JP6764219B2 - グッド緩衝液に対して安定なアマドリアーゼ - Google Patents
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Description
[1] (i)アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置において1以上のアミノ酸置換を有し、アマドリアーゼ活性を有し、配列番号1、6又は9のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
(ii)前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位及び311位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアマドリアーゼ活性を有するアマドリアーゼ、或いは
(iii)前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、6又は9のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつアマドリアーゼ活性を有するアマドリアーゼ。
[2] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンである、配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、及び配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、からなる群より選択されるアミノ酸置換を1以上有する、1に記載のアマドリアーゼ。
[3] アマドリアーゼ活性を有し、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、又は
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、1又は2に記載のアマドリアーゼ。
[4] アマドリアーゼ活性を有し、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、1〜3のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[5] 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、1〜4のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[6] 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12又は配列番号13に示すアミノ酸配列を有し、かつ1〜4のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、1〜4のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[7] 1〜6のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
[8] 以下の工程:
(i)7に記載の遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程;
(ii)宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程;及び
(iii)培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
[9] 1〜6のいずれかに記載のアマドリアーゼ、並びに、アセトアミドグリシン、ACES(N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)、ADA(N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸)、BES(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸)、Bicin(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)、Bis−Tris(ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン)、コラミン塩酸、EPPS(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸)、グリシンアミド、HEPES(4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、HEPPSO(N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)、MOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、MOPSO(2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸)、PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸))、POPSO(ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸))、TAPS(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸)、TAPSO(3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、TES(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸)、トリシン(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)、AMPSO(N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、CABS(4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸)、CAPS(N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸)、CHES(N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸)、CAPSO(N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸)、DIPSO(3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)及びこれらの混合物からなる群より選択されるグッド緩衝剤を含む、ヘモグロビンA1c測定用試薬キット。
[10] 1〜6のいずれかに記載のアマドリアーゼ又は9に記載のキットを用いる、糖化ヘモグロビンの測定方法。
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する(ポリ)ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリシン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド(α−フルクトシルペプチド)である。α−糖化ペプチドは、N末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンA1c(HbA1c)である場合、該当するα−糖化ペプチドは、N末端が糖化されているHbA1cのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。146残基のアミノ酸により構成されているHbA1cのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する(αF146P)。
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ2酢酸又はその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸又はα−ケトアルデヒド、アミノ酸又はペプチド及び過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。本明細書ではこの酵素活性をアマドリアーゼ活性、糖化基質に対する活性又は糖化ペプチドに対する酸化活性とよぶことがある。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物又は植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母又は細菌等から得ることができる。
(2)290位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えば、グルタミンへの置換。
(3)311位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えば、グルタミン、アラニン又はアスパラギンへの置換。
(アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換について)
本発明者は、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその基質特異性を変化させることができることを以前に報告した(例えば国際公開2013/162035号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグルタミン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアラニン
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのカチオン性界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している(特願2013-221515号及びPCT/JP2014/071036号明細書参照、これらは参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする)。
(i)262位のアスパラギン、
(ii)257位のバリン、
(iii)249位のグルタミン酸
(iv)253位のグルタミン酸、
(v)337位のグルタミン、
(vi)340位のグルタミン酸、
(vii)232位のアスパラギン酸、
(viii)129位のアスパラギン酸、
(ix)132位のアスパラギン酸、
(x)133位のグルタミン酸、
(xi)44位のグルタミン酸、
(xii)256位のグリシン、
(xiii)231位のグルタミン酸、及び
(xiv)81位のグルタミン酸
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのデヒドロゲナーゼ活性を向上及び/又はオキシダーゼ活性を低減させることができることを確認している。例えば特願2014-217405号明細書を参照のこと(参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする)。
(1)280位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、スレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
(2)267位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
(3)269位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
(4)54位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
(5)241位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのアニオン性界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している。例えば特願2014-227548号明細書を参照のこと。この文献は参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
(1)80位のリシン、
(2)71位のメチオニン、
(3)175位のグルタミン酸、
(4)172位のフェニルアラニン、
(5)279位のバリン、
(6)12位のバリン、
(7)9位のアルギニン、
(8)77位のグルタミン、
(9)30位のセリン、
(10)28位のバリン、
(11)13位のバリン、
(12)3位のセリン、
(13)4位のアスパラギン
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNA又はcDNAを用いて、染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製することができる。
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(STRATAGENE社製)等が好ましい。
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;又はタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体DNAを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌K-12株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株(ともにタカラバイオ社製)や大腸菌B株、好ましくは大腸菌BL21株(ニッポンジーン社製)等を形質転換又はそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11(ゼネティックス社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム又はDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該2以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
本明細書において、ある基準となるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置という。本明細書では便宜上、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列を基準として説明する。この場合、アミノ酸配列における「対応する位置」とは、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の288位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの288位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸を意味する。これは上記の「アミノ酸配列における対応する位置」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
なお、「配列番号1記載のアミノ酸配列の80位のリシンに対応する位置のアミノ酸」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの80位のリシンに対応する位置のアミノ酸を意味する。
なお、本明細書において「配列番号1記載のアミノ酸配列の280位のシステインに対応する位置のアミノ酸」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの280位のシステインに対応する位置のアミノ酸を意味する。
本明細書において「配列番号1記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸を意味する。
なお、本明細書において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸を意味する。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1により特定することができる。
上記のようにして得られたグッド緩衝剤の存在下での熱安定性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
本発明はアマドリアーゼ及び緩衝剤を含む糖化ヘモグロビン測定用キットを提供する。アマドリアーゼと緩衝剤とは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。一般に、同一の成分としてアマドリアーゼと緩衝剤とがキット中に含まれる場合、緩衝剤はアマドリアーゼを失活させない濃度で含まれるのが好ましい。別個の成分としてアマドリアーゼと緩衝剤とがキット中に含まれる場合、緩衝剤は測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。このストック溶液を適宜希釈して、測定に用いる溶液を調製する。
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるpH5.0〜pH10.0、好ましくはpH6.0〜pH8.0の範囲で緩衝能を有する緩衝剤又は緩衝液を適宜加えてよい。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は1以上の緩衝剤を包含するものとする。緩衝液とは溶液のpHを一定範囲に保つ緩衝作用(緩衝能)のある溶液のことをいい、緩衝剤とは溶液に緩衝作用を付与する物質をいう。緩衝剤は、弱酸を例にとると、弱酸とその塩から構成され、この場合、当該塩を共役塩と呼ぶ。ある緩衝剤についての濃度は、当該緩衝剤のベースとなる化合物の単独形態とその共役塩の形態とを合計したベース化合物についての濃度をいう。例えば100mMのグッド緩衝剤というとき、これは終濃度として溶液に含まれるグッド緩衝剤化合物及びその共役塩を合計したグッド緩衝剤化合物濃度が100mMであることをいう。
本発明の組成物は界面活性剤を含み得る。界面活性剤としては、本発明のHbA1cの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられるが、特にカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤が好ましい。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は1以上の界面活性剤を包含するものとする。
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して緩衝剤の存在下での安定性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法及び緩衝剤の存在下での安定性評価方法に記載した反応条件下で、所定の緩衝剤を添加してから、53℃、10分の熱処理後の残存活性が、向上していることを特徴とする。ここで、残存活性(%)とは、熱処理前の活性を100とした場合の熱処理後の活性の割合をパーセンテージ(%)で表したものである。
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
(1)試薬1:POD−4−AA溶液
4.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(東京化成工業社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、1Lに定容する。
(2)試薬2:TOOS溶液
500mgのTOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
(3)試薬3:基質溶液(150mM;終濃度 5mM)
フルクトシルバリン417mgをイオン交換水に溶解して10mlに定容する。
2.7mlの試薬1,100μlの試薬2、及び100μlの試薬3を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、酵素液を100μl加えてよく混ぜた後、分光光度計(U−3900、日立ハイテクノロジーズ社製)により、555nmにおける吸光度を測定する。測定値は、555nmにおける1分後から3分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。37℃、1分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
ΔAs : 反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0 : 対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2: 反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数(mM−1・cm−1)
0.5 : 1molの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のmol数
df : 希釈係数
上記の活性測定方法において、種々の緩衝剤の存在下で熱処理を行った後のアマドリアーゼの残存活性測定を行うことで、緩衝剤存在下でのアマドリアーゼの熱安定性を評価することができる。例えば、アマドリアーゼ粗酵素液を約0.5U/mlとなるように、0.1M HEPES緩衝液(pH7.0)、TES緩衝液(pH7.0)、又はリン酸緩衝液(pH7.0)で希釈し、53℃にて10分間加温する。上記の活性測定方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、加熱前の活性を100とした場合の加熱後の活性の割合、すなわち、残存活性(%)を求めることにより、緩衝剤存在下での熱安定性を評価する。
(緩衝剤存在下での熱安定性向上型変異について)
(1)組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの調製
CFP-T7遺伝子(配列番号2)を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株(国際公開2007/125779号参照)を、LB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。
得られた組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、配列番号15、19の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、上記の緩衝剤存在下での熱安定性評価方法に従って、各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価を行った。緩衝液として、0.1M HEPES緩衝液(pH7.0)又はリン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。結果を表1に示す。
(安定性向上型変異の蓄積)
実施例1で見出された安定性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらにグッド緩衝剤存在下での熱安定性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、2重変異体及び3重変異体を作製した。
(Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼについて)
配列番号6はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ(以降CcFXと称する)のアミノ酸配列である(国際公開第2004/104203号)。配列番号6のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号14)を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した(終止コドンTAAを含む)。このとき、配列番号14の5´末端、3´末端にはそれぞれEcoRIサイトとHindIIIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図1のCcFXの配列と一致していることを確認した。続いて、取得した配列番号14の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をEcoRIサイトとHindIIIサイトの2種類の制限酵素(タカラバイオ社製)で処理し、pKK-223-3 Vector(GEヘルスケア社製)のEcoRI-HindIIIサイトに挿入することで、組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109(pKK223-3-CcFX)株を得た。
(Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼについて)
配列番号9はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(以降PnFXと称する)のアミノ酸配列である(Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010)。配列番号9のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号32)を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した(終止コドンTAAを含む)。このとき、配列番号32の5´末端、3´末端にはそれぞれEcoRIサイトとHindIIIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図1のPnFXの配列と一致していることを確認した。続いて、取得した配列番号32の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をEcoRIサイトとHindIIIサイトの2種類の制限酵素で処理し、pKK-223-3 VectorのEcoRI-HindIIIサイトに挿入することで、組換え体プラスミドpKK223-3-PnFXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109(pKK223-3-PnFX)株を得た。
配列番号1 CFP-T7のアミノ酸配列
配列番号2 CFP-T7の遺伝子配列
配列番号3 Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号4 Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号5 Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号6 Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号7 Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号8 Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号9 Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号10 Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号11 Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号12 Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号13 Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号14 Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子配列
配列番号15 R288N-Fw
配列番号16 R288D-Fw
配列番号17 R288A-Fw
配列番号18 R288Q-Fw
配列番号19 R288X-Rv
配列番号20 K290Q-Fw
配列番号21 K290N-Fw
配列番号22 K290A-Fw
配列番号23 K290X-Rv
配列番号24 K311Q-Fw
配列番号25 K311A-Fw
配列番号26 K311N-Fw
配列番号27 K311X-Rv
配列番号28 R288N/K290Q-Fw
配列番号29 CcR286N-Fw
配列番号30 CcR286N/K288Q-Fw
配列番号31 CcK288Q-Rv
配列番号32 Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子配列
配列番号33 PnR284N-Fw
配列番号34 PnR284N/K286Q-Fw
配列番号35 PnK286Q-Rv
Claims (9)
- (i)アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置において1以上のアミノ酸置換を有し、アマドリアーゼ活性を有し、配列番号1、6又は9のアミノ酸配列と70%以上の全長アミノ酸配列同一性を有する改変アマドリアーゼであって、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該改変アマドリアーゼの対応するそれぞれの位置からなる相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有する、改変アマドリアーゼ、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列を有し、ただし、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置において1以上のアミノ酸置換を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位及び311位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアマドリアーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
(iii)配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、ただし、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置において1以上のアミノ酸置換を有し、かつアマドリアーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
(iv)配列番号6のアミノ酸配列と90%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、ただし、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置において1以上のアミノ酸置換を有し、かつアマドリアーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、或いは
(v)配列番号9のアミノ酸配列と90%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、ただし、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置において1以上のアミノ酸置換を有し、かつアマドリアーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
ここで、上記(i)〜(v)において、前記配列番号1に示すアミノ酸配列における288位、290位、及び311位からなる群より選択される位置に対応する位置における1以上のアミノ酸置換が、配列番号1の290位に対応する位置におけるアミノ酸置換である場合、当該配列番号1の290位に対応する位置におけるアミノ酸置換はグルタミンへのアミノ酸置換であり、配列番号1の288位に対応する位置におけるアミノ酸置換である場合、当該配列番号1の288位に対応する位置におけるアミノ酸置換はアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンへのアミノ酸置換であり、配列番号1の311位に対応する位置におけるアミノ酸置換である場合、当該配列番号1の311位に対応する位置におけるアミノ酸置換はグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンへの置換である、前記改変アマドリアーゼ。 - アマドリアーゼ活性を有し、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンである、
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、又は
(iii)配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、請求項1に記載のアマドリアーゼ。 - アマドリアーゼ活性を有し、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における288位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、アラニン、若しくはグルタミンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列における290位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、かつ、配列番号1に示すアミノ酸配列における311位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、アスパラギン、若しくはアラニンである、請求項1又は2に記載のアマドリアーゼ。
- 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、又はペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12又は配列番号13に示すアミノ酸配列を有し、かつ請求項1〜3のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
- 以下の工程:
(i)請求項6に記載の遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程;
(ii)宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程;及び
(iii)培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ、並びに、アセトアミドグリシン、ACES(N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)、ADA(N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸)、BES(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸)、Bicin(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)、Bis−Tris(ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン)、コラミン塩酸、EPPS(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸)、グリシンアミド、HEPES(4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、HEPPSO(N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)、MOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、MOPSO(2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸)、PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸))、POPSO(ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸))、TAPS(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸)、TAPSO(3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、TES(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸)、トリシン(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)、AMPSO(N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)、CABS(4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸)、CAPS(N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸)、CHES(N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸)、CAPSO(N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸)、DIPSO(3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)及びこれらの混合物からなる群より選択されるグッド緩衝剤を含む、ヘモグロビンA1c測定用試薬キット。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ又は請求項8に記載のキットを用いる、糖化ヘモグロビンの測定方法。
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