KR20130107268A

KR20130107268A - 당화 헤모글로빈의 측정 방법

Info

Publication number: KR20130107268A
Application number: KR1020137002549A
Authority: KR
Inventors: 도모미 무라카미; 하루요 소야; 유 오스기; 아야코 요다; 하루키 츠노다; 마사시 마츠시타
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 2010-08-11
Filing date: 2011-08-09
Publication date: 2013-10-01
Also published as: EP2604698A4; BR112013001398A2; CN103124793B; JP5871800B2; JPWO2012020744A1; US20130171676A1; CA2806261A1; EP2604698A1; CN103124793A; WO2012020744A1

Abstract

헤모글로빈 함유 시료에, 계면활성제 존재하에 단백질 분해 효소를 작용시킨 후, 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응에 있어서, 당해 반응을 이소티아졸리논 유도체 존재하에 실시하여, 생성된 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법.
본 발명에 의해 헤모글로빈의 영향을 받지 않고, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 또한 고감도로 측정하는 방법이 제공된다.

Description

당화 헤모글로빈의 측정 방법{METHOD FOR MEASURING GLYCATED HEMOGLOBIN}

본 발명은 당화 (糖化) 헤모글로빈의 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트에 관한 것이다.

당화 헤모글로빈은 헤모글로빈에 글루코오스가 결합된 당화물이다. 헤모글로빈은 α 사슬, β 사슬로 이루어지는 4 량체의 구조를 취하고 있는데, β 사슬의 N 말단이 당화된 것은 헤모글로빈 A1c 라 불리며, 혈당치가 높을수록 증가하므로 당뇨병 마커로서 임상 검사에 있어서 측정되고 있다.

당화 헤모글로빈의 측정 방법으로는, HPLC 법 등의 크로마토그래피법, 전기 영동법, 라텍스 면역 응집법 등 항체를 이용하는 면역 측정법, 당화 단백질에 작용하는 효소와 당화 펩티드 및/또는 당화 아미노산에 작용하는 효소를 사용하는 효소 측정법 등이 알려져 있다.

당화 헤모글로빈의 효소 측정법으로는, 먼저, 헤모글로빈 함유 시료 중의 헤모글로빈을 변성제에 의해 변성시키고, 변성된 헤모글로빈에 단백질 분해 효소를 작용시키고, 이어서 생성된 당화 펩티드에 당화 펩티드 산화 효소를 작용시키고, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하에, 산화 발색형 색원체와 반응시켜서 색소로 유도하고, 생성된 색소의 흡광도로부터 당화 헤모글로빈을 측정하는 방법 (흡광도법) 등이 알려져 있다.

그러나, 이 흡광도법에 의한 당화 헤모글로빈의 측정에 있어서는, 시료 중에 대량으로 존재하는 헤모글로빈의 간섭이 문제가 된다. 이 과제에 대한 해결 수단으로는, 예를 들면, 카티온성 계면활성제 및/또는 양쪽성 계면활성제를 사용하는 방법 (특허문헌 1), 술폰 화합물 및/또는 니트로 화합물을 사용하는 방법 (특허문헌 2, 특허문헌 3), 테트라졸륨 화합물을 사용하는 방법 (특허문헌 4), 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염류 등의 특정 음이온계 계면활성제를 사용하는 방법 (특허문헌 5) 등이 알려져 있다.

그러나, 이들 방법에 있어서도 반드시 헤모글로빈의 영향이 회피되는 것은 아니고, 헤모글로빈의 영향을 받지 않는, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 정확한 측정 방법이 요구되고 있다.

일본 공개특허공보 평3-010696호 WO2003/107011 팜플렛 일본 공개특허공보 2007-147630호 일본 공개특허공보 2000-210100호 WO2005/049858 팜플렛

본 발명의 목적은 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을, 헤모글로빈의 영향을 받지 않고, 정확하게 또한 고감도로 측정하기 위한 방법 및 시약을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 예의 검토한 바, 계면활성제 존재하에 헤모글로빈 함유 시료에 단백질 분해 효소를 작용시킨 후, 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응에 있어서, 당해 반응을 이소티아졸리논 유도체 존재하에 실시하여, 생성된 과산화수소를 측정함으로써, 헤모글로빈의 영향을 받지 않고, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 또한 고감도로 측정할 수 있다는 지견을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 [1] ∼ [15] 에 관한 것이다.

[1] 헤모글로빈 함유 시료에, 계면활성제 존재하에 단백질 분해 효소를 작용시킨 후, 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응에 있어서, 당해 반응을 이소티아졸리논 유도체 존재하에 실시하여, 생성된 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법.

[2] 이소티아졸리논 유도체가 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물인 [1] 에 기재된 측정 방법.

[화학식 1]

식 중, A¹ 은 수소 원자, 또는 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, A² 와 A³ 은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 할로겐 원자를 나타내거나 또는 하나가 되어 고리 구조를 형성한다)

[3] 식 (I) 로 나타내는 화합물이 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 및 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온으로 이루어지는 군에서 선택되는 이소티아졸리논 유도체인 [2] 에 기재된 측정 방법.

[4] 과산화수소의 측정이 과산화수소 측정 시약에 의해 실시되는 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[5] 과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 [4] 에 기재된 측정 방법.

[6] 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 시약으로서, 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 시약.

[7] 이소티아졸리논 유도체가 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물인 [6] 에 기재된 측정 시약.

[화학식 2]

[8] 식 (I) 로 나타내는 화합물이 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 및 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온으로 이루어지는 군에서 선택되는 이소티아졸리논 유도체인 [7] 에 기재된 측정 시약.

[9] 추가로 과산화수소 측정 시약을 포함하는 [6] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 측정 시약.

[10] 과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 [9] 에 기재된 시약.

[11] 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 키트로서, 단백질 분해 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 키트.

[12] 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 키트로서, 단백질 분해 효소 및 계면활성제를 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소 및 이소티아졸리논 유도체를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 키트.

[13] 이소티아졸리논 유도체가 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물인 [11] 또는 [12] 에 기재된 측정 키트.

[화학식 3]

(식 중, A¹ 은 수소 원자, 또는 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, A² 와 A³ 은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 할로겐 원자를 나타내거나 또는 하나가 되어 고리 구조를 형성한다)

[14] 식 (I) 로 나타내는 화합물이 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 및 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온으로 이루어지는 군에서 선택되는 이소티아졸리논 유도체인 [13] 에 기재된 측정 키트.

[15] 추가로 퍼옥시다아제 및 류코형 색원체가 각각 제 1 시약과 제 2 시약, 또는 제 2 시약과 제 1 시약에 포함되는 [11] ∼ [14] 중 어느 하나에 기재된 측정 키트.

본 발명에 의해, 헤모글로빈의 영향을 받지 않고, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 또한 고감도로 측정하기 위한 방법, 시약 및 키트가 제공된다.

도 1 은 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 검체 중의 헤모글로빈 A1c (이하, HbA1c 라고도 기재한다) 의 측정에 있어서의 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ● 는 비교예 1 의 키트, △ 는 실시예 1 의 키트, ■ 는 실시예 2 의 키트를 사용한 측정을 각각 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10^-4 Abs) 를, 가로축은 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖) 를 나타낸다.
도 2 는 실시예 9, 실시예 10 및 비교예 5 의 키트를 사용하는 검체 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ● 는 비교예 5 의 키트, ▲ 는 실시예 9 의 키트, □ 는 실시예 10 의 키트를 사용한 측정을 각각 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10^-4 Abs) 를, 가로축은 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖) 를 나타낸다.
도 3 은 실시예 7, 실시예 8 및 비교예 4 의 키트를 사용하는 검체 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ● 는 비교예 4 의 키트, △ 는 실시예 7 의 키트, ■ 는 실시예 8 의 키트를 사용한 측정을 각각 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10^-4 Abs) 를, 가로축은 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖) 를 나타낸다.
도 4 는 실시예 15, 실시예 16 및 비교예 8 의 키트를 사용하는 검체 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ● 는 비교예 8 의 키트, ▲ 는 실시예 15 의 키트, ■ 는 실시예 16 의 키트를 사용한 측정을 각각 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10^-4 Abs) 를, 가로축은 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖) 를 나타낸다.
도 5 는 실시예 21, 실시예 22 및 비교예 11 의 키트를 사용하는 검체 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ● 는 비교예 11 의 키트, ■ 는 실시예 21 의 키트, ▲ 는 실시예 22 의 키트를 사용한 측정을 각각 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10^-4 Abs) 를, 가로축은 헤모글로빈 농도 (㎎/㎖) 를 나타낸다.

(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법

본 발명의, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법은, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에, 계면활성제 존재하에 단백질 분해 효소를 작용시킨 후, 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응에 있어서, 당해 반응을 이소티아졸리논 유도체 존재하에 실시하여, 생성되는 과산화수소를 측정하는 방법이다. 이소티아졸리논 유도체는 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응에 존재시켜도 되고, 단백질 분해 효소를 작용시키는 반응과 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응의 양방의 반응에 존재시켜도 된다.

구체적으로는 이하의 공정을 포함하는 측정 방법이 예시된다.

＜측정 방법 1＞

(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에, 계면활성제 존재하에 단백질 분해 효소를 작용시키는 공정；

(2) 공정 (1) 에서 얻어지는 반응 생성물에, 이소티아졸리논 유도체 존재하에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정；

(3) 공정 (2) 에서 생성된 과산화수소를 측정하는 공정；및,

(4) 이미 알려진 농도의 당화 헤모글로빈을 사용하여 미리 작성한, 과산화수소량과 당화 헤모글로빈 농도의 관계를 나타내는 검량선에 기초하여, 공정 (3) 에서 측정한 과산화수소량으로부터 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 농도를 결정하는 공정.

＜측정 방법 2＞

(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제의 존재하에 단백질 분해 효소를 작용시키는 공정；

(2) 공정 (1) 에서 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소와 반응시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정；

(3) 공정 (2) 에서 생성된 과산화수소를 측정하는 공정；및,

또, 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법은, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 양의 총 헤모글로빈 (즉, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 합한 총 헤모글로빈) 양에 대한 비율을 산출하는 방법도 포함한다. 이 경우, 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법은 구체적으로는 이하의 공정을 포함하는 측정 방법이다.

＜측정 방법 3＞

(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 총 헤모글로빈 (즉, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 합한 총 헤모글로빈) 양을 결정하는 공정；

(2) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에, 계면활성제 존재하, 단백질 분해 효소를 작용시키는 공정；

(3) 공정 (2) 에서 얻어지는 반응 생성물에, 이소티아졸리논 유도체 존재하에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정；

(4) 공정 (3) 에서 생성된 과산화수소를 측정하는 공정；및,

(5) 이미 알려진 양의 당화 헤모글로빈을 사용하여 미리 작성한, 과산화수소량과 당화 헤모글로빈 양의 관계를 나타내는 검량선에 기초하여, 공정 (4) 에서 측정한 과산화수소량으로부터 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 양을 결정하는 공정；및,

(6) 공정 (1) 에서 결정한 총 헤모글로빈 양과 공정 (5) 에서 결정한 당화 헤모글로빈 양으로부터, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 양의 총 헤모글로빈 양에 대한 비율을 산출하는 공정.

상기 공정 (1) 의 총 헤모글로빈 양의 결정은 공정 (2) 후에 실시할 수도 있다.

＜측정 방법 4＞

(2) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에, 이소티아졸리논 유도체와 계면활성제 존재하, 단백질 분해 효소를 작용시키는 공정；

(3) 공정 (2) 에서 얻어지는 반응 생성물에, 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정；

(4) 공정 (3) 에서 생성된 과산화수소를 측정하는 공정；및,

본 발명의 측정 방법에 있어서의 헤모글로빈 함유 시료는 헤모글로빈을 함유하고, 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법이 적용 가능한 시료이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 전혈, 혈구, 혈구에 혈장이 혼재된 시료, 이들 시료를 용혈 처리한 시료 등을 들 수 있다. 용혈 처리로는, 전혈, 혈구, 혈구에 혈장이 혼재된 시료를 용혈시키는 처리이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 물리적 방법, 화학적 방법, 생물학적 방법 등을 들 수 있다. 물리적 방법으로는, 예를 들면, 증류수 등의 저장액 (低張液) 을 사용하는 방법, 초음파를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 화학적 방법으로는, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 유기 용매를 사용하는 방법, 폴리옥시에틸렌계 계면활성제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 생물학적 방법으로는, 예를 들면, 항체나 보체 (補體) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 당화 헤모글로빈은 헤모글로빈에 글루코오스 등의 당이 결합되어 생성된 것으로, 헤모글로빈 A1a, 헤모글로빈 A1b, 헤모글로빈 A1c 등을 들 수 있고, 헤모글로빈 A1c 가 바람직하다.

본 발명에 있어서의 이소티아졸리논 유도체로는, 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법을 가능하게 하는 이소티아졸리논 유도체이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물 [이하, 화합물 (I) 이라 한다] 을 들 수 있다.

[화학식 4]

화합물 (I) 에 있어서의 A¹ 은 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, A² 와 A³ 은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 할로겐 원자를 나타내거나 또는 하나가 되어 고리 구조를 형성한다. 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 에이코실 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐, 이소데실, 이소운데실, 이소도데실, 이소트리데실, 이소테트라데실, 이소펜타데실, 이소헥사데실, 이소헵타데실, 이소옥타데실, 이소노나데실, 이소에이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다. 치환 알킬에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 전술한 할로겐 원자 등을 들 수 있다.

A² 와 A³ 이 하나가 되어 형성되는 고리 구조로는, 예를 들면, 벤젠 고리, 나프탈렌 고리 등을 들 수 있다.

화합물 (I) 의 구체예로는, 예를 들면, 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온, 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온 등을 들 수 있다. 시판되는 화합물 (I) 로는, 예를 들면, 2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 (도쿄 카세이사 제조), 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 (와코 준야쿠 공업사 제조), 4,5-디클로로-2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 (하이켐사 제조) 등을 들 수 있다.

본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 있어서, 이소티아졸리논 유도체의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한되지 않지만, 통상적으로 0.005 ∼ 20 m㏖/ℓ 이며, 바람직하게는 0.01 ∼ 10 m㏖/ℓ 이다.

본 발명에 있어서의 계면활성제로는, 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법을 가능하게 하는 계면활성제이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 등을 들 수 있다.

양이온성 계면활성제로는, 예를 들면, 제 4 급 암모늄염, 피리디늄염, 포스포늄염, 이미다졸륨염, 이소퀴놀리늄염 등을 들 수 있고, 제 4 급 암모늄염, 피리디늄염, 포스포늄염이 바람직하다.

제 4 급 암모늄염으로는, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬을 적어도 하나 갖는 제 4 급 암모늄염이 바람직하다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 에이코실 등을 들 수 있다.

제 4 급 암모늄염의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 데실트리메틸암모늄클로라이드, 데실트리메틸암모늄브로마이드 (이하, C10TMA 라고 기재한다), 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄브로마이드, 디도데실디메틸암모늄클로라이드, 디도데실디메틸암모늄브로마이드 (모두, 도쿄 카세이사 제조) 등을 들 수 있다.

피리디늄염으로는, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 피리디늄염 [이하, 화합물 (II) 라 한다] 이 사용된다.

[화학식 5]

식 중, R¹ 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐, R_a 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐, n 은 1 ∼ 5 의 정수, X^- 는 1 가의 아니온을 각각 나타낸다.

R¹ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있고, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬이 바람직하다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 에이코실 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐, 이소데실, 이소운데실, 이소도데실, 이소트리데실, 이소테트라데실, 이소펜타데실, 이소헥사데실, 이소헵타데실, 이소옥타데실, 이소노나데실, 이소에이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 이소옥틸, 이소노닐, 이소데실, 이소운데실, 이소도데실, 이소트리데실, 이소테트라데실, 이소펜타데실, 이소헥사데실, 이소헵타데실, 이소옥타데실, 이소노나데실, 이소에이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다.

R¹ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있고, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐이 바람직하다. 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 비닐, 프로페닐, 알릴, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 올레일, 노나데세닐, 에이코세닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 올레일, 노나데세닐, 에이코세닐 등을 들 수 있다.

R¹ 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

R_a 에있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.

R_a 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐에로는, 예를 들면, 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 2 ∼ 20 의 직사슬 알케닐 등을 들 수 있다.

R_a 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

피리딘 고리 상에 2 이상의 치환기가 있는 경우, 치환기는 동일해도 되고 상이해도 된다. 화합물 (II) 에 있어서의 X^- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온, OH^-, PF₆ ^-, BF₄ ^-, CH₃CH₂OSO₃ ^-, (CF₃SO₂)₂N^- 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl^-, Br^-, I^- 등을 들 수 있다.

화합물 (II) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 1-도데실피리디늄클로라이드 (이하, C12py 라고 기재한다；도쿄 카세이사 제조), 1-세틸피리디늄클로라이드, 1-세틸-4-메틸피리디늄클로라이드 (도쿄 카세이사 제조), N-옥타데실-4-스틸바졸브로마이드 (도쿄 카세이사 제조) 등을 들 수 있다.

포스포늄염으로는, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 포스포늄염 [이하, 화합물 (III) 이라 한다] 이 사용된다.

[화학식 6]

식 중, R² ∼R⁵ 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내는, Y^- 는 1 가의 아니온을 각각 나타낸다.

R² 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 치환 알킬에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

R³ ∼R⁵ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 치환 알킬에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

Y^- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온, OH^-, PF₆ ^-, BF₄ ^-, CH₃CH₂OSO₃ ^-, (CF₃SO₂)₂N^-, B(C₆H₅)₄ ^-, 벤조트리아졸레이트 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl^-, Br^-, I^- 등을 들 수 있다.

화합물 (III) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 테트라옥틸포스포늄브로마이드 (도쿄 카세이사 제조), 트리부틸옥틸포스포늄브로마이드 (도쿄 카세이사 제조), 트리부틸도데실포스포늄브로마이드, 트리부틸헥사데실포스포늄브로마이드 등을 들 수 있다.

이미다졸륨염으로는, 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이미다졸륨염 [이하, 화합물 (IV) 라 한다] 이 사용된다.

[화학식 7]

식 중, R⁶ 과 R⁸ 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R⁷, R⁹, R¹⁰ 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z^- 는 1 가의 아니온을 나타낸다.

R⁶ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.

R⁶ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.

R⁶ 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

R⁷, R⁸, R⁹ 및 R¹⁰ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 전술한 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.

R⁷, R⁸, R⁹ 및 R¹⁰ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.

R⁷, R⁸, R⁹ 및 R¹⁰ 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

Z^- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온, OH^-, PF₆ ^-, BF₄ ^-, CH₃CH₂OSO₃ ^-, (CF₃SO₂)₂N^-, (CH₃O)₂P(=O)O^-, B(C₆H₅)₄ ^-, FeCl₄ ^-, CF₃BF₃ ^-, CF₃SO₃ ^-, (NC)₂N^-, CH₃(OCH₂CH₂)₂OSO₃ ^-, CH₃CH₂OSO₃ ^-, HSO₄ ^-, p-CH₃C₆H₄SO₃ ^- 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl^-, Br^-, I^- 등을 들 수 있다.

화합물 (IV) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨브로마이드 (도쿄 카세이사 제조), 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨클로라이드 (도쿄 카세이사 제조), 1-도데실-2-메틸-3-벤질이미다졸륨클로라이드 등을 들 수 있다.

이소퀴놀리늄염으로는, 이하의 일반식 (V) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염 [이하, 화합물 (V) 라 한다] 이 사용된다.

[화학식 8]

식 중, R¹¹ 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W^- 는 1 가의 아니온을 나타낸다.

R¹¹ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.

R¹¹ 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.

R¹¹ 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.

W^- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl^-, Br^-, I^- 등을 들 수 있다.

화합물 (V) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, N-라우릴이소퀴놀리늄클로라이드 (니치유사 제조), N-라르릴이소퀴놀리늄브로마이드 (니치유사 제조) 등을 들 수 있다.

음이온성 계면활성제로는, 예를 들면, 황산에스테르염, 카르복실산염, 술폰산염, 인산에스테르염, 술포숙신산염, N-메틸타우린염, N-알카노일-N-메틸타우린염 등을 들 수 있다.

양쪽성 계면활성제로는, 예를 들면, 제 3 급 아민옥사이드, 알킬카르복시베타인 등을 들 수 있다.

비이온성 계면활성제로는, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알케닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 에틸렌디아민테트라폴리옥시에틸렌, 폴리글리세린지방산에스테르 등을 들 수 있고, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 폴리옥시에틸렌알킬에테르가 바람직하다.

폴리옥시에틸렌알킬아민에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬로는, 예를 들면, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 에이코실 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알케닐아민에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 올레일, 노나데세닐, 에이코세닐 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알킬에테르에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알케닐에테르에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬 등을 들 수 있다.

총 헤모글로빈 양은 공지된 방법, 예를 들면 시안메트헤모글로빈법, 옥시헤모글로빈법, SLS-헤모글로빈법 등에 의해 결정할 수 있다. 총 헤모글로빈 양은, 헤모글로빈 함유 시료 그 자체뿐만 아니라, 헤모글로빈 함유 시료에 이소티아졸리논 유도체 및/또는 계면활성제를 첨가하여 얻어지는 시료, 헤모글로빈 함유 시료에 이소티아졸리논 유도체 및/또는 계면활성제와 단백질 분해 효소를 첨가하여 얻어지는 시료에 대해, 시안메트헤모글로빈법, 옥시헤모글로빈법, SLS-헤모글로빈법을 적용함으로써도 결정할 수 있다.

헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에, 상기 계면활성제 존재하, 단백질 분해 효소를 작용시키는 반응은, 상기 계면활성제 존재하에 단백질 분해 효소가 당화 헤모글로빈에 작용할 수 있는 조건이면, 어떠한 조건하에서도 실시할 수 있다. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응은 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다. 수성 매체로는, 후술하는 수성 매체 등을 들 수 있다. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응에 있어서의 반응 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃ 이며, 20 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 반응 시간은 통상적으로 1 분간 ∼ 3 시간이며, 2.5 분간 ∼ 1 시간이 바람직하다. 단백질 분해 효소의 농도로는, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응이 진행되는 농도이면 특별히 제한되지는 않고, 통상적으로 50 ∼ 25000 kU/ℓ 이며, 바람직하게는 250 ∼ 10000 kU/ℓ 이다.

단백질 분해 효소로는, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에 작용하고, 당화 헤모글로빈으로부터 당화 펩티드를 생성시키는 효소이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 세린프로테아제 (키모트립신, 서브틸리신 등), 시스테인프로테아제 (파파인, 카스파아제 등), 아스파르트산프로테아제 (펩신, 카텝신 D 등), 메탈로프로테아제 (서몰리신 등), N-말단 트레오닌프로테아제, 글루탐산프로테아제 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 시판되는 단백질 분해 효소도 사용할 수 있으며, 시판품으로는, 예를 들면 프로테아제 P 「아마노」 3G, 프로테아제 K 「아마노」 (이상, 아마노 엔자임사 제조), 액티나아제 AS, 액티나아제 E (이상, 카켄 파머사 제조), 서몰리신 (다이와 카세이사 제조), 수미자임 MP (신니혼 화학 공업사 제조) 등을 들 수 있다.

상기 단백질 분해 효소를 작용시키는 반응에 있어서의 계면활성제의 농도로는, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응이 진행되는 농도이면 특별히 제한되지는 않고, 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이며, 바람직하게는 0.0005 ∼ 5 ％ 이다.

헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응에 의해, 당화 펩티드를 포함하는 반응 생성물이 생성된다. 이어서, 이 반응 생성물 중의 당화 펩티드에 프럭토실펩티드 산화 효소와 반응하여, 과산화수소가 생성된다. 당화 펩티드와 프럭토실펩티드 산화 효소의 반응은 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다. 수성 매체로는, 후술하는 수성 매체 등을 들 수 있다.

당화 펩티드와 프럭토실펩티드 산화 효소의 반응에 있어서의 반응 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃ 이며, 20 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 반응 시간은 통상적으로 1 분간 ∼ 3 시간이며, 2.5 분간 ∼ 1 시간이 바람직하다. 프럭토실펩티드 산화 효소의 농도로는, 당화 헤모글로빈과 프럭토실펩티드 산화 효소의 반응이 진행되는 농도이면 특별히 제한되지는 않고, 통상적으로 0.1 ∼ 30 kU/ℓ 이며, 바람직하게는 0.2 ∼ 15 kU/ℓ 이다.

프럭토실펩티드 산화 효소로는, 당화 펩티드에 작용하여 과산화수소를 생성시키는 효소이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 사상균 유래, 효모 유래, 방선균 유래, 박테리아 유래, 고세균 유래의 프럭토실펩티드 산화 효소 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 시판되는 프럭토실펩티드 산화 효소도 사용할 수 있으며, 시판품으로는, 예를 들면, FPOX-CE (키코만사 제조), FPOX-EE (키코만사 제조), FPOX-CET (키코만사 제조) 등을 들 수 있다.

생성된 과산화수소의 측정 방법으로는, 예를 들면, 전극을 사용하는 방법, 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 방법 등을 들 수 있고, 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 방법이 바람직하다. 과산화수소 측정용 시약은 과산화수소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들면, 색소, 광 (발광), 형광 등을 들 수 있고, 색소가 바람직하다.

검출 가능한 물질이 색소인 경우, 과산화수소 측정용 시약은 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질과 산화 발색형 색원체를 포함하는 시약 등을 들 수 있다. 산화 발색형 색원체로는, 산화 커플링형 색원체, 류코형 색원체 등을 들 수 있고, 류코형 색원체가 바람직하다. 류코형 색원체로는, 예를 들면, 페노티아진계 색원체, 트리페닐메탄계 색원체, 디페닐아민계 색원체, o-페닐렌디아민, 하이드록시프로피온산, 디아미노벤지딘, 테트라메틸벤지딘 등을 들 수 있고, 페노티아진계 색원체가 바람직하다. 페노티아진계 색원체로는, 예를 들면, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염 (DA-67) 등을 들 수 있다. 페노티아진계 색원체 중에서도, 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염 (DA-67) 이 특히 바람직하다. 트리페닐메탄계 색원체로는, 예를 들면, N,N,N',N',N'',N''-헥사(3-술포프로필)-4,4',4''-트리아미노트리페닐메탄 (TPM-PS) 등을 들 수 있다. 디페닐아민계 색원체로는, 예를 들면, N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.

검출 가능한 물질이 광 (발광) 인 경우, 과산화수소 측정용 시약은 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질과 화학 발광 물질을 포함하는 시약 등을 들 수 있다. 화학 발광 물질로는, 예를 들면, 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등을 들 수 있다.

검출 가능한 물질이 형광인 경우, 과산화수소 측정용 시약은 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질과 형광 물질을 포함하는 시약 등을 들 수 있다. 형광 물질로는, 예를 들면, 4-하이드록시페닐아세트산, 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산, 쿠마린 등을 들 수 있다.

(2) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 시약

본 발명의, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 시약은 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 포함하는 시약이며, 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 사용된다. 본 발명의 측정 시약은 추가로 과산화수소 측정 시약을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 측정 시약에 있어서의 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 이소티아졸리논 유도체, 계면활성제 및 과산화수소 측정 시약으로는, 예를 들면, 각각, 전술한 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 이소티아졸리논 유도체, 계면활성제 및 과산화수소 측정 시약 등을 들 수 있다.

본 발명의 측정 시약에 있어서의 단백질 분해 효소의 농도는 통상적으로 50 ∼ 25000 kU/ℓ 이며, 바람직하게는 250 ∼ 10000 kU/ℓ 이다. 본 발명의 측정 시약에 있어서의 프럭토실펩티드 산화 효소의 농도는 통상적으로 0.1 ∼ 30 kU/ℓ 이며, 바람직하게는 0.2 ∼ 15 kU/ℓ 이다.

본 발명의 측정 시약에 있어서의 이소티아졸리논 유도체의 농도는 통상적으로 0.005 ∼ 20 m㏖/ℓ 이며, 바람직하게는 0.01 ∼ 10 m㏖/ℓ 이다.

본 발명의 측정 시약에 있어서의 계면활성제의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이며, 바람직하게는 0.0005 ∼ 5 ％ 이다.

본 발명의 측정 시약에는, 필요에 따라, 수성 매체, 안정화제, 방부제, 염류, 간섭 물질 소거제, 유기 용매 등이 함유되어도 된다.

수성 매체로는, 예를 들면, 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다.

수성 매체의 pH 는 예를 들면 pH 4 ∼ 10 이다. 수성 매체로서 완충액을 사용하는 경우에는, 설정하는 pH 에 따른 완충제를 사용하는 것이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들면, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.

굿 완충제로는, 예를 들면, 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-하이드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-하이드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산[(H)EPPS], N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.

완충액의 농도는 통상적으로 0.001 ∼ 2.0 mol/ℓ 이며, 0.005 ∼ 1.0 mol/ℓ가 바람직하다.

안정화제로는, 예를 들면, 에틸렌디아민아세트산 (EDTA), 슈크로오스, 염화칼슘, 아세트산칼슘, 질산칼슘, 페로시안화칼륨, 소혈청 알부민 (BSA), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌계 계면활성제 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들면, 아지화나트륨, 항생 물질 등을 들 수 있다. 염류로는, 예를 들면, 염화나트륨, 질산나트륨, 황산나트륨, 탄산나트륨, 포름산나트륨, 아세트산나트륨, 염화칼륨, 질산칼륨, 황산칼륨, 탄산칼륨, 포름산칼륨, 아세트산칼륨 등을 들 수 있다. 간섭 물질 소거제로는, 예를 들면, 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산옥시다아제 등을 들 수 있다. 유기 용매로는, 예를 들면, 류코형 색원체의 수성 매체에 대한 용해 보조제를 위한 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸술폭사이드 (DMSO), 디옥산, 아세톤, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있다.

(3) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 키트

본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 시약은 키트의 형태로 보존, 유통 및 사용되어도 된다. 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 키트는 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 사용된다. 본 발명의 측정 키트로는, 예를 들면, 2 시약계 키트, 3 시약계 키트 등을 들 수 있고, 2 시약계 키트가 바람직하다.

본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 키트는 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 방법을 가능하게 하는 키트이면 특별히 제한되지는 않고, 2 시약계 키트인 경우에는, 예를 들면, 단백질 분해 효소를 함유하는 제 1 시약과 프럭토실펩티드 산화 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 키트나, 단백질 분해 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 함유하는 제 1 시약과 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 키트 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 당화 헤모글로빈 측정 키트로서, 이들 키트의 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양방에 과산화수소 측정 시약이 포함되는 키트를 들 수 있다. 특히, 과산화수소 측정 시약으로서 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약을 사용하는 경우에는, 퍼옥시다아제와 류코형 색원체는 각각의 시약에 포함되는 것이 바람직하다. 즉, 퍼옥시다아제와 류코형 색원체가 각각 제 1 시약과 제 2 시약에, 또는 제 2 시약과 제 1 시약에 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 측정 키트를 구성하는 시약 중의 단백질 분해 효소의 농도는 통상적으로 100 ∼ 30000 kU/ℓ 이며, 바람직하게는 500 ∼ 10000 kU/ℓ 이다. 본 발명의 측정 키트를 구성하는 시약 중의 프럭토실펩티드 산화 효소의 농도는 통상적으로 0.5 ∼ 100 kU/ℓ 이며, 바람직하게는 1 ∼ 50 kU/ℓ 이다.

본 발명의 측정 키트를 구성하는 시약 중의 이소티아졸리논 유도체의 농도는 통상적으로 0.005 ∼ 20 m㏖/ℓ 이며, 바람직하게는 0.01 ∼ 10 m㏖/ℓ 이다.

본 발명의 측정 키트를 구성하는 시약 중의 계면활성제의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 40 ％ 이며, 바람직하게는 0.0005 ∼ 20 ％ 이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 실시예, 비교예 및 시험예에 있어서는 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.

Bis-Tris (도진 화학 연구소사 제조), ADA (도진 화학 연구소사 제조), MES (도진 화학 연구소사 제조), 염화칼슘 2 수화물 (와코 준야쿠 공업사 제조), 아세트산칼슘 (와코 준야쿠 공업사 제조), 질산칼슘 (와코 준야쿠 공업사 제조), DA-67 (와코 준야쿠 공업사 제조), 1-도데실피리디늄클로라이드 (C12py) [화합물 (II)；도쿄 카세이사 제조], 데실트리메틸암모늄브로마이드 (C10TMA) (제 4 급 암모늄염；도쿄 카세이사 제조), NIKKOL LMT (LMT) [N-알카노일-N-메틸타우린염 (N-라우로일-N-메틸타우린나트륨염)；닛코 케미컬즈사 제조], 아논 BL [알킬카르복시베타인 (라우릴디메틸아미노아세트산베타인)；니혼 유지사 제조], 2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 (이소티아졸리논 유도체；도쿄 카세이사 제조), 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 (이소티아졸리논 유도체；와코 준야쿠 공업사 제조), 4,5-디클로로-2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 (하이옴사 제조), 서몰리신 (단백질 분해 효소；다이와 카세이사 제조), 액티나아제 E (단백질 분해 효소；카켄 파머사 제조), FPOX-CE (프럭토실펩티드 산화 효소；키코만사 제조), FPOX-CET (프럭토실펩티드 산화 효소；키코만사 제조), 퍼옥시다아제 (토요 방적사 제조), 트리톤 X-405 (폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르；시그마 알드리치사 제조).

실시예 1

이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정 키트를 조제하였다.

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 2

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 3

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C10TMA 16 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 4

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C10TMA 16 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 5

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

LMT 5 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 6

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

LMT 5 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 7

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

아논 BL 5 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 8

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

아논 BL 5 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

실시예 9

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 10

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 11

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C10TMA 16 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 12

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C10TMA 16 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 13

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

LMT 5 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 14

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

LMT 5 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.2 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 15

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

아논 BL 5 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 16

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

아논 BL 5 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.4 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 17

제 1 시약

MES (pH 6.0) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.2 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

아세트산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

액티나아제 E 340 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 2.5 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 18

제 1 시약

MES (pH 6.0) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.2 g/ℓ

1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 0.04 g/ℓ

아세트산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

액티나아제 E 340 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 2.5 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 19

제 1 시약

MES (pH 6.5) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

질산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 6 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 20

제 1 시약

MES (pH 6.5) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

4,5-디클로로-2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.04 g/ℓ

질산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 6 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 21

제 1 시약

MES (pH 6.5) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.2 g/ℓ

질산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

액티나아제 E 340 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 6 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 22

제 1 시약

MES (pH 6.5) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

4,5-디클로로-2-옥틸-4-이소티아졸린-3-온 0.04 g/ℓ

질산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

액티나아제 E 340 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 6 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

실시예 23

HbA1c 측정 키트로서 실시예 1 의 키트를, 시료로서 당뇨병이 의심되는 10 명의 피험자 유래의 전혈을 사용하여, 이하의 순서에 의해 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도 (양) 의 총 헤모글로빈 농도 (양) 에 대한 비율 [HbA1c (％)] 을 결정하였다.

(1) 총 헤모글로빈 농도 결정을 위한 검량선의 작성

측정 키트로서 총 헤모글로빈 측정용 키트인 헤모글로빈 B-테스트 와코 (SLS-헤모글로빈법) (와코 준야쿠 공업사 제조) 를 사용하고, 검체로서 헤모글로빈 B-테스트 와코에 부속되는 표준품 (헤모글로빈 농도：15.3 ㎎/㎖) 을 사용하여, 헤모글로빈 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.

(2) HbA1c 농도 결정을 위한 검량선의 작성

라텍스 면역 응집법과 혈구 획분의 총 헤모글로빈값으로부터, HbA1c 농도가 2.77 μ㏖/ℓ, 6.33 μ㏖/ℓ 로 값이 매겨진 2 개의 혈구 획분에 대해, 실시예 1 의 HbA1c 측정 키트를 사용하여 측정해서, 각 혈구 획분에 대한 흡광도를 측정하였다. 당해 혈구 획분 대신에 생리 식염수를 사용하여, 생리 식염수에 대한 HbA1c 농도를 측정하였다. 당해 혈구 획분에 대한 각각의 흡광도에서 생리 식염수에 대한 흡광도를 빼서 산출한 값을, 당해 혈구 획분에 대한 블랭크 보정 흡광도로 하였다. 당해 혈구 획분에 대한 블랭크 보정 흡광도와 생리 식염수에 대한 블랭크 보정 흡광도 (0 Abs) 로부터, HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 와 흡광도 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.

(3) 각 혈구 획분에 있어서의 헤모글로빈 농도의 결정

각 시료에 대해 25 ℃, 3000 rpm 으로 5 분간 원심 분리를 실시하여 혈구 획분을 얻었다. 각 혈구 획분에 대해 헤모글로빈 B-테스트 와코를 사용하여 측정하고, 얻어진 측정값과 (1) 의 검량선으로부터 각 혈구 획분 중의 헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ) 를 결정하였다.

(4) 각 혈구 획분에 있어서의 HbA1c 농도의 결정

각 혈구 획분에 대해, 실시예 1 의 측정 키트를 사용하여 측정하고, 얻어진 측정값과 (2) 의 검량선으로부터 각 혈구 획분 중의 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 를 결정하였다.

(5) HbA1c (％) (= HbA1c 농도의 헤모글로빈 농도에 대한 비율) 의 결정

상기 (3) 에서 결정한 각 혈구 획분에 있어서의 헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ) 와, 상기 (4) 에서 결정한 각 혈구 획분에 있어서의 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 로부터, 이하의 식에 의해, 일본 당뇨병 학회 (Japan Diabetes Society；JDS) 값의 HbA1c (％) 를 산출하였다.

[수학식 1]

HbA1c (％) =

[HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ)]/[헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ)]×0.0963＋1.62

(6) 동일 혈구 획분 중의 HbA1c (％) 의 면역 측정법에 의한 결정

상기 (5) 에서의 HbA1c (％) 의 결정에 사용한 혈구 획분과 동일한 혈구 획분을 사용하여, 각 혈구 획분 중의 HbA1c (％) 를, 데타미나-L HbA1c (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하는 면역 측정법에 의해 데타미나-L HbA1c 의 첨부 문서에 기재된 방법에 따라 결정하였다.

(7) 본 발명의 측정 방법과 면역 측정법의 상관

본 발명의 측정 방법을 이용하여 상기 (5) 에서 결정한 HbA1c (％) 와, 면역 측정법을 이용하여 상기 (6) 에서 결정한 HbA1c (％) 로부터, 본 발명의 측정 방법과 면역 측정법 사이의 상관 관계를 검증하여, 상관 계수를 결정하였다.

마찬가지로, 실시예 1 의 측정 키트 대신에 실시예 2 ∼ 22 의 측정 키트를 사용하여, 데타미나-L HbA1c (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용한 측정과의 사이의 상관 계수를 결정하였다. 그 결과를 제 1 표에 나타낸다.

제 1 표에 나타내는 바와 같이, 실시예 1 ∼ 22 의 측정 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법과 면역 측정법 사이에 양호한 상관 관계가 확인되었다. 따라서, 실시예 1 ∼ 22 의 측정 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법에 의해, 시료 중의 HbA1c 를 정확하게 또한 고감도로 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.

[비교예 1]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

[비교예 2]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C10TMA 16 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

[비교예 3]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

LMT 5 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

[비교예 4]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

아논 BL 5 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

퍼옥시다아제 40 kU/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

DA-67 60 μ㏖/ℓ

[비교예 5]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[비교예 6]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

C10TMA 16 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[비교예 7]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

LMT 5 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[비교예 8]

제 1 시약

Bis-Tris (pH 6.8) 10 m㏖/ℓ

아논 BL 5 g/ℓ

염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CE 6 kU/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[비교예 9]

제 1 시약

MES (pH 6.0) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.2 g/ℓ

아세트산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

액티나아제 E 340 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 2.5 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[비교예 10]

제 1 시약

MES (pH 6.5) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

질산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

서몰리신 1800 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 6 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[비교예 11]

제 1 시약

MES (pH 6.5) 20 m㏖/ℓ

C12py 1.6 g/ℓ

질산칼슘 10 m㏖/ℓ

질산나트륨 100 m㏖/ℓ

액티나아제 E 340 kU/ℓ

DA-67 20 μ㏖/ℓ

제 2 시약

ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

FPOX-CET 6 kU/ℓ

트리톤 X-405 7.1 g/ℓ

퍼옥시다아제 120 kU/ℓ

[시험예 1] 이소티아졸리논 유도체의 효과 (1)

(1) 용혈 검체의 조제

사람 혈액을 원심 분리하여 얻어진 혈구 획분을 헤모글로빈 측정 시약인 네스코트 헤모키트-N (알프레사 파머사 제조) 을 이용하여 측정하고, 그 혈구 획분의 헤모글로빈 농도를 결정하였다. 이어서, 이 값이 매겨진 그 혈구 획분을 정제수로 희석하여 용혈시키고, 헤모글로빈 농도가 2 ㎎/㎖, 4 ㎎/㎖, 6 ㎎/㎖, 8 ㎎/㎖ 및 10 ㎎/㎖ 의 각 용혈 검체를 조제하였다.

(2) 용혈 검체에 대한 반응 흡광도의 측정

키트로서 실시예 1 의 키트를 사용하고, 검체로서 생리 식염수 (헤모글로빈 농도가 0 ㎎/㎖) 및 (1) 에서 조제한 용혈 검체를 사용하여, 이하의 방법에 의해 각 검체에 대한 반응 흡광도를 측정하였다.

반응 셀에 검체 9.6 ㎕ 와 실시예 1 의 키트의 제 1 시약 120 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고 (제 1 반응), 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하고, 이어서 이 반응액에 제 2 시약 40 ㎕ 를 첨가하여 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고 (제 2 반응), 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하여, E2 에서 E1 을 뺀 흡광도차 (△E) (=E2-E1) 를 각 검체에 대한 반응 흡광도로 하였다.

키트로서 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 및 비교예 1 의 각 키트를 사용하여, 동일한 방법에 의해 각 검체에 대한 반응 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 제 1 도에 나타낸다.

제 1 도에서 분명한 바와 같이, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 실시예 1 및 2 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법에 있어서는 헤모글로빈 농도에 비례하여 반응 흡광도가 상승했지만, 이소티아졸리논 유도체를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트를 사용하는 측정 방법에 있어서는 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 사이에 비례 관계가 인정되지 않았다. 측정에 사용한 용혈 검체는 동일한 사람 혈액으로 조제된 것이기 때문에, HbA1c 농도는 헤모글로빈 농도에 의존하여 높아진다. 따라서, 이소티아졸리논 유도체를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트를 사용하는 측정 방법은 헤모글로빈의 영향을 강하게 받아, HbA1c 의 정확한 측정이 곤란한 반면에, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 실시예 1 및 2 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법은 헤모글로빈의 영향을 받지 않아, HbA1c 의 정확한 측정이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

또한, 키트로서 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 9, 10 및 비교예 5 의 각 키트를 사용하여, 동일한 방법에 의해 각 검체에 대한 반응 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 제 2 도에 나타낸다.

제 2 도에서 분명한 바와 같이, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 실시예 9 및 10 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법에 있어서는 헤모글로빈 농도에 비례하여 반응 흡광도가 상승했지만, 이소티아졸리논 유도체를 포함하지 않은 비교예 5 의 키트를 사용하는 측정 방법에 있어서는 헤모글로빈 농도와 반응 흡광도의 사이에 비례 관계가 인정되지 않았다. 측정에 사용한 용혈 검체는 동일한 사람 혈액으로 조제된 것이기 때문에, HbA1c 농도는 헤모글로빈 농도에 의존하여 높아진다. 따라서, 이소티아졸리논 유도체를 포함하지 않은 비교예 5 의 키트를 사용하는 측정 방법은 헤모글로빈의 영향을 강하게 받아, HbA1c 의 정확한 측정이 곤란한 반면에, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 실시예 9 및 10 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법은 헤모글로빈의 영향을 받지 않아, HbA1c 의 정확한 측정이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

[시험예 2] 이소티아졸리논 유도체의 효과 (2)

키트로서 실시예 1 의 키트를, 검체로서 시험예 1 의 (1) 에서 조제한 용혈 검체를 사용하여 측정을 실시하고, 얻어진 측정값을 바탕으로, 실시예 9 의 (2) 에서 작성한 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 와 흡광도 사이의 관계를 나타내는 검량선으로부터 각 검체 중의 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 를 결정하였다. 한편, 각 검체 중의 헤모글로빈 농도를 헤모글로빈 B-테스트 와코를 사용하여 측정하고, 얻어진 측정값과 실시예 9 의 (1) 에서 작성한 검량선으로부터 각 검체 중의 헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ) 를 결정하였다.

결정한 각 검체 중의 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 와 헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ) 로부터, 이하의 식에 의해, 일본 당뇨병 학회 (Japan Diabetes Society；JDS) 값의 HbA1c (％) 를 산출하였다.

[수학식 2]

HbA1c (％) =

[HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ)]/[헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ)]×0.0963＋1.62

키트로서 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 ∼ 13, 15, 17 ∼ 22 및 비교예 1 ∼ 11 의 각 키트를 사용하여 동일한 측정을 실시하고, 각각의 키트에 대해, 각 검체 중의 HbA1c 농도 (％) 를 측정하였다. 헤모글로빈 농도가 6 ㎎/㎖ 인 검체에서의 HbA1c 농도 (％) 를 기준 0 으로 하고, 그 기준으로부터의 각 검체의 HbA1c 농도 (％) 의 차 [△HbA1c 농도 (％)] 를 산출하였다. 그 결과를 제 2 표에 나타낸다.

전술한 바와 같이, 측정에 사용한 용혈 검체는 동일한 사람 혈액으로 조제된 것이기 때문에, 총 헤모글로빈에 대한 HbA1c 의 비율 (％) 은 헤모글로빈 농도에 상관없이 일정하다. 따라서, △HbA1c 농도 (％) 가 0 에 가까울 수록, HbA1c 측정 방법이 헤모글로빈 농도의 영향을 받지 않는 것이 된다. 제 2 표에서 분명한 바와 같이, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 본 발명의 키트에서는 이소티아졸리논 유도체를 포함하지 않은 비교예의 키트와 비교하여, 헤모글로빈 농도의 영향을 받지 않는 것이 판명되었다.

[시험예 3] 이소티아졸리논 유도체의 효과 (3)

키트로서 실시예 7, 8 및 비교예 4 의 각 키트를, 검체로서 시험예 1 의 (1) 에서 조제한 용혈 검체를 사용하여, 시험예 1 과 동일한 방법에 의해 각각의 키트에 있어서 각 검체에 대한 반응 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 제 3 도에 나타낸다.

마찬가지로, 키트로서 실시예 15, 16 및 비교예 8 의 각 키트를, 검체로서 시험예 1 의 (1) 에서 조제한 용혈 검체를 사용하여, 시험예 1 과 동일한 방법에 의해 각각의 키트에 있어서 각 검체에 대한 반응 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 제 4 도에 나타낸다.

마찬가지로, 키트로서 실시예 21, 22 및 비교예 11 의 각 키트를, 검체로서 시험예 1 의 (1) 에서 조제한 용혈 검체를 사용하여, 시험예 1 과 동일한 방법에 의해 각각의 키트에 있어서 각 검체에 대한 반응 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 제 5 도에 나타낸다.

제 3 도 및 제 4 도에서 분명한 바와 같이, 본 발명의 키트 및 비교예의 키트 중 어느 키트에 있어서도 헤모글로빈 농도에 비례하여 반응 흡광도가 상승했지만, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 본 발명의 키트를 사용하는 경우는, 이소티아졸리논을 포함하지 않은 비교예의 키트를 사용하는 경우와 비교하여, 동일 농도의 헤모글로빈의 검체 (즉, 동일 농도의 HbA1c 의 검체) 에 있어서 반응 흡광도가 높은 것이 판명되었다.

전술한 바와 같이, 측정에 사용한 용혈 검체는 동일한 사람 혈액으로 조제된 것이기 때문에, HbA1c 농도는 헤모글로빈 농도에 의존하여 높아진다. 동일 농도의 HbA1c 의 검체에 있어서는 반응 흡광도가 높을수록 헤모글로빈의 영향을 받지 않아, 측정 데이터로서의 신뢰도가 높아진다. 특히, 저농도의 HbA1c 의 검체에 있어서는 높은 반응 흡광도가 얻어지는 것이 중요해진다. 실시예 7 및 8 의 키트를 사용하는 경우는 비교예 4 의 키트를 사용하는 경우와 비교하여, 동일 농도의 HbA1c 의 검체에 있어서 높은 반응 흡광도가 얻어졌다. 마찬가지로, 실시예 15 및 16 의 키트를 사용하는 경우는 비교예 8 의 키트를 사용하는 경우와 비교하여, 실시예 21 및 22 의 키트를 사용하는 경우는 비교예 11 의 키트를 사용하는 경우와 비교하여, 동일 농도의 HbA1c 의 검체에 있어서 높은 반응 흡광도가 얻어졌다. 따라서, 이소티아졸리논 유도체를 포함하는 본 발명의 키트를 사용하는 측정 방법은 이소티아졸리논 유도체를 포함하지 않은 비교예의 키트를 사용하는 측정 방법과 비교하여 헤모글로빈의 영향을 받지 않고, 또한, 고감도의 HbA1c 의 측정이 가능해지는 것이 판명되었다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, 당뇨병 진단에 유용한 당화 헤모글로빈의 측정 등에 유용한, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트가 제공된다.

Claims

헤모글로빈 함유 시료에, 계면활성제 존재하에 단백질 분해 효소를 작용시킨 후, 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시키는 반응에 있어서, 당해 반응을 이소티아졸리논 유도체 존재하에 실시하여, 생성된 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법.
제 1 항에 있어서,
이소티아졸리논 유도체가 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물인 측정 방법.
[화학식 9]

(식 중, A¹ 은 수소 원자, 또는 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, A² 와 A³ 은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 할로겐 원자를 나타내거나 또는 하나가 되어 고리 구조를 형성한다)
제 2 항에 있어서,
식 (I) 로 나타내는 화합물이 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 및 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온으로 이루어지는 군에서 선택되는 이소티아졸리논 유도체인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
과산화수소의 측정이 과산화수소 측정 시약에 의해 실시되는 측정 방법.
제 4 항에 있어서,
과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 측정 방법.
헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 시약으로서, 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 시약.
제 6 항에 있어서,
이소티아졸리논 유도체가 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물인 측정 시약.
[화학식 10]

(식 중, A¹ 은 수소 원자, 또는 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, A² 와 A³ 은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 할로겐 원자를 나타내거나 또는 하나가 되어 고리 구조를 형성한다)
제 7 항에 있어서,
식 (I) 로 나타내는 화합물이 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 및 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온으로 이루어지는 군에서 선택되는 이소티아졸리논 유도체인 측정 시약.
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로 과산화수소 측정 시약을 포함하는 측정 시약.
제 9 항에 있어서,
과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 시약.
헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 키트로서, 단백질 분해 효소, 이소티아졸리논 유도체 및 계면활성제를 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 키트.
헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 키트로서, 단백질 분해 효소 및 계면활성제를 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소 및 이소티아졸리논 유도체를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 키트.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
이소티아졸리논 유도체가 하기 식 (I) 로 나타내는 화합물인 측정 키트.
[화학식 11]

(식 중, A¹ 은 수소 원자, 또는 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, A² 와 A³ 은 동일하거나 또는 상이하며, 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 할로겐 원자를 나타내거나 또는 하나가 되어 고리 구조를 형성한다)
제 13 항에 있어서,
식 (I) 로 나타내는 화합물이 2-알킬-4-이소티아졸린-3-온, 1,2-벤조이소티아졸-3(2H)-온 및 2-알킬-4,5-디할로게노-4-이소티아졸린-3-온으로 이루어지는 군에서 선택되는 이소티아졸리논 유도체인 측정 키트.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
추가로 퍼옥시다아제 및 류코형 색원체가 각각 제 1 시약과 제 2 시약, 또는 제 2 시약과 제 1 시약에 포함되는 측정 키트.