JP2015100345A - アマドリアーゼ含有組成物の安定化方法、アマドリアーゼ含有組成物の製造方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上する方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供する。
【解決手段】特定の配列における２８８位のアルギニン、２９０位のリジン、３１１位のリジン、および、３１２位のヒスチジンに対応する位置、または特定の配列における２８６位のアルギニン、２８８位のリジン、３０９位のリジン、および、３１０位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸を共通に有するアマドリアーゼに対して、１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩を共存させることにより得られるアマドリアーゼ含有組成物。
【効果】熱安定性、保存安定性等に優れたアマドリアーゼ含有組成物および糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、アマドリアーゼ含有組成物の安定化方法、アマドリアーゼ含有組成物の製造方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物に関する。

糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。

これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。

このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）またはα−フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照。）。実際には、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。

アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。

アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。

糖化ヘモグロビンを測定する目的で、アマドリアーゼを含有する測定用組成物や測定用キットを製造するにあたり、その保存性を向上させるという観点から、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させることが求められている。熱安定性を向上させることにより、長期保存が可能になり、あるいは、常温流通が可能になり、また、高温環境下での流通や使用が可能になることが期待される。
従来、アマドリアーゼの熱安定性を向上させるための技術としては、アマドリアーゼの数個のアミノ酸を置換することにより熱安定性を向上させる手法が挙げられる。具体的には、変異型Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ ｓｐ． ＮＩＳＬ ９３３０株由来アマドリアーゼおよび変異型Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ ＡＴＣＣ１８５４７株由来アマドリアーゼ、変異型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、変異型Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ株由来フルクトシルペプチドオキシダーゼが報告されている（例えば、特許文献１６、１７参照。）。中でも、特許文献１６において開示されている大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２）株が生産する変異型アマドリアーゼは、従来のアマドリアーゼと比較して非常に優れた熱安定性を示し、６０℃、３０分間の熱処理においても８１％の残存活性を維持することが示されている。また、特許文献１７において開示されているＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ株由来変異型フルクトシルペプチドオキシダーゼＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙは、５０℃、１０分間の熱処理において９２％の残存活性を維持することが示されている。また、変異を導入することなくある程度の熱安定性を有する天然型アマドリアーゼもいくつか見いだされている。具体的には、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ ＮＢＲＣ７５９０株由来の真核型ケトアミンオキシダーゼは、４５℃、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ ＹＨ９２３株由来の真核型ケトアミンオキシダーゼは、５０℃、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。また、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ株由来フルクトシルペプチドオキシダーゼは、５０℃、１０分間の熱処理で７５％の残存活性を示している（例えば、特許文献１７参照。）。さらに、アマドリアーゼそのものに対する改変ではなく、アマドリアーゼと共存させてその安定性を向上させるという観点からの検討もなされている。具体的には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ ｓｐ． ＮＩＳＬ ９３３０株由来アマドリアーゼを含んだ溶液に、５ｍＭのエチレンジアミン４酢酸および３％のグリシンを添加した際は、３０℃、７日間保存後において７９％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献１８参照。）。また、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＩＦＯ−９９７２株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含んだ溶液に、３％のＬ−アラニン、３％のグリシンまたは３％のザルコシンを添加した際は、３７℃、２日間保存後において１００％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献１９参照。）。

しかしながら、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法にはさらなる知見が求められているのが現状である。

国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１−９５５９８号公報 特公平０５−３３９９７号公報 特開平１１−１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２０１１−２２９５２６号公報 特開２００３−２３５５８５号公報 特開２００４−２７５０１３号公報 特開２００４−２７５０６３号公報 特開２０１０−３５４６９号公報 特開２０１０−５７４７４号公報 国際公開第２０１０／４１７１５号 国際公開第２０１０／４１４１９号 国際公開第２０１１／１５３２５号 国際公開第２０１３／１００００６号 特開２０１０−１１５１８９号公報 特開２００６−３２５５４７号公報 特開２００９−０００１２８号公報

Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３１１， １０４−１１， ２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０６， ３５８−６６， ２０１０ Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０２， ２４１−３， ２００６ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４２， ４９９−５０５， １９９６ Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８，３４４−５０，２００２ Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，６２５−３２，２００４ Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９， ４８７−９１，１９９５ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４， ８１３−８１９， ２００７ Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６， １２５６−６１， ２００２ Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６， ２３２３−２９， ２００２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７， ２７−３２，２００５

本発明が解決しようとする課題は、アマドリアーゼ含有組成物の安定化方法、アマドリアーゼ含有組成物の製造方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、特定のモチーフを有する複数のアマドリアーゼに対して、ある種のアニオンを共存させることにより得られるアマドリアーゼ含有組成物が前記アニオンを共存させない場合と比較して、熱安定性が向上することを見出した。そして、このような特定のアニオンを共存させたアマドリアーゼ含有組成物を用いることにより、熱安定性が向上した糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）配列番号１と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における
（ａ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｂ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｃ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｄ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させることを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
（２）配列番号１４と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４における
（ｅ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｆ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｇ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｈ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させることを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
（３）アマドリアーゼが糖化ジペプチドに作用するアマドリアーゼである上記（１）または（２）記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
（４）アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩である上記（３）記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
（５）配列番号１と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における
（ａ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｂ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｃ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｄ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
（６）配列番号１４と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４における
（ｅ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｆ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｇ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｈ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
（７）アマドリアーゼが糖化ジペプチドに作用するアマドリアーゼである上記（５）または（６）記載のアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
（８）アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩である上記（７）記載のアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
（９）配列番号１と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における
（ａ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｂ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｃ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｄ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。
（１０）
配列番号１４と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４における
（ｅ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｆ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｇ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｈ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。
（１１）１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩を含有する上記（９）または（１０）に記載の組成物。
（１２）リンゴ酸、クエン酸もしくはリン酸またはこれらの塩のいずれか１つの化合物を含有する上記（１１）記載の組成物。
（１３）上記（９）〜（１２）記載のアマドリアーゼ組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用試薬。
（１４）上記（９）〜（１２）記載のアマドリアーゼ組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用キット。

本発明によれば、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供することができる。
本発明のアマドリアーゼ含有組成物は、常温流通や長距離輸送等、酵素が処方されたキットが過酷な温度条件にさらされることを想定した場合、あるいは、製造工程において加熱処理等を施すことが想定される酵素センサーとしての用途等を考えた場合等において、これまでに提案されたアマドリアーゼ含有組成物よりも、さらに優れた耐熱性、保存性を有することが期待され、糖化ヘモグロビン測定用組成物およびキットの流通において、また、センサー等の用途開発において、多大に貢献することが期待される。

各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。 Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列のアライメントの一部である。

以下、本発明を詳細に説明する。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。

本発明に用いるアマドリアーゼの種類は、限定されるものではなく、各種公知のアマドリアーゼを含み得るが、特定の４か所の対応する位置のアミノ酸残基が特定の残基であることを特徴とする。具体的には、本発明に用いるアマドリアーゼは、配列番号１に記載のアマドリアーゼにおける対応する４か所の位置において、下記のアミノ酸を有することを特徴とする：
（ｉ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｉｉ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｉｉｉ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｉｖ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである。
または、本発明に用いるアマドリアーゼは、配列番号１４に記載のアマドリアーゼにおける対応する４か所の位置において、下記のアミノ酸を有することを特徴とする：
（ｖ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
（ｖｉ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｖｉｉ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
（ｖｉｉｉ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである。

一態様において、本発明に用いるアマドリアーゼは、配列番号１または配列番号１４に示されるアミノ酸配と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、および、配列番号１または配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを含む。

本発明のアマドリアーゼは、例えば、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属などのの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよいし、上記以外の生物種に由来し、上述の４か所の対応する特定の位置に特定のアミノ酸残基を有するものでもよい。

（特定モチーフ）
なお、本明細書中においては、上述の４か所の対応する特定の位置に特定のアミノ酸残基を有する構造を「特定モチーフ」と称し、上述の４か所の対応する特定の位置に特定のアミノ酸残基を有することを「特定モチーフを有する」と称する場合がある。
本発明に用いるために好ましいアマドリアーゼは、上述の特定モチーフを有することを特徴とする。上述の特定モチーフを有するアマドリアーゼに、後述する特定のアニオンを共存させることにより、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物が得られる。

なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、特開２０１３−１７６３５１号において、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と称する組換え体プラスミド（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５９３）を保持する大腸菌が生産するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）に対し、基質特異性改善型変異（Ｅ９８Ａ、Ｇ１０３Ｈ、Ｓ１５４Ｎ、Ｇ２６３Ｍ）と熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、カルボシル基３アミノ酸欠失（ΔＰＴＳ１））を導入したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２の遺伝子にコードされている。なお、このＣＦＰ−Ｔ７は、天然型のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である（国際公開２００７／１２５７７９号参照）。そして、当該アマドリアーゼの２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はアルギニンであり、２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はリジンであり、３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はリジンであり、３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンである。

また、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開２００４／１０４２０３号において、ｐＰＯＳＦＯＤ９２３と称する組み換えプラスミドを保持する大腸菌が生産するＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（ＣｃＦＸ）のアミノ酸配列である。そして、当該アマドリアーゼの２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はアルギニンであり、２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はリジンであり、３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はリジンであり、３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンである。

上記の２つのアマドリアーゼにおけるアミノ酸の位置を示す番号は、配列番号１または配列番号１４に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。

なお、本明細書において、配列番号１または配列番号１４を例示しているが、これは、本発明の効果が配列番号１または配列番号１４で示されるアマドリアーゼに限定的であることや、あるいは、これらの配列とは異なるアマドリアーゼに対する効果よりも顕著に大きいことを示すものではない。本発明の効果は、特定モチーフを有する各種のアマドリアーゼに共通的にみられるものであるから、アマドリアーゼ活性を有し、特定モチーフを有するアマドリアーゼ全般が、本発明に包含される。例えば、本明細書中に例示する配列番号１と配列番号１４のアマドリアーゼの間のアミノ酸の同一性は８０％である。このような同一性の程度を有する複数のアマドリアーゼにおいて、本発明の効果が確認されていることからも、本発明の効果が、配列番号１あるいは配列番号１４との同一性が同等程度以上である各種アマドリアーゼについても当然に発揮されるとの蓋然性が高いことが理解される。

本発明に使用できるアマドリアーゼは、上述の通り、特定モチーフを有することを特徴とし、それ以外の位置において、任意の各種変異等を含んでいても良い。例えば、それらの各種変異の中には、耐熱性向上や基質特異性向上、生産性向上等に寄与する変異が含まれ得るが、特段に人為的な変異を導入していない天然型酵素を用いる場合であれ、何らかの変異等を人為的に導入している場合であれ、本発明の効果が発揮され、その熱安定性が向上している限り、いかなるアマドリアーゼも、本発明に用いることができる。本発明に使用できるアマドリアーゼは、公知の各種文献等に記載の方法で入手・製造できるほか、市販品に関しては適宜購入することもできる。

（アミノ酸配列の同一性）
アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。

（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１または配列番号１４に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。

図１に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。また、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を上から５段目に示す。
図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。なお、配列番号１４の配列を基準にしても、対応する位置は変わらない。図１からＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる 。図１には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ（配列番号１１）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１２）、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１３）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１４）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１５）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１６）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１８）、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１９）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号２０）のアミノ酸配列を示してある。

（対応する位置）
なお、本発明において、「配列番号１における２８８位のアルギニンに対応する位置」、または「配列番号１４における２８６位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１または配列番号１４に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２８８位のアルギニン、または配列番号１４のアマドリアーゼの２８６位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。

すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２８８位のアルギニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２８６位のアルギニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２８８位のアルギニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２８８位のアルギニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８８位のアルギニン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８４位のアルギニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８８位のヒスチジン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８６位のアルギニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８８位のアルギニンである。

また、「配列番号１における２９０位のリジンに対応する位置」または「配列番号１４における２８８位のリジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１または配列番号１４に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２９０位のリジンまたは配列番号１４のアマドリアーゼの２８８位のリジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。

すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２９０位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２８８位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２９１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２９０位のリジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９０位のリジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８６位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９０位のリジン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８８位のリジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２９０位のリジンである。

また、「配列番号１における３１１位のリジンに対応する位置」または「配列番号１４における３０９位のリジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１または配列番号１４に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３１１位のリジンまたは配列番号１４のアマドリアーゼの３０９位のリジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。

すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３１１位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３０９位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３１２位のリジン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３１１位のリジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１１位のリジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３０７位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１１位のリジン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０９位のリジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１１位のリジンである。

また、「配列番号１における３１２位のヒスチジンに対応する位置」または「配列番号１４における３１０位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１または配列番号１４に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３１２位のヒスチジンまたは配列番号１４のアマドリアーゼの３１０位のヒスチジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。

すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３１０位のヒスチジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３１３位のヒスチジン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３０８位のヒスチジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１０位のヒスチジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１２位のヒスチジンである。

（熱安定性向上成分）
本発明は、上述の特定モチーフを有する任意のアマドリアーゼに対し、アニオンを共存させることにより、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上できることを特徴とする。これまでに、アマドリアーゼ自体を改変して熱安定性を向上させる試みや、あるいは、天然型の状態で比較的熱安定性が高いアマドリアーゼを探索する試みが多く行われてきた一方で、各種アマドリアーゼに対して効果的な熱安定性向上成分や、組成物として熱安定性が向上しているアマドリアーゼ含有組成物の知見は乏しかった。本発明は、特定の１変異体に限定的な知見ではなく、特定モチーフという着想によって、一定の同一性を有する複数のアマドリアーゼに共通の効果を奏する熱安定性向上成分として、アニオンが有効であることを見出した。

本発明において、特定モチーフを有するアマドリアーゼと共存させるアニオンの濃度は、アマドリアーゼ含有組成物中、２ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは５ｍＭ〜５Ｍ、より好ましくは１０ｍＭ〜５Ｍ、２０ｍＭ〜５Ｍ、３０ｍＭ〜５Ｍ、さらに好ましくは４０ｍＭ〜１Ｍ、特に好ましくは５０ｍＭ〜１Ｍ、１００ｍＭ〜１Ｍ、２００ｍＭ〜１Ｍであることを特徴とする。このような濃度でアニオンを共存させることにより、共存させない場合と比較して、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を良好に向上させることができる。

（アニオンの種類）
上記のアニオンを、単独で、あるいは複数種組み合わせて、本発明に使用することができる。これらのアニオンを共存させることにより、特定モチーフを有する各種アマドリアーゼの熱安定性を向上させることができる。本発明におけるアニオンとしては、本発明のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させるものであれば特に制限は無く、例えば、カルボキシル基含有化合物、ハロゲン化合物、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、タンパク質、ペプチド、アミノ酸などが挙げられるが、特に、本発明に用いる好ましいアニオンは、１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩である。

また、本発明に用いるジカルボン酸は、本発明のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させるものであれば特に制限は無いが、例えば、一態様において、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、リンゴ酸、酒石酸、タルトロン酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、ムコン酸、メサコン酸、メコン酸、３−３’ジメチルグルタル酸等がこのましいジカルボン酸として例示される。また、一態様において、本発明に用いる好ましいトリカルボン酸としては、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸等が挙げられる。さらに、一態様において、本発明に用いる好ましいジカルボン酸塩、トリカルボン酸塩またはリン酸塩としては、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等が挙げられる。

（アマドリアーゼ及びアニオンを共存させたアマドリアーゼ含有組成物）
上述のアニオンを各種任意の特定モチーフを有するアマドリアーゼと共存させることにより、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及が得られる。
本発明において、アニオンとアマドリアーゼを共存させる方法は、限定されるものではないが、例えば、溶液中で両成分を混合する方法が挙げられる。
本発明のアマドリアーゼ及びアニオンを含むアマドリアーゼ含有組成物には、本発明の効果を妨げない限り、その他の各種目的で混合される任意の成分が添加されていてもよい。例えば、ｐＨ調整剤（緩衝剤）、界面活性剤による影響を低減する安定化剤等が挙げられる。

（アマドリアーゼ及びアニオンを共存させた糖化ヘモグロビン測定用組成物）
上述のアマドリアーゼ含有組成物に、その他の糖化ヘモグロビン測定試薬、糖化ヘモグロビン測定用キットに必要とされる各種成分をさらに組み合わせて、糖化ヘモグロビン測定用組成物を得ることができる。
例えば、本発明のアマドリアーゼ含有組成物に対し、αＦＶＨ測定用試薬、αＦＶＨを切り出すためのプロテアーゼまたはペプチダーゼ、その他公知の安定化剤や緩衝溶液を組み合わせて、糖化ヘモグロビン測定用組成物を製造できる。

（本発明のアニオンを共存させることによる、熱安定性の向上）
本発明において、アニオンを共存させることによるアマドリアーゼの熱安定性の向上とは、アニオンを共存させないものと比較した場合に、５５℃、１０分間の熱処理後の熱安定性が向上していることをいう。具体的には、アニオンを共存させないものと比較して、本明細書中に記載の活性測定方法および熱安定性評価方法に記載した反応条件下で、５５℃、１０分間の熱処理後の残存活性（％）が、本発明の変異を導入する前と比較して３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは４０％以上向上していることを特徴とする。
あるいは、一態様において、アニオンを共存させることによるアマドリアーゼの熱安定性が向上しているとは、アニオンを共存させることによるアマドリアーゼの残存活性（％）を、アニオンを共存させないもの残存活性（％）で割ることにより得られる値（残存活性比率）が、１より大きい、好ましくは２より大きい、より好ましくは３．１より大きい、４より大きい、さらに好ましくは５より大きい、６より大きいことをいう。
アマドリアーゼの活性測定および残存活性測定方法については後述する。

（アマドリアーゼ含有組成物中のアマドリアーゼの濃度）
本発明における、アマドリアーゼ含有組成物中のアマドリアーゼの濃度は、限定されるものではないが、例えば、保存中あるいは糖化ヘモグロビン測定時における終濃度として、アニオン１０ｍＭ当たり０．０１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌである。ここで、測定時における終濃度、とは最終的に成分を希釈して糖化ヘモグロビン測定を行うときの濃度をいう。したがってキット中では、測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。

（緩衝剤）
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲で緩衝剤または緩衝液を適宜加えて良い。緩衝液とは溶液のｐＨを一定範囲に保つ緩衝作用（緩衝能）のある溶液のことをいい、緩衝剤とは溶液に緩衝作用を付与する物質をいう。緩衝剤は、弱酸を例にとると、弱酸とその塩から構成され、この場合、当該塩を共役塩と呼ぶ。

本発明のキット（組成物）に用いることのできる緩衝剤（緩衝液）としては、例えば、ホウ酸及び／又はその塩を含むホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸及び／又はその塩を含むリン酸緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤又はリン酸ナトリウム緩衝剤、クエン酸及び／又はその塩を含むクエン酸緩衝剤等の緩衝剤が挙げられる。また、本発明のキット等に用いることのできる緩衝剤としては、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）、ＣＨＥＳ（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）及び／又はそれらの塩等を含むグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸及び／又はその塩を含むフタル酸緩衝剤、マレイン酸及び／又はその塩を含むマレイン酸緩衝剤、グルタル酸及び／又はその塩を含むグルタル酸緩衝剤等のジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。これらのうち１種のみを適用しても良いし、２種以上を用いても良い。塩としてはベース化合物のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及びアンモニウム塩が挙げられるがこれらに限らない。

本発明の緩衝剤は、適当な濃度で本発明のキットまたは組成物に用いることができる。通常、本発明のキットまたは組成物に添加する本発明の緩衝剤の量は、測定溶液での終濃度に基づいて算出することができる。ある実施形態において、測定溶液における本発明の緩衝剤の終濃度は、好ましくは当該測定溶液に生じうるｐＨ変化を緩衝するのに十分な濃度である。例えば、本発明の緩衝剤としてＨＥＰＥＳ緩衝剤を用いる場合、その濃度は２００ｍＭ〜１Ｍ、例えば２００ｍＭ〜５００ｍＭであり得る。なお、組成物に用いる本発明の緩衝剤の量は、組成物に安定化剤も添加する場合、当該安定化剤の量に応じて変化しうる。

（アマドリアーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
以下、本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特開２００１−９５５９８号参照）。

Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマンバイオケミファ社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度 ５ｍＭ）
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。

Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡｓ）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡ０）を測定した。３７℃で１分間あたりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。

活性（Ｕ／ｍｌ）＝ ｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）

ΔＡｓ ： 反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ_０ ： 対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２： 反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数（ｍＭ^−１・ｃｍ^−１）
０．５ ： １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ ： 希釈係数

（熱安定性測定方法）
１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に約０．５Ｕ／ｍｌのアマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品が含まれる溶液を６００μｌ調製し、この希釈溶液１００μｌを５５℃にて１０分間加温する。上述のＢ．の方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、加熱前の活性を１００とした場合の残加熱後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求めることにより、熱安定性を評価する。

（安定化剤評価方法）
上記の熱安定性測定方法において、種々の安定化剤をさらに添加してアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことにより、当該安定化剤の作用を評価することができる。具体的には、例えば、「５ｍＭの添加成分を安定化剤として評価する」とは、上述の熱安定性測定法において、添加成分を共存させない状態で５５℃にて１０分間加温した際の残存活性（％）を１とした場合の、終濃度５ｍＭの添加成分を共存させた状態で加温した際の残存活性（％）の割合を比率として算出し、その値を評価することをいう。
「添加成分が安定化剤として効果がある」ということは、上記の比率が、１より大きい、好ましくは２より大きい、より好ましくは３．１より大きい、４より大きい、さらに好ましくは５より大きい、６より大きいことをいう。
一態様において、安定化剤評価の際の熱処理条件は、安定化剤の効果を比較しやすい条件を個別に選択することができる。例えば、もともと比較的熱処理による活性の減少が見られにくいアマドリアーゼの場合は、より厳しい熱処理条件を採用することによって、安定化剤の効果を観察しやすくなることが想定される。例えば、一態様において、安定化剤候補成分を共存させない場合において、熱処理後の残存活性が約８〜２０％となる熱処理条件を採用することができる。
評価対象である安定化剤が緩衝作用をも有する化合物である場合、緩衝剤を溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度で使用しつつ（例えば、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．０）を５００ｍＭにて使用）、安定化剤を低濃度で（すなわち、溶液のｐＨを変化させるには十分でない低濃度で）用いることができる。
「溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度」とは、当該溶液に添加する他の試薬に起因するｐＨ変動が生じずｐＨが一定の範囲（例えばｐＨ５〜１０、ｐＨ６〜８）に保たれる濃度をいう。「溶液に緩衝能を付与するには十分でない濃度」とは、当該溶液に他の試薬を添加するとｐＨ変動が生じｐＨが一定範囲から逸脱する濃度をいう。これらの濃度は溶液に添加される他の試薬の種類及び量に応じて変化するが、当業者であれば慣用法により該濃度を適宜決定することができる。他の条件及び手順は上記の熱安定性測定方法と同様とする。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。

（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対する本発明の熱安定性向上効果の確認）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡの調製およびアマドリアーゼの生産
配列番号１は基質特異性改善型変異（Ｅ９８Ａ、Ｇ１０３Ｈ、Ｓ１５４Ｎ、Ｇ２６３Ｍ）と熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙ、カルボシル基３アミノ酸欠失（ΔＰＴＳ１））を導入したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２の遺伝子にコードされている（特開２０１３−１７６３５１号参照、以下、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）。このＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）株（特開２０１３−１７６３５１号参照）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
次いで、前記培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、ＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１のＤＮＡ２．５μｇを得た。
得られた上記組換え体プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。その後、菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、アマドリアーゼ粗酵素液１．５ｍｌを調製した。本アマドリアーゼは、本発明の特定モチーフを有するアマドリアーゼの一例である。

（２）各添加成分の共存下におけるアマドリアーゼの熱安定性評価
上記のように得られたアマドリアーゼの粗酵素液をサンプルとし、上述の「アマドリアーゼ活性の測定方法」、「熱安定性評価方法」、「安定化剤評価方法」に従って、種々の添加成分を共存させた場合のアマドリアーゼの熱安定性評価を行った。
１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌに、終濃度の３０倍濃度の添加成分含有溶液または超純水を２０μｌ加えて、アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約０．５Ｕ／ｍｌとなるように混合し、総体積が６００μｌとなるように超純水を混合した。このうち、１００μｌを５５℃にて１０分間加温し、上述のＢ．の方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、上述の熱安定性評価方法に従って、残存活性（％）を求めることにより、熱安定性を評価した。さらに、添加成分含有溶液の代わりに超純水を混合した場合を基準として、上述の安定化剤評価方法に従って、各種添加成分が安定化剤となり得るか否かの評価を行った。
なお、安定化効果を評価する対象の各種の成分を添加して、その熱安定化効果を評価する際に、各種の成分を添加することによりｐＨが変化し、ｐＨの違いによる安定性の差異が熱安定性の評価に影響することを防ぐ目的で、添加成分を共存させてもｐＨが変化しないように、緩衝液として５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用い、実際に、各種の添加成分を共存させた時にもｐＨは７．０に維持されていることを確認した後、熱処理を行った。上記のように、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１粗酵素液に対し、種々の安定化効果評価対象の各種の成分を共存させ、上記の熱安定性測定法に従って、熱安定性評価を行った。結果の一部を表１〜５に示す。なお、表１〜５における「比率」は、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。表１はリン酸を添加した場合、表２はクエン酸を添加した場合、表３はリンゴ酸を添加した場合、表４は酢酸を添加した場合、表５はＭＥＳを添加した場合の熱安定性評価の結果を示す。

表１に示す通り、本実施例の条件下では、リン酸を添加した際に、リン酸を添加しない場合と比較して、添加濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が高い、すなわち、熱安定性が向上していることが明らかとなった。以上のことから、リン酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示された。

同様に、表２に示す通り、本実施例の条件下では、クエン酸を添加した際に、クエン酸を添加しない場合と比較して、添加濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が高い、すなわち、熱安定性が向上していることが明らかとなった。以上のことから、クエン酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示された。

同様に、表３に示す通り、本実施例の条件下では、リンゴ酸を添加した際に、リンゴ酸を添加しない場合と比較して、添加濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が高い、すなわち、熱安定性が向上していることが明らかとなった。以上のことから、リンゴ酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示された。

一方、表４、５に示す通り、酢酸とＭＥＳでは５０ｍＭという濃度で共存させた場合でも、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の熱安定性を向上させることができなかった。以上より、ジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが確認された。

（人為的に特定モチーフの一部を欠損させた変異体における本発明の熱安定性向上効果の確認）
次に、実施例１で見出されたＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１に対する本発明の安定化剤の効果が、特定モチーフを有することに起因するものであることを確認する目的で、４つのアミノ酸からなる特定モチーフ（Ｒ／Ｈ２８８，Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２）のアミノ酸を１つずつ、別のアミノ酸へと置換する変異を導入させた改変型アマドリアーゼを作製し、その効果を確認した。具体的には、下記の手順により、各変異体を作製した。

（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。

すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ_４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。

反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８８位のアルギニンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２８８Ｎ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２９０位のリジンをグルタミンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡを鋳型として、配列番号５、６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２９０位のリジンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２９０Ｑ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３１１位のリジンをグルタミンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡを鋳型として、配列番号７、８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３１１位のリジンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１１Ｑ）を得た。

続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３１２位のヒスチジンをアスパラギンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１ ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３１２位のヒスチジンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｎ）を得た。

（２）安定化剤添加時における各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価
上記のようにして得られた各種の改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２８８Ｎ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２９０Ｑ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１１Ｑ）株、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｎ）株を、実施例１記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた熱安定性測定方法に従って、種々の酸を添加した際のアマドリアーゼの熱安定性を評価した。ただし、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｎをサンプルとしたのみ、熱処理を５２℃にて１０分間加温で行った。安定化剤に関しては、結果の一部を表６〜８に示す。

なお、本実施例では、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）株由来のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を変異元酵素としたため、表中に記載の「変異」の記載には、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１に既に導入済みの各種変異点は含めず、上記変異元酵素が有している特定モチーフの４つのアミノ酸のうち、各１か所を変異させた、その変異箇所のみを記載する。また、表中の「比率」は、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。

表６に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリン酸を添加した際に、７．４となるのに対し、モチーフを欠損させた各変異体は大幅に安定化剤の効果が減少した。例えば、Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２８８Ｎの残存活性の比率は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリン酸を添加した際に、１．２となり、ほとんど安定化剤の効果はないことが示された。

表７に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのクエン酸を添加した際に、６．０となるのに対し、モチーフを欠損させた各変異体は大幅に安定化剤の効果が減少した。例えば、Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２８８Ｎの残存活性の比率は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのクエン酸を添加した際に、１．４となり、ほとんど安定化剤の効果はないことが示された。

表８に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリンゴ酸を添加した際に、３．２となるのに対し、モチーフを欠損させた各変異体は大幅に安定化剤の効果が減少した。例えば、Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２８８Ｎの残存活性の比率は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリンゴ酸を添加した際に、１．１となり、ほとんど安定化剤の効果はないことが示された。
以上のことから、Ｒ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２の４つのアミノ酸に１つでも変異を導入した場合には、リン酸、クエン酸、リンゴ酸による安定化効果は減少することが示された。すなわち、Ｒ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２からなる特定モチーフを有するアマドリアーゼに特有の効果として、リン酸、クエン酸、リンゴ酸を添加した際の熱安定性向上効果が確認された。

（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼにおける本発明の熱安定性向上効果の確認）
実施例１、２に示したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼにおけるＲ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２からなる特定モチーフに相当する同様の特定モチーフを共通に有する別種のアマドリアーゼについても本発明の効果が奏されることを確認する目的で、別種の他のアマドリアーゼの一例として、同様の特定モチーフを共通に有するＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（ＣｃＦＸ）に対し、上記の安定化剤による熱安定性向上効果を確認した。

（１）Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの生産
配列番号１４はＣｃＦＸのアミノ酸配列であり、配列番号１４で示される４４０アミノ酸をコードし、且つ、大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号２１で示す１３２３ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成により、ｃＤＮＡを全合成することによって取得した。このとき、配列番号２１の５´末端、３´末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されたアミノ酸配列全長は図１のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの配列と一致していることを確認した。

続いて、取得した配列番号２１に示される遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＫＫ２２３−３ Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸを取得し、実施例１と同様の条件でＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ）株を得た。

上記のようにして得られたＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ）株を実施例１の方法で培養して、粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた活性測定方法に従ってケトアミンオキシダーゼの活性を確認した。

（２）各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの熱安定性評価
安定化剤は実施例１および実施例２と同様のものを用い、実施例１および２と同様に、各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの熱安定性評価を行った。本実施例においては、安定化剤を添加しない場合の残存活性を約８〜２０％とするために、熱処理条件を６０℃、１０分加温とした。各種安定化剤を添加した際に、ｐＨの変化を防ぐ目的から、緩衝液は５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用い、安定化剤を添加した際のｐＨは実際に７．０を示すことを確認後に、熱処理を行った。結果の一部を表９〜１１に示す。本発明の効果の傾向を参照する目的で、実施例１に示したＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の結果も並べて示す。表中の「比率」は、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。

安定化剤を添加しない場合、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来アマドリアーゼの６０℃、１０分加温後の残存活性は、８．４％であったのに対し、５０ｍＭリン酸を共存させた際の残存活性は、４６．５％に向上した。すなわち、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１と同様、ＣｃＦＸに対しても、リン酸を添加した際の熱安定性向上効果が示された。

安定化剤を添加しない場合、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来アマドリアーゼの６０℃、１０分加温後の残存活性は、８．４％であったのに対し、５０ｍＭクエン酸を共存させた際の残存活性は、５３．１％に向上した。すなわち、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１と同様、ＣｃＦＸに対しても、クエン酸を添加した際の熱安定性向上効果が示された。

したがって、ジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼに限定されず、Ｒ／Ｈ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２からなる特定モチーフに相当する特定モチーフを共通して有する別種のアマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが確認された。
ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１とＣｃＦＸのアミノ酸配列同一性は８０％であり、このような相同性を有する同種の酵素において、本発明の効果が共に確認されたことから、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１と８０％のアミノ酸配列同一性を有し、または、ＣｃＦＸと８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのＲ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２からなるモチーフに相当するモチーフを持つアマドリアーゼは、本発明の効果を有するアマドリアーゼに包含される蓋然性が高い。

（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにおける本発明の熱安定性向上効果の確認）
Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのＲ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２からなる特定モチーフに相当する特定モチーフを持たないアマドリアーゼにおいては、本発明の効果が発揮されないか否かを確認する目的で、特定モチーフを持たないアマドリアーゼの一例として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＡｏ２）に対し、上記の安定化剤による熱安定性向上効果を確認した。

図２にＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来アマドリアーゼ（ＦＡＯＡｏ２）の配列の一部を示す。配列番号１で示されるアミノ酸配列を１段目、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を２段目に示す。これらの配列は３３％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。
図２に示す通り、ＦＡＯＡｏ２は、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのＲ／Ｈ２８８、Ｋ２９０、Ｋ３１１、Ｈ３１２からなる特定モチーフのうち、Ｋ２９０、Ｋ３１１のみを共通に有している。すなわち、特定モチーフを構成する４アミノ酸のうち、２箇所を有し、２箇所を欠くアマドリアーゼである。

（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産
配列番号２２はＦＡＯＡｏ２のアミノ酸配列であり、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号２３）を挿入した組換え体プラスミド（以降ｐＵＣ１９−ＦＡＯＡｏ２と称する）を大腸菌ＤＨ５αで発現させることにより、ＦＡＯＡｏ２が生産されることが示されている（国際公開第２００８／１０８３８５号公報参照）。

上記ＦＡＯＡｏ２生産能を有する大腸菌ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＦＡＯＡｏ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。

調製した粗酵素液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂に吸着していたＦＡＯＡｏ２を溶出させ回収した。

得られたＦＡＯＡｏ２粗酵素液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにアプライして同緩衝液でＦＡＯＡｏ２を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＦＡＯＡｏ２の精製標品とした。

（２）各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの熱安定性評価
安定化剤は実施例１〜３と同様のものを用い、実施例１〜３と同様に、各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの熱安定性評価を行った。ただし、安定化剤を添加しない場合の残存活性を約１０〜２０％とするために、熱処理を５２℃、１０分加温で行った。各種安定化剤を添加した際に、ｐＨの変化を防ぐ目的から、緩衝液は５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用い、安定化剤を添加した際のｐＨは実際に７．０を示すことを確認後に、熱処理を行った。結果の一部を表１２〜１４に示す。本発明の効果の傾向を参照する目的で、実施例１に示したＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の結果も並べて示す。表中の「比率」は、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。

安定化剤を添加しない場合、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来アマドリアーゼの５２℃、１０分加温後の残存活性は、１５．５％であったのに対し、５０ｍＭリン酸を共存させた際の残存活性は、４４．０％に向上した。しかし、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１とは異なり、その向上の程度は十分なものとはいえず、ＦＡＯＡｏ２に対しては、リン酸を添加した際の熱安定性向上効果は十分に発揮されないことがわかった。

安定化剤を添加しない場合、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来アマドリアーゼの５２℃、１０分加温後の残存活性は、１５．５％であったのに対し、５０ｍＭクエン酸を共存させた際の残存活性は、４４．８％に向上した。しかし、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１とは異なり、その向上の程度は十分なものとはいえず、ＦＡＯＡｏ２に対しては、クエン酸を添加した際の熱安定性向上効果は十分に発揮されないことがわかった。

配列番号１． ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１のアミノ酸配列
配列番号２． ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の遺伝子配列
配列番号３． Ｒ２８８Ｎ導入プライマーＦｗ
配列番号４． Ｒ２８８Ｎ導入プライマーＲｖ
配列番号５． Ｋ２９０Ｑ導入プライマーＦｗ
配列番号６． Ｋ２９０Ｑ導入プライマーＲｖ
配列番号７． Ｋ３１１Ｑ導入プライマーＦｗ
配列番号８． Ｋ３１１Ｑ導入プライマーＦｗ
配列番号９． Ｈ３１２Ｎ導入プライマーＦｗ
配列番号１０． Ｈ３１２Ｎ導入プライマーＲｖ
配列番号１１． Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ
配列番号１２． Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号１３． Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号１４． Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号１５． Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号１６． Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１７． Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１８． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１９． Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号２０． Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号２１． Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子
配列番号２２． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号２３． Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの遺伝子

Claims (14)

1. 配列番号１と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における
   （ａ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
   （ｂ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｃ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｄ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
   アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させることを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
2. 配列番号１４と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４における
   （ｅ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
   （ｆ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｇ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｈ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
   アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させることを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
3. アマドリアーゼが糖化ジペプチドに作用するアマドリアーゼである請求項１または請求項２記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
4. アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩である請求項３記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
5. 配列番号１と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における
   （ａ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
   （ｂ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｃ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｄ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
   アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
6. 配列番号１４と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４における
   （ｅ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
   （ｆ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｇ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｈ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
   アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
7. アマドリアーゼが糖化ジペプチドに作用するアマドリアーゼである請求項５または請求項６記載のアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
8. アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩である請求項７記載のアマドリアーゼ含有組成物の製造方法。
9. 配列番号１と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における
   （ａ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
   （ｂ）２９０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｃ）３１１位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
   （ｄ）３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
   アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。
10. 配列番号１４と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４における
    （ｅ）２８６位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンまたはヒスチジンであり、
    （ｆ）２８８位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
    （ｇ）３０９位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がリジンであり、
    （ｈ）３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである
    アマドリアーゼを含む組成物に５ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を経て得られる、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。
11. １種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩を含有する請求項９または請求項１０に記載の組成物。
12. リンゴ酸、クエン酸もしくはリン酸またはこれらの塩のいずれか１つの化合物を含有する請求項１１記載の組成物。
13. 請求項９〜請求項１２記載のアマドリアーゼ組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用試薬。
14. 請求項９〜請求項１２記載のアマドリアーゼ組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用キット。

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