列番号１ CFP-T7のアミノ酸配列
配列番号２ CFP-T7の遺伝子配列
配列番号３ Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号４ Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号５ Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号６ Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号７ Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号８ Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号９ Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１０ Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１１ Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１２ Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１３ Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１４ R9T-Fw
配列番号１５ R9T-Rv
配列番号１６ V12I-Fw
配列番号１７ V12I-Rv
配列番号１８ M71L-Fw
配列番号１９ M71X-Rv
配列番号２０ K80R-Fw
配列番号２１ K80R-Rv
配列番号２２ F172E-Fw
配列番号２３ F172E-Rv
配列番号２４ E175R-Fw
配列番号２５ E175R-Rv
配列番号２６ V279I-Fw
配列番号２７ V279X-Rv
配列番号２８ V28L-Fw
配列番号２９ V28X-Rv
配列番号３０ S30A-Fw
配列番号３１ S30X-Rv
配列番号３２ Q77D-Fw
配列番号３３ Q77D-Rv
配列番号３４ F43Y/E44P-Fw
配列番号３５ E44X-Rv
配列番号３６ H53N-Fw
配列番号３７ H53X-Rv
配列番号３８ E340P-Fw
配列番号３９ E340X-Rv
配列番号４０ F172E/E175R-Fw
配列番号４１ V28LS30A-Fw
配列番号４２ Q77D/K80R-Fw
配列番号４３ Q77D/K80R-Rv
配列番号４４ R9T/V12I/V13I-Fw
配列番号４５ R9T/V12I/V13I-Rv
配列番号４６ S3T/N4P-Fw
配列番号４７ S3T/N4P/R9T/V12I/V13I-Rv
配列番号４８ S154D-Fw
配列番号４９ S154D-Rv
配列番号５０ V257C/N262H-Fw
配列番号５１ V257C/N262H-Rv
配列番号５２ ΔPTS1-Fw
配列番号５３ ΔPTS1-Rv
配列番号５４ E98A-Fw
配列番号５５ E98A-Rv
配列番号５６ T9R/V12I/V13I-Fw
配列番号５７ T9R/V12I/V13I-Rv
配列番号５８ R9T/I12V/V13I-Fw
配列番号５９ V13X-Rv
配列番号６０ R9T/V12I/I13V-Fw
配列番号６１ CET_V12X_Rv
配列番号６２ CET_V12L_Fw
配列番号６３ CET_V13X_Rv
配列番号６４ CET_V13L_Fw
配列番号６５ CET_V28X_Rv
配列番号６６ CET_V28I_Fw
配列番号６７ CET_V28M_Fw
配列番号６８ CET_S30X_Rv
配列番号６９ CET_S30T_Fw
配列番号７０ CET_V30V_Fw
配列番号７１ CET_M71X_Rv
配列番号７２ CET_M71I_Fw
配列番号７３ CET_M71A_Fw
配列番号７４ CET_M71V_Fw
配列番号７５ CET_M71C_Fw
配列番号７６ CET_Q77X_Rv
配列番号７７ CET_Q77E_Fw
配列番号７８ CET_Q77K_Fw
配列番号７９ CET_Q77K_Fw
配列番号８０ E77N f
配列番号８１ CET_K80X_Rv
配列番号８２ CET_K80N_Fw
配列番号８３ CET_K80Q_Fw
配列番号８４ K80H f
配列番号８５ CET_F172X_Rv
配列番号８６ CET_F172D_Fw
配列番号８７ CET_F172Y_Fw
配列番号８８ CET_F172Q_Fw
配列番号８９ CET_E175X_Rv
配列番号９０ CET_E175K_Fw
配列番号９１ CET_E175H_Fw
配列番号９２ V279C f
配列番号９３ V279C r
配列番号９４ Cc-Pr protein
配列番号９５ Cc-Gn gene
配列番号９６ CcFx_V28X_Rv
配列番号９７ CcFx_V28L_Fw
配列番号９８ CcFx_V28M_Fw
配列番号９９ CcFx_L71X_Rv
配列番号１００ CcFx_L71A_Fw
配列番号１０１ CcFx_L71V_Fw
配列番号１０２ CcFx_R80X_Rv
配列番号１０３ CcFx_R80N_Fw
配列番号１０４ CcFx_R80Q_Fw
配列番号１０５ CcFx_Y172X_Rv
配列番号１０６ CcFx_Y172E_Fw
配列番号１０７ CcFx_Y172D_Fw
配列番号１０８ CcFx_A175X_Rv
配列番号１０９ CcFx_A175K_Fw
配列番号１１０ En-Pr protein
配列番号１１１ En-Gn gene
配列番号１１２ En-c1
配列番号１１３ En-c2
配列番号１１４ En-c3
配列番号１１５ En-c4
配列番号１１６ En_L70X_Rv
配列番号１１７ En_L70V_Fw
配列番号１１８ R9X_Rv
配列番号１１９ R9N_Fw
配列番号１２０ R9Q_Fw
配列番号１２１ F286X-Rv
配列番号１２２ F286Y-Fw
配列番号１２３ E44K_Rv
配列番号１２４ E44K_Fw
配列番号１２５ D194X_Rv
配列番号１２６ D194K_Fw
配列番号１２７ D194A_Fw
配列番号１２８ E204A_Rv
配列番号１２９ E204A_Fw
配列番号１３０ D338A_Rv
配列番号１３１ D338A_Fw
配列番号１３２ E340K_Rv
配列番号１３３ E340K_Fw
配列番号１３４ F171D_Rv
配列番号１３５ F171D_Fw
配列番号１３６ E174R_Rv
配列番号１３７ E174R_Fw
配列番号１ CFP-T7のアミノ酸配列
配列番号２ CFP-T7の遺伝子配列
配列番号３ Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号４ Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号５ Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号６ Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号７ Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号８ Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号９ Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１０ Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１１ Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１２ Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１３ Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１４ R9T-Fw
配列番号１５ R9T-Rv
配列番号１６ V12I-Fw
配列番号１７ V12I-Rv
配列番号１８ M71L-Fw
配列番号１９ M71X-Rv
配列番号２０ K80R-Fw
配列番号２１ K80R-Rv
配列番号２２ F172E-Fw
配列番号２３ F172E-Rv
配列番号２４ E175R-Fw
配列番号２５ E175R-Rv
配列番号２６ V279I-Fw
配列番号２７ V279X-Rv
配列番号２８ V28L-Fw
配列番号２９ V28X-Rv
配列番号３０ S30A-Fw
配列番号３１ S30X-Rv
配列番号３２ Q77D-Fw
配列番号３３ Q77D-Rv
配列番号３４ F43Y/E44P-Fw
配列番号３５ E44X-Rv
配列番号３６ H53N-Fw
配列番号３７ H53X-Rv
配列番号３８ E340P-Fw
配列番号３９ E340X-Rv
配列番号４０ F172E/E175R-Fw
配列番号４１ V28LS30A-Fw
配列番号４２ Q77D/K80R-Fw
配列番号４３ Q77D/K80R-Rv
配列番号４４ R9T/V12I/V13I-Fw
配列番号４５ R9T/V12I/V13I-Rv
配列番号４６ S3T/N4P-Fw
配列番号４７ S3T/N4P/R9T/V12I/V13I-Rv
配列番号４８ S154D-Fw
配列番号４９ S154D-Rv
配列番号５０ V257C/N262H-Fw
配列番号５１ V257C/N262H-Rv
配列番号５２ ΔPTS1-Fw
配列番号５３ ΔPTS1-Rv
配列番号５４ E98A-Fw
配列番号５５ E98A-Rv
配列番号５６ T9R/V12I/V13I-Fw
配列番号５７ T9R/V12I/V13I-Rv
配列番号５８ R9T/I12V/V13I-Fw
配列番号５９ V13X-Rv
配列番号６０ R9T/V12I/I13V-Fw
配列番号６１ CET_V12X_Rv
配列番号６２ CET_V12L_Fw
配列番号６３ CET_V13X_Rv
配列番号６４ CET_V13L_Fw
配列番号６５ CET_V28X_Rv
配列番号６６ CET_V28I_Fw
配列番号６７ CET_V28M_Fw
配列番号６８ CET_S30X_Rv
配列番号６９ CET_S30T_Fw
配列番号７０ CET_V30V_Fw
配列番号７１ CET_M71X_Rv
配列番号７２ CET_M71I_Fw
配列番号７３ CET_M71A_Fw
配列番号７４ CET_M71V_Fw
配列番号７５ CET_M71C_Fw
配列番号７６ CET_Q77X_Rv
配列番号７７ CET_Q77E_Fw
配列番号７８ CET_Q77K_Fw
配列番号７９ CET_Q77K_Fw
配列番号８０ E77N f
配列番号８１ CET_K80X_Rv
配列番号８２ CET_K80N_Fw
配列番号８３ CET_K80Q_Fw
配列番号８４ K80H f
配列番号８５ CET_F172X_Rv
配列番号８６ CET_F172D_Fw
配列番号８７ CET_F172Y_Fw
配列番号８８ CET_F172Q_Fw
配列番号８９ CET_E175X_Rv
配列番号９０ CET_E175K_Fw
配列番号９１ CET_E175H_Fw
配列番号９２ V279C f
配列番号９３ V279C r
配列番号９４ Cc-Pr protein
配列番号９５ Cc-Gn gene
配列番号９６ CcFx_V28X_Rv
配列番号９７ CcFx_V28L_Fw
配列番号９８ CcFx_V28M_Fw
配列番号９９ CcFx_L71X_Rv
配列番号１００ CcFx_L71A_Fw
配列番号１０１ CcFx_L71V_Fw
配列番号１０２ CcFx_R80X_Rv
配列番号１０３ CcFx_R80N_Fw
配列番号１０４ CcFx_R80Q_Fw
配列番号１０５ CcFx_Y172X_Rv
配列番号１０６ CcFx_Y172E_Fw
配列番号１０７ CcFx_Y172D_Fw
配列番号１０８ CcFx_A175X_Rv
配列番号１０９ CcFx_A175K_Fw
配列番号１１０ En-Pr protein
配列番号１１１ En-Gn gene
配列番号１１２ En-c1
配列番号１１３ En-c2
配列番号１１４ En-c3
配列番号１１５ En-c4
配列番号１１６ En_L70X_Rv
配列番号１１７ En_L70V_Fw
配列番号１１８ R9X_Rv
配列番号１１９ R9N_Fw
配列番号１２０ R9Q_Fw
配列番号１２１ F286X-Rv
配列番号１２２ F286Y-Fw
配列番号１２３ E44K_Rv
配列番号１２４ E44K_Fw
配列番号１２５ D194X_Rv
配列番号１２６ D194K_Fw
配列番号１２７ D194A_Fw
配列番号１２８ E204A_Rv
配列番号１２９ E204A_Fw
配列番号１３０ D338A_Rv
配列番号１３１ D338A_Fw
配列番号１３２ E340K_Rv
配列番号１３３ E340K_Fw
配列番号１３４ F171D_Rv
配列番号１３５ F171D_Fw
配列番号１３６ E174R_Rv
配列番号１３７ E174R_Fw
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (9)
- アニオン性界面活性剤であるドデカノイルサルコシン酸ナトリウム（ＳＤＤＳ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対する耐性が改変前アマドリアーゼよりも向上した改変アマドリアーゼであって、
改変前のアマドリアーゼの全長アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１のアミノ酸配列に対して８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、２０４位、３３８位及び１９４位に対応する位置以外の位置において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位、７１位、１７５位、１７２位、２７９位、１２位、９位、７７位、３０位、２８位、１３位、２０４位、３３８位及び１９４位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する改変アマドリアーゼであり、
以下よりなる群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する改変アマドリアーゼ、
（a） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
（b） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
（c） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンである、
（d） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸若しくはグルタミンである、
（e） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
（f） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
（g） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
（h） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
（i） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンである、
（j） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
（k） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
（o） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
（p） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、並びに
（s） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。 - 改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシンであるアミノ酸置換を有するか、又は、 改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)～(c)及び（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであるアミノ酸置換を有するか、又は、 改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)～(f)及び（h）、（i）、（j）、（k）、（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンであるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)～(g)及び（i）、（j）、（k）、（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)～(k)及び（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)～(k)及び（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンであるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a)～(k)及び（o）、（p）、及び（s）よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８６位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン若しくはトリプトファンであるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（o）、（p）及び(s)よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンであるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（o）、（p)及び(s)よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンであるアミノ酸置換を有するか、又は、
改変アマドリアーゼが有するアミノ酸置換が、(a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、（i）、（j）、（k）、（o）、（p)よりなる群から選択されるものである請求項１に記載の改変アマドリアーゼであって、さらに、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンであるアミノ酸置換を有する、
請求項１に記載の改変アマドリアーゼ。 - 改変アマドリアーゼが、以下からなる群、
（a） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における８０位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
（b） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、アラニン、バリン若しくはシステインである、
（c） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７５位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、リシン若しくはヒスチジンである、
（d） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１７２位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸若しくはグルタミンである、
（e） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７９位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
（f） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１２位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはロイシンである、及び
（g） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における９位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
（h） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における７７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
（i） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３０位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン若しくはバリンである、
（j） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはメチオニンである、
（k） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
（m） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２０４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
（n） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における３３８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、並びに
（q） 配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９４位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
より選択される１以上を有する、請求項１に記載の改変アマドリアーゼ。 - 請求項１～３のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を有する改変アマドリアーゼをコードするアマドリアーゼ遺伝子。
- 以下の工程：
（ｉ）請求項４に記載のアマドリアーゼ遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程；
（ｉｉ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；及び
（ｉｉｉ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。 - 請求項１～３のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。
- １以上のアニオン性界面活性剤を含む、請求項６に記載の組成物。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼを用いる、糖化ヘモグロビンの測定方法。
- コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムを含む、請求項６に記載の組成物。
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