JP6401056B2 - フルクトシルヘキサペプチドに作用する改変型アマドリアーゼ - Google Patents
フルクトシルヘキサペプチドに作用する改変型アマドリアーゼ Download PDFInfo
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Description
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつα−フルクトシルヘキサペプチド(αF6P)に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]に記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]又は[2]に記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]〜[3]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]〜[4]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]〜[5]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における355位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]〜[6]のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における419位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαF6Pに対する活性を有する[1]〜[7]のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
配列番号1、配列番号38、配列番号40、配列番号54、配列番号62、配列番号89、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、又は配列番号123に示すアミノ酸配列を有し、前記[1]〜[8]のいずれかに規定したアミノ酸置換を有し、かつαF6Pに対する活性を有する、[1]〜[8]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、[1]〜[9]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号151、配列番号153又は配列番号155に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号151、配列番号153又は配列番号155のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号157、配列番号159、配列番号161又は配列番号163に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位及び110位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号157、配列番号159、配列番号161又は配列番号163のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号137、配列番号139、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171又は配列番号173に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、110位、及び、106位又は113位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号137、配列番号139、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171又は配列番号173のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号133、配列番号135、配列番号175又は配列番号189に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、110位、106位及び113位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号133、配列番号135、配列番号175又は配列番号189のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号177又は配列番号179に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、63位、106位、110位及び113位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号177又は配列番号179のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号143、配列番号181、配列番号183、配列番号187又は配列番号191に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、63位、106位、110位及び113位、並びに、102位又は355位又は419位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号143、配列番号181、配列番号183、配列番号187又は配列番号191のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号141又は配列番号185に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、63位、102位、106位、110位、113位及び355位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号141又は配列番号185のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが95%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
改変前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している、[1]〜[17]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸配列の以下(a)から(h)よりなる群から選択されるアミノ酸の位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ配列番号1記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
(a)配列番号1の62位のアルギニン
(b)配列番号1の63位のロイシン
(c)配列番号1の102位のグルタミン酸
(d)配列番号1の106位のアスパラギン酸
(e)配列番号1の110位のグルタミン
(f)配列番号1の113位のアラニン
(g)配列番号1の355位のアラニン
(h)配列番号1の419位のアラニン
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸の以下(a)から(h)よりなる群から選択される1つまたはそれ以上の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換され、配列番号1記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸の以下(p)から(u)よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、配列番号1記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号40記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号40記載のアミノ酸配列において以下(v)に記載したアミノ酸残基の置換を有し、配列番号40記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しているアマドリアーゼ。
(i)[25]記載の宿主細胞を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び
(ii)培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程。
(i)HbA1cを含む試料をプロテアーゼ及び/又はペプチダーゼで処理し、HbA1cのβ鎖アミノ末端よりαF6Pを遊離させる工程、及び
(ii)遊離したHbA1c由来αF6Pに[1]〜[22]のいずれかに記載のアマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのHbA1c由来αF6Pに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程。
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と50%、好ましくは60%、より好ましくは70%、さらに好ましくは80%、さらに好ましくは90%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第11〜18位、20〜32位、50〜52位、54〜58位、266〜268位、270〜273位、277〜286位、及び370〜383位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%、好ましくは95%、より好ましくは98%以上の配列同一性を有し、αF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ。
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
本発明におけるフルクトシルペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものが含まれる。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明におけるフルクトシルペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド(α−フルクトシルペプチド)である。α−フルクトシルペプチドは、N末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、特定対象の糖化タンパク質がヘモグロビンA1c(HbA1c)である場合、該当するα−フルクトシルペプチドは、糖化されたN末端から切り出される糖化されたペプチドを指し、特に、HbA1cを定量する目的からは、ヘモグロビンβ鎖の糖化されたN末端から切り出される糖化されたペプチドを指す。
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ2酢酸若しくはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。本発明のアマドリアーゼは、αF6Pに対して高い反応性を有することを特徴とする。
本発明は、配列番号1、配列番号38、配列番号40、配列番号54、又は配列番号62、又は配列番号89、又は配列番号99に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製された、αF6Pに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、αF6Pに対して高い反応性を有する、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグルタミン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のアラニン
上記Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ(配列番号1)において、好ましくは、(a)62位のアルギニンは、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンは、ヒスチジン又はアラニンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸は、リジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換される。好ましくは(e)110位のグルタミンはロイシン又はチロシンへと置換される。好ましくは(f)113位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは(g)355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)419位のアラニンはリジンへと置換されていてもよい。
(a)62位のセリン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグリシン
(f)113位のアラニン
(g)351位のアラニン
(h)416位のセリン
上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ(配列番号38)において、好ましくは(a)62位のセリンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により(c)102位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは110位のグリシンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは351位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)416位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のグリシン
(e)110位のグルタミン酸
(f)113位のリジン
(g)355位のセリン
(h)420位のアラニン
上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ(配列番号54)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは110位のグルタミン酸はロイシンへと置換される。場合により113位のリジンは置換されなくともよい。場合により355位のセリンは置換されなくともよい。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)61位のアルギニン
(b)62位のロイシン
(c)101位のグルタミン酸
(d)105位のグリシン
(e)109位のリジン
(f)112位のセリン
(g)355位のアラニン
(h)420位のアラニン
上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ(配列番号62)において、好ましくは(a)61位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)62位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)101位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは(d)105位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは109位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは112位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン
(e)110位のリジン
(f)113位のスレオニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のグリシン
上記EFP-T5由来アマドリアーゼ(配列番号40)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギンはリジンへと置換される。好ましくは110位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)419位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のイソロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のセリン
(e)110位のセリン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)420位のアラニン
上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(CnFX、配列番号89又は149)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のイソロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは110位のセリンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のスレオニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のアラニン
上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号113)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により(c)102位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは110位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアラニン
(e)110位のグルタミン
(f)113位のスレオニン
(g)356位のアラニン
(h)421位のアラニン
上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号115)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により(c)102位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは(d)106位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは110位のグルタミンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは356位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)421位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のアラニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のアラニン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号117)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは110位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のアラニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のセリン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号117)と95%のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ(配列番号99)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは110位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
(a)61位のアルギニン
(b)62位のロイシン
(c)101位のグルタミン酸
(d)105位のリジン
(e)109位のアルギニン
(f)112位のセリン
(g)355位のアラニン
(h)420位のアラニン
上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ(配列番号119)において、好ましくは(a)61位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)62位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)101位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により(d)105位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは109位のアルギニンはロイシンへと置換される。好ましくは112位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)420位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のリジン
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のアラニン
(f)113位のアラニン
(g)353位のアラニン
(h)418位のアラニン
上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号121)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により(c)102位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは(d)106位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは110位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは353位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)418位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のセリン
(e)110位のリジン
(f)113位のアスパラギン酸
(g)355位のアラニン
(h)419位のセリン
上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号123)において、好ましくは(a)62位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸へと置換される。好ましくは(b)63位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは(c)102位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは(d)106位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは110位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは113位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは355位のアラニンはセリンへと置換される。場合により(h)419位のセリンはリジンへと置換されてもよい。
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(Stratagene社製)等が好ましい。
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体DNAを用いて、例えば、大腸菌K−12株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株(ともにタカラバイオ社製)等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、GENETYX(GENETYX社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTALWのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該2以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで2以上のアミノ酸配列について、同一性%とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して2以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、2以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばC末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性%の算出には利用されない。
本発明において、あるベースとなるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置、又は相当する位置という。また、「アミノ酸の位置に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行う方法が挙げられる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
本発明のアマドリアーゼ変異体は、一重変異体であってもよいが、2以上のアミノ酸置換を有する多重変異体、例えば二重〜八重変異体であってもよい。本発明者らは、配列番号1のアミノ酸配列における第62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位及び419位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼのαF6Pに対する活性が増大することを見出した。特に一重、二重、三重、四重、五重、六重及び七重と変異を追加するにつれ変異体のαF6Pに対する活性が大きく増大することを見出した。実施例に示すアマドリアーゼ変異体のαF6Pに対する活性の増大からみて、これらのアミノ酸置換が相乗効果を有することは明らかである。また、配列番号1のアミノ酸配列における第62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位及び419位に対応する位置のアミノ酸置換の種々の組合せが同様にαF6Pに対する活性の増大をもたらす、と当業者であれば理解する。
アマドリアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列の第60位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαFVH活性を示さなかった酵素が、置換後にαFVH活性を示すようになることが報告されている(特開2010−35469号公報、国際公開第2012/018094号参照)。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号1の第60位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号1の60位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号1の第62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位及び419位に対応する位置に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号1の第60位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号1の60位に対応する配列番号147中の第59位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの(配列番号62)を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ(配列番号123)についても同様である。
上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してαF6Pに対する反応性が向上し、基質特異性が向上していることを特徴とする。本発明においてαF6Pに対する「基質特異性が向上している」とは、具体的には、改変前のものと比較して、「αFVHに対する反応性」を1とした時の「αF6Pに対する反応性」の割合が増大していることを特徴とする。なお、「αFVHに対する反応性」は「αFVH酸化活性」と表記することもある。
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
(試薬1):5U/ml パーオキシダーゼ、0.49mM 4−アミノアンチピリンを含む0.1M リン酸緩衝液 pH6.5
5.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(和光純薬工業社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に溶解し、1000mlに定容する。
500mgのTOOS(同仁化学研究所製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
αF6P(ペプチド研究所製) 257.1mg、若しくはαFVH(キッコーマン社製) 124.9mg、若しくはαFV(キッコーマン社製) 83.8mgをイオン交換水に溶解し、10mlに定容する。
2.7mlの試薬1、100μlの試薬2、および100μlの酵素液を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、試薬3を100μl加えて良く混ぜた後、分光光度計(U−3010A、日立ハイテクノロジーズ社製)により、555nmにおける吸光度の経時変化を観測し、555nmにおける吸光度の1分間あたりの変化量(ΔAs)を測定した。なお、対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、555nmにおける吸光度の1分間あたりの変化量(ΔA0)を測定した。37℃で1分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出した。
ΔAs:反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0:対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2:反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5:1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df:希釈係数
(αF6Pを含む測定用試料の調製)
本発明の測定法においては、糖化蛋白質由来のαF6Pを含む試料にαF6Pオキシダーゼを作用させ、その作用による生成物又は消費物を測定する。HbA1c等の糖化蛋白質の測定を目的として、測定対象の糖化蛋白質からαF6Pを切り出すための好適な方法としては、プロテアーゼやペプチダーゼを用いた消化が挙げられる。αF6Pを遊離させるためのプロテアーゼまたはペプチダーゼとしては、臨床検査に使用が可能で、HbA1cから、少なくともαF6Pを有効に切り出し得るものであれば、いかなるプロテアーゼを用いても良い。そのようなプロテアーゼの例としては、エンドプロテイナーゼGlu−C、V8プロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロテイナーゼP、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン、カルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、ディスパーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはペプチダーゼ等が挙げられ、特に好ましくは、糖化蛋白質に含まれるグルタミン酸残基のカルボキシル末端を特異的に開裂させるエンドプロテアーゼあるいはエンドペプチダーゼが挙げられ、その一例としてはエンドプロテイナーゼGlu−C、V8プロテアーゼが挙げられる。
上記のαF6Pを含む試料に、本発明の測定法に使用するαF6Pオキシダーゼを作用させる。αF6Pの切り出しとαF6Pオキシダーゼの作用の時期は連続的でも、同時でも、切り出しを終了してからαF6Pオキシダーゼを作用させてもよい。αF6Pに対するαF6Pオキシダーゼの作用時間は例えば、5秒以上、10秒以上、又は20秒以上、180分未満又は150分未満、例えば0.5〜120分間、好ましくは0.5〜60分間、より好ましくは1〜30分間とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中の糖化ヘキサペプチドを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。αF6Pオキシダーゼ作用時間を0.5〜60分間、より好ましくは1〜30分間、さらに好ましくは1〜10分間とすることにより、迅速かつ良好にαF6Pを測定することができる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、20〜45℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
本発明のαF6P測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでαF6Pの定量的測定方法とは、試料中のαF6Pの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼ変異体を使用することを含む、試料中のα−フルクトシルヘキサペプチドの定量法を提供する。この定量法は、HbA1c由来のα−フルクトシルヘキサペプチド(αF6P)を含む試料と本発明のアマドリアーゼを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのHbA1c由来αF6Pに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここで該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがαF6Pの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼを試料と物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とαF6Pを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにαF6Pを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子(配列番号2)の組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)株(国際公開第2007/125779号参照)を、3mlのLB−amp培地[1%(w/v)バクトトリプトン、0.5%(w/v)ペプトン、0.5%(w/v)NaCl、50μg/ml アンピシリン]に接種して、37℃で16時間振とう培養し、培養物を得た。
得られた組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7 DNAを鋳型として、配列番号3、4の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
pKK223−3−CFP−T7−H1を形質導入した大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H1)株を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地3mlにおいて、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離して、改変型アマドリアーゼ(CFP−T7−H1)を含む粗酵素液0.6mlを調製した。
上述のCFP−T7−H1を含む酵素液を用いて、上記のB:活性測定法に示した方法により、αFV、αFVH、αF6Pに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)株から生産したCFP−T7を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αFVH酸化活性を100とした場合の、αFV、αFVHおよびαF6Pに対する酸化活性、ならびに、αF6P/αFVHおよびαF6P/αFVを表1に示す。
続いて、組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7−H1 DNAを鋳型として、配列番号5〜8のオリゴヌクレオチド、およびKOD −Plus− を用い、上記(2)と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のアマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号1記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンがアラニンに置換され、かつ110位のグルタミンがロイシン、またはフェニルアラニン、若しくはチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223−3−CFP−T7−H2、pKK223−3−CFP−T7−H3、pKK223−3−CFP−T7−H4)を得た。
(Coniochaeta属由来改変型アマドリアーゼの生産および精製)
Coniochaeta属由来の野生型アマドリアーゼ、および上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−62D)、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H20)、および大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H21)、および大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7−H35)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地120mlに植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液24mlを調製した。
調製した粗酵素液を1.35M (NH4)2SO4を含む10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化した12mlのButyl Toyopearl 650C樹脂(東ソー社製)に吸着させ、次に120mlの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて84mlの1.05M (NH4)2SO4を含む10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で樹脂に吸着していたアマドリアーゼを溶出させ回収した。
配列番号36はAspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(以降FAOAo2と称する)のアミノ酸配列であり、配列番号36のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号37)を挿入した組換え体プラスミド(以降pUC19−FAOAo2と称する)を大腸菌DH5αで発現させることにより、FAOAo2が生産され、FAOAo2がフルクトシルヘキサペプチドに対して作用することが示されている(国際公開第2008/108385号公報参照)。
配列番号38はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(以降PnFXと称する)のアミノ酸配列である(Biotechnology and Bioengineering, 106, 358−366, 2010参照)。配列番号38のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号39)を、定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した。このとき、配列番号39の5´末端、3´末端にはそれぞれNdeIサイトとBamHIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図1のPnFXの配列と一致していることを確認した。
上記のようにして得られたPnFX生産能を有する大腸菌BL21(DE3)(pET22b−PnFX)株を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
上記のようにして得られたCFP−T7−H35の精製標品を用いて、αFV、αFVH、αF6Pを基質とした時の比活性を測定した。結果を表14に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、280nmにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した(Protein Sci. 4, 2411−23, 1995参照)。
本発明の知見は、まずConiochaeta属由来のアマドリアーゼを用いて検証されたが、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様な効果を奏することが期待できるという示唆を与え得る。そこで、実際に本発明の知見を、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも導入して、この検証を行った。
配列番号40はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(以降EFP−T5と称する)のアミノ酸配列であり、配列番号40のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号41)を挿入した組換え体プラスミドpUTE100K’−EFP−T5を保持する大腸菌により生産でき、EFP−T5はαFVおよびαFVH酸化活性を示すことが確認されている(国際公開第2007/125779号公報および国際公開第2008/018094号公報参照)。
続いて、上記と同様にして、pUTE100K’−EFP−T5−62Dを鋳型とし、配列番号44,45の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号40記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンがアスパラギン酸に、106位のアスパラギンがリジンに置換されたEFP−T5遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pUTE100K’−EFP−T5−62D/106K)を得た。
配列番号54はNeocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ(以降NvFXと称する)のアミノ酸配列であり、配列番号54のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号55)を挿入した組換え体プラスミドpET22b―NvFXを保持する大腸菌により生産でき、NvFXはαFVおよびαFVH酸化活性を示すことが確認されている(国際公開第2012/018094号公報参照)。
続いて、上記と同様にして、pET22b―NvFX−62Dを鋳型とし、配列番号58,59の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号54記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンがアスパラギン酸に、106位のグリシンがリジンに置換されたNvFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b―NvFX−62D/106K)を得た。
配列番号62はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために59位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(以降AnFXと称する)のアミノ酸配列であり、配列番号62のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号63)を挿入した組換え体プラスミドpET22b―AnFXを保持する大腸菌により生産でき、AnFXはαFVおよびαFVH酸化活性を示すことが確認されている(国際公開第2012/018094号公報参照)。
PnFXに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドpET22b−PnFXを鋳型にして、配列番号77、78の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のPnFX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号38記載のアミノ酸配列の62位のセリンがアスパラギン酸に置換されたPnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b−PnFX−62D)を得た。
配列番号89はCryptococcus neoformans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(以降CnFXと称する)のアミノ酸配列であり、配列番号89のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号90)を挿入した組換え体プラスミドpET22b―CnFXを保持する大腸菌により生産でき、CnFXはαFVおよびαFVH酸化活性を示すことが確認されている(国際公開第2012/018094号公報参照)。
(Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと95%の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産株の作製)
配列番号99はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと95%の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである(以降Cc95FXと称する)。配列番号99のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号100)を、定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した。このとき、配列番号100の5´末端、3´末端にはそれぞれNdeIサイトとBamHIサイトを付加した。
Cc95FXに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドpET22b−Cc95FXを鋳型にして、配列番号101、102の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のCc95FX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号99記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたCc95FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b−Cc95FX−62D)を得た。
(Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製)
野生型のEFP−T5、および前述の様にして得られた改変型EFP−T5を生産する大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T5)、大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T5−62D)、大腸菌JM109(pUTE100K’−EFP−T5−62D/63H/106K/110L/113K/355S)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
野生型のNvFX、および前述の様にして得られた改変型NvFXを生産する大腸菌BL21(DE3)(pET22b−NvFX)、大腸菌BL21(DE3)(pET22b―NvFX−62D/106K/110L)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
野生型のAnFX、および前述の様にして得られた改変型AnFXを生産する大腸菌BL21(DE3)(pET22b―AnFX−61D/105K/109L)および大腸菌BL21(DE3)(pET22b―AnFX−61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
前述の様にして得られた改変型AnFXを生産する大腸菌BL21(DE3)(pET22b―PnFX−62D/106K/110L/113K)および大腸菌BL21(DE3)(pET22b―PnFX−62D/63H/106K/110L/113K/351S)を、前述の、野生型PnFXの精製方法に従い精製した。HiLoad 26/600 Superdex 200カラムによる精製終了後、SDS−PAGEにより純度を分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型PnFXの精製標品とした。
野生型のCnFX、および前述の様にして得られた改変型CnFXを生産する大腸菌BL21(DE3)(pET22b−CnFX)、大腸菌BL21(DE3)(pET22b―CnFX−62D/106K/110L/113K)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
(Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと95%の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産)
野生型のCc95FX、および前述の様にして得られた改変型Cc95FXを生産する大腸菌JM109(pET22b−Cc95FX)、および大腸菌JM109(pET22b−Cc95FX−62D/63H/106K/110L/113K/355S)を、終濃度0.1mMとなるようにIPTGを添加したLB−amp培地に植菌し、25℃で16時間培養した。得られた各培養菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、20,000×gで10分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
以下の組成から成るαF6P測定用試薬を調製し、Bio Majesty JCA−BM1650(日本電子)を利用して下記の通りαF6Pの測定を実施した。
0μM、4.0μM、8.0μM、12μM、16μM、24μM、32μM、40μM、48μM、80μM αF6P
試薬4:ロイコ色素溶液
24mM HEPES−NaOH緩衝液 pH7.8
0.24mM N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′− ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64、和光純薬工業製)
試薬5:パーオキシダーゼ、F6Pオキシダーゼ溶液
400mM MES−NaOH緩衝液 pH6.0
20U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
4.0U/ml(0.94mg/ml)CFP−T7−H35(本発明25)
試薬6:パーオキシダーゼ、αF6P酸化活性を示さないアマドリアーゼ溶液
400mM MES−NaOH緩衝液 pH6.0
20U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
0.94mg/ml CFP−T7(比較例1)
125μlの試薬4に25μlの試料1を添加し、37℃で5分間インキュベートした後、波長751nmの光の吸光度を測定した(A0)、続いて50μlの試薬5または試薬6を添加してαF6Pの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を37℃で5分間進行させた後、再度波長751nmの光の吸光度を測定した(A5)。試料1に由来するαF6Pの終濃度を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の吸光度差ΔA(A5−A0より算出)を縦軸にプロットしたグラフを図5に示した。
以下の組成から成るHbA1c測定用試薬を調製し、Bio Majesty JCA−BM1650(日本電子製)を利用して下記の通りHbA1cの測定を実施した。
HbA1c認証実用標準物質JCCRM423−8(検査医学標準物質機構製)
総ヘモグロビン濃度133g/l、
HbA1c濃度3レベル(NGSP値 5.56、7.74、10.48%)
試薬7:試料前処理液
0.012% 1−ドデシルピリジニウムクロリド(DPC、東京化成工業製)
試薬8:ロイコ色素、Glu−Cプロテアーゼ溶液
24mM HEPES−NaOH緩衝液 pH7.8
0.24mM N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′− ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64、和光純薬工業製)
8.0U/ml V−8プロテアーゼ(エンドプロテイナーゼGlu−C、和光純薬工業製)
試薬9:パーオキシダーゼ、F6Pオキシダーゼ溶液
400mM MES−NaOH緩衝液 pH6.0
20U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
8.0U/ml(1.9mg/ml)CFP−T7−H35(本発明25)
試薬10:パーオキシダーゼ、αF6P酸化活性を示さないアマドリアーゼ溶液
400mM MES−NaOH緩衝液 pH6.0
20U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン製)
1.9mg/ml CFP−T7(比較例1)
125μlの試薬8に、試薬7で20倍希釈した試料2を25μlを添加して37℃で5分間インキュベートした後、50μlの試薬9または試薬10を添加してHbA1cのβ鎖アミノ末端から遊離したαF6Pの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を37℃で5分間進行させた。試料2のHbA1c濃度(NGSP値)終濃度を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の751nmの光の吸光度差ΔAを縦軸にプロットしたグラフを図6に示した。
以上の通り、本発明のアマドリアーゼは、αF6Pに対する優れた反応性(基質特異性)を示し、αF6Pを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できる実用性に優れた測定用酵素として非常に有望であり、酵素法によるHbA1cの測定において産業上の利用価値が期待される。
配列番号2 配列番号1のアマドリアーゼの塩基配列
配列番号3−33 PCRプライマー
配列番号34 PCRプライマー
配列番号35 PCRプライマー
配列番号36 Aspergillus oryzae RIB40 (FAOAo2) アミノ酸配列
配列番号37: FAOAo2塩基配列
配列番号38 Phaeosphaeria nodorum(PnFX) アミノ酸配列
配列番号39 PnFX塩基配列
配列番号40 Eupenicillium terrenum(EFP-T5)アミノ酸配列
配列番号41 EFP-T5塩基配列
配列番号42−53 PCRプライマー
配列番号54 Neocosmospora vasinfecta(NvFX)アミノ酸配列
配列番号55 NvFX塩基配列
配列番号56−61 PCRプライマー
配列番号62 S59G置換 Aspergillus nidulans(AnFX) アミノ酸配列
配列番号63 AnFX塩基配列
配列番号64−88 PCRプライマー
配列番号89 Cryptococcus neoformans (CnFX) アミノ酸配列
配列番号90 CnFX塩基配列
配列番号91−98 PCRプライマー
配列番号99 Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと95%の配列同一性を示すアマドリアーゼ(Cc95FX) アミノ酸配列
配列番号100 Cc95FX塩基配列
配列番号101−112 PCRプライマー
配列番号113 Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号114 Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号115 Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号116 Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号117 Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号118 Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号119 Emericella nidulans(En)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号120 Emericella nidulans(En)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号121 Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号122 Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号123 Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号124 Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号125 Aspergillus fumigatus Amadoriase Iのアミノ酸配列
配列番号126 Amadoriase I塩基配列
配列番号127 Aspergillus oryzae FAOAo1アミノ酸配列
配列番号128 FAOAo1塩基配列
配列番号129 Aspergillus fumigatus Amadoriase IIアミノ酸配列
配列番号130 Amadoriase II塩基配列
配列番号131 Aspergillus terreus FAOD-Aアミノ酸配列
配列番号132 FAOD-A塩基配列
配列番号133 CFP-T7-H20(R62D、D106K、Q110L、A113K)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号134 CFP-T7-H20塩基配列
配列番号135 PnFPOX(S62D、D106K、G110L、A113K)Phaeosphaeria nodorum アミノ酸配列
配列番号136 配列番号135のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号137 (本発明29)NvFX-62D/106K/110L(R62D、G106K、E110L)Neocosmospora vasinfectaアミノ酸配列
配列番号138 配列番号137のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号139 (本発明30)AnFX-61D/105K/109L(S59G、R61D、G105K、K1091L)Aspergillus nidulans アミノ酸配列
配列番号140 配列番号139のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号141 CFP-T7-H35(R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号142 CFP-T7-H35塩基配列
配列番号143 EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S Eupenicillium terrenumアミノ酸配列
配列番号144 配列番号143のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号145 Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号146 Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号147 AnFX 野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号148 AnFX 野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号149 CnFX 野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号150 CnFX 野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号151 (本発明1)CFP-T7-H1(R62A)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号152 CFP-T7-H1塩基配列
配列番号153 (本発明26)CFP-T7-62D(R62D)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号154 CFP-T7-62D塩基配列
配列番号155(本発明27)EFP-T5-R62D(R62D) Eupenicillium terrenum アミノ酸配列
配列番号156 EFP-T5-R62D塩基配列
配列番号157 (本発明2)CFP-T7-H2(R62A、Q110L)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号158 CFP-T7-H2塩基配列
配列番号159 (本発明4)CFP-T7-H4(R62A、Q110Y)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号160 CFP-T7-H4塩基配列
配列番号161 (本発明5)CFP-T7-H2-62N(R62N、Q110L)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号162 CFP-T7-H2-62N塩基配列
配列番号163 (本発明6)CFP-T7-H6(R62D、Q110L)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号164 CFP-T7-H6塩基配列
配列番号165 (本発明12)CFP-T7-H10(R62D、D106A、Q110L)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号166 CFP-T7-H10塩基配列
配列番号167 (本発明13)CFP-T7-H11(R62D、D106K、Q110L)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号168 CFP-T7-H11塩基配列
配列番号169 (本発明14)CFP-T7-H12(R62D、D106R、Q110L)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号170 CFP-T7-H12塩基配列
配列番号171 (本発明15)CFP-T7-H13(R62D、Q110L、A113K)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号172 CFP-T7-H13塩基配列
配列番号173 (本発明16)CFP-T7-H14(R62D、Q110L、A113R)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号174 CFP-T7-H14塩基配列
配列番号175 (本発明18)CFP-T7-H21(R62D、D106K、Q110L、A113R)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号176 CFP-T7-H21塩基配列
配列番号177 (本発明19)CFP-T7-H24(R62D、L63A、D106K、Q110L、A113K)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号178 CFP-T7-H24塩基配列
配列番号179 (本発明21)CFP-T7-H26(R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号180 CFP-T7-H26塩基配列
配列番号181 (本発明23)CFP-T7-H28(R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K) Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号182 CFP-T7-H28塩基配列
配列番号183 (本発明24)CFP-T7-H29(R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419K) Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号184 CFP-T7-H29塩基配列
配列番号185 (本発明31)(AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)Aspergillus nidulansアミノ酸配列
配列番号186 配列番号185のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号187 (本発明33)(PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S)Phaeosphaeria nodorumアミノ酸配列
配列番号188 配列番号187のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号189 (本発明34)(CnFX-62D/106K/110L/113K)Cryptococcus neoformansアミノ酸配列
配列番号190 配列番号189のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号191 (本発明35)(Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S)Curvularia clavataアミノ酸配列
配列番号192 配列番号191のアミノ酸配列をコードする塩基配列
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (33)
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、α−フルクトシルヘキサペプチド(αF6P)に対する活性を有する改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1又は2に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1〜4のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における355位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1〜6のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに配列番号1に示すアミノ酸配列における419位に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、かつαF6Pに対する活性を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- 前記改変アマドリアーゼを作製するための出発アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼであり、かつ、請求項1〜8のいずれか1項に記載の改変を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- 前記改変アマドリアーゼを作製するための出発アマドリアーゼが配列番号1、配列番号38、配列番号40、配列番号54、配列番号62、配列番号89、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、又は配列番号123に示すアミノ酸配列を有するものであり、かつ、前記請求項1〜8のいずれかに規定したアミノ酸置換を有し、かつαF6Pに対する活性を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号151、配列番号153又は配列番号155に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号151又は配列番号153のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ、当該アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はアスパラギン酸であり、かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、並びに
(iv) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号155のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ、当該アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号157、配列番号159、配列番号161又は配列番号163に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位及び110位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号157、配列番号159、配列番号161又は配列番号163のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ、当該アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシン若しくはチロシンであるか、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであるか、又は
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつ
αF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号137、配列番号139、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171又は配列番号173に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、110位、及び、106位又は113位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号137のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号139のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、並びに
(v) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171又は配列番号173のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであるか、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアルギニンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであるか、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアルギニンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号133、配列番号135、配列番号175又は配列番号189に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、110位、106位及び113位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号133又は配列番号175のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアルギニンであり、
かつ、αF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号135のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、並びに
(v) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号189のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号177又は配列番号179に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、63位、106位、110位及び113位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号177又は配列番号179のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がアラニン若しくはヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号143、配列番号181、配列番号183、配列番号187又は配列番号191に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、63位、106位、110位及び113位、並びに、102位又は355位又は419位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号143のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における355位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、
(iv) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号181又は配列番号183のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであるか、又は
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における419位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、
(v) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号187のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ配列番号1に示すアミノ酸配列における355位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ、
(vi) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号191のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ配列番号1に示すアミノ酸配列における355位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i) 配列番号141又は配列番号185に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における62位、63位、102位、106位、110位、113位及び355位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαF6Pに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号141又は配列番号185のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、
配列番号1に示すアミノ酸配列における62位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であり、配列番号1に示すアミノ酸配列における63位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における102位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における106位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における110位に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における113位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、かつ配列番号1に示すアミノ酸配列における355位に対応する位置のアミノ酸がセリンであり、
かつαF6Pに対する活性を有する改変アマドリアーゼ。 - 改変前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している、請求項1〜17のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、グルタミン、又はグルタミン酸に置換されており、かつ置換前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しており、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する改変アマドリアーゼ。
- さらに配列番号1記載のアミノ酸配列の以下(b)から(h)よりなる群から選択されるアミノ酸の位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ置換前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している、請求項19に記載の改変アマドリアーゼ、
(b)配列番号1の63位のロイシン
(c)配列番号1の102位のグルタミン酸
(d)配列番号1の106位のアスパラギン酸
(e)配列番号1の110位のグルタミン
(f)配列番号1の113位のアラニン
(g)配列番号1の355位のアラニン
(h)配列番号1の419位のアラニン。 - アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、アスパラギン又はアラニンに置換されており、置換前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しており、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する改変アマドリアーゼ。
- さらに配列番号1記載のアミノ酸の以下(b)から(h)よりなる群から選択される1つまたはそれ以上の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換され、置換前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している、請求項21に記載の改変アマドリアーゼ、
(b)配列番号1の63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンに置換されている。
(c)配列番号1の102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
(d)配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンに置換されている。
(e)配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンに置換されている。
(f)配列番号1の113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンに置換されている。
(g)配列番号1の355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。
(h)配列番号1の419位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。 - アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1記載のアミノ酸の以下(p)から(u)よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、置換前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上しており、かつ当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する改変アマドリアーゼ。
(p)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、かつ、配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジン、アルギニンに置換されている。
(q)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、かつ、配列番号1の113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジン、アルギニンに置換されている。
(r)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号1の113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号1の63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、ヒスチジンに置換されている。
(s)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号1の113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、かつ、配列番号1の102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
(t)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号1の113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、かつ、配列番号1の419位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換されている。
(u)配列番号1の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号1の106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号1の113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号1の63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号1の102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号1の355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。 - アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号40記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号40記載のアミノ酸配列において以下(v)に記載したアミノ酸残基の置換を有し、配列番号40記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する、α−フルクトシルヘキサペプチドに対する反応性の割合が向上している改変アマドリアーゼ。
(v)配列番号40記載の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換され、配列番号40記載の63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号40記載の106位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、配列番号40記載の110位のリジンに対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号40記載の113位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がリジンに置換され、かつ、配列番号40記載の355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。 - 請求項1から請求項24のいずれかに記載の改変アマドリアーゼをコードするアマドリアーゼ遺伝子。
- 請求項25記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項26記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
- 以下の工程を含む、アマドリアーゼの製造方法、
(i)請求項27記載の宿主細胞を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び
(ii)培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程。 - 請求項1から請求項24のいずれかに記載の改変アマドリアーゼを含む、HbA1cの測定に用いるためのキット。
- HbA1c由来のα−フルクトシルヘキサペプチド(αF6P)を含む試料に請求項1から請求項24のいずれかに記載の改変アマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのHbA1c由来αF6Pに対する作用による生成物又は消費物を測定することを特徴とするαF6Pの測定方法。
- 試料中のHbA1c由来αF6Pを定量する、請求項30に記載の方法。
- 以下の工程を含む、HbA1cの測定方法、
(i)HbA1cを含む試料をプロテアーゼ及び/又はペプチダーゼで処理し、HbA1cのβ鎖アミノ末端よりαF6Pを遊離させる工程、及び
(ii)遊離したHbA1c由来αF6Pに請求項1〜24のいずれかに記載の改変アマドリアーゼを作用させ、該アマドリアーゼのHbA1c由来αF6Pに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程。 - 試料中のHbA1cを定量する、請求項32に記載の方法。
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