CN103124793B - 糖化血红蛋白的测定方法 - Google Patents

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Abstract

一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样后，在异噻唑啉酮衍生物存在下进行使果糖基肽氧化酶起作用的反应，并测定生成的过氧化氢。根据本发明，提供在不受血红蛋白影响的条件下准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法。

Description

糖化血红蛋白的测定方法
技术领域
本发明涉及糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂及测定试剂盒。
背景技术
糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖而成的糖化物。血红蛋白具有由α链、β链构成的四聚体结构，但将β链的N末端糖化后的血红蛋白称为血红蛋白A1c，血糖值越高越增加，因此，作为糖尿病标志物而在临床检查中进行测定。
作为糖化血红蛋白的测定方法，已知HPLC法等色谱法、电泳法、胶乳免疫凝聚法等利用抗体的免疫测定法、使用作用于糖化蛋白的酶和作用于糖化肽和/或糖化氨基酸的酶的酶测定法等。
作为糖化血红蛋白的酶测定法，已知如下方法(吸光度法)等：首先，通过改性剂使含有血红蛋白的试样中的血红蛋白改性，使蛋白质分解酶作用于改性后的血红蛋白，接着，使糖化肽氧化酶作用于生成的糖化肽，使生成的过氧化氢在过氧化物酶等过氧化活性物质存在下与氧化显色型色原体反应而导入色素中，由生成的色素的吸光度测定糖化血红蛋白。
但是，利用该吸光度法的糖化血红蛋白的测定中，在试样中大量存在的血红蛋白的干涉成为问题。作为针对该问题的解决方法，已知例如：使用阳离子性表面活性剂和/或两性表面活性剂的方法(专利文献1)、使用砜化合物和/或硝基化合物的方法(专利文献2、专利文献3)、使用四唑化合物的方法(专利文献4)、使用聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类等特定的阴离子型表面活性剂的方法(专利文献5)等。
但是，这些方法中也未必能够避免血红蛋白的影响，因而需求不受血红蛋白影响、准确地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平3-010696号公报
专利文献2：WO2003/107011小册子
专利文献3：日本特开2007-147630号公报
专利文献4：日本特开2000-210100号公报
专利文献5：WO2005/049858小册子
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供用于在不受血红蛋白影响的条件下准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法及试剂。
用于解决问题的方法
本发明人进行了深入的研究，结果发现如下见解：在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样后，在异噻唑啉酮衍生物存在下进行使果糖基肽氧化酶起作用的反应，并测定生成的过氧化氢，由此，能够在不受血红蛋白影响的条件下准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]~[15]。
[1]一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样后，在异噻唑啉酮衍生物存在下进行使果糖基肽氧化酶起作用的反应，并测定生成的过氧化氢。
[2]如[1]所述的测定方法，其中，异噻唑啉酮衍生物为由下述式(I)表示的化合物，
式(I)中，A1表示氢原子、或者取代或未取代的烷基，A2与A3相同或不同，表示氢原子、取代或未取代的烷基、卤素原子，或者一起形成环结构。
[3]如[2]所述的测定方法，其中，由式(I)表示的化合物为选自由2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物。
[4]如[1]~[3]中任一项所述的测定方法，其中，过氧化氢的测定利用过氧化氢测定试剂来进行。
[5]如[4]所述的测定方法，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
[6]一种糖化血红蛋白测定试剂，其为用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的试剂，其特征在于，含有蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂。
[7]如[6]所述的测定试剂，其中，异噻唑啉酮衍生物为由下述式(I)表示的化合物，
式(I)中，A1表示氢原子、或者取代或未取代的烷基，A2与A3相同或不同，表示氢原子、取代或未取代的烷基、卤素原子，或者一起形成环结构。
[8]如[7]所述的测定试剂，其中，由式(I)表示的化合物为选自由2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物。
[9]如[6]~[8]中任一项所述的测定试剂，其还含有过氧化氢测定试剂。
[10]如[9]所述的试剂，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
[11]一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其为用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的试剂盒，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶、异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶的第二试剂。
[12]一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其为用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的试剂盒，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶和异噻唑啉酮衍生物的第二试剂。
[13]如[11]或[12]所述的测定试剂盒，其中，异噻唑啉酮衍生物为由下述式(I)表示的化合物，
式(I)中，A1表示氢原子、或者取代或未取代的烷基，A2与A3相同或不同，表示氢原子、取代或未取代的烷基、卤素原子，或者一起形成环结构。
[14]如[13]所述的测定试剂盒，其中，由式(I)表示的化合物为选自由2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物。
[15]如[11]~[14]中任一项所述的测定试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体还分别包含在第一试剂和第二试剂中或者分别包含在第二试剂和第一试剂中。
发明效果
根据本发明，提供用于在不受血红蛋白影响的条件下准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法、试剂及试剂盒。
附图说明
图1是表示使用实施例1、实施例2和比较例1的试剂盒测定样本中的血红蛋白A1c(以下也记为HbA1c)时的、血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。●表示使用比较例1的试剂盒的测定，△表示使用实施例1的试剂盒的测定，■表示使用实施例2的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图2是表示使用实施例9、实施例10和比较例5的试剂盒测定样本中的HbA1c时的、血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。●表示使用比较例5的试剂盒的测定，▲表示使用实施例9的试剂盒的测定，□表示使用实施例10的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图3是表示使用实施例7、实施例8和比较例4的试剂盒测定样本中的HbA1c时的、血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。●表示使用比较例4的试剂盒的测定，△表示使用实施例7的试剂盒的测定，■表示使用实施例8的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图4是表示使用实施例15、实施例16和比较例8的试剂盒测定样本中的HbA1c时的、血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。●表示使用比较例8的试剂盒的测定，▲表示使用实施例15的试剂盒的测定，■表示使用实施例16的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图5是表示使用实施例21、实施例22和比较例11的试剂盒测定样本中的HbA1c时的、血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。●表示使用比较例11的试剂盒的测定，■表示使用实施例21的试剂盒的测定，▲表示使用实施例22的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
具体实施方式
(1)含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法为如下方法：在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白后，在异噻唑啉酮衍生物存在下进行使果糖基肽氧化酶起作用的反应，并测定生成的过氧化氢。异噻唑啉酮衍生物可以存在于使果糖基肽氧化酶起作用的反应中，也可以存在于使蛋白质分解酶起作用的反应和使果糖基肽氧化酶起作用的反应这两种反应中。
具体而言，例示包括以下工序的测定方法。
<测定方法1>
(1)在表面活性剂存在下，使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的工序；
(2)在异噻唑啉酮衍生物存在下，使果糖基肽氧化酶作用于工序(1)中得到的反应产物而生成过氧化氢的工序；
(3)测定工序(2)中生成的过氧化氢的工序；以及
(4)基于使用已知浓度的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白浓度的关系的标准曲线，由工序(3)中测得的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白浓度的工序。
<测定方法2>
(1)在异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂存在下，使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的工序；
(2)使果糖基肽氧化酶与工序(1)中得到的反应产物反应而生成过氧化氢的工序；
(3)测定工序(2)中生成的过氧化氢的工序；以及
(4)基于使用已知浓度的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白浓度的关系的标准曲线，由工序(3)中测得的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白浓度的工序。
另外，本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法也包括计算出含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白(即血红蛋白与糖化血红蛋白合在一起的总血红蛋白)量的比例的方法。该情况下，具体而言，本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法为包括以下工序的测定方法。
<测定方法3>
(1)确定含有血红蛋白的试样中的总血红蛋白(即血红蛋白与糖化血红蛋白合在一起的总血红蛋白)量的工序；
(2)在表面活性剂存在下，使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的工序；
(3)在异噻唑啉酮衍生物存在下，使果糖基肽氧化酶作用于工序(2)中得到的反应产物而生成过氧化氢的工序；
(4)测定工序(3)中生成的过氧化氢的工序；
(5)基于使用已知量的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白量的关系的标准曲线，由工序(4)中测得的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量的工序；以及
(6)由工序(1)中确定的总血红蛋白量和工序(5)中确定的糖化血红蛋白量计算出含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白量的比例的工序。
上述工序(1)的总血红蛋白量的确定也可以在工序(2)之后进行。
<测定方法4>
(1)确定含有血红蛋白的试样中的总血红蛋白(即血红蛋白与糖化血红蛋白合在一起的总血红蛋白)量的工序；
(2)在异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂存在下，使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的工序；
(3)使果糖基肽氧化酶作用于工序(2)中得到的反应产物而生成过氧化氢的工序；
(4)测定工序(3)中生成的过氧化氢的工序；
(5)基于使用已知量的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白量的关系的标准曲线，由工序(4)中测得的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量的工序；以及
(6)由工序(1)中确定的总血红蛋白量和工序(5)中确定的糖化血红蛋白量计算出含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白量的比例的工序。
上述工序(1)的总血红蛋白量的确定也可以在工序(2)之后进行。
本发明的测定方法中的含有血红蛋白的试样只要是含有血红蛋白且能够适用本发明的糖化血红蛋白的测定方法的试样，则没有特别限制，可以列举例如：全血、血球、在血球中混合存在有血浆的试样、对这些试样进行溶血处理而得到的试样等。作为溶血处理，只要是使全血、血球、在血球中混合存在有血浆的试样发生溶血的处理，则没有特别限制，可以列举例如：物理方法、化学方法、生物学方法等。作为物理方法，可以列举例如：使用蒸馏水等低张液的方法、使用超声波的方法等。作为化学方法，可以列举例如：使用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂的方法；使用聚氧乙烯类表面活性剂的方法等。作为生物学方法，可以列举例如：使用抗体、补体的方法等。
本发明中的糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖等糖而生成的血红蛋白，可以列举：血红蛋白A1a、血红蛋白A1b、血红蛋白A1c等，优选为血红蛋白A1c。
作为本发明中的异噻唑啉酮衍生物，只要是能够使本发明的糖化血红蛋白的测定方法进行的异噻唑啉酮衍生物，则没有特别限制，可以列举例如下述由式(I)表示的化合物[以下称为化合物(I)]。
式(I)中，A1表示氢原子、或者取代或未取代的烷基，A2与A3相同或不同，表示氢原子、取代或未取代的烷基、卤素原子，或者一起形成环结构。
化合物(I)中的A1表示取代或未取代的烷基，A2与A3相同或不同，表示氢原子、取代或未取代的烷基、卤素原子，或者一起形成环结构。作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数1~20的直链烷基、碳原子数3~20的支链烷基等。作为碳原子数1~20的直链烷基，可以列举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数3~20的支链烷基，可以列举例如：异丙基、异丁基、异戊基、异己基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为卤素原子，可以列举例如上述卤素原子等。
作为A2与A3一起形成的环结构，可以列举例如：苯环、萘环等。
作为化合物(I)的具体例，可以列举例如：2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮、2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮等。作为市售的化合物(I)，可以列举例如：2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(东京化成公司制)、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮(和光纯药工业公司制)、4,5-二氯-2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(ハイケム公司制)等。
在本发明的糖化血红蛋白的测定方法中，作为异噻唑啉酮衍生物的反应液中的浓度，只要是能够使本发明的糖化血红蛋白的测定方法进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.005~20毫摩尔/升，优选为0.01~10毫摩尔/升。
作为本发明中的表面活性剂，只要是能够使本发明的糖化血红蛋白的测定方法进行的表面活性剂，则没有特别限制，可以列举例如：阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂、非离子性表面活性剂等。
作为阳离子性表面活性剂，可以列举例如：季铵盐、吡啶盐、盐、咪唑盐、异喹啉盐等，优选为季铵盐、吡啶盐、盐。
作为季铵盐，优选具有至少一个碳原子数8~20的直链烷基的季铵盐。作为碳原子数8~20的直链烷基，可以列举例如：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。
作为季铵盐的具体例(产品)，可以列举例如：癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵(以下记为C10TMA)、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、二癸基二甲基氯化铵、二癸基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基氯化铵、双十二烷基二甲基溴化铵(均为东京化成公司制)等。
作为吡啶盐，使用由以下通式(II)表示的吡啶盐[以下称为化合物(II)]。
式(II)中，R1表示取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的烯基，n表示1~5的整数，X-表示1价的阴离子。
R1中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数1~20的直链烷基、碳原子数3~20的支链烷基等，优选碳原子数8~20的直链烷基、碳原子数8~20的支链烷基。作为碳原子数1~20的直链烷基，可以列举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数3~20的支链烷基，可以列举例如：异丙基、异丁基、异戊基、异己基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基等。作为碳原子数8~20的直链烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的直链烷基等。作为碳原子数8~20的支链烷基，可以列举例如：异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基等。
R1中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数2~20的烯基等，优选碳原子数8~20的烯基。作为碳原子数2~20的烯基，可以列举例如：乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、油烯基、十九烯基、二十烯基等。作为碳原子数8~20的烯基，可以列举例如：辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、油烯基、十九烯基、二十烯基等。
R1中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
Ra中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数1~20的直链烷基、碳原子数3~20的支链烷基等。作为碳原子数1~20的直链烷基，可以列举例如上述碳原子数1~20的直链烷基等。作为碳原子数3~20的支链烷基，可以列举例如上述碳原子数3~20的支链烷基等。
Ra中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数2~20的烯基等。作为碳原子数2~20的烯基，可以列举例如上述碳原子数2~20的直链烯基等。
Ra中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如：苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
在吡啶环上具有两个以上取代基的情况下，取代基可以相同也可以不同。化合物(II)中的X-表示1价的阴离子。作为1价的阴离子，可以列举例如：卤素离子、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如：Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(II)的具体例(产品)，可以列举例如：氯化1-十二烷基吡啶(以下记为C12py；东京化成公司制)、氯化1-鲸蜡基吡啶、氯化1-鲸蜡基-4-甲基吡啶(东京化成公司制)、溴化N-十八烷基-4-苯乙烯基吡啶(东京化成公司制)等。
作为盐，使用由以下通式(III)表示的盐[以下称为化合物(III)]。
式(III)中，R2~R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示1价的阴离子。
R2中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数8~20的直链烷基、碳原子数8~20的支链烷基等。作为碳原子数8~20的直链烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的直链烷基等。作为碳原子数8~20的支链烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的支链烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如：苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
R3~R5中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数1~20的直链烷基、碳原子数3~20的支链烷基等。作为碳原子数1~20的直链烷基，可以列举例如上述碳原子数1~20的直链烷基等。作为碳原子数3~20的支链烷基，可以列举例如上述碳原子数3~20的支链烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如：苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
Y-表示1价的阴离子。作为1价的阴离子，可以列举例如：卤素离子、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、苯并三唑盐等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如：Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(III)的具体例(产品)，可以列举例如：四辛基溴化(东京化成公司制)、三丁基辛基溴化(东京化成公司制)、三丁基十二烷基溴化、三丁基十六烷基溴化等。
作为咪唑盐，使用由以下通式(IV)表示的咪唑盐[以下称为化合物(IV)]。
式(IV)中，R6与R8相同或不同，表示取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基，R7、R9、R10表示氢原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基，Z-表示1价的阴离子。
R6中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数8～20的直链烷基、碳原子数8～20的支链烷基等。作为碳原子数8～20的直链烷基，可以列举例如上述碳原子数8～20的直链烷基等。作为碳原子数8～20的支链烷基，可以列举例如上述碳原子数8～20的支链烷基等。
R6中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数8~20的烯基等。作为碳原子数8~20的烯基，可以列举例如上述碳原子数8~20的烯基等。
R6中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如：苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
R7、R8、R9和R10中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数1~20的直链烷基、碳原子数3~20的支链烷基等。作为碳原子数1~20的直链烷基，可以列举上述碳原子数1~20的直链烷基等。作为碳原子数3~20的支链烷基，可以列举例如上述碳原子数3~20的支链烷基等。
R7、R8、R9和R10中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数2~20的烯基等。作为碳原子数2~20的烯基，可以列举例如上述碳原子数2~20的烯基等。
R7、R8、R9和R10中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如：苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
Z-表示1价的阴离子。作为1价的阴离子，可以列举例如：卤素离子、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、(CH3O)2P(=O)O-、B(C6H5)4 -、FeCl4 -、CF3BF3 -、CF3SO3 -、(NC)2N-、CH3(OCH2CH2)2OSO3 -、CH3CH2OSO3 -、HSO4 -、p-CH3C6H4SO3 -等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如：Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(IV)的具体例(产品)，可以列举例如：溴化1-甲基-3-辛基咪唑(东京化成公司制)、氯化1-甲基-3-辛基咪唑(东京化成公司制)、氯化1-十二烷基-2-甲基-3-苄基咪唑等。
作为异喹啉盐，使用由以下通式(V)表示的异喹啉盐[以下称为化合物(V)]。
式(V)中，R11表示取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基，W-表示1价的阴离子。
R11中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如：碳原子数8~20的直链烷基、碳原子数8~20的支链烷基等。作为碳原子数8~20的直链烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的直链烷基等。作为碳原子数8~20的支链烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的支链烷基等。
R11中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数8~20的烯基等。作为碳原子数8~20的烯基，可以列举例如上述碳原子数8~20的烯基等。
R11中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如：苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如：苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如：氯原子、溴原子、碘原子等。
W-表示1价的阴离子。作为1价的阴离子，可以列举例如：卤素离子等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如：Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(V)的具体例(产品)，可以列举例如：氯化N-月桂基异喹啉(日油公司制)、溴化N-月桂基异喹啉(日油公司制)等。
作为阴离子性表面活性剂，可以列举例如：硫酸酯盐、羧酸盐、磺酸盐、磷酸酯盐、磺基琥珀酸盐、N-甲基牛磺酸盐、N-烷酰基-N-甲基牛磺酸盐等。
作为两性表面活性剂，可以列举例如：叔胺氧化物、烷基羧基甜菜碱等。
作为非离子性表面活性剂，可以列举例如：聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯烯基胺、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、乙二胺四聚氧乙烯、聚甘油脂肪酸酯等，优选聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯烷基醚。
作为聚氧乙烯烷基胺中的烷基，可以列举例如碳原子数8~20的烷基等。作为碳原子数8~20的烷基，可以列举例如：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。
作为聚氧乙烯烯基胺中的烯基，可以列举例如碳原子数8~20的烯基等。作为碳原子数8~20的烯基，可以列举例如：辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、油烯基、十九烯基、二十烯基等。
作为聚氧乙烯烷基醚中的烷基，可以列举例如碳原子数8~20的烷基等。作为碳原子数8~20的烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的烷基等。
作为聚氧乙烯烯基醚中的烯基，可以列举例如碳原子数8~20的烯基等。作为碳原子数8~20的烯基，可以列举例如上述碳原子数8~20的烯基等。
作为聚氧乙烯烷基苯基醚中的烷基，可以列举例如碳原子数8~20的烷基等。作为碳原子数8~20的烷基，可以列举例如上述碳原子数8~20的烷基等。
总血红蛋白量可以通过公知的方法、例如氰化高铁血红蛋白法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法等确定。通过使用氰化高铁血红蛋白法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法，不仅可以确定含有血红蛋白的试样本身的总血红蛋白量，而且还可以确定在含有血红蛋白的试样中添加异噻唑啉酮衍生物和/或表面活性剂而得到的试样、在含有血红蛋白的试样中添加异噻唑啉酮衍生物和/或表面活性剂及蛋白质分解酶而得到的试样的总血红蛋白量。
在上述表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的反应中，只要是能够在上述表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于糖化血红蛋白的条件，则在任意条件下均可以进行。含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应优选在水性介质中进行。作为水性介质，可以列举后述的水性介质等。含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应中的反应温度通常为10~50℃，优选为20~40℃，反应时间通常为1分钟~3小时，优选为2.5分钟~1小时。作为蛋白质分解酶的浓度，只要是使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为50~25000kU/升，优选为250~10000kU/升。
作为蛋白质分解酶，只要是作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白而由糖化血红蛋白生成糖化肽的酶，则没有特别限制，可以列举例如：丝氨酸蛋白酶(糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等)、半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶、半胱天冬酶等)、天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶、组织蛋白酶D等)、金属蛋白酶(嗜热菌蛋白酶等)、N-末端苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶等。本发明中，也可以使用市售的蛋白质分解酶，作为市售品，可以列举例如：蛋白酶P“アマノ”3G、蛋白酶K“アマノ”(以上为天野エンザイム公司制)、链霉蛋白酶(actinase)AS、链霉蛋白酶E(以上为科研ファルマ公司制)、嗜热菌蛋白酶(大和化成公司制)、スミチームMP(新日本化学工业公司制)等。
作为使上述蛋白质分解酶起作用的反应中的表面活性剂的浓度，只要是使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.0001~10%，优选为0.0005~5%。
通过含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应，生成含有糖化肽的反应产物。接着，使果糖基肽氧化酶与该反应产物中的糖化肽反应，生成过氧化氢。糖化肽与果糖基肽氧化酶的反应优选在水性介质中进行。作为水性介质，可以列举后述的水性介质等。
糖化肽与果糖基肽氧化酶的反应中的反应温度通常为10~50℃，优选为20~40℃，反应时间通常为1分钟~3小时，优选为2.5分钟~1小时。作为果糖基肽氧化酶的浓度，只要是使糖化血红蛋白与果糖基肽氧化酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.1~30kU/升，优选为0.2~15kU/升。
作为果糖基肽氧化酶，只要是作用于糖化肽而生成过氧化氢的酶，则没有特别限制，可以列举例如：来自丝状菌的果糖基肽氧化酶、来自酵母的果糖基肽氧化酶、来自放线菌的果糖基肽氧化酶、来自细菌的果糖基肽氧化酶、来自古细菌的果糖基肽氧化酶等。本发明中，也可以使用市售的果糖基肽氧化酶，作为市售品，可以列举例如：FPOX-CE(キッコーマン公司制)、FPOX-EE(キッコーマン公司制)、FPOX-CET(キッコーマン公司制)等。
作为生成的过氧化氢的测定方法，可以列举例如：使用电极的方法、使用过氧化氢测定用试剂的方法等，优选为使用过氧化氢测定用试剂的方法。过氧化氢测定用试剂是用于将过氧化氢转变成能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如：色素、光(发光)、荧光等，优选为色素。
在能够检测的物质为色素的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和氧化显色型色原体的试剂等。作为氧化显色型色原体，可以列举：氧化耦合型色原体、无色型色原体等，优选为无色型色原体。作为无色型色原体，可以列举例如：吩噻嗪类色原体、三苯基甲烷类色原体、二苯胺类色原体、邻苯二胺、羟基丙酸、二氨基联苯胺、四甲基联苯胺等，优选为吩噻嗪类色原体。作为吩噻嗪类色原体，可以列举例如：10-N-羧甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)等。吩噻嗪类色原体中，特别优选10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)。作为三苯基甲烷类色原体，可以列举例如：N,N,N’,N’,N’’,N’’-六(3-磺丙基)-4,4’,4’’-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)等。作为二苯胺类色原体，可以列举例如：N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、4,4’-双(二甲氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。
在能够检测的物质为光(发光)的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和化学发光物质的试剂等。作为化学发光物质，可以列举例如：鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。
在能够检测的物质为荧光的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和荧光物质的试剂等。作为荧光物质，可以列举例如：4-羟基苯乙酸、3-(4-羟基苯基)丙酸、香豆素等。
(2)含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂
本发明的、含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂是含有蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂的试剂，在本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法中使用。本发明的测定试剂还可以含有过氧化氢测定试剂。
作为本发明的测定试剂中的蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、异噻唑啉酮衍生物、表面活性剂和过氧化氢测定试剂，分别可以列举例如上述的蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、异噻唑啉酮衍生物、表面活性剂和过氧化氢测定试剂等。
本发明的测定试剂中的蛋白质分解酶的浓度通常为50~25000kU/升，优选为250~10000kU/升。本发明的测定试剂中的果糖基肽氧化酶的浓度通常为0.1~30kU/升，优选为0.2~15kU/升。
本发明的测定试剂中的异噻唑啉酮衍生物的浓度通常为0.005~20毫摩尔/升，优选为0.01~10毫摩尔/升。
本发明的测定试剂中的表面活性剂的浓度通常为0.0001~10%，优选为0.0005~5%。
在本发明的测定试剂中，可以根据需要含有水性介质、稳定剂、防腐剂、盐类、干涉物质消除剂、有机溶剂等。
作为水性介质，可以列举例如：去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。
水性介质的pH例如为pH4~10。在使用缓冲液作为水性介质的情况下，优选使用与设定的pH相适应的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举例如：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good's缓冲剂等。
作为Good's缓冲剂，可以列举例如：2-吗啉代乙烷磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-吗啉代丙烷磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙烷磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。
缓冲液的浓度通常为0.001~2.0摩尔/升，优选为0.005~1.0摩尔/升。
作为稳定剂，可以列举例如：乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、乙酸钙、硝酸钙、亚铁氰化钾、牛血清白蛋白(BSA)、聚氧乙烯烷基苯基醚等聚氧乙烯类表面活性剂等。作为防腐剂，可以列举例如：叠氮化钠、抗生素等。作为盐类，可以列举例如：氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、碳酸钠、甲酸钠、乙酸钠、氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、碳酸钾、甲酸钾、乙酸钾等。作为干涉物质消除剂，可以列举例如用于消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为有机溶剂，可以列举例如：用于辅助无色型色原体在水性介质中溶解的溶解助剂的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二氧杂环己烷、丙酮、甲醇、乙醇等。
(3)含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂盒
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂可以以试剂盒的形式保存、流通和使用。本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂盒用于本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法。作为本发明的测定试剂盒，可以列举例如：双试剂型试剂盒、三试剂型试剂盒等，优选双试剂型试剂盒。
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂盒只要是能够使本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定方法进行的试剂盒，则没有特别限制，在双试剂型试剂盒的情况下，可以列举例如：包含含有蛋白质分解酶的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶、异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂的第二试剂的试剂盒；包含含有蛋白质分解酶、异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶的第二试剂的试剂盒等。
另外，作为本发明的糖化血红蛋白测定试剂盒，可以列举在上述试剂盒的第一试剂、第二试剂中的任意一种或两种中含有过氧化氢测定试剂的试剂盒。特别是在使用含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂作为过氧化氢测定试剂的情况下，优选过氧化物酶和无色型色原体分别包含在各试剂中。即，优选过氧化物酶和无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中或者分别包含在第二试剂和第一试剂中。
构成本发明的测定试剂盒的试剂中的蛋白质分解酶的浓度通常为100~30000kU/升，优选为500~10000kU/升。构成本发明的测定试剂盒的试剂中的果糖基肽氧化酶的浓度通常为0.5~100kU/升，优选为1~50kU/升。
构成本发明的测定试剂盒的试剂中的异噻唑啉酮衍生物的浓度通常为0.005~20毫摩尔/升，优选为0.01~10毫摩尔/升。
构成本发明的测定试剂盒的试剂中的表面活性剂的浓度通常为0.0001~40%，优选为0.0005~20%。
以下，通过实施例对本发明更详细地进行说明，但这些实施例不对本发明的范围进行任何限定。
另外，本实施例、比较例和试验例中，使用下述制造商的试剂和酶。
Bis-Tris(同仁化学研究所公司制)、ADA(同仁化学研究所公司制)、MES(同仁化学研究所公司制)、氯化钙二水合物(和光纯药工业公司制)、乙酸钙(和光纯药工业公司制)、硝酸钙(和光纯药工业公司制)、DA-67(和光纯药工业公司制)、氯化1-十二烷基吡啶(C12py)[化合物(II)；东京化成公司制]、癸基三甲基溴化铵(C10TMA)(季铵盐；东京化成公司制)、NIKKOL LMT(LMT)[N-烷酰基-N-甲基牛磺酸盐(N-月桂酰基-N-甲基牛磺酸钠盐)；日光ケミカルズ公司制]、アノンBL[烷基羧基甜菜碱(月桂基二甲氨基乙酸甜菜碱)；日本油脂公司制]、2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(异噻唑啉酮衍生物；东京化成公司制)、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮(异噻唑啉酮衍生物；和光纯药工业公司制)、4,5-二氯-2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮(ハイオム公司制)、嗜热菌蛋白酶(蛋白质分解酶；大和化成公司制)、链霉蛋白酶E(蛋白质分解酶；科研ファルマ公司制)、FPOX-CE(果糖基肽氧化酶；キッコーマン公司制)、FPOX-CET(果糖基肽氧化酶；キッコーマン公司制)、过氧化物酶(东洋纺织公司制)、トリトンX-405(聚氧乙烯烷基苯基醚；シグマ－アルドリッチ公司制)。
实施例1
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例2
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例3
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例4
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例5
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例6
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例7
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例8
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
实施例9
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例10
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例11
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例12
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例13
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例14
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例15
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例16
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
实施例17
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例18
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例19
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例20
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例21
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例22
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
实施例23
使用实施例1的试剂盒作为HbA1c测定试剂盒，使用来源于疑似患有糖尿病的10名受试者的全血作为试样，按照以下步骤确定各试样中的HbA1c浓度(量)相对于总血红蛋白浓度(量)的比例[HbA1c(%)]。
(1)用于确定总血红蛋白浓度的标准曲线的制作
使用总血红蛋白测定用试剂盒即血红蛋白B-テストワコー(SLS-血红蛋白法)(和光纯药工业公司制)作为测定试剂盒，使用血红蛋白B-テストワコー附带的标准品(血红蛋白浓度：15.3mg/mL)作为样本，制作表示血红蛋白浓度与吸光度的关系的标准曲线。
(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作
根据胶乳免疫凝聚法和血球级分(血球画分)的总血红蛋白值，使用实施例1的HbA1c测定试剂盒对HbA1c浓度值为2.77微摩尔/升、6.33微摩尔/升的两个血球级分进行测定，测定对各血球级分的吸光度。使用生理盐水来代替该血球级分，测定在生理盐水中的HbA1c浓度。将从各自的对该血球级分的吸光度中减去对生理盐水的吸光度而计算得到的值作为对该血球级分的空白校正吸光度。根据对该血球级分的空白校正吸光度和对生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)，制作表示HbA1c浓度(微摩尔/升)与吸光度之间的关系的标准曲线。
(3)各血球级分中的血红蛋白浓度的确定
对于各试样，在25℃下以3000rpm进行5分钟的离心分离，得到血球级分。关于各血球级分，使用血红蛋白B-テストワコー进行测定，由所得到的测定值和(1)的标准曲线确定各血球级分中的血红蛋白浓度(微摩尔/升)。
(4)各血球级分中的HbA1c浓度的确定
关于各血球级分，使用实施例1的测定试剂盒进行测定，由所得到的测定值和(2)的标准曲线确定各血球级分中的HbA1c浓度(微摩尔/升)。
(5)HbA1c(%)(=HbA1c浓度相对于血红蛋白浓度的比例)的确定
通过下述式子由上述(3)中确定的各血球级分中的血红蛋白浓度(微摩尔/升)和上述(4)中确定的各血球级分中的HbA1c浓度(微摩尔/升)计算出日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)值的HbA1c(%)。
HbA1c(%)=[HbA1c浓度(微摩尔/升)]/[血红蛋白浓度(微摩尔/升)]×0.0963+1.62
(6)相同的血球级分中的HbA1c(%)的通过免疫测定法的确定
使用与上述(5)的HbA1c(%)的确定中使用的血球级分相同的血球级分，通过使用デタミナーL HbA1c(协和梅迪克斯公司制)的免疫测定法，根据デタミナーL HbA1c的附件中记载的方法，确定各血球级分中的HbA1c(%)。
(7)本发明的测定方法与免疫测定法的相关
根据使用本发明的测定方法在上述(5)中确定的HbA1c(%)和使用免疫测定法在上述(6)中确定的HbA1c(%)，验证本发明的测定方法与免疫测定法之间的相关关系，确定相关系数。
同样地，使用实施例2~22的测定试剂盒来代替实施例1的测定试剂盒，确定与使用デタミナーL HbA1c(协和梅迪克斯公司制)的测定之间的相关系数。将其结果示于表1中。
表1
试剂盒 相关系数
实施例1 0.9967
实施例2 0。9973
实施例3 0.9949
实施例4 0.9977
实施例5 0.9978
实施例6 0.9986
实施例7 0.9935
实施例8 0.9984
实施例9 0.9979
实施例10 0.9984
实施例11 0.9976
实施例12 0.9984
实施例13 0.9965
实施例14 0.9981
实施例15 0.9936
实施例16 0.9975
实施例17 0.9980
实施例18 0.9984
实施例19 0.9969
实施例20 0.9983
实施例21 0.9967
实施例22 0.9959
如表1所示，在使用实施例1～22的测定试剂盒的本发明的测定方法与免疫测定法之间观察到良好的相关关系。因此可知，通过使用实施例1～22的测定试剂盒的本发明的测定方法，能够准确且高灵敏度地测定试样中的HbA1c。
[比较例1]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
[比较例2]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
[比较例3]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
[比较例4]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
DA-67          60微摩尔/升
[比较例5]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
[比较例6]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
[比较例7]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
[比较例8]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
ADA(pH7.0)     50毫摩尔/升
FPOX-CE        6kU/升
过氧化物酶     120kU/升
[比较例9]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
[比较例10]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
[比较例11]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
[试验例1]异噻唑啉酮衍生物的效果(1)
(1)溶血样本的制备
使用血红蛋白测定试剂即ネスコートヘモキット-N(アルフレッサファーマ公司制)对通过将人血液离心分离而得到的血球级分进行测定，确定该血球级分的血红蛋白浓度。接着，将具有该值的该血球级分用纯化水进行稀释而使其溶血，制备血红蛋白浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL的各溶血样本。
(2)对溶血样本的反应吸光度的测定
使用实施例1的试剂盒作为试剂盒，使用生理盐水(血红蛋白浓度为0mg/mL)和(1)中制备的溶血样本作为样本，通过以下的方法测定对各样本的反应吸光度。
向反应池中添加样本9.6μL和实施例1的试剂盒的第一试剂120μL，在37℃下加热5分钟(第一反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E1)，接着，在该反应液中添加第二试剂40μL，进一步在37℃下加热5分钟(第二反应)，在主波长660nm、副波长800nm下测定反应液的吸光度(E2)，将从E2中减去E1而得到的吸光度差△E(=E2-E1)作为对各样本的反应吸光度。
作为试剂盒，使用实施例2和比较例1的各试剂盒来代替实施例1的试剂盒，通过同样的方法测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图1中。
由图1可知，在使用含有异噻唑啉酮衍生物的实施例1和2的试剂盒的本发明的测定方法中，反应吸光度与血红蛋白浓度成比例地上升，但在使用不含异噻唑啉酮衍生物的比较例1的试剂盒的测定方法中，血红蛋白浓度与反应吸光度之间没有观察到比例关系。测定中使用的溶血样本由同一人血液制备得到，因此，HbA1c浓度依赖于血红蛋白浓度而升高。因此可知，使用不含异噻唑啉酮衍生物的比较例1的试剂盒的测定方法受到血红蛋白的强烈影响，难以进行HbA1c的准确测定，与此相对，使用含有异噻唑啉酮衍生物的实施例1和2的试剂盒的本发明的测定方法不受血红蛋白的影响，能够进行HbA1c的准确测定。
另外，作为试剂盒，使用实施例9、10和比较例5的各试剂盒来代替实施例1的试剂盒，通过同样的方法测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图2中。
由图2可知，在使用含有异噻唑啉酮衍生物的实施例9和10的试剂盒的本发明的测定方法中，反应吸光度与血红蛋白浓度成比例地上升，但在使用不含异噻唑啉酮衍生物的比较例5的试剂盒的测定方法中，血红蛋白浓度与反应吸光度之间没有观察到比例关系。测定中使用的溶血样本由同一人血液制备得到，因此，HbA1c浓度依赖于血红蛋白浓度而升高。因此可知，使用不含异噻唑啉酮衍生物的比较例5的试剂盒的测定方法受到血红蛋白的强烈影响，难以进行HbA1c的准确测定，与此相对，使用含有异噻唑啉酮衍生物的实施例9和10的试剂盒的本发明的测定方法不受血红蛋白的影响，能够进行HbA1c的准确测定。
[试验例2]异噻唑啉酮衍生物的效果(2)
使用实施例1的试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本来进行测定，基于所得到的测定值，由实施例9的(2)中制作的表示HbA1c浓度(微摩尔/升)与吸光度之间的关系的标准曲线确定各样本中的HbA1c浓度(微摩尔/升)。另一方面，使用血红蛋白B-テストワコー测定各样本中的血红蛋白浓度，由所得到的测定值和实施例9的(1)中制作的标准曲线确定各样本中的血红蛋白浓度(微摩尔/升)。
通过下述式子由确定的各样本中的HbA1c浓度(微摩尔/升)和血红蛋白浓度(微摩尔/升)计算出日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)值的HbA1c(%)。
HbA1c(%)=[HbA1c浓度(微摩尔/升)]/[血红蛋白浓度(微摩尔/升)]×0.0963+1.62
作为试剂盒，使用实施例2~13、15、17~22和比较例1~11的各试剂盒来代替实施例1的试剂盒，进行同样的测定，对于各试剂盒，测定各样本中的HbA1c浓度(%)。将血红蛋白浓度为6mg/mL的样本中的HbA1c浓度(%)作为基准0，计算出各样本的HbA1c浓度(%)与该基准的差值[△HbA1c浓度(%)]。将其结果示于表2中。
表2
如上所述，测定中使用的溶血样本由同一人血液制备得到，因此，HbA1c相对于总血红蛋白的比例(%)恒定而不依赖于血红蛋白浓度。因此，△HbA1c浓度(%)越接近于0，HbA1c测定方法越不受血红蛋白浓度的影响。由表2可知，与不含异噻唑啉酮衍生物的比较例的试剂盒相比，含有异噻唑啉酮衍生物的本发明的试剂盒不受血红蛋白浓度的影响。
[试验例3]异噻唑啉酮衍生物的效果(3)
使用实施例7、8和比较例4的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法，对于各试剂盒，测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图3中。
同样地，使用实施例15、16和比较例8的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法，对于各试剂盒，测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图4中。
同样地，使用实施例21、22和比较例11的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法，对于各试剂盒，测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图5中。
由图3和图4可知，对于本发明的试剂盒和比较例的试剂盒中的任意一种试剂盒而言，反应吸光度均与血红蛋白浓度成比例地上升，但在使用含有异噻唑啉酮衍生物的本发明的试剂盒的情况下，与使用不含异噻唑啉酮的比较例的试剂盒时相比，在相同浓度的血红蛋白的样本(即相同浓度的HbA1c的样本)中，反应吸光度更高。
如上所述，测定中使用的溶血样本由同一人血液制备得到，因此，HbA1c浓度依赖于血红蛋白浓度而升高。在相同浓度的HbA1c的样本中，反应吸光度越高，越不受血红蛋白的影响，作为测定数据的可靠度越高。特别是在低浓度的HbA1c的样本中，得到高反应吸光度变得重要。在使用实施例7和8的试剂盒的情况下，与使用比较例4的试剂盒时相比，在相同浓度的HbA1c的样本中，得到更高的反应吸光度。同样地，在使用实施例15和16的试剂盒的情况下，与使用比较例8的试剂盒时相比，在相同浓度的HbA1c的样本中，得到更高的反应吸光度，在使用实施例21和22的试剂盒的情况下，与使用比较例11的试剂盒时相比，在相同浓度的HbA1c的样本中，得到更高的反应吸光度。因此判明，使用含有异噻唑啉酮衍生物的本发明的试剂盒的测定方法与使用不含异噻唑啉酮衍生物的比较例的试剂盒的测定方法相比，不受血红蛋白的影响，并且能够进行高灵敏度的HbA1c测定。
产业上的可利用性
根据本发明，提供在用于诊断糖尿病的糖化血红蛋白的测定等中有用的、含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒。

Claims (17)

1.一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样后，在由下述式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物存在下进行使果糖基肽氧化酶起作用的反应，并测定生成的过氧化氢，
式(I)中，A1表示氢原子、或者碳原子数1～8的烷基，A1为氢原子时，A2与A3一起形成苯环，A1为碳原子数1～8的烷基时，A2与A3相同或不同，表示氢原子或卤素原子。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中，由式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物为选自由2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物，其中烷基表示碳原子数1～8的烷基。
3.如权利要求2所述的测定方法，其中，异噻唑啉酮衍生物为选自由2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和4,5-二氯-2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，过氧化氢的测定利用过氧化氢测定试剂来进行。
5.如权利要求4所述的测定方法，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
6.一种糖化血红蛋白测定试剂，其为用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的试剂，其特征在于，含有蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、由下述式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂，
式(I)中，A1表示氢原子、或者碳原子数1～8的烷基，A1为氢原子时，A2与A3一起形成苯环，A1为碳原子数1～8的烷基时，A2与A3相同或不同，表示氢原子或卤素原子。
7.如权利要求6所述的测定试剂，其中，由式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物为选自由2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物，其中烷基表示碳原子数1～8的烷基。
8.如权利要求7所述的测定试剂，其中，异噻唑啉酮衍生物为选自由2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和4,5-二氯-2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物。
9.如权利要求6～8中任一项所述的测定试剂，其还含有过氧化氢测定试剂。
10.如权利要求9所述的试剂，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
11.一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其为用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的试剂盒，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶、由下述式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶的第二试剂，
式(I)中，A1表示氢原子、或者碳原子数1～8的烷基，A1为氢原子时，A2与A3一起形成苯环，A1为碳原子数1～8的烷基时，A2与A3相同或不同，表示氢原子或卤素原子。
12.一种糖化血红蛋白测定试剂盒，其为用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的试剂盒，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶和由下述式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物的第二试剂，
式(I)中，A1表示氢原子、或者碳原子数1～8的烷基，A1为氢原子时，A2与A3一起形成苯环，A1为碳原子数1～8的烷基时，A2与A3相同或不同，表示氢原子或卤素原子。
13.如权利要求11或12所述的测定试剂盒，其中，由式(I)表示的异噻唑啉酮衍生物为选自由2-烷基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和2-烷基-4,5-二卤代-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物，其中烷基表示碳原子数1～8的烷基。
14.如权利要求13所述的测定试剂盒，其中，异噻唑啉酮衍生物为选自由2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮、1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮和4,5-二氯-2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮组成的组中的异噻唑啉酮衍生物。
15.如权利要求11或12所述的测定试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体还分别包含在第一试剂和第二试剂中或者分别包含在第二试剂和第一试剂中。
16.如权利要求13所述的测定试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体还分别包含在第一试剂和第二试剂中或者分别包含在第二试剂和第一试剂中。
17.如权利要求14所述的测定试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体还分别包含在第一试剂和第二试剂中或者分别包含在第二试剂和第一试剂中。
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