JP2022119761A - アニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ - Google Patents

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Abstract

【課題】従来よりも強い界面活性剤の存在下でも、糖化ヘモグロビンを測定できる組成物を提供する。【解決手段】本発明は特定の配列番号に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼの80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されているアマドリアーゼ、並びにアニオン性界面活性剤の存在下においても活性が残存するアマドリアーゼを含む糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供する。【効果】本発明によりアニオン性界面活性剤にさらされた場合でも安定性に優れた酵素および糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供できる。【選択図】なし

Description

本発明は、界面活性剤耐性に優れたアマドリアーゼ、例えばアニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体DNAならびに界面活性剤耐性に優れたアマドリアーゼの製造法に関する。また本発明は、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得るアマドリアーゼに関する。
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース(アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体)のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリシン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン(HbA1c)が注目されている。血液中のHbA1c濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
このHbA1cを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、HbA1cをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα-フルクトシルバリルヒスチジン(以降「αFVH」と表す。)もしくはα-フルクトシルバリン(以降「αFV」と表す。)を定量する方法が提案されている(例えば、特許文献1~7参照。)。実際には、HbA1cからαFVを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、正確な測定値が得られないという課題があり、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαFVHを測る方法が主流となっている。
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ2酢酸もしくはその誘導体(「アマドリ化合物」ともいう)を酸化して、グリオキシル酸またはα-ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にHbA1cの測定に有用である、αFVHおよび/またはαFVに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている(例えば、特許文献1、6~15、非特許文献1~11参照。)。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
HbA1cを測定する際に、測定用の試薬組成物中にはアマドリアーゼが過剰に含有されていることが知られている。例えば、終濃度0.36μMのHbA1cを測定する際に、アマドリアーゼは1.4kU/L、すなわち1分間当たり1.4mMの基質を反応させることができる濃度を用いている(特許文献16参照。)。アマドリアーゼを用いたHbA1cの測定は、自動分析装置を用いた手法が主流となっており、そのアマドリアーゼの基質との反応時間は5分~25分程度で測定を行うことが多い。アマドリアーゼを過剰量で含有させる理由は、上記のような短時間の測定時間の中で基質に対し十分に反応させるためであり、また、アマドリアーゼの反応性や安定性に大きな負の影響を与え得る物質が測定用組成物中に共存する場合には、この影響への対策として、アマドリアーゼを過剰に配合せざるを得ないためである。
アマドリアーゼを用いて全血または赤血球からHbA1cを測定するための前処理方法として、界面活性剤を用いて溶血する事例が挙げられている(例えば、特許文献2、16~18参照。)。HbA1cをプロテアーゼで分解する際に、反応促進剤として界面活性剤が用いられることもある(例えば、特許文献19参照。)。したがって、アマドリアーゼを用いてHbA1cを測定するにあたり、界面活性剤は必要とされているが、界面活性剤およびプロテアーゼで処理したHbA1c溶液とアマドリアーゼ溶液を混合してからHbA1c定量反応を開始する際に、また、界面活性剤とアマドリアーゼを混合して保存した際に、界面活性剤がアマドリアーゼを変性させる可能性が極めて高い。現在のHbA1c測定用キットは、アマドリアーゼを必要量より多分に処方し、かつ、安定化剤を処方しているために正確な測定を成し得ているが、多量の試薬を用いているために高コストになることは避けられない。また、現行より効果の強い界面活性剤を使用できるならば、HbA1cのプロテアーゼ分解効率がより改善され、HbA1cの測定感度が向上する可能性が高い。さらに、界面活性剤にはヘモグロビンやHbA1c由来の不溶性ペプチド断片の可溶化効果もあるため、濁りの発生を防止し、測定精度の向上に寄与する。したがって、アマドリアーゼを糖尿病の臨床診断用酵素としてキット試薬に処方する上で要望される性質のひとつに、界面活性剤を含んだ溶液中における良好な安定性があるといえる。
実際の測定条件は個々に異なるが、公知の文献中に各種アマドリアーゼの液状における安定性に関する開示がみられる:Coniochaeta sp. NISL 9330株由来アマドリアーゼを含んだ溶液に、5mMのエチレンジアミン4酢酸および3%のグリシンを添加した際は、30℃、7日間後において79%の残存活性を維持していることが示されている(例えば、特許文献20参照。)。また、Fusarium oxysporum IFO-9972株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含んだ溶液に、3%のL-アラニン、3%のグリシンまたは3%のザルコシンを添加した際は、37℃、2日間後において100%の残存活性を維持していることが示されている(例えば、特許文献21参照)。しかしながら、上述のようなアマドリアーゼタンパク質を含んだ溶液には界面活性剤は添加されておらず、界面活性剤の影響を低減する記述は一切ない。
アマドリアーゼに変異を導入し界面活性剤耐性を向上させたことが報告されている(例えば、特許文献22参照)。特許文献22には、カチオン性界面活性剤の存在下でのアマドリアーゼの残存活性を向上する変異が記載されており、変異が蓄積されたCFP-D7はカチオン性界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリドが0.04%存在下で残存活性が100%であり、変異導入前のCFP-Dは12.7%であった。一方、0.04%のドデシル硫酸ナトリウム存在下では、CFP-Dの残存活性は、11.3%であり、CFP-D7は3.92%と、むしろ低下した。したがって、カチオン性界面活性剤耐性が向上してもアニオン性界面活性剤耐性が向上するとはいえない。またアニオン性界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する安定化剤や緩衝剤は報告されていない。
国際公開第2004/104203号 国際公開第2005/49857号 特開2001-95598号公報 特公平05-33997号公報 特開平11-127895号公報 国際公開第97/13872号 特開2011-229526号公報 特開2003-235585号公報 特開2004-275013号公報 特開2004-275063号公報 特開2010-35469号公報 特開2010-57474号公報 国際公開第2010/41715号 国際公開第2010/41419号 国際公開第2011/15325号 国際公開第2012/020744号 国際公開第2005/87946号 国際公開第2002/06519号 国際公開第2006/120976号 特開2006-325547号公報 特開2009-000128号公報 国際公開第2015/020200号
Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11, 2003 Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010 J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006 Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996 Arch.Microbiol.178,344-50,2002 Mar.Biotechnol.6,625-32,2004 Biosci. Biotechnol. Biochem.59, 487-91,1995 Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-819, 2007 Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002 Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002 Biotechnol. Letters 27, 27-32, 2005
上述のように従来、アマドリアーゼは、測定時間中に基質に対し十分に反応するよう過剰量で使用されてきた。本発明者らは、界面活性剤がアマドリアーゼの安定性に顕著に負の影響を与え得る成分であることを見いだした。よって、従来のアマドリアーゼよりも、さらに優れた界面活性剤耐性を有する酵素を作製すれば、酵素およびキットの流通における利便性向上や、キットに処方するアマドリアーゼや安定化剤の量を低減できることによる低コスト化、さらには強力な界面活性剤が処方可能になることによるHbA1cの測定感度向上等において多大に貢献することが期待される。したがって本発明が解決しようとする課題は、従来のアマドリアーゼと比較して界面活性剤耐性が優れたアマドリアーゼを提供すること、並びに界面活性剤存在下でも、HbA1cまたはそれに由来する糖化ペプチドの定量が可能な試薬組成物を提供することにある。
酵素に界面活性剤耐性を付与するための情報はほとんど開示されていない現状の中で、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼに対して、特定のアミノ酸残基の置換を導入することにより、また、界面活性存在下でも活性が残存するアマドリアーゼを試薬組成物に含有することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
[1] 以下からなる群より選択される、界面活性剤に対する耐性を有するアマドリアーゼ、
(i)ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度0.03%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)が、ドデシル硫酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して20%以上残存しており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv) 前記(iii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号94又は配列番号110のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
(v) 前記(iv)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号94又は配列番号110のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位~32位、36~41位、49~52位、54~58位、63~65位、73~75位、84~86位、88~90位、120~122位、145~150位、156~162位、164~170位、180~182位、202~205位、207~211位、214~224位、227~230位、236~241位、243~248位、258~261位、266~268位、270~273位、275~287位、295~297位、306~308位、310~316位、324~329位、332~334位、341~344位、346~355位、357~363位、370~383位、385~387位、389~394位、405~410位及び423~431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
(vi) 前記(ii)~(v)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されているアマドリアーゼ及び当該位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてドデカノイルサルコシン酸ナトリウムを終濃度0.15%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)同士の数値比較において、前記アミノ酸置換を有しないアマドリアーゼと比較して3%以上、残存活性が向上しているアマドリアーゼ。
[2]アマドリアーゼが以下からなる群、
(a) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
(b) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
(c) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンである、
(d) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
(e) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における279位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
(f) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
(g) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
(h) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
(i) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンである、
(j) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
(k) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
(l) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における3位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
(m) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
(n) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン若しくはトリプトファンである、
(o) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
(p) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
(q) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、
(r) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、並びに
(s) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
より選択される1以上を有する、1に記載のアマドリアーゼ。
[3] アマドリアーゼが、以下からなる群、
(a) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
(b) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン若しくはシステインである、
(c) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、リシン若しくはヒスチジンである、
(d) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
(e) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における279位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
(f) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはロイシンである、及び
(g) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
(h) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
(i) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン若しくはバリンである、
(j) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはメチオニンである、
(k) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
(l) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
(m) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
(n) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
(o) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
(p) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
(q) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
より選択される1以上を有する、2に記載のアマドリアーゼ。
[4] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位に対応する位置のアミノ酸及び71位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、1に記載のアマドリアーゼ。
[5]配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
4に記載のアマドリアーゼ。
[6] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
5に記載のアマドリアーゼ。
[7] さらに、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、4~6のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[8] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸である、6または7に記載のアマドリアーゼ。
[9] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、8に記載のアマドリアーゼ。
[10] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位に対応する位置のアミノ酸及び172位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、1~9のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[11] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸である、
10に記載のアマドリアーゼ。
[12] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
11に記載のアマドリアーゼ。
[13] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位に対応する位置のアミノ酸及び28位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、1~12のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[14] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
13に記載のアマドリアーゼ。
[15] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
14に記載のアマドリアーゼ。
[16] アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位に対応する位置のアミノ酸、9位に対応する位置のアミノ酸、13位に対応する位置のアミノ酸、3位に対応する位置のアミノ酸及び4位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、1~15のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[17] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンであり、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における3位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
16に記載のアマドリアーゼ。
[18] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における3位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
17に記載のアマドリアーゼ。
[19] 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、1~18のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[20] さらに、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
1~19のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[21] 界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、1~20のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[22] 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、1~21のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[23] 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号94又は配列番号110に示すアミノ酸配列を有し、1~20のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、1~21のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[24] 1~23のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼをコードするアマドリアーゼ遺伝子。
[25] 以下の工程:
(i)24に記載の遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程;
(ii)宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程;及び
(iii)培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
[26] 1~23のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。
[27] 1以上のアニオン性界面活性剤を含む、26に記載の組成物。
[28] 界面活性剤が、25℃において130mM以下の臨界ミセル濃度を有するものである、27記載の組成物。
[29] アニオン性界面活性剤が、以下からなる群、
次の一般式(I)で表される硫酸エステル化合物、
Figure 2022119761000001
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式(II)で表されるベンゼンスルホン酸塩化合物、
Figure 2022119761000002
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式(III)で表されるアシルサルコシン酸塩化合物、
Figure 2022119761000003
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式(IV)で表されるホスホン酸塩化合物、
Figure 2022119761000004
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式(V)で表されるスルホコハク酸塩化合物、
Figure 2022119761000005
[式中、R1及びR2は、それぞれ独立に、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式(VI)で表されるカルボン酸塩化合物、
Figure 2022119761000006
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
次の一般式(VII)で表されるスルホン酸塩化合物、
Figure 2022119761000007
[式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
コール酸塩、デオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩及びタウロデオキシコール酸塩、アシルグルタミン酸塩、アシルメチルアラニン塩、アシルグリシン塩、アシルメチルタウリン塩並びにこれらの誘導体、
より選択される1以上のアニオン性界面活性剤である、27又は28に記載の組成物。
[30] 1~23のいずれかに記載のアマドリアーゼを用いる、糖化ヘモグロビンの測定方法。
[31] コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムを含む、26に記載の組成物。
[32] コール酸ナトリウムを終濃度0.5~1.5%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後のアマドリアーゼの残存活性(%)が、コール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して100%以上である、又は
デオキシコール酸ナトリウムを終濃度0.3~2.0%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後のアマドリアーゼの残存活性(%)が、デオキシコール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して100%以上である、31に記載の組成物。
[33] コール酸ナトリウム及びアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物。
[34] コール酸ナトリウムを終濃度0.5~1.5%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後のアマドリアーゼの残存活性(%)が、コール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して100%以上である、33に記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-227548号の開示内容を包含する。
本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼおよびそれをコードする遺伝子等を提供することができる。このアマドリアーゼを用いると、高濃度の界面活性剤の存在下でも糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる。
図1-1は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。 図1-1の続きである。 図1-2の続きである。 図1-3の続きである。 図1-4の続きである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアマドリアーゼは糖化タンパク質や糖化ペプチドを基質としうる。
(糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c)
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
(糖化ペプチド、フルクトシルペプチド)
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する(ポリ)ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα-アミノ基、ペプチド内部のリシン残基側鎖のε-アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α-糖化ペプチド(α-フルクトシルペプチド)である。α-糖化ペプチドは、N末端のα-アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンA1c(HbA1c)である場合、該当するα-糖化ペプチドは、N末端が糖化されているHbA1cのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。146残基のアミノ酸により構成されているHbA1cのβ鎖もまたα-糖化ペプチドに該当する(αF146P)。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質(基質)は、HbA1c、より具体的にはHbA1cのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はHbA1cのβ鎖から切り出されるα-糖化ペプチド、例えばαFV~αF128P、αFV~αF64P、αFV~αF32P、αFV~αF16P、例えばαF6P(α-フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸)である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαFVH(α-フルクトシルバリルヒスチジン)又はαFV(α-フルクトシルバリン)である。本発明のアマドリアーゼは、上記の基質の1以上に作用しうる。本明細書ではこれを総称して糖化基質に対する活性、または糖化基質に対する酸化活性と呼ぶことがある。
(アマドリアーゼ)
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ2酢酸またはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸またはα-ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するConiochaeta属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号94に示されるアミノ酸配列を有するCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ(CcFX)に基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号110に示されるアミノ酸配列を有するEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ(En42FX)に基づき作製された、界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
このような変異体の例としては、配列番号1、配列番号94又は配列番号110と高い配列同一性(例えば、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上)を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および/または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。
なお、本発明のアマドリアーゼは例えば、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などのの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。これらの中でも界面活性剤耐性を有し、かつ/又はアミノ酸配列が上記のように配列番号1と高い配列同一性を有するものが好ましい。
アニオン性界面活性剤耐性が改変されたアマドリアーゼの変異体(改変体)は、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基を置換する、または付加する、または欠失させることによって得ることができる。
アニオン性界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。本明細書では、これらの位置への置換を、アマドリアーゼのアニオン性界面活性剤に対する耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
(a) 80位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、
(b) 71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換、
(c) 175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンへの置換、
(d) 172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンへの置換、
(e) 279位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン若しくはシステインへの置換、
(f) 12位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、
(g) 9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換、
(h) 77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンへの置換、
(i) 30位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、スレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンへの置換、
(j) 28位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインへの置換、
(k) 13位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、
(l) 3位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニンへの置換、
(m) 4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばプロリンへの置換、
(n) 286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばチロシン若しくはトリプトファンへの置換、
(o) 204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換、
(p) 338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換、
(q) 44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン若しくはヒスチジンへの置換、
(r) 340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン若しくはヒスチジンへの置換、並びに
(s) 194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインへの置換。
界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも1つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18又は19を有している。
その中でも、配列番号1のアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置にアミノ酸置換を有している変異体が好ましい。
71/80変異:80位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、及び71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを71/80変異(置換)と呼び、これを有する変異体を71/80変異体と呼ぶことがある。71/80変異体としては例えば71L/80R変異体、71L/K80N変異体、71A/K80R変異体、71A/K80N変異体がある。
71/77/80変異:80位のリシンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンへの置換、71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインへの置換及び77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを71/77/80変異と呼び、これを有する変異体を71/77/80変異体と呼ぶことがある。71/77/80変異体としては例えば71L/77D/80R変異体、71L/77D/K80N変異体、71A/77D/K80R変異体、71A/77D/K80N変異体がある。
172/175変異:172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばグルタミン酸若しくはアスパラギン酸への置換、及び175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを172/175変異と呼び、これを有する変異体を172/175変異体と呼ぶことがある。172/175変異体としては例えば172E/175Rがある。
28/30変異:30位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばアラニン、スレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンへの置換及び28位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30変異と呼び、これを有する変異体を28/30変異体と呼ぶことがある。28/30変異体としては、例えば28L/30A変異体がある。
3/4/9/12/13変異:12位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換、13位のバリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンへの置換、3位のセリンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばスレオニンへの置換、及び4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸の置換、例えばプロリンへの置換を有する変異体。本明細書においてこの変異の組み合わせを3/4/9/12/13変異と呼び、これを有する変異体を3/4/9/12/13変異体と呼ぶことがある。3/4/9/12/13変異体としては例えば3T/4P/9T/12I/13I変異体がある。
上記の変異の組み合わせ同士を組み合わせることもできる。例えば以下の変異体が好ましい。
28/30/172/175変異:上記の28/30変異及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30/172/175変異と呼び、これを有する変異体を28/30/172/175変異体と呼ぶことがある。28/30/172/175変異体としては、例えば28L/30A/172E/175R変異体がある。
28/30/71/80変異:上記の28/30変異及び71/80変異の組み合わせである。これを有する変異体を28/30/71/80変異体と呼ぶことがある。28/30/71/80変異体としては、例えば28L/30A/71L/80R変異体、28L/30A/71L/K80N変異体、28L/30A/71A/K80R変異体、28L/30A/71A/K80N変異体がある。
28/30/71/77/80変異:上記の28/30変異及び71/77/80変異の組み合わせである。これを有する変異体を28/30/71/77/80変異体と呼ぶことがある。28/30/71/77/80変異体としては、例えば28L/30A/71L/77D/80R変異体、28L/30A/71L/77D/K80N変異体、28L/30A/71A/77D/K80R変異体、28L/30A/71A/77D/K80N変異体がある。
71/80/172/175変異:上記の71/80変異及び172/175変異の組み合わせである。これを有する変異体を71/80/172/175変異体と呼ぶことがある。71/80/172/175変異体としては、例えば71L/80R/172E/175R変異体、71L/K80N/172E/175R変異体、71A/K80R/172E/175R変異体、71A/K80N/172E/175R変異体がある。
71/77/80/172/175変異:上記の71/77/80変異及び/172/175変異の組み合わせである。これを有する変異体を71/77/80/172/175変異体と呼ぶことがある。71/77/80/172/175変異体としては、例えば71L/77D/80R/172E/175R変異体、71L/77D/K80N/172E/175R変異体、71A/77D/K80R/172E/175R変異体、71A/77D/K80N/172E/175R変異体がある。
28/30/71/80/172/175変異:上記の28/30変異、71/80変異、及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30/71/80/172/175変異と呼び、これを有する変異体を28/30/71/80/172/175変異体と呼ぶことがある。28/30/71/80/172/175変異体としては、例えば28L/30A/71L/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71L/80N/172E/175R変異体、28L/30A/71A/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71A/80N/172E/175R変異体がある。
28/30/71/77/80/172/175変異:上記の28/30変異、71/77/80変異、及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを28/30/71/77/80/172/175変異と呼び、これを有する変異体を28/30/71/77/80/172/175変異体と呼ぶことがある。28/30/71/77/80/172/175変異体としては、例えば28L/30A/71L/77D/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71L/77D/80N/172E/175R変異体、28L/30A/71A/77D/80R/172E/175R変異体、28L/30A/71A/77D/80N/172E/175R変異体がある。
3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異:上記の3/4/9/12/13変異、28/30変異、71/77/80変異、及び172/175変異の組み合わせである。本明細書においてこの変異の組み合わせを3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異と呼び、これを有する変異体を3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異体と呼ぶことがある。3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175変異体しては、例えば3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80R/172E/175R変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80N/172E/175R変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80R/172E/175R変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80N/172E/175R変異体がある。
3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175/286変異:上記の3/4/9/12/13変異、28/30変異、71/77/80変異、172/175変異及び286変異の組み合わせである。これを有する変異体を3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175/286変異体と呼ぶことがある。3/4/9/12/13/28/30/71/77/80/172/175/286変異体しては、例えば3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80R/172E/175R/286Y変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71L/77D/80N/172E/175R/286Y変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80R/172E/175R/286Y変異体、3T/4P/9T/12I/13I/28L/30A/71A/77D/80N/172E/175R/286Y変異体がある。
本発明の界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼ変異体は、配列番号1、配列番号94、又は配列番号110に示すアミノ酸配列において、上記の界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換を有し得る。さらに、本発明の界面活性剤耐性アマドリアーゼ変異体は、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに1または数個(例えば1~15個、例えば1~10個、好ましくは1~5個、さらに好ましくは1~3個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、挿入、付加および/または置換されていてもよい。さらに本発明は、上記の界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換変異、基質特異性等、界面活性剤耐性以外の性質を向上させるアミノ酸の置換変異を有し、配列番号1または3、又は配列番号94又は配列番号110に示すアミノ酸配列における前記置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上のアミノ酸配列同一性を有し、アマドリアーゼ活性を有し、界面活性剤耐性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
なお、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開2007/125779号においてpKK223-3-CFP-T7と称する組換え体プラスミド(寄託番号:FERM BP-10593)を保持する大腸菌が生産するConiochaeta属由来のアマドリアーゼ(CFP-T7)であり、先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである。このCFP-T7は、天然型のConiochaeta属由来のアマドリアーゼに対し、272位、302位および388位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した3重変異体である。
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号1に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
(さらなる置換)
(アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換について)
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその基質特異性を変化させることができることを以前に報告した(例えば国際公開2013/162035号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸の置換として配列番号1のアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグルタミン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアラニン
場合により62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン、プロリンへと置換されてもよい。場合により(b)63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジン又はアラニンへと置換されてもよい。場合により(c)102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸は、リシンへと置換されてもよい。場合により(d)106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、リシン、又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により(e)110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はロイシン又はチロシンへと置換されてもよい。場合により(f)113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリシン又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により(g)355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換されてもよい。場合により(h)419位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリシンへと置換されてもよい。場合により(i)68位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により(j)356位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はスレオニンへと置換されてもよい。
本明細書では、これらの位置(62/63/68/102/106/110/113/355/419/356)への置換をアマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
(アマドリアーゼのカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換について)
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのカチオン性界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している(特願2013-221515号及びPCT/JP2014/071036号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書参照、これらは参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする)。
アマドリアーゼのカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
(i)262位のアスパラギン、
(ii)257位のバリン、
(iii)249位のグルタミン酸
(iv)253位のグルタミン酸、
(v)337位のグルタミン、
(vi)340位のグルタミン酸、
(vii)232位のアスパラギン酸、
(viii)129位のアスパラギン酸、
(ix)132位のアスパラギン酸、
(x)133位のグルタミン酸、
(xi)44位のグルタミン酸、
(xii)256位のグリシン、
(xiii)231位のグルタミン酸、及び
(xiv)81位のグルタミン酸
場合により262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸はヒスチジンへと置換されてもよい。場合により257位のバリンに対応する位置のアミノ酸はシステイン、セリン、スレオニンへと置換されてもよい。場合により249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。場合により232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアラニン、メチオニン、リシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。場合により256位のグリシンに対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により231位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。場合により81位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリシン、アルギニンへと置換されてもよい。
本明細書では、これらの位置(262/257/249/253/337/340/232/129/132/133/44/256/231/81)への置換をアマドリアーゼのカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。特に、44位をプロリンとする変異及び340位をプロリンとする変異はカチオン性界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換である。
(アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上/オキシダーゼ活性の低減をもたらす置換)
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりそのデヒドロゲナーゼ活性を向上及び/又はオキシダーゼ活性を低減させることができることを確認している。例えば特願2014-217405号明細書を参照のこと(参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする)。
アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上及び/又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
(1)280位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、スレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
(2)267位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
(3)269位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシンへの置換。
(4)54位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
(5)241位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
本明細書においてこれらの位置(280/267/269/54/241)への置換をアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上及び/又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換と呼ぶことがある。
(アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸欠失又はアミノ酸置換について)
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、3アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した(国際公開第2013/100006号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。本明細書においてカルボキシル末端からの3アミノ酸残基の欠失を、熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。
また本発明者らは以前に、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを確認している(国際公開第2013/100006号パンフレット参照)。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにアマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸置換を有しうる。
アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号1のアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
(b)151位のアラニン;
(c)43位のフェニルアラニン;
(d)53位のヒスチジン;
(e)267位のフェニルアラニン;
(f)350位のスレオニン;
(g)185位のアラニン;
(h)196位のグルタミン酸;
(i)299位のセリン;
(j)323位のバリン
場合により151位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はシステインに置換されてもよい。場合により43位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸はチロシンに置換されてもよい。場合により53位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸はアスパラギン、チロシンに置換されてもよい。場合により267位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸はチロシンに置換されてもよい。場合により350位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸はアラニンに置換されてもよい。場合により185位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンに置換されてもよい。場合により196位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギン酸に置換されてもよい。場合により299位のセリンに対応する位置のアミノ酸はスレオニンに置換されてもよい。場合により323位のバリンに対応する位置のアミノ酸はグルタミン酸に置換されてもよい。
本明細書においてこれらの位置(151/43/53/267/350/185/196/299/323)への置換をアマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
(アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得)
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブDNAを合成して、これを用いて染色体DNAまたはcDNAのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、5’RACE法や3’RACE法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ遺伝子(特開2003-235585号公報)の例などが挙げられる。
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするDNAがpKK223-3 Vector(GEヘルスケア社製)に挿入された組換え体プラスミドpKK223-3-CFP(特開2003-235585号公報)が挙げられる。
(ベクター)
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(STRATAGENE社製)等が好ましい。
(アマドリアーゼ遺伝子の変異処理)
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または5-ブロモウラシル等を挙げることができる。
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.5~12Mの上記薬剤濃度において、20~80℃の反応温度下で10分間以上、好ましくは10~180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる(現代化学、p24~30、1989年6月号)。
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法(Nucleic Acids Res.,12,9441(1984):Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985):Methods Enzymol.,154,367(1987))等が挙げられる。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の利用が挙げられる。
また、一般的なPCR法(ポリメラーゼチェインリアクション、Polymerase Chain Reaction)として知られる手法を用いることもできる(Technique,1,11(1989))。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のDNA塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000(ベックマン・コールター社製)等を用いることにより行うことができる。
(形質転換・形質導入)
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体DNAを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌K-12株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株(ともにタカラバイオ社製)や大腸菌B株、好ましくは大腸菌BL21株(ニッポンジーン社製)等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
(アミノ酸配列の同一性又は類似性)
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11(ゼネティックス社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該2以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
また、2以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域(保存領域、保存性領域)を決定できる。
本明細書において「相同性領域」とは、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上又は10以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図1では全長アミノ酸配列の配列同一性が74%以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号1で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第10位~32位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号1で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として36~41位、49~52位、54~58位、63~65位、73~75位、84~86位、88~90位、120~122位、145~150位、156~162位、164~170位、180~182位、202~205位、207~211位、214~224位、227~230位、236~241位、243~248位、258~261位、266~268位、270~273位、275~287位、295~297位、306~308位、310~316位、324~329位、332~334位、341~344位、346~355位、357~363位、370~383位、385~387位、389~394位、405~410位及び423~431位は相同性領域に該当しうる。
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号1で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第11位~32位、36~41位、50~52位、54~58位、84~86位、88~90位、145~150位、157~168位、202~205位、207~212位、215~225位、236~248位、258~261位、266~268位、270~273位、275~287位、347~354位、357~363位、370~383位、385~387位、及び405~410位のアミノ酸配列からなる領域である。
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号1で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第11~18位、20~32位、50~52位、54~58位、266~268位、270~273位、277~286位、及び370~383位のアミノ酸配列からなる領域である。
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号1、配列番号94又は配列番号110に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに50%以上、例えば60%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、アニオン性界面活性剤に対する耐性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号1における相同性領域のアミノ酸配列と75%以上、例えば80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の配列同一性を有する。図1では全長アミノ酸配列の配列同一性が74%以上であるアマドリアーゼをアライメントしたが、このうち、配列番号1で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として比較すると図1に示す他のアマドリアーゼとの相同性領域におけるアミノ酸配列同一性は90%以上である。
(アミノ酸に対応する位置の特定)
「アミノ酸に対応する位置(相当する位置)」とは、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン-パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
図1に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号1で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図1に示される各種配列は、いずれも配列番号1の配列と70%以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。図1からConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図1には、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ(配列番号1)、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ(配列番号3)、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号4)、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号5)、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号6)、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ(配列番号7)、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号8)、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ(配列番号9)、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号10)、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ(配列番号11)、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号12)およびPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(配列番号13)のアミノ酸配列を示してある。
(置換箇所に対応する位置)
(本発明のアニオン性界面活性剤耐性向上変異の対応位置)
なお、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の80位のリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの80位のリシンに対応する位置を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基(相当する位置のアミノ酸残基)」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは80位のグルタミン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは80位のアルギニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは80位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは80位のアルギニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは80位のアルギニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは80位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは80位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは79位のリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは79位のリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは80位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは80位のリシンである。
また、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの71位のメチオニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは71位のロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは70位のロイシンである。
さらに、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の175位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの175位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは175位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは175位のリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは175位のアルギニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは175位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは175位のアルギニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは175位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは173位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは174位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは174位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは175位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは175位のセリンである。
さらに、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の172位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの172位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは172位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは172位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは172位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは172位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは172位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは172位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは170位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは171位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは171位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは172位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは172位のフェニルアラニンである。
さらに、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の279位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの279位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは279位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは277位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは279位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは277位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは279位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは279位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは275位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは279位のバリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは279位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは277位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは279位のバリンである。
さらに、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の12位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの12位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは12位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは12位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは12位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは12位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは12位のイソロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは12位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは12位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは11位のバリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは11位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは12位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは12位のイソロイシンである。
なお、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の9位のアルギニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの9位のアルギニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは9位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは9位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは9位のリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは9位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは9位のスレオニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは9位のリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは9位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは8位のリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは8位のリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは9位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは9位のリシンである。
さらに、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の77位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの77位のグルタミンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは77位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは77位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは77位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは77位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは77位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは77位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは77位のグルタミン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは76位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは76位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは77位のグルタミン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは77位のアスパラギン酸である。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の30位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の30位のセリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは30位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは30位のセリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは30位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは30位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは30位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは30位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは30位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは29位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは29位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは30位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは30位のセリンである。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の28位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の28位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは28位のイソロイシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは28位のロイシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは28位のロイシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは28位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは28位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは28位のロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは28位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは27位のロイシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは27位のロイシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは28位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは28位のイソロイシンである。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の3位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの3位のセリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは3位のヒスチジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは3位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは3位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは3位のプロリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは3位のスレオニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは3位のプロリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは3位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは3位のプロリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは3位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは3位のプロリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは3位のヒスチジンである。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の4位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの4位のアスパラギンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは4位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは4位のセリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは4位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは4位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは4位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは4位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは4位のセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは4位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは4位のセリンである。なお、図1より、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは、配列番号1のアマドリアーゼの4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸が欠失している。しかしながら、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼにおいて、配列番号1のアマドリアーゼの4位のアスパラギンに対応する位置(欠失位置)にアミノ酸を挿入することは可能である。本明細書では便宜上、配列番号1のアマドリアーゼの4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸が欠失している場合、当該欠失位置へのアミノ酸の挿入も、配列番号1のアマドリアーゼの4位のアスパラギンに対応する位置へのアミノ酸置換に含めるものとする。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の13位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの13位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは13位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは13位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは13位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは13位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは13位のイソロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは13位のイソロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは13位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは12位のバリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは12位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは13位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは13位のバリンである。
さらに、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の286位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの286位に対応する位置を意味する。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは286位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは284位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは286位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは284位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは286位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは286位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは282位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは286位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは286位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは284位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは286位のフェニルアラニンである。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の204位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの204位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは204位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは202位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは204位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは202位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは204位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは204位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは200位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは204位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは204位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは202位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは204位のグルタミン酸である。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の338位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの338位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは338位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは336位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは339位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは336位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは338位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは338位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは334位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは338位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは338位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは336位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは338位のアスパラギン酸である。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の44位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの44位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは44位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは44位のプロリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは44位のプロリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは44位のプロリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは44位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは44位のロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは44位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは43位のプロリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは43位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは44位のプロリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは44位のプロリンである。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の340位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの340位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは340位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは338位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは341位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは338位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは340位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは340位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは336位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは340位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは340位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは338位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは340位のグルタミン酸である。
さらに本発明において「配列番号1記載のアミノ酸配列の194位に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの194位に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは194位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは194位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは194位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは194位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは194位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは194位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは192位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは193位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは193位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは194位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは194位のアラニンである。
(デヒドロゲナーゼ活性向上/オキシダーゼ活性低減変異の対応位置)
なお、本明細書において「配列番号1記載のアミノ酸配列の280位のシステインに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの280位のシステインに対応する位置を意味するものである。これは上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは280位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは278位のシステイン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは280位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは278位のシステイン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは280位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは280位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは276位のシステイン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは280位のシステイン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは280位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは278位のシステイン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは280位のシステインである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の267位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの267位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは267位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは265位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは265位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは263位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは265位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは267位のフェニルアラニンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の269位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の269位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは269位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは269位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは269位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは269位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは265位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは269位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは269位のイソロイシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは267位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは269位のフェニルアラニンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の54位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の54位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは54位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは53位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは53位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは54位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは54位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の241位のチロシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの241位のチロシンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは241位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは239位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは241位のチロシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは239位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは241位のチロシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは241位のチロシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは237位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは241位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは241位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは239位のチロシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは241位のフェニルアラニンである。
(基質特異性改変変異の対応位置)
本明細書において「配列番号1記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの62位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これは上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは62位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは62位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは61位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは61位のアルギニンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の63位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの63位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の63位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは63位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは63位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは62位のロイシンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の102位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの102位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の102位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは102位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは102位のリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは101位のグルタミン酸である。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の106位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの106位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の106位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは106位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは106位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは106位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは106位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは106位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは105位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは105位のグリシンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の110位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの110位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の110位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは110位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは110位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは110位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは110位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは110位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは110位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは109位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、109位のリシンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の113位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの113位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の113位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは113位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは113位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは113位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは112位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは113位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の355位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの355位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の355位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは355位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは353位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは356位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは355位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは351位のアラニンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の419位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの419位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の419位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは419位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは418位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは421位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは420位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは416位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは419位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは420位のアラニンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の68位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの68位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の68位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは68位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは67位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の356位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの356位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、「配列番号1記載のアミノ酸配列の356位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは356位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは354位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは357位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは354位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは356位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは356位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは352位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは356位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは356位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは354位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは356位のアスパラギンである。
(カチオン性界面活性剤耐性向上変異の対応位置)
「配列番号1記載のアミノ酸配列の44位のグルタミン酸に対応する位置」は、上記に説明したとおりである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の81位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの81位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは81位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは81位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは81位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは81位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは81位のアスパラギン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは81位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは81位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは80位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは80位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは81位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは81位のアスパラギンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の133位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の133位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは133位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは133位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは133位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは133位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは133位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは133位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは131位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは132位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは132位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは133位のリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは133位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の253位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の253位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは253位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは251位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは253位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは251位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは253位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは253位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは249位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは253位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは253位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは251位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは253位のグルタミンである。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の256位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの256位のグリシンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは256位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは254位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは256位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは254位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは256位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは256位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは252位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは256位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは256位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは254位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは256位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の257位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの257位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは257位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは255位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは257位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは255位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは257位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは257位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは253位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは257位のスレオニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは257位のスレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは255位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは257位のバリンである。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の262位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの262位のアスパラギンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは262位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは260位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは262位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは260位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは262位のヒスチジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは262位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは258位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは262位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは262位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは260位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは262位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の337位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの337位のグルタミンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは337位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは335位のリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは338位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは335位のスレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは337位のリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは337位のリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは333位のリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは337位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは337位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは335位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは337位のリシンである。
「配列番号1記載のアミノ酸配列の340位のグルタミン酸に対応する位置」は、上記に説明したとおりである。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の129位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの129位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは129位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは129位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは129位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは129位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは129位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは129位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは127位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは128位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは128位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは129位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは129位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の132位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの132位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは132位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは132位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは132位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは132位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは132位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは132位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは130位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは131位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは131位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは132位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは132位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の231位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの231位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは231位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは229位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは231位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは229位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは231位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは231位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは227位のヒスチジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは231位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは231位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは229位のグルタミン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは231位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の232位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの232位のアスパラギン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは232位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは230位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは232位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは230位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは232位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは232位のグリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは228位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは232位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは232位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは230位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは232位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の249位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの249位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは249位のリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは247位のリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは249位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは247位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは249位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは249位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは245位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは249位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは249位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは247位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは249位のグルタミンである。
(熱安定性向上欠失及び熱安定性向上アミノ酸置換の対応位置)
本明細書において「配列番号1記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの3アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を意味する。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の3残基の配列は、435位のプロリン、436位のリシン及び437位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が435位のアラニン、436位のヒスチジン及び437位のロイシンからなり、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が438位のアラニン、439位のリシン及び440位のロイシンからなり、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が450位のヒスチジン、451位のリシン及び452位のロイシンからなり、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が438位のセリン、439位のリシン及び440位のロイシンからなり、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が435位のアラニン、436位のアスパラギン及び437位のロイシンからなり、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が436位のアラニン、437位のリシン及び438位のメチオニンからなり、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が436位のアラニン、437位のリシン及び438位のメチオニンからなり、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が439位のアラニン、440位のリシン及び441位のロイシンからなり、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の3アミノ酸が435位のアラニン、436位のリシン及び437位のロイシンからなる。
さらに「配列番号1記載のアミノ酸配列の43位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの43位のフェニルアラニンに対応する位置を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1により特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは43位のチロシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは43位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは43位のチロシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは43位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは43位のチロシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは43位のチロシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは43位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは42位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは43位のチロシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは43位のチロシンである。
また、「配列番号1記載のアマドリアーゼの53位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の53位のヒスチジンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは53位のヒスチジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは53位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは53位のアスパラギン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは53位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは53位のアスパラギン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは53位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは53位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは52位のチロシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは53位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは53位のチロシンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の151位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの151位のアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは151位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは151位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは151位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは151位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは151位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは151位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは149位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは150位のグリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは151位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは151位のグリシンである。
また、「配列番号1記載のアマドリアーゼの185位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の185位のアラニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは185位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは185位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは185位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは185位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは185位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは185位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは183位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは184位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは185位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは185位のアラニンである。
また、「配列番号1記載のアマドリアーゼの196位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列の196位のグルタミン酸に対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは196位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは196位のグリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは196位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは196位のグリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは196位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは196位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは194位のグリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは195位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは196位のグリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは196位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号1記載のアミノ酸配列の299位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの299位のセリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは299位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは297位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは300位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは297位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは299位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは299位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは295位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは299位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは297位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは299位のセリンである。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の323位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの323位のバリンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは323位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは321位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは324位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは321位のリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは323位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは323位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは319位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは323位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは321位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは323位のグルタミン酸である。
また、「配列番号1記載のアミノ酸配列の350位のスレオニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの350位のスレオニンに対応する位置を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは350位のスレオニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは348位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは351位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは348位のスレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは350位のスレオニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは350位のスレオニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは346位のスレオニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは350位のスレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは348位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは350位のスレオニンである。
(復帰変異について)
本明細書では便宜上、配列番号1のアミノ酸配列を基準として、ある位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を説明した。しかしながら、天然のアマドリアーゼの中には、配列番号1のアミノ酸配列とアライメントしたときに、あるアミノ酸の位置に対応する位置に、本発明のアミノ酸置換に相当するアミノ酸を既に有するものがある。例えば配列番号1の80位のアミノ酸はリシンであり、これをアルギニンに置換することは本発明の変異に該当する。ところがPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、配列番号1の80位に対応する位置のアミノ酸は既にアルギニンである。このようなアマドリアーゼに関し、配列番号1の80位に対応する当該位置のアルギニンのリシンへの置換は、配列番号1から見ると一種の復帰変異に相当し、特定の実施形態では、これは本発明のアミノ酸置換に包含されない。逆にこのようなアマドリアーゼに関し、配列番号1の80位に対応する当該位置のアミノ酸がアルギニンであることは、配列番号1から見ればリシンがアルギニンとなった、すなわちアルギニンに置換されたものと同等である。したがってある実施形態において、天然のアマドリアーゼとしてPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのような、配列番号1のアミノ酸配列の80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンであるアマドリアーゼも、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに配列番号1の80位のリシンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
このような本発明の界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換に包含されるアミノ酸を以下に例示する。
配列番号1のアミノ酸配列の3位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではスレオニンである。ある実施形態においてこれを配列番号1の3位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のセリンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の4位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではプロリンである。ある実施形態においてこれを配列番号1の4位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の9位に対応する位置のアミノ酸はPyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではスレオニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではセリンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の9位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のアルギニンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の12位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ及びPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではイソロイシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の12位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のバリンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の13位に対応する位置のアミノ酸はNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、及びCryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではイソロイシンである。ある実施形態においてこれを配列番号1の13位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のバリンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の28位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではイソロイシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではロイシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではロイシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではロイシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではロイシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではイソロイシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の28位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のバリンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の30位に対応する位置のアミノ酸は、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではアラニンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の30位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のセリンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の44位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではリシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の44位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の71位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではロイシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の71位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のメチオニンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の77位に対応する位置のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアスパラギン酸である。ある実施形態においてこれらを配列番号1の77位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のグルタミンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の80位に対応する位置のアミノ酸は、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、及びCryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではアルギニンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の80位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のリシンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の172位に対応する位置のアミノ酸は、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ及びNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではグルタミン酸である。ある実施形態においてこれらを配列番号1の172位に対応する位置のアミノ酸置換に含めるものとする。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の175位に対応する位置のアミノ酸は、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではアルギニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではアルギニンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の175位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、これらの位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を含まない。
配列番号1のアミノ酸配列の340位に対応する位置のアミノ酸は、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼではリシンである。ある実施形態においてこれらを配列番号1の340位に対応する位置のアミノ酸置換に含める。ある実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、この位置のアミノ酸のグルタミン酸への置換を含まない。
(本発明のアマドリアーゼの生産)
上記のようにして得られた界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の1種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第2鉄、硫酸第2鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発pHは、pH7~9に調整するのが適当である。
また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、20~42℃の培養温度、好ましくは30℃前後の培養温度で4~24時間、さらに好ましくは30℃前後の培養温度で8~16時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法;イオン交換体を用いる吸着溶出法;ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法;ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法;蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法;アフィニティクロマトグラフィー法;分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の基質特異性が改善されたアマドリアーゼを得ることができる。
(本発明における界面活性剤)
本発明における界面活性剤としては、本発明のHbA1cの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられるが、特にカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤が好ましい。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は1以上の界面活性剤を包含するものとする。
本発明における界面活性剤は、臨界ミセル濃度(CMC)が25℃において、130mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、20mM以下、10mM以下、9mM以下、8mM以下、7mM以下、6mM以下、5mM以下、4.5mM以下、4mM以下、3.5mM以下、3mM以下、2.5mM以下、2mM以下、1.5mM以下又は1mM以下のものであり得る。ある実施形態において本発明の界面活性剤の臨界ミセル濃度は25℃において、0.1mM又は0.01mM以上であり得る。好ましくは、臨界ミセル濃度は50mM以下であり、より好ましくは20mM以下であり、最も好ましくは10mM以下である。臨界ミセル濃度とは界面活性剤が溶液中でミセルを形成する臨界濃度であり、これよりも低濃度ではミセルは形成されない。一般に臨界ミセル濃度が低い方が、低濃度の界面活性剤でもミセル形成し、界面活性剤としての作用は強くなる傾向がある。当業者であれば、慣用の手法により所望の界面活性剤の臨界ミセル濃度を決定することができる。例えば界面活性剤と相互作用する蛍光試薬の蛍光変化を利用して、界面活性剤の臨界ミセル濃度を測定する市販のキット等を用いることができる(例えばPFP社のDetergent Critical Micelle Concentration(CMC) Assay Kit等)。
例えば、オクチル硫酸ナトリウムのCMCは130mMであり(BULL.CHEM.SOC.JAPAN,38,1700(1965)参照)、デシル硫酸ナトリウムのCMCは30mMであり(J.COLLOID.DCI,16,484(1961)参照)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のCMCは8.3mMであり(Hampton Research社カタログデータ参照)、テトラデシル硫酸ナトリウムのCMCは2mMであり(J.COLLOID.DCI,16,484(1961)参照)、ヘキサデシル硫酸ナトリウムのCMCは0.5mMであり(J.COLLOID.DCI,16,484(1961)参照)、オクタデシル硫酸ナトリウムのCMCは0.6mMである(界面活性剤便覧,産業図書株式会社版(1960)参照)。ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム(SDDS)のCMCは14.4mMである(Hampton Research社カタログデータ参照)。4-オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウムのCMCは10.6mMであり、4-デシルベンゼンスルホン酸ナトリウムのCMCは3.7mMであり、4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムのCMCは1.2mMである(界面活性剤便覧,産業図書株式会社版(1960)参照)。カプリル酸カリウムのCMCは390mMであり、カプリン酸カリウムのCMCは98mMであり、ラウリン酸カリウムのCMCは25.5mMであり、ミリスチン酸カリウムのCMCは6.6mMであり、パルミチン酸カリウムのCMCは1.8mMであり、ステアリン酸カリウムのCMCは0.45mMである(界面活性剤便覧,産業図書株式会社版(1960)参照)。コール酸ナトリウムのCMCは14mMである(日本化学雑誌,90(5),463-466(1969)参照)。デオキシコール酸ナトリウムのCMCは4.8mMである(オレオサイエンス,1(12),1127-1132(2001) 参照)。臨界ミセル濃度は適宜%(w/v)に換算することができる。例えば1.04mMのSDSは、0.03%に相当する。
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
(アニオン性界面活性剤)
アニオン性界面活性剤は、その親水性頭部において、カルボン酸、スルホン酸、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩などのアニオン性官能基を有する界面活性剤である。対となるカチオンとしては、ナトリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、銀、銅、ニッケル、亜鉛、カリウム等のカチオンが挙げられる。スルホン酸系界面活性剤の例としては直鎖若しくは分岐鎖のアルキル硫酸エステル塩、環状のアルキル硫酸エステル塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルキルスルホン酸塩、環状のアルキルスルホン酸塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルケニルスルホン酸塩、環状ののアルケニルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリーレンスルホン酸塩、直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキルベンゼンスルホン酸塩、直鎖若しくは分岐鎖のアルケニルベンゼンスルホン酸塩、アリール若しくはアリーレンにより修飾されたベンゼンスルホン酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩が挙げられ、カルボン酸を有する界面活性剤の例としては脂肪酸塩やコール酸塩、アルキルアミノ酸塩が挙げられ、リン酸系界面活性剤としてはモノアルキルリン酸エステル塩、アルキルホスホン酸エステル塩が挙げられる。またアニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α-スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩なども挙げられる。さらに、こうした界面活性剤の誘導体、例えばフッ素置換誘導体等も包含される。アルキル基やアルケニル基は直鎖又は分岐鎖であってもよく、環状であってもよく、これらやアリール基、アリーレン基はさらに置換されていてもよく、又は非置換でありうる。置換は、一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C6アルコキシ基により行うことができる。
硫酸エステル塩化合物は次の一般式(I)で表される。
Figure 2022119761000008
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキル硫酸エステル塩としては、オクチル硫酸エステル塩、例えばオクチル硫酸ナトリウム、デシル硫酸エステル塩、例えばデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸エステル塩、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、テトラデシル硫酸エステル塩、例えばテトラデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸エステル塩、例えばヘキサデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸エステル塩、例えばオクタデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。
ベンゼンスルホン酸塩化合物は次の一般式(II)で表される。
Figure 2022119761000009
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、4-オクチルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-デシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-デシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-ドデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-テトラデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-テトラデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-ヘキサデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-ヘキサデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、4-オクタデシルベンゼンスルホン酸塩、例えば4-オクタデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。
アシルサルコシン酸塩化合物は次の一般式で表される。
Figure 2022119761000010
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アシルサルコシン酸塩としては、オクトイルサルコシン酸塩、例えばオクトイルサルコシン酸ナトリウム、ドデカノイルサルコシン酸塩、例えばドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、デカノイルサルコシン酸塩、例えばデカノイルサルコシン酸ナトリウムが挙げられる。
ホスホン酸エステル塩化合物は次の一般式(IV)で表される。
Figure 2022119761000011
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルホスホン酸エステル塩としては、オクチルホスホン酸エステル塩、例えばオクチルホスホン酸ナトリウム、デシルホスホン酸エステル塩、例えばデシルホスホン酸ナトリウム、ドデシルホスホン酸エステル塩、例えばドデシルホスホン酸ナトリウム、テトラデシルホスホン酸エステル塩、例えばテトラデシルホスホン酸ナトリウム、ヘキサデシルホスホン酸エステル塩、例えばヘキサデシルホスホン酸ナトリウム、オクタデシルホスホン酸エステル塩、例えばオクタデシルホスホン酸ナトリウムが挙げられる。
スルホコハク酸塩化合物は次の一般式で表される。
Figure 2022119761000012
[式中、Z+は対イオンであり、R1及びR2は、それぞれ独立に、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルスルホコハク酸塩としては、スルホコハク酸ジオクチル塩、例えばスルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホコハク酸ジ(2-エチルヘキシル)塩、例えばスルホコハク酸ジ(2-エチルヘキシル)ナトリウム、スルホコハク酸ジオクタデシル塩、例えばスルホコハク酸ジオクタデシルナトリウムが挙げられる。
カルボン酸塩化合物は次の一般式で表される。
Figure 2022119761000013
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]。
カルボン酸塩としては、C1~C20アルキルを有する脂肪酸塩が挙げらる。脂肪酸塩としては、例えばオクタン酸塩、例えばオクタン酸ナトリウム、ノナン酸塩、デカン酸塩、例えばデカン酸ナトリウム、ラウリン酸塩、例えばラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸塩、例えばミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸塩、例えばパルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸塩、例えばステアリン酸ナトリウムなどが挙げられる。さらに、カルボン酸塩誘導体も包含し、カルボン酸誘導体としてフッ素置換された誘導体、例えばペルフルオロオクタン酸塩、例えばペルフルオロオクタン酸ナトリウム、ペルフルオロノナン酸塩、例えばペルフルオロノナン酸ナトリウム等や、ココイルグルタミン酸塩、例えばココイルグルタミン酸ナトリウム[HOOCCH2CH2CH(NHCOR)COONa、式中RはC11~C17]等が挙げられる。
スルホン酸塩化合物は次の一般式で表される。
Figure 2022119761000014
[式中、Z+は対イオンであり、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC1~C20アルキル、C3~C20環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレン、例えば直鎖若しくは分岐鎖のC8~C18アルキル、C3~C18環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C18アルケニル、C3~C18環状アルケニル、C6~C18アリール、C7~C18アリーレンでありうる。これらは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
アルキルスルホン酸塩としては、オクチルスルホン酸塩、例えばオクチルスルホン酸ナトリウム、デシルスルホン酸塩、例えばデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸塩、例えばドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸塩、例えばテトラデシルスルホン酸ナトリウム、ヘキサデシルスルホン酸塩、例えばヘキサデシルスルホン酸ナトリウム、オクタデシルスルホン酸塩、例えばオクタデシルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。
また、置換基を含むスルホン酸塩として、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩、例えばアルファスルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム[CH3(CH2)nCH(SO3Na)COOCH3)、式中nは8~18]が挙げられる。
また、置換基を含むスルホン酸塩として、アシルイセチオン酸塩が挙げられる(R1CO-O-CH2-CH2-SO3 -:Z+、式中、Z+は対イオンであり、R1はC1-C30、例えばC1-C11アルキルでありうる)。例えば、ステアロイルイセチオン酸ナトリウム、パルミトイルイセチオン酸ナトリウム、ミリストイルイセチオン酸ナトリウム、ココイルイセチオン酸ナトリウム、ラウロイルイセチオン酸ナトリウム、カプロイルイセチオン酸ナトリウム、オクタノイルイセチオン酸ナトリウム等が挙げられる。
コール酸塩としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、例えばデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸塩、例えばグリココール酸ナトリウム、タウロコール酸塩、例えばタウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸塩、例えばタウロデオキシコール酸ナトリウムが挙げられるがこれに限らない。
さらに、アミノ酸を基盤とした界面活性剤として、アシルグルタミン酸塩、アシルメチルアラニン塩、アシルグリシン塩、アシルメチルタウリン塩が挙げられる。ここでのアシル基(R1CO-)は、R1が置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1-C30アルキル又は環状のC2-C30アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、C7~C30アリーレンでありうる。これらのR1は場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基により置換されていてもよい。例えば、ステアロイルグルタミン酸ナトリウム、パルミトイルグルタミン酸ナトリウム、ミリストイルグルタミン酸ナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム, ラウロイルグルタミン酸ナトリウム, カプロイルグルタミン酸ナトリウム、パルミトイルメチルタウリンナトリウム、ミリストイルメチルタウリンナトリウム、ココイルメチルタウリンナトリウム, カプロイルメチルタウリンナトリウム、ココイルメチルタウリンカリウム, ココイルメチルタウリンマグネシウム, ラウロイルメチルタウリンナトリウム, ステアロイルメチルタウリンナトリウム, ミリストイルメチルタウリンナトリウム,パルミトイルメチルアラニンナトリウム、ミリストイルメチルアラニンナトリウム、ココイルメチルアラニンナトリウム, ラウロイルメチルアラニンナトリウム,カプロイルメチルアラニンナトリウム、パルミトイルグリシンナトリウム、ミリストイルグリシンナトリウム、ココイルグリシンナトリウム, ラウロイルグリシンナトリウム、カプロイルグリシンナトリウム、ココイルグリシンカリウムが挙げられるが、これに限らない。上記には対イオンの種類の異なる均等物も包含される。
また、アニオン性界面活性剤として、上記に記載されている化合物の誘導体も挙げられる。例えば化合物中の水素をフッ素に置換した誘導体、アミノ酸を構造中に含む誘導体なども本発明における界面活性剤に包含される。
フッ素置換誘導体としては、上記化合物中の水素をフッ素に置換したあらゆる化合物が挙げられ、例えばペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロノナン酸などが例示されるがこれに限らない。
アミノ酸を構造中に含む誘導としては、アシル化アミノ酸塩、例えばN-アセチルグルタミン酸塩、N-アセチルアラニン酸塩、N-アセチルグリシン酸塩、N-アセチルアスパラギン酸塩、N-アセチルグルタミン酸塩、N-アルキルアミノプロピオン酸塩等が挙げられるがこれに限らない。
(カチオン性界面活性剤)
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
またカチオン性界面活性剤としては、以下の一般式で表される第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩やホスホニウム塩が挙げられる。
Figure 2022119761000015
[式中、R1~R4は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、例えばC1~C20アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレンを表し、Zは、1価のアニオンを表す。R1~R4は場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
Figure 2022119761000016
[式中、R5は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、例えばC1~C20アルキルを表し、各Raは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のC1~C30アルキル、例えばC1~C20アルキル、C3~C30環状アルキル、C2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレンを表し、nは1~5の整数を表し、Zは、1価のアニオンを表す。R5及び各Raは場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
Figure 2022119761000017
[式中、R6~R9は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、例えばC1~C20アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C20アルケニル、C3~C20環状アルケニル、C6~C20アリール、C7~C20アリーレンを表し、Zは、1価のアニオンを表す。R6~R9は場合により一又は複数個のハロゲン若しくは直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルコキシ基、C1~C30アシルオキシ基、C2~C30アルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。]
第四級アンモニウム塩としては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、が挙げられる。
ピリジニウム塩としては、例えば、1-デシルピリジニウムクロリド及びブロミド、1-ドデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、1-テトラデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、1-ヘキサデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、N-セチル-2-メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、N-セチル-3-メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、N-セチル-4-メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、1-オクタデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、1-エイコシルピリジニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド及びブロミド、テトラ-n-オクチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
カチオン性界面活性剤の対となるアニオンZ-は例えばCl-、Br-、I-等でありうる。
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
(本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキット)
本発明はアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む糖化ヘモグロビン測定用キットを提供する。界面活性剤は非イオン性又はイオン性界面活性剤とすることができる。また、アマドリアーゼと界面活性剤とは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。一般に、同一の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤はアマドリアーゼを失活させない濃度で含まれるのが好ましい。別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤は測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。このストック溶液を適宜希釈して、測定に用いる溶液を調製する。界面活性剤を含む溶液は、水、純水、緩衝溶液又は有機溶剤中に界面活性剤を溶解させて調製することができる。例えば水への溶解性の低い界面活性剤等は、まずジメチルスルホキシド(DMSO)等の有機溶剤中に溶解させ、次いでこれを測定に用いる溶液に添加することができる。
本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットは、さらにαFVH等の糖化基質測定用試薬、αFVH等の糖化基質を切り出すためのプロテアーゼまたはペプチダーゼ、その他公知の安定化剤や緩衝溶液を含み得る。αFVHを測定するための各種キットに用いられている技術を、本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットの製造に適宜用いることができる。すなわち本発明は、適当なアマドリアーゼ及び界面活性剤を用意するステップを含む、アマドリアーゼ及び界面活性剤を含むキットの製造方法を提供する。このとき、アマドリアーゼ及び界面活性剤は同一又は別個の成分として用意することができる。キット中に別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とが提供される場合、これらはαFVH等の糖化基質測定の直前に混合され得る。
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、好ましくはキットに含まれる界面活性剤を終濃度に調製したものを添加してから5分後の残存活性(%)が、添加しない場合と比較して例えば10%以上、15%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上又は99%以上である。残存活性については下記に説明する。
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、好ましくは測定時における終濃度として、界面活性剤0.0032%(w/v)当たり110μg/ml以下、例えば100μg/ml以下、90μg/ml以下、80μg/ml以下、70μg/ml以下、60μg/ml以下、又は50μg/ml以下である。また、キットに含まれる界面活性剤は、測定時における終濃度として、0.003%(w/v)以上、例えば0.0032%(w/v)以上、0.0035%(w/v)以上、0.004%(w/v)以上、0.0045%(w/v)以上、0.005%(w/v)以上、0.006%以上、0.007%(w/v)以上、0.008%(w/v)以上、0.009%(w/v)以上、0.01%(w/v)以上、0.015%(w/v)以上、0.02%(w/v)以上、0.025%(w/v)以上、0.03%(w/v)以上、0.035%(w/v)以上、0.036%(w/v)以上、0.04%(w/v)以上、0.045%(w/v)以上、0.05%(w/v)以上、0.06%(w/v)以上、0.07%(w/v)以上、0.08%(w/v)以上、0.09%(w/v)以上、0.1%(w/v)以上、0.11%(w/v)以上、0.12%(w/v)以上、0.13%(w/v)以上、0.14%(w/v)以上、0.15%(w/v)以上、0.16%(w/v)以上、0.17%(w/v)以上、0.18%(w/v)以上、0.19%(w/v)以上、0.2%(w/v)以上、0.21%(w/v)以上、0.22%(w/v)以上、0.23%(w/v)以上、0.24%(w/v)以上、0.25%(w/v)以上、0.26%(w/v)以上、0.27%(w/v)以上、0.28%(w/v)以上、0.29%(w/v)以上、0.3%(w/v)以上、0.35%(w/v)以上、0.4%(w/v)以上、0.45%(w/v)以上、0.5%(w/v)以上、0.6%(w/v)以上、0.7%(w/v)以上、00.8%(w/v)以上、0.9%(w/v)以上、1.0%(w/v)以上、1.05%(w/v)以上、1.1%(w/v)以上、1.15%(w/v)以上、1.2%(w/v)以上、1.25%(w/v)以上、1.3%(w/v)以上、1.35%(w/v)以上、1.4%(w/v)以上、1.45%(w/v)以上、1.5%(w/v)以上、1.6%(w/v)以上、1.7%(w/v)以上、1.8%(w/v)以上、1.9%(w/v)以上、2.0%(w/v)以上、2.1%(w/v)以上、2.2%(w/v)以上、2.3%(w/v)以上、2.4%(w/v)以上、2.5%(w/v)以上、又は3.0%(w/v)以上である。ここで、測定時における終濃度、とは最終的に成分を希釈して糖化ヘモグロビン測定を行うときの濃度をいう。したがってキット中では、測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。
ある実施形態において本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、配列番号1、配列番号94又は配列番号110に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ又はこれに基づき作製された、界面活性剤耐性が向上した変異体であり得る。該変異体は、配列番号1、配列番号94又は配列番号110と例えば、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号1のアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および/または挿入されたアミノ酸配列を有し得る。
また本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などに由来する天然のアマドリアーゼ又はそれらの変異体であり得る。こうした変異体は、上記のアミノ酸置換を1以上、有しうる。
当業者であれば、本明細書の教示に従って、あるアマドリアーゼが本発明のキットに使用可能か、すなわち所望の界面活性剤耐性を有するか適宜に調べることができる。
ある実施形態において、本発明のキットはアマドリアーゼ及びコール酸ナトリウムを含む。キットに含まれるアマドリアーゼは、天然アマドリアーゼや既知のアマドリアーゼであってもよく、また本発明の変異を有するアマドリアーゼであってもよい。アマドリアーゼとコール酸ナトリウムとは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。ある実施形態において、本発明のキットに含まれるコール酸ナトリウムは、アマドリアーゼ溶液中での濃度又は糖化ヘモグロビン測定時の終濃度が0.1%(w/v)以上、0.2%(w/v)以上、0.5%(w/v)以上、1.0%(w/v)以上、2.0%(w/v)以下、1.8%(w/v)以下、1.5%(w/v)以下、例えば0.1~2.0%(w/v)、0.5~1.5%(w/v)となるようにすることができる。
ある実施形態において、本発明のキットはアマドリアーゼ及びデオキシコール酸ナトリウムを含む。キットに含まれるアマドリアーゼは、天然アマドリアーゼや既知のアマドリアーゼであってもよく、また本発明の変異を有するアマドリアーゼであってもよい。アマドリアーゼとデオキシコール酸ナトリウムとは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。ある実施形態において、本発明のキットに含まれるデオキシコール酸ナトリウムは、アマドリアーゼ溶液中での濃度又は糖化ヘモグロビン測定時の終濃度が0.1%(w/v)以上、0.2%(w/v)以上、0.3%(w/v)以上、0.4%(w/v)以上、0.5%(w/v)以上、1.0%(w/v)以上、2.0%(w/v)以下、1.8%(w/v)以下、1.5%(w/v)以下、例えば0.1~2.0%(w/v)、0.2~2.0%(w/v)、例えば0.5~1.5%(w/v)となるようにすることができる。
当業者であれば、本明細書の教示に従って、アマドリアーゼを含む本発明のキットに用いるコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムの濃度を適宜、決定することができる。
(緩衝剤)
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるpH5.0~pH10.0、好ましくはpH6.0~pH8.0の範囲で緩衝能を有する緩衝剤または緩衝液を適宜加えて良い。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は1以上の緩衝剤を包含するものとする。
本発明のキット(組成物)に用いることのできる緩衝剤(緩衝液)としては、例えば、ホウ酸及び/又はその塩を含むホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸及び/又はその塩を含むリン酸緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤又はリン酸ナトリウム緩衝剤、有機酸緩衝剤及び/又はその塩を含む有機酸緩衝剤、例えばトリカルボン酸緩衝剤及び/又はその塩を含むトリカルボン酸緩衝剤、例えばクエン酸及び/又はその塩を含むクエン酸緩衝剤、モノカルボン酸緩衝剤及び/又はその塩を含むモノカルボン酸緩衝剤、例えば酢酸緩衝剤及び/又はその塩を含む酢酸緩衝剤、並びにグッド緩衝剤等の緩衝剤が挙げられる。
緩衝剤は、適当な濃度で本発明のキットまたは組成物に用いることができる。通常、本発明のキットまたは組成物に添加する緩衝剤の量は、測定溶液での終濃度に基づいて算出することができる。ある実施形態において測定溶液における緩衝剤の終濃度は、好ましくは当該測定溶液に生じうるpH変化を緩衝するのに十分な濃度である。緩衝剤の終濃度は、例えば1mM以上、5mM以上、10mM以上、20mM以上、例えば50mM以上、1M以下、500mM以下、400mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下、例えば1mM~1M、5mM~500mM、10mM~300mM、例えば50mM~100mMであり得る。
(本発明のアマドリアーゼにおける界面活性剤耐性の向上)
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して界面活性剤耐性が向上していることを特徴とする。具体的には、ある実施形態において、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、本発明の改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、0.1~0.2%、例えば0.15~0.2%(w/v)のSDDS又は0.03%、0.036%、若しくは0.04%のSDSを添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)が、向上していることを特徴とする。またある実施形態において、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、本発明の改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、終濃度1.0~2.0%(w/v)となるオクチル硫酸ナトリウム、終濃度0.0032~0.0064%(w/v)となるテトラデシル硫酸ナトリウム、終濃度0.002~0.0032%(w/v)となるオクタデシル硫酸ナトリウム、終濃度0.005~0.001%(w/v)となる4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、終濃度1.0~2.0%(w/v)となるコール酸ナトリウム又は終濃度0.60~1.2%(w/v)となるデオキシコール酸ナトリウムを添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)が、向上していることを特徴とする。ここで、残存活性(%)とは、界面活性剤処理前の活性を100とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合をパーセンテージ(%)で表したものである。なお、本明細書において界面活性剤の濃度をパーセンテージで記載する場合、特に断らない限りこれは%(w/v)を意味するものとする。
本発明の改変アマドリアーゼの残存活性(%)の向上度合は限定されないが、例えば、本発明の変異を導入したアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性(%)が好ましくは5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上又は99%以上である改変アマドリアーゼが本発明に包含される。例えばアニオン性界面活性剤で処理した後の残存活性が20%である改変アマドリアーゼがこれに該当する。
ある実施形態において、本発明の改変アマドリアーゼの残存活性(%)は、界面活性剤処理を行った後に100%を超えうる。したがって本発明の変異を導入したアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性(%)が、100%以上、105%以上、110%以上、115%以上、120%以上、125%以上、130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、例えば150%以上である改変アマドリアーゼが本発明に包含される。本発明の変異を導入することにより界面活性剤処理を行った後の残存活性(%)が100%を超える変異体については、当該変異が界面活性剤に対する耐性を向上させるのみならずアマドリアーゼ活性を増強させているといえる。こうした変異も、界面活性剤に対する耐性を向上させる変異に含まれる。すなわち、本発明の界面活性剤に対する耐性を向上させる変異は、界面活性剤存在下でアマドリアーゼ活性を増強する変異も包含する。界面活性剤存在下でアマドリアーゼ活性を増強する変異とは、界面活性剤処理後の残存活性(%)が100%を超えるアマドリアーゼをもたらす変異をいう。
また、本発明の変異を有しないアマドリアーゼ及び本発明の変異を有するアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行った後の残存活性(%)同士の数値比較において、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、99%以上、100%以上、110%以上、120%以上、130%以上、例えば140%以上残存活性が向上している改変アマドリアーゼが本発明に包含される。例えば、アニオン性界面活性剤で処理した後の残存活性が変異導入前のアマドリアーゼについて18%、変異導入後の改変アマドリアーゼについて20%であれば、これらの残存活性(%)同士の数値比較において、残存活性が2%向上していると言うことができ、このような改変アマドリアーゼは本発明に包含される。アニオン性界面活性剤で処理した後の残存活性が変異導入後のアマドリアーゼについて153%、変異導入前の改変アマドリアーゼについて9%であれば、これらの残存活性(%)同士の数値比較において、残存活性が144%向上していると言うことができ、このような改変アマドリアーゼも本発明に包含される。
ある実施形態では、本発明のアマドリアーゼの界面活性剤耐性を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を終濃度0.03%となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)にて評価する。このときSDSを添加しない場合の残存活性を100%とする。この条件下で、あるアマドリアーゼの残存活性(%)が20%である場合、本明細書ではこれを「ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度0.03%となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)が、ドデシル硫酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して20%残存している」と表現する。
また、この条件下で、本発明の変異を有しないアマドリアーゼと有するアマドリアーゼとの界面活性剤処理後の残存活性(%)同士を比較し、本発明の変異を有するアマドリアーゼの残存活性が2.5%向上している場合、本明細書ではこれを「ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度0.03%となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性が2.5%向上している」と表現する。
ある実施形態では、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼについて界面活性剤処理を行うと活性が全て消失することがある。このような場合、本発明の変異を導入した後のアマドリアーゼの残存活性(%)の向上を見るには、界面活性剤処理によっても活性が全て消失しない基準となるアマドリアーゼを用い、基準となるアマドリアーゼの界面活性剤処理後の残存活性と、変異導入後のアマドリアーゼの界面活性剤処理後の残存活性とを比較してもよい。
実際には、測定時の温度条件に加えて、変異導入前のアマドリアーゼの界面活性剤耐性の程度によっても相対的な評価結果は異なってくるため、残存活性(%)や残存活性比率数値の大小のみを比較して、各変異体の絶対的な界面活性剤耐性を評価することは難しい場合がある。ただし、本発明における実施例の条件を踏襲することで、各変異体の界面活性剤耐性を絶対的に評価することが可能である。また、本発明のアマドリアーゼの選抜を容易にする意図から変異導入前のアマドリアーゼの残存活性(%)が十分に低く算出される界面活性剤処理条件を選択することにより、一般的には、残存活性(%)の向上度合および残存活性比率が高く算出される傾向を有する。
例えば、本発明に包含される、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7/K80R)株が生産する本発明のアマドリアーゼを、0.03%のSDSと混合して、30℃、5分間に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるCFP-T7の残存活性が18.9%であるのに対し、本発明の変異導入後のアマドリアーゼ4は残存活性が46.2%となり、SDSに対する安定性が向上した。また、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7/M71L)株が生産する本発明のアマドリアーゼを、0.03%のSDSと混合して、30℃、5分間に供したときには、本発明の変異を導入する前のアマドリアーゼであるCFP-T7の残存活性が18.9%であるのに対し、本発明の変異導入後のアマドリアーゼ3は残存活性が34.0%となり、SDSに対する安定性が向上した。このようにアニオン性界面活性剤に対する耐性が向上した本発明のアマドリアーゼは、該酵素含有製品等における保存性が著しく向上し、また、HbA1cのプロテアーゼ分解効率を向上させ、測定感度を高めるために強い界面活性剤を使用する場合にも安定であるため、産業上非常に有利である。
ある実施形態において本発明は、0.03%若しくは0.036%SDSの存在下でHbA1c測定が可能な改変アマドリアーゼを提供する。この改変アマドリアーゼはそのアミノ酸配列を配列番号1のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されている。置換アミノ酸は上記に例示したとおりである。この改変マドリアーゼ及び前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてSDSを終濃度0.03%若しくは0.036%となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)同士の数値比較において、この本発明の改変アマドリアは、前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼと比較して例えば2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、15%以上、例えば20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、例えば50%以上残存活性が向上している。
ある実施形態において本発明は、0.1%又は0.15%SDDSの存在下でHbA1c測定が可能な改変アマドリアーゼを提供する。この改変アマドリアーゼはそのアミノ酸配列を配列番号1のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されている。置換アミノ酸は上記に例示したとおりである。この改変マドリアーゼ及び前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてSDDSを終濃度0.1%又は0.15%となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)同士の数値比較において、この本発明の改変アマドリアは、前記位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼと比較して例えば2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、15%以上、例えば20%以上、25%以上、例えば30%以上、残存活性が向上している。
このような本発明の改変アマドリアーゼは、HbA1cを変性させる界面活性剤、例えば0.03%若しくは0.036%SDSまたは0.1%若しくは0.15%SDDSの存在下でも活性が残存し、HbA1c測定に用いることができる。
(ハイスループットスクリーニング)
アマドリアーゼはさらに、機能性アマドリアーゼ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したアマドリアーゼ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異アマドリアーゼの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーゼバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際には界面活性剤存在下でのアマドリアーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
(アマドリアーゼ活性の測定方法)
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
(アマドリアーゼ活性の測定方法)
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
以下、本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義する。フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる(特開2001-95598号参照)。なお、これは測定方法の説明のための便宜であって、本発明に用いるアマドリアーゼの基質特異性はフルクトシルバリンに何ら限定されるものではない。
A.試薬の調製
(1)試薬1:POD-4-AA溶液
4.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4-アミノアンチピリン(東京化成工業社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、1Lに定容する。
(2)試薬2:TOOS溶液
500mgのTOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
(3)試薬3:基質溶液(150mM;終濃度 5mM)
フルクトシルバリン417mgをイオン交換水に溶解して10mlに定容する。
B.測定法
2.7mlの試薬1,100μlの試薬2、および100μlの試薬3を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、酵素液を100μl加えてよく混ぜた後、分光光度計(U-3010、日立ハイテクノロジーズ社製)により、555nmにおける吸光度を測定する。測定値は、555nmにおける1分後から3分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。37℃、1分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)= {(ΔAs-ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs : 反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA : 対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2: 反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数(mM-1・cm-1
0.5 : 1molの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のmol数
df : 希釈係数
(界面活性剤耐性測定方法)
アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約1.0U/mlとなるように、30mM MES/21mM Tris緩衝液(pH6.5)で希釈し、SDS(例えば、和光純薬工業社製)を終濃度0.03%(w/v)または0.04%となるように添加後、30℃にて5分間加温する。加温後、0.15%のBSAを含む10mM リン酸緩衝液(pH7.0)で2倍希釈し、上述のB.の方法を用いて界面活性剤処理前と界面活性剤処理後のサンプルの酵素活性を測定し、界面活性剤処理前の活性を100とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合、すなわち、残存活性(%)を求めることにより、界面活性剤耐性を評価する。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
[実施例1]
(界面活性剤耐性向上型変異について)
(1)組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの調製
CFP-T7遺伝子(配列番号2)を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株(国際公開2007/125779号参照)を、LB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を7,000rpmで、5分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりQIAGEN tip-100(キアゲン社製)を用いて組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7を抽出して精製し、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7のDNA2.5μgを得た。
(2)組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、配列番号14、15の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-(東洋紡社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
すなわち、10×KOD-Plus-緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるpKK223-3-CFP-T7 DNAを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加えて、滅菌水により全量を50μlとした。調製した反応液をサーマルサイクラー(エッペンドルフ社製)を用いて、94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」-「50℃、30秒」-「68℃、6分」のサイクルを30回繰り返した。
反応液の一部を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、約6,000bpのDNAが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたDNAを制限酵素DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS社製)で処理し、残存している鋳型DNAを切断した後、大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地に接種して振とう培養し、上記(1)と同様の方法でプラスミドDNAを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ(Life Technologies社製)を用いて決定し、その結果、配列番号1記載のアミノ酸配列の9位のアルギニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T)を得た。
同様の手順で、配列番号16、17の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の12位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V12I)を得た。
同様の手順で、配列番号61、62の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の12位のバリンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V12L)を得た。
同様の手順で、配列番号18、19の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71L)を得た。
同様の手順で、配列番号71、72の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71I)を得た。
同様の手順で、配列番号71、73の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71A)を得た。
同様の手順で、配列番号71、74の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンがバリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71V)を得た。
同様の手順で、配列番号71、75の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の71位のメチオニンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71C)を得た。
同様の手順で、配列番号20、21の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の80位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-K80R)を得た。
同様の手順で、配列番号81、82の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の80位のリシンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-K80N)を得た。
同様の手順で、配列番号81、83の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の80位のリシンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-K80Q)を得た。
同様の手順で、配列番号81、84の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の80位のリシンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-K80H)を得た。
同様の手順で、配列番号22、23の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F172E)を得た。
同様の手順で、配列番号85、86の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の172位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F172D)を得た。
同様の手順で、配列番号85、87の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の172位のフェニルアラニンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F172Y)を得た。
同様の手順で、配列番号85、88の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の172位のフェニルアラニンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F172Q)を得た。
同様の手順で、配列番号24、25の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の175位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E175R)を得た。
同様の手順で、配列番号89、90の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の175位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E175K)を得た。
同様の手順で、配列番号89、91の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の175位のグルタミン酸がヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E175H)を得た。
同様の手順で、配列番号26、27の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の279位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V279I)を得た。
同様の手順で、配列番号92、93の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の279位のバリンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V279C)を得た。
同様の手順で、配列番号28、29の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の28位のバリンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V28L)を得た。
同様の手順で、配列番号65、66の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の28位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V28I)を得た。
同様の手順で、配列番号65、67の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の28位のバリンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V28M)を得た。
同様の手順で、配列番号30、31の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の30位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S30A)を得た。
同様の手順で、配列番号68、69の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の30位のセリンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S30T)を得た。
同様の手順で、配列番号68、70の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の30位のセリンがバリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S30V)を得た。
同様の手順で、配列番号32、33の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の77位のグルタミンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-Q77D)を得た。
同様の手順で、配列番号76、77の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の77位のグルタミンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-Q77E)を得た。
同様の手順で、配列番号76、79の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の77位のグルタミンがリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-Q77K)を得た。
同様の手順で、配列番号76、80の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の77位のグルタミンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-Q77N)を得た。
同様の手順で、配列番号63、64の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の13位のバリンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V13L)を得た。
これらのプラスミドについて、上記と同様に当該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を決定し、変異導入を確認した。
(3)各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
(4)各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDSの終濃度を0.03%として、またはSDDS(東京化成工業社製)の終濃度を0.15%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表1に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表1において、CFP-T7は、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼであるCFP-T7を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、CFP-T7に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
Figure 2022119761000018
表1に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性は0.15%SDDS処理後に73.0%となり、0.03%SDS処理後に18.9%となった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた7の変異体、すなわち、CFP-T7の9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、71位のメチオニンがロイシンに、80位のリシンがアルギニンに、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、279位のバリンがイソロイシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれもCFP-T7と比較して、SDDSについては4%~16.9%、SDSについては8.6%~27.3%向上した。またCFP-T7の77位のグルタミンがアスパラギン酸に置換されたアマドリアーゼにおいては、残存活性がCFP-T7と比較してSDSについて2.5%向上した。さらにCFP-T7の12位のバリンがロイシンに、71位のメチオニンがアラニン又はバリン又はシステインに、80位のリシンがアスパラギン又はグルタミンに、172位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に、175位のグルタミン酸がリシンに、28位のバリンがイソロイシン又はメチオニンに、30位のセリンがスレオニン又はバリンに、13位のバリンがロイシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、SDS存在下での残存活性がいずれもCFP-T7と比較して向上した。したがって、これらの各変異点が、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異点であることが確認された。
9位については、スレオニン、アスパラギン、及びグルタミンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく極性の側鎖を有するアミノ酸であるセリンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また12位については、イソロイシン及びロイシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくバリンよりも分子量が大きいアミノ酸であるメチオニン、システインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また71位については、ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン及びシステインへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくメチオニンよりも分子量の小さいアミノ酸であるグリシン、への置換により同様の結果が得られると考えられる。
80位については、アルギニン、アスパラギン、及びグルタミン及びヒスチジンへの置換により良好な結果が得られた。
また172位についてはグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン及びグルタミンへの置換により良好な結果が得られた。
また175位についてはアルギニン、リシン及びヒスチジンへの置換により良好な結果が得られた。
また279位については、イソロイシン及びシステインへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくバリンよりも分子量の大きいアミノ酸であるメチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また28位については、イソロイシン及びメチオニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく疎水性の側鎖を有するアミノ酸であるアラニン、及び同じくバリンよりも分子量の大きいアミノ酸であるシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また30位については、スレオニン及びバリンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく疎水性の側鎖を有するアミノ酸であるロイシン、イソロイシンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また77位については、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン及びアスパラギンへの置換により良好な結果が得られた。
また13位については、ロイシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じくバリンよりも分子量の大きいアミノ酸であるイソロイシン、システイン及びメチオニンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
本発明のこれらの変異点は、単独変異として有効であるのみならず、既に知られている各種公知の変異と組み合わせ、また、本発明の変異同士を組み合わせることによって、実用上の利点を有する変異体を創出することに貢献することが期待される。
[実施例2]
(アニオン性界面活性剤耐性向上型変異の蓄積)
実施例1で見出された界面活性剤耐性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらに界面活性剤耐性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、多重変異体の作製による界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を試みた。
実施例1と同様にして、pKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型とし、配列番号34、35の合成オリゴヌクレオチドを使用して、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P DNAを鋳型とし、配列番号36、37の合成オリゴヌクレオチドを使用して、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P/H53N)を得た。
続いて、PCT/JP2014/071036号(国際公開第2015/020200号)に示されているカチオン性界面活性剤耐性向上型アマドリアーゼであるCFP-T7-E44Pを発現するプラスミドであるpKK223-3-CFP-T7-E44P DNAを鋳型とし、配列番号38、39の合成オリゴヌクレオチドを使用して、44位のグルタミン酸がプロリンに、340位のグルタミン酸がプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E44P/E340P)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-F172E DNAを鋳型とし、配列番号25、40の合成オリゴヌクレオチドを使用して、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-F172E/E175R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-V28L DNAを鋳型とし、配列番号31、41の合成オリゴヌクレオチドを使用して、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-V28L/S30A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-M71L DNAを鋳型とし、配列番号42、43の合成オリゴヌクレオチドを使用して、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-M71L/Q77D/K80R)を得た。
なお、43Y、53N、184Dは酵素の熱安定性を向上させることが報告されている変異である(国際公開第2013/100006号パンフレット)。また44P、340Pはカチオン性界面活性剤耐性を向上させる変異である(PCT/JP2014/071036号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書参照)。
実施例1と同様に上記の多重変異体を生産させ、得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記(4)に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、実施例1と同様に、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表2に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
Figure 2022119761000019
表2に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性は0.15%SDDS処理後に73.0%となり、0.03%SDS処理後に18.9%となった。これと比較して、作製した本発明の二重変異体及び三重変異体はアニオン性界面活性剤での処理後の残存活性が向上していた。
具体的には、172E/175R変異を導入したアマドリアーゼ15の0.03%SDS処理後の残存活性は51.2%であり、CFP-T7の残存活性18.9%と比較して顕著に向上した。
172E/175R変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの172位を酸性アミノ酸であるグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換し、同時に、175位を塩基性アミノ酸であるアルギニン、ヒスチジン又はリシンに置換することにより、同様の結果が得られると考えられる。
また、28L/30A変異を導入したアマドリアーゼ16の0.03%SDS処理後の残存活性は37.3%であり、CFP-T7の残存活性18.9%と比較して有意に向上した。
28L/30A変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの28位を疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、アラニンへと置換し、同時に、30位をセリンよりも分子量の小さいアミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン又はセリンと構造の類似するアミノ酸であるスレオニンへと置換することにより同様の結果が得られると考えられる。特に28位をロイシン又はイソロイシンに置換し、同時に、30位をアラニンに置換する組み合わせは同様の結果が得られると考えられる。
また、71L/77D/80R変異を導入したアマドリアーゼ17の0.03%SDS処理後の残存活性は56.3%であり、CFP-T7の残存活性18.9%と比較して顕著に向上した。
したがって、これらの本発明の変異の組み合わせが、より強力な変性条件下においてもアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させることが確認された。
71L/77D/80R変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの71位をメチオニンよりも分子量の小さいアミノ酸であるロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン又はシステインへと置換し、同時に77位を酸性アミノ酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸へと置換し、同時に80位を塩基性アミノ酸であるアルギニン又はヒスチジンへと置換することにより同様の結果が得られると考えられる。
また酵素の熱安定性を向上させることが報告されている変異43Y及び53N、並びにカチオン性界面活性剤耐性を向上させる変異44P及び340Pについても表2の組み合わせによる残存活性の向上が見られた。
本発明のこれらの変異の組み合わせの効果が示されたことから、当該組み合わせ同士を蓄積させることによって、さらに界面活性剤に対する耐性を向上させうると期待される。
(さらなる変異の蓄積)
続いて、pKK223-3-CFP-T7-R9T DNAを鋳型とし、配列番号44、45の合成オリゴヌクレオチドを使用して、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I DNAを鋳型とし、配列番号46、47の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I DNAを鋳型とし、配列番号31、41の合成オリゴヌクレオチドを使用して、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-R9T/V12I/V13I/V28L/S30A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-F43Y/E44P/H53N DNAを鋳型とし、配列番号18、19、31、41、42、43、44、45、46、47の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R DNAを鋳型とし、配列番号48、49の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D DNAを鋳型とし、配列番号50、51の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H DNAを鋳型とし、配列番号25、40の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R DNAを鋳型とし、配列番号52、53の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、カルボキシル末端の3アミノ酸残基が欠失(ΔPTS1)した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1 DNAを鋳型とし、配列番号54、55の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに、98位のグルタミン酸がアラニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに置換され、カルボキシル末端の3アミノ酸残基が欠失(ΔPTS1)した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1/E98A)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1/E98A DNAを鋳型とし、配列番号121、122の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、53位のヒスチジンがアスパラギンに、71位のメチオニンがロイシンに、77位のグルタミンがアスパラギン酸に、80位のリシンがアルギニンに、98位のグルタミン酸がアラニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに、286位のフェニルアラニンがチロシンに置換され、カルボキシル末端の3アミノ酸残基が欠失(ΔPTS1)した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/V28L/S30A/F43Y/E44P/H53N/M71L/Q77D/K80R/S154D/V257C/N262H/F172E/E175R/ΔPTS1/E98A/F286Y)を得た。このプラスミドによりコードされるアマドリアーゼを、アマドリアーゼ25-F286Yとよぶことがある。
続いて、PCT/JP2014/071036号(国際公開第2015/020200号)に示されているカチオン性界面活性剤耐性向上型アマドリアーゼであるCFP-D4(CFP-T7-F43Y/E44P/E98A/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1)を発現するプラスミドであるpKK223-3-CFP-D4 DNAを鋳型とし、配列番号44、45、46、47、48、49の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、98位のグルタミン酸がアラニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、184位のグリシンがアスパラギン酸に、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに340位のグルタミン酸がプロリンに置換され、カルボキシル末端の3アミノ酸残基が欠失(ΔPTS1)した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1 DNAを鋳型とし、配列番号25、40の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、98位のグルタミン酸がアラニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、184位のグリシンがアスパラギン酸に、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに340位のグルタミン酸がプロリンに置換され、カルボキシル末端の3アミノ酸残基が欠失(ΔPTS1)した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R)を得た。
さらに上記と同様にして、pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R DNAを鋳型とし、配列番号31、41の合成オリゴヌクレオチドを使用して、3位のセリンがスレオニンに、4位のアスパラギンがプロリンに、9位のアルギニンがスレオニンに、12位のバリンがイソロイシンに、13位のバリンがイソロイシンに、28位のバリンがロイシンに、30位のセリンがアラニンに、43位のフェニルアラニンがチロシンに、44位のグルタミン酸がプロリンに、98位のグルタミン酸がアラニンに、154位のセリンがアスパラギン酸に、172位のフェニルアラニンがグルタミン酸に、175位のグルタミン酸がアルギニンに、184位のグリシンがアスパラギン酸に、257位のバリンがシステインに、262位のアスパラギンがヒスチジンに340位のグルタミン酸がプロリンに置換され、カルボキシル末端の3アミノ酸残基が欠失(ΔPTS1)した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た。
また98A、154Dは基質特異性を改変することが報告されている変異である(国際公開第2012/018094号パンフレット)。また257C、262Hはカチオン性界面活性剤およびSDSに対する耐性を向上させることが報告されている変異である(PCT/JP2014/071036号、すなわち国際公開第2015/020200号の明細書)。またΔPTS1は熱安定性を向上させることが報告されているカルボキシル末端の3アミノ酸の欠失である(国際公開第2013/100006号パンフレット)。
得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記(4)に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、より厳しい条件である0.04%のSDSの混合に変更し、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表3に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
Figure 2022119761000020
表3に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性はわずか4.8%であった。このように過酷なアニオン性界面活性剤条件下においては、従来のアマドリアーゼは、ほとんど活性を失うことが確認された。
これに対し、実施例1で確認された各種の単独変異を組み合わせて作製した各種多重変異体においては、残存活性が顕著に向上した。
具体的には、71L/77D/80R変異を導入したアマドリアーゼ17の残存活性は7.1%であり、CFP-T7の残存活性4.8%と比較して向上した。また71L/77D/80R変異及び28L/30A変異及び3T/4P/R9T/12I/13I変異を導入したアマドリアーゼ20の残存活性は22.8%であり、CFP-T7と比較して有意に向上しており、変異導入前のアマドリアーゼ12、17、18、19それぞれと比較して向上した。
また172E/175R変異を導入したアマドリアーゼ23の残存活性は55.2%であり、変異導入前のアマドリアーゼ22の残存活性47.9%と比較して向上した。また172E/175R変異を導入したアマドリアーゼ27の残存活性は40.6%であり、変異導入前のアマドリアーゼ26の残存活性28.9%と比較して向上した。
28L/30A変異を導入したアマドリアーゼ19の残存活性は5.9%であり、CFP-T7の残存活性4.8%と比較して向上した。また28L/30A変異を導入したアマドリアーゼ28の残存活性は81.9%であり、変異導入前のアマドリアーゼ27の残存活性40.6%やアマドリアーゼ26の残存活性28.9%と比較して顕著に向上した。
3T/4P/R9T/12I/13I変異を導入したアマドリアーゼ18の残存活性は8.9%であり、アマドリアーゼ26の残存活性は28.9%であり、それぞれ、CFP-T7と比較して耐性が向上した。
3T/4P/R9T/12I/13I変異により良好な結果が得られたことから、アマドリアーゼの3位を極性の側鎖を有するアミノ酸であるスレオニンへと置換し、同時に、4位をプロリンへと置換し、9位を極性の側鎖を有するアミノ酸であるスレオニン、セリン、アスパラギン又はグルタミンへと置換し、同時に、12位をバリンよりも分子量が大きいアミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、メチオニン又はシステインへと置換し、同時に13位をバリンよりも分子量が大きいアミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、メチオニン又はシステインへと置換することにより、同様の結果が得られると考えられる。
また、これらの多重変異を累積させたアマドリアーゼ20~25及び27~28は残存活性がCFP-T7と比較して顕著に向上した。特に本発明のアマドリアーゼ22、23、24、25、27、28はアマドリアーゼ12、17、18、26と比較すると、アニオン性界面活性剤に対する耐性が顕著に向上しており、これらの変異が相乗効果を有することが分かる。例えばアマドリアーゼ20は3T/4P/R9T/12I/13I変異、28L/30A変異、及び71L/77D/80R変異を累積させた変異体であり、これらを有しないアマドリアーゼ12と比較して残存活性が有意に向上している。またアマドリアーゼ26、27、28は、3T/4P/R9T/12I/13I変異、172E/175R変異、及び28L/30A変異を段階的に組み合わせたものであるが、変異の累積によりアニオン性界面活性剤に対する耐性が段階的に向上しており、変異の累積的な効果が確認された。よって実施例1で確認された本発明の変異点を適宜組み合わせることによって、一層優れた界面活性剤耐性を有するアマドリアーゼが作出され得ることが明らかとなった。
さらに、9位、12位及び13位の変異がそれぞれ、単独でもアマドリアーゼの界面活性剤耐性の向上に寄与しているか否かを調べるために、アマドリアーゼ28から出発して当該位置の変異後のアミノ酸を野生型のアミノ酸に戻した復帰変異体を作製し、そのアニオン性界面活性剤耐性を測定した。
具体的には、上記と同じ手順で、ただしpKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30Aを鋳型とし、配列番号56、57の合成オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、鋳型における9位のスレオニンをアルギニンに復帰変異させた改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(CET/E98A/G184D/ΔPTS1/F43Y/E44P/S154D/V257C/N262H/E340P/S3T/N4P/V12I/V13I/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た(T9R復帰変異)。
また、上記と同じ手順で、ただしpKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30Aを鋳型とし、配列番号58、59の合成オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、鋳型における12位のイソロイシンをバリンに復帰変異させた改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(CET/E98A/G184D/ΔPTS1/F43Y/E44P/S154D/V257C/N262H/E340P/S3T/N4P/R9T/V13I/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た(I12V復帰変異)。
また、上記と同じ手順で、ただしpKK223-3-CFP-T7-S3T/N4P/R9T/V12I/V13I/F43Y/E44P/E98A/S154D/G184D/V257C/N262H/E340P/ΔPTS1/F172E/E175R/V28L/S30Aを鋳型とし、配列番号59、60の合成オリゴヌクレオチドを使用してPCR反応を行い、鋳型における13位のイソロイシンをバリンに復帰変異させた改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(CET/E98A/G184D/ΔPTS1/F43Y/E44P/S154D/V257C/N262H/E340P/S3T/N4P/R9T/V12I/F172E/E175R/V28L/S30A)を得た(I13V復帰変異)。
実施例1と同様に上記の多重変異体を生産させ、得られた各粗酵素液をサンプルとし、上記(4)に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件は、0.04%のSDSの混合とし、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表4に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
Figure 2022119761000021
表4に示す通り、R9T/V12I/V13Iを全て有するアマドリアーゼ28の残存活性81.9%と比較して、9位のみをアルギニンに復帰させたアマドリアーゼ29は残存活性が63.3%へと低下した。逆に言えば、アマドリアーゼ29から出発して9位のアルギニンをスレオニンとする本発明の単独変異はアマドリアーゼ28をもたらし、この1つの変異によって18.6%に相当する残存活性の向上、すなわち界面活性剤に対する耐性をもたらす。
またR9T/V12I/V13Iを全て有するアマドリアーゼ28の残存活性81.9%と比較して、12位のみをバリンに復帰させたアマドリアーゼ30は残存活性が55.1%へと低下した。逆に言えば、アマドリアーゼ30から出発して12位のバリンをイソロイシンとする本発明の単独変異はアマドリアーゼ28をもたらし、この1つの変異によって26.8%に相当する残存活性の向上、すなわち界面活性剤に対する耐性をもたらす。
またR9T/V12I/V13Iを全て有するアマドリアーゼ28の残存活性81.9%と比較して、13位のみをバリンに復帰させたアマドリアーゼ31は残存活性が58.0%へと低下した。逆に言えば、アマドリアーゼ31から出発して13位のバリンをイソロイシンとする本発明の単独変異はアマドリアーゼ28をもたらし、この1つの変異によって23.9%に相当する残存活性の向上、すなわち界面活性剤に対する耐性をもたらす。
したがってこれらの結果から、9位、12位及び13位の変異がそれぞれ、単独でもアマドリアーゼの界面活性剤耐性の向上に寄与していることが示された。
[実施例3]
(CFP-T7、および各種変異型アマドリアーゼの精製)
実施例1,2で得たCFP-T7、CFP-T7-M71A、アマドリアーゼ21、アマドリアーゼ24、およびアマドリアーゼ25-F286Yの粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で平衡化した4mlのQ Sepharose Fast Flow樹脂(GEヘルスケア社製)に吸着させ、次に80mlの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて100mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Amicon Ultra-15, 30K NMWL(ミリポア社製)で濃縮した。その後、150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pg(GEヘルスケア社製)にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。得られた精製標品はSDS-PAGEによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。
精製したCFP-T7は実施例2の条件でアニオン性界面活性剤処理を行い、残存活性を測定したところ、0%であった。これに対して精製した本発明のアマドリアーゼ24について、実施例2の条件でアニオン性界面活性剤処理を行い、残存活性を測定したところ、67.2%と顕著な向上が見られた。
[実施例4](様々な界面活性剤に対する耐性試験)
実施例3で得た各種アマドリアーゼの精製酵素をサンプルとし、上記(4)に記載の界面活性剤耐性測定方法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表5、6に示す。ただし、評価に用いた界面活性剤の終濃度は表5、6に記載の通りとした。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
Figure 2022119761000022
Figure 2022119761000023
表5に示すとおり、M71A変異体は種々の界面活性剤の存在下でも、未変異のCFP-T7と比較して、残存活性が向上した。なお、未変異のCFP-T7アマドリアーゼと1.0%(w/v)コール酸ナトリウムとの組み合わせは、コール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して、有意の活性増加を示した。すなわちこの条件下では、コール酸ナトリウムはアマドリアーゼ活性を向上させた。また、M71A変異体と1.0%コール酸ナトリウムとの組み合わせは、当該変異を有しないアマドリアーゼの場合と比較して、活性がさらに増加していた。したがってM71A変異はコール酸ナトリウムに対する耐性を向上させるか、又はコール酸ナトリウム存在下でアマドリアーゼ活性をさらに増強するといえる。M71A変異はまた、0.6%デオキシコール酸ナトリウム存在下で、界面活性剤に対する耐性を向上させるのみならず、デオキシコール酸ナトリウム不在下の場合と比較して、アマドリアーゼ活性をさらに増強した。
また表6に示すとおり、アマドリアーゼ21は、未変異のCFP-T7と比較して、2.0%オクチル硫酸ナトリウム、0.4%SDS、0.010%4-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、及び1.2%デオキシコール酸ナトリウム存在下で、残存活性が向上した。さらに、アマドリアーゼ25にF286Y変異を導入した変異体は、試験した全ての種類の界面活性剤について、CFP-T7と比較して、残存活性が向上していた。アマドリアーゼ25-F286Y変異体はまた、1.2%デオキシコール酸ナトリウム存在下で、界面活性剤に対する耐性を向上させるのみならず、デオキシコール酸ナトリウム不在下の場合と比較して、アマドリアーゼ活性をさらに増強した。
また286位については、チロシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく分子量の大きい疎水性アミノ酸であるトリプトファンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
[実施例5]
(CFP-T7に対する界面活性剤耐性向上型変異について)
(1)組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAの部位特異的改変操作
実施例1に記載の方法に従って、配列番号123、124の合成オリゴヌクレオチドを使用し、組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7)を鋳型としてPCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の44位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E44K)を得た。
同様の手順で、配列番号125、126の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の194位のアスパラギン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-D194K)を得た。
同様の手順で、配列番号125、127の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の194位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-D194A)を得た。
同様の手順で、配列番号128、129の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の204位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E204A)を得た。
同様の手順で、配列番号130、131の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の338位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-D338A)を得た。
同様の手順で、配列番号132、133の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応を行い、配列番号1記載のアミノ酸配列の340位のグルタミン酸がリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-E340K)を得た。
これらのプラスミドについて、上記と同様に当該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするDNAの塩基配列を決定し、変異導入を確認した。
(2)各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
(3)各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDSの終濃度を0.036%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表7に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
表7において、CFP-T7は、大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌JM109(pKK223-3-CFP-T7)株由来のアマドリアーゼであるCFP-T7を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、CFP-T7に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
Figure 2022119761000024
表7に示す通り、本実施例の条件下では、CFP-T7の残存活性は0.036%SDS処理後に9.6%となった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた6の変異体、すなわち、CFP-T7の44位のグルタミン酸がリシンに、194位のアスパラギン酸がリシンに、204位のグルタミン酸がアラニンに、338位のアスパラギン酸がアラニンに、340位のグルタミン酸ががリシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、残存活性がいずれもCFP-T7と比較して、SDSについては2.9%~37.7%向上した。またCFP-T7の194位のアスパラギン酸がアラニンに置換されたアマドリアーゼにおいては、残存活性がCFP-T7と比較してSDSについて1.3%向上した。したがって、これらの各変異点が、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異点であることが確認された。
44位については、リシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく塩基性のアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また194位については、リシン及びアラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく塩基性のアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジンへの置換、および分子量の小さい疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また204位については、アラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく分子量の小さい疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また338位については、アラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく分子量の小さい疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びシステインへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また340位についてはリシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく塩基性のアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
本発明のこれらの変異点は、単独変異として有効であるのみならず、既に知られている各種公知の変異と組み合わせ、また、本発明の変異同士を組み合わせることによって、実用上の利点を有する変異体を創出することに貢献することが期待される。
[実施例6](各種アマドリアーゼの部位特異的改変操作)
(組換え体プラスミドpKK223-3-CcFX DNAの調製)
配列番号94はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ(CcFX)のアミノ酸配列である(国際公開第WO2004/104203号)。配列番号94のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号95)を挿入した組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを保持する大腸菌により生産できる(国際公開第2015/020200号公報参照)。pKK223-3-CcFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例1 (1)組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pKK223-3-CcFXを抽出、精製した。
(Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
CcFXに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを鋳型にして、配列番号96、97の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応を行った後、DpnI処理済みのDNAを2μl、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を5μl、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを1μl加えて、滅菌水により全量を15μlとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌JM109を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のCcFX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号94記載のアミノ酸配列の28位のバリンがロイシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-V28L)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号96,98の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の28位のバリンがメチオニンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-V28M)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号99,100の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の71位のロイシンがアラニンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-L71A)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号99,101の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の71位のロイシンがバリンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-L71V)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号102,103の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の80位のアルギニンがアスパラギンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-R80N)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号102,104の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の80位のアルギニンがグルタミンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-R80Q)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号105,106の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の172位のチロシンがグルタミン酸に置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-Y172E)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号105,107の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の172位のチロシンがアスパラギン酸に置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-Y172D)を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号108,109の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号94記載のアミノ酸配列の175位のアラニンがリシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-A175K)を得た。
(Emericella nidulans由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
配列番号110はEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ(En42FX)のアミノ酸配列である(国際公開第WO2015/005258号)。配列番号110のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号111)を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した(終止コドンTAAを含む)。続いて、取得した配列番号111の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.製)のユーザーマニュアルに従って、配列番号111の遺伝子を含む断片を、配列番号112, 113の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。平行して、pET22bを含む断片を、配列番号113、115の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。続いて、In-fusion反応により、配列番号111の遺伝子を含む断片を、pET22bを含む断片にサブクローニングし、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109 (pET22b-En42FX)株を得た。
En42FXに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを鋳型にして、配列番号116,117の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応を行った後、DpnI処理済みのDNAを2μl、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を5μl、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを1μl加えて、滅菌水により全量を15μlとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌JM109を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のEn42FX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号110記載のアミノ酸配列の70位のロイシンがバリンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b-En42FX-L70V)を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号134,135の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号110記載のアミノ酸配列の171位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b-En42FX-F171D)を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号136,137の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号110記載のアミノ酸配列の174位のグルタミン酸がアルギニンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b-En42FX-E174R)を得た。
そして、得られたプラスミドを用いて、大腸菌JM109株の形質転換と同様の条件で大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、大腸菌BL21(DE3) (pET22b-En42FX)株、大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX-L70V)株、大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX-F171D)株、大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX-E174R)株を得た。
(各種改変型アマドリアーゼの生産)
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株、もしくは大腸菌BL21(DE3)株を、0.1mMのIPTGを添加したLB-amp培地3mlにおいて、25℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
(各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価)
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、SDDS(東京化成工業社製)の終濃度を0.1%または0.15%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を下記の表に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表8において、CcFXは、大腸菌JM109(pKK223-3-CcFx)株由来のアマドリアーゼを示す。表9において、En42Fxは、大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌BL21(DE3)(pET22b-En42FX)株由来のアマドリアーゼであるEn42Fxを変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、En42Fxに既に導入済みの各種変異点は含めていない。
Figure 2022119761000025
Figure 2022119761000026
上記のとおり、CcFXについては、全ての変異が単独でSDDSに対する耐性向上をもたらした。またL71V変異はSDDSを添加しない場合(100%)と比較して、有意の活性増加を示した。したがってL71V変異はSDDSに対する耐性を向上させるのみならず、0.1%SDDS存在下でのアマドリアーゼ活性をさらに増強するといえる。CcFX-L71V変異体はSDDS存在下での活性が、SDDS不在下での活性(100%)を上回ったことから、SDSに対する耐性も調べたところ、未変異のCcFXは0.036%のSDSの存在下での残存活性が16.6%であるのに対して、CcFX-L71V変異体は0.036%のSDSの存在下で20.9%の残存活性を示し、SDS耐性が向上した。
またEn42Fxについては、L70V変異、F171D変異、及びE174R変異によりSDDSに対する耐性向上が見られた。これは、前述のアミノ酸置換によるアニオン性界面活性剤耐性の向上効果が、アマドリアーゼの由来を問わず発揮されることを意味する。
配列の簡単な説明
配列番号1 CFP-T7のアミノ酸配列
配列番号2 CFP-T7の遺伝子配列
配列番号3 Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号4 Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号5 Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号6 Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号7 Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号8 Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号9 Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号10 Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号11 Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号12 Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号13 Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号14 R9T-Fw
配列番号15 R9T-Rv
配列番号16 V12I-Fw
配列番号17 V12I-Rv
配列番号18 M71L-Fw
配列番号19 M71X-Rv
配列番号20 K80R-Fw
配列番号21 K80R-Rv
配列番号22 F172E-Fw
配列番号23 F172E-Rv
配列番号24 E175R-Fw
配列番号25 E175R-Rv
配列番号26 V279I-Fw
配列番号27 V279X-Rv
配列番号28 V28L-Fw
配列番号29 V28X-Rv
配列番号30 S30A-Fw
配列番号31 S30X-Rv
配列番号32 Q77D-Fw
配列番号33 Q77D-Rv
配列番号34 F43Y/E44P-Fw
配列番号35 E44X-Rv
配列番号36 H53N-Fw
配列番号37 H53X-Rv
配列番号38 E340P-Fw
配列番号39 E340X-Rv
配列番号40 F172E/E175R-Fw
配列番号41 V28LS30A-Fw
配列番号42 Q77D/K80R-Fw
配列番号43 Q77D/K80R-Rv
配列番号44 R9T/V12I/V13I-Fw
配列番号45 R9T/V12I/V13I-Rv
配列番号46 S3T/N4P-Fw
配列番号47 S3T/N4P/R9T/V12I/V13I-Rv
配列番号48 S154D-Fw
配列番号49 S154D-Rv
配列番号50 V257C/N262H-Fw
配列番号51 V257C/N262H-Rv
配列番号52 ΔPTS1-Fw
配列番号53 ΔPTS1-Rv
配列番号54 E98A-Fw
配列番号55 E98A-Rv
配列番号56 T9R/V12I/V13I-Fw
配列番号57 T9R/V12I/V13I-Rv
配列番号58 R9T/I12V/V13I-Fw
配列番号59 V13X-Rv
配列番号60 R9T/V12I/I13V-Fw
配列番号61 CET_V12X_Rv
配列番号62 CET_V12L_Fw
配列番号63 CET_V13X_Rv
配列番号64 CET_V13L_Fw
配列番号65 CET_V28X_Rv
配列番号66 CET_V28I_Fw
配列番号67 CET_V28M_Fw
配列番号68 CET_S30X_Rv
配列番号69 CET_S30T_Fw
配列番号70 CET_V30V_Fw
配列番号71 CET_M71X_Rv
配列番号72 CET_M71I_Fw
配列番号73 CET_M71A_Fw
配列番号74 CET_M71V_Fw
配列番号75 CET_M71C_Fw
配列番号76 CET_Q77X_Rv
配列番号77 CET_Q77E_Fw
配列番号78 CET_Q77K_Fw
配列番号79 CET_Q77K_Fw
配列番号80 E77N f
配列番号81 CET_K80X_Rv
配列番号82 CET_K80N_Fw
配列番号83 CET_K80Q_Fw
配列番号84 K80H f
配列番号85 CET_F172X_Rv
配列番号86 CET_F172D_Fw
配列番号87 CET_F172Y_Fw
配列番号88 CET_F172Q_Fw
配列番号89 CET_E175X_Rv
配列番号90 CET_E175K_Fw
配列番号91 CET_E175H_Fw
配列番号92 V279C f
配列番号93 V279C r
配列番号94 Cc-Pr protein
配列番号95 Cc-Gn gene
配列番号96 CcFx_V28X_Rv
配列番号97 CcFx_V28L_Fw
配列番号98 CcFx_V28M_Fw
配列番号99 CcFx_L71X_Rv
配列番号100 CcFx_L71A_Fw
配列番号101 CcFx_L71V_Fw
配列番号102 CcFx_R80X_Rv
配列番号103 CcFx_R80N_Fw
配列番号104 CcFx_R80Q_Fw
配列番号105 CcFx_Y172X_Rv
配列番号106 CcFx_Y172E_Fw
配列番号107 CcFx_Y172D_Fw
配列番号108 CcFx_A175X_Rv
配列番号109 CcFx_A175K_Fw
配列番号110 En-Pr protein
配列番号111 En-Gn gene
配列番号112 En-c1
配列番号113 En-c2
配列番号114 En-c3
配列番号115 En-c4
配列番号116 En_L70X_Rv
配列番号117 En_L70V_Fw
配列番号118 R9X_Rv
配列番号119 R9N_Fw
配列番号120 R9Q_Fw
配列番号121 F286X-Rv
配列番号122 F286Y-Fw
配列番号123 E44K_Rv
配列番号124 E44K_Fw
配列番号125 D194X_Rv
配列番号126 D194K_Fw
配列番号127 D194A_Fw
配列番号128 E204A_Rv
配列番号129 E204A_Fw
配列番号130 D338A_Rv
配列番号131 D338A_Fw
配列番号132 E340K_Rv
配列番号133 E340K_Fw
配列番号134 F171D_Rv
配列番号135 F171D_Fw
配列番号136 E174R_Rv
配列番号137 E174R_Fw
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (34)

  1. 以下からなる群より選択される、界面活性剤に対する耐性を有するアマドリアーゼ、
    (i)ドデシル硫酸ナトリウムを終濃度0.03%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)が、ドデシル硫酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して20%以上残存しており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (ii) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii) 前記(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iv) 前記(iii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号94又は配列番号110のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
    (v) 前記(iv)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号94又は配列番号110のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位~32位、36~41位、49~52位、54~58位、63~65位、73~75位、84~86位、88~90位、120~122位、145~150位、156~162位、164~170位、180~182位、202~205位、207~211位、214~224位、227~230位、236~241位、243~248位、258~261位、266~268位、270~273位、275~287位、295~297位、306~308位、310~316位、324~329位、332~334位、341~344位、346~355位、357~363位、370~383位、385~387位、389~394位、405~410位及び423~431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつ糖化基質に対する活性を有するアマドリアーゼ、並びに
    (vi) 前記(ii)~(v)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位、71位、175位、172位、279位、12位、9位、77位、30位、28位、13位、3位、4位、286位、204位、338位、44位、340位及び194位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されているアマドリアーゼ及び当該位置のアミノ酸が置換されていないアマドリアーゼについてドデカノイルサルコシン酸ナトリウムを終濃度0.15%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)同士の数値比較において、前記アミノ酸置換を有しないアマドリアーゼと比較して3%以上、残存活性が向上しているアマドリアーゼ。
  2. アマドリアーゼが以下からなる群、
    (a) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
    (b) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
    (c) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンである、
    (d) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
    (e) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における279位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
    (f) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
    (g) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
    (h) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
    (i) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンである、
    (j) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
    (k) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンである、
    (l) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における3位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
    (m) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
    (n) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン若しくはトリプトファンである、
    (o) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
    (p) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
    (q) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、
    (r) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンである、並びに
    (s) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである、
    より選択される1以上を有する、請求項1に記載のアマドリアーゼ。
  3. アマドリアーゼが、以下からなる群、
    (a) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンである、
    (b) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン若しくはシステインである、
    (c) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、リシン若しくはヒスチジンである、
    (d) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン若しくはグルタミンである、
    (e) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における279位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはシステインである、
    (f) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはロイシンである、及び
    (g) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンである、
    (h) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン若しくはアスパラギンである、
    (i) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン若しくはバリンである、
    (j) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン若しくはメチオニンである、
    (k) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
    (l) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
    (m) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    (n) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    (o) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
    (p) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
    (q) 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
    より選択される1以上を有する、請求項2に記載のアマドリアーゼ。
  4. アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位に対応する位置のアミノ酸及び71位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、請求項1に記載のアマドリアーゼ。
  5. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニン、アスパラギン、グルタミン若しくはヒスチジンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、バリン若しくはシステインである、
    請求項4に記載のアマドリアーゼ。
  6. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における80位のリシンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における71位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
    請求項5に記載のアマドリアーゼ。
  7. さらに、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、請求項4~6のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  8. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸である、請求項6または7に記載のアマドリアーゼ。
  9. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における77位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸である、請求項8に記載のアマドリアーゼ。
  10. アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位に対応する位置のアミノ酸及び172位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、請求項1~9のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  11. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはリシンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸若しくはアスパラギン酸である、
    請求項10に記載のアマドリアーゼ。
  12. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における175位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における172位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸である、
    請求項11に記載のアマドリアーゼ。
  13. アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位に対応する位置のアミノ酸及び28位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、請求項1~12のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  14. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン若しくはシステインである、
    請求項13に記載のアマドリアーゼ。
  15. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における30位のセリンに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における28位のバリンに対応する位置のアミノ酸がロイシンである、
    請求項14に記載のアマドリアーゼ。
  16. アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位に対応する位置のアミノ酸、9位に対応する位置のアミノ酸、13位に対応する位置のアミノ酸、3位に対応する位置のアミノ酸及び4位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、かつ糖化基質に対する活性を有する、請求項1~15のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  17. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニン、セリン、アスパラギン若しくはグルタミンであり、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、システイン若しくはメチオニンであり、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における3位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
    請求項16に記載のアマドリアーゼ。
  18. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における12位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における9位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における13位のバリンに対応する位置のアミノ酸がイソロイシンであり、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における3位のセリンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における4位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がプロリンである、
    請求項17に記載のアマドリアーゼ。
  19. 配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における286位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシンである、請求項1~18のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  20. さらに、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における204位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における338位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸がリシンである、並びに
    配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における194位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸がリシン若しくはアラニンである、
    請求項1~19のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  21. 界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、請求項1~20のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  22. 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、請求項1~21のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  23. 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号94又は配列番号110に示すアミノ酸配列を有し、請求項1~20のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、請求項1~21のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。
  24. 請求項1~23のいずれか1項に記載のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼをコードするアマドリアーゼ遺伝子。
  25. 以下の工程:
    (i)請求項24に記載の遺伝子が形質導入された宿主細胞を培養する工程;
    (ii)宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程;及び
    (iii)培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
  26. 請求項1~23のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。
  27. 1以上のアニオン性界面活性剤を含む、請求項26に記載の組成物。
  28. 界面活性剤が、25℃において130mM以下の臨界ミセル濃度を有するものである、請求項27記載の組成物。
  29. アニオン性界面活性剤が、以下からなる群、
    次の一般式(I)で表される硫酸エステル化合物、
    Figure 2022119761000027
    [式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    次の一般式(II)で表されるベンゼンスルホン酸塩化合物、
    Figure 2022119761000028
    [式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    次の一般式(III)で表されるアシルサルコシン酸塩化合物、
    Figure 2022119761000029
    [式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    次の一般式(IV)で表されるホスホン酸塩化合物、
    Figure 2022119761000030
    [式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール、又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    次の一般式(V)で表されるスルホコハク酸塩化合物、
    Figure 2022119761000031
    [式中、R1及びR2は、それぞれ独立に、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    次の一般式(VI)で表されるカルボン酸塩化合物、
    Figure 2022119761000032
    [式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    次の一般式(VII)で表されるスルホン酸塩化合物、
    Figure 2022119761000033
    [式中、R1は、置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐鎖のC1~C30アルキル、C3~C30環状アルキル、直鎖若しくは分岐鎖のC2~C30アルケニル、C3~C30環状アルケニル、C6~C30アリール又はC7~C30アリーレンを表し、Z+は対イオンである]
    コール酸塩、デオキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩及びタウロデオキシコール酸塩、アシルグルタミン酸塩、アシルメチルアラニン塩、アシルグリシン塩、アシルメチルタウリン塩並びにこれらの誘導体、
    より選択される1以上のアニオン性界面活性剤である、請求項27又は28に記載の組成物。
  30. 請求項1~23のいずれかに記載のアマドリアーゼを用いる、糖化ヘモグロビンの測定方法。
  31. コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウムを含む、請求項26に記載の組成物。
  32. コール酸ナトリウムを終濃度0.5~1.5%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後のアマドリアーゼの残存活性(%)が、コール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して100%以上である、又は
    デオキシコール酸ナトリウムを終濃度0.3~2.0%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後のアマドリアーゼの残存活性(%)が、デオキシコール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して100%以上である、請求項31に記載の組成物。
  33. コール酸ナトリウム及びアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物。
  34. コール酸ナトリウムを終濃度0.5~1.5%(w/v)となるよう添加してから、30℃、5分後のアマドリアーゼの残存活性(%)が、コール酸ナトリウムを添加しない場合(100%)と比較して100%以上である、請求項33に記載の組成物。
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