WO2007072941A1 - 糖化タンパク質の測定方法 - Google Patents

糖化タンパク質の測定方法 Download PDF

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WO2007072941A1
WO2007072941A1 PCT/JP2006/325586 JP2006325586W WO2007072941A1 WO 2007072941 A1 WO2007072941 A1 WO 2007072941A1 JP 2006325586 W JP2006325586 W JP 2006325586W WO 2007072941 A1 WO2007072941 A1 WO 2007072941A1
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measured
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protein
amino acid
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Asami Saito
Haruki Tsunoda
Akira Kadota
Akihito Tomita
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Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins

Definitions

  • the present invention relates to a glycoprotein measurement method, a measurement reagent, and a measurement kit.
  • Biological samples, foods, and the like contain many types of glycoproteins produced by non-enzymatic binding of protein amino groups with reducing sugars such as glucose.
  • blood proteins such as hemoglobin and albumin produce sugar ⁇ hemoglobin, saccharide albumin, etc., depending on the glucose concentration in the blood. Because they have a fixed half-life, these glycoproteins reflect the average blood glucose level over a period of time and are routinely measured in clinical settings as an indicator of blood glucose in diabetic patients.
  • an immunoassay method using an antibody such as a chromatography method such as HPLC method, electrophoresis, latex immunoagglutination method, glycated protein and Z or glycoprotein oligopeptide and Z or Enzyme measurement methods using enzymes that act on sugar amino acids are known.
  • the enzyme measurement method has the advantage that the operation is relatively simple and inexpensive.
  • Examples of enzyme measuring methods for glycoprotein include fructosyl amino acid oxidase (Patent Document 1), fructosyl peptide oxidase (Patent Documents 2 to 7), and fructosyl that act on sugar amino acid and Z or glycopeptide.
  • Patent Document 8 A method using tosyl amino acid kinase (Patent Document 8) is known.
  • the glycoprotein of the structure to be measured is selectively hydrolyzed.
  • a method for measuring sugar amino acids and Z or sugar oligopeptides produced by the reaction For example, in order to selectively measure only a glycoprotein having a ⁇ -chain terminus of hemoglobin, ie, hemoglobin Ale (hereinafter abbreviated as HbAlc), from sugar glycohemoglobin or a fragment thereof.
  • HbAlc hemoglobin Ale
  • Patent Document 9 A method using a protease (Patent Document 9) is known, which has a larger effect on the 13-chain N-terminal glycated amino acid and Z or glycosyl oligopeptide than the effect of generating Z and glycosyl oligopeptide.
  • sugar compounds other than the sugar protein to be measured which are originally present in the specimen, for example, free sugar amino acids and Z or sugar compounds that cause measurement error.
  • a method for measuring glycated protein present in a sample from which this free saccharide amino acid and Z or saccharide oligopeptide is removed is known.
  • the present invention also relates to a method for measuring glycoprotein by reacting fructosyl amino acid oxidase with a glycoprotein in a sample and measuring its acid reduction reaction, wherein the glycoprotein is contained in the sample.
  • fructosyl amino acid oxidase Prior to the oxidation-reduction reaction, fructosyl amino acid oxidase is reacted with fructosyl amino acid oxidase for the purpose of removing sugar amino acids that are present separately from proteins.
  • Patent Document 12 A method for measuring a glycated protein in which the redox reaction is performed in the presence of sodium chloride
  • a fructosyl peptide or a fructosyl amino acid is specifically reacted with an enzyme for measuring fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0 to 7.0, and the resulting product is converted to pH 4.0 to 7.
  • An enzyme for measuring fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0 to 7.0 is specifically reacted with an enzyme for measuring fructosyl peptide or fructosyl amino acid at pH 4.0 to 7.0, and the resulting product is converted to pH 4.0 to 7.
  • a method for reducing the influence of fructosyl lysine in the measurement of fructosyl peptide or fructosyl amino acid, characterized by measuring at 0 Patent Document 13
  • a quantification method for glycoprotein using a protease-containing reagent in the presence of catalase is known.
  • Patent Document 1 International Publication No. W097Z13872 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95598
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-235585
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-110657
  • Patent Document 5 Pamphlet of International Publication No. WO04Z038033
  • Patent Document 6 International Publication No. WO04Z038034 Pamphlet
  • Patent Document 7 International Publication No. WO04Z275013 Pamphlet
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-58157
  • Patent Document 9 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-344052
  • Patent Document 10 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-113014
  • Patent Document 11 International Publication No. WO03Z033729 Pamphlet
  • Patent Document 12 International Publication No. WO03Z064683 Pamphlet
  • Patent Document 13 International Publication No. WO05Z049857 Pamphlet
  • Patent Document 14 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-49063
  • An object of the present invention is to provide a method, a reagent, and a kit for accurately measuring a glycoprotein to be measured in a sample containing two or more glycoproteins.
  • a glycated protein to be measured is produced by causing a proteolytic enzyme to act on a sample containing two or more kinds of glycated proteins to produce glycated amino acids and Z or glycated oligopeptides. Glycoprotein derived from other glycoproteins and Z or glycopeptides are removed in advance, and then the glycoprotein derived from glycoproteins and z or glycopeptides to be measured are measured.
  • the present invention provides a method for selectively measuring a glycoprotein to be measured in a sample.
  • the present invention relates to the following [1] to [21].
  • a method for measuring a glycoprotein to be measured in a sample containing two or more types of glycoproteins comprising: (i) the two or more glycoproteins in the sample in an aqueous medium (Ii) an enzyme that acts on a glycated amino acid and a Z or glycosylation oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured. And (m) an enzyme that acts on a sugar amino acid and Z or a sugar oligopeptide that also produces the glycoprotein power to be measured.
  • a method for measuring glycoprotein comprising a step of measuring a product produced in a reaction solution.
  • glycoprotein a protein constituting the glycoprotein to be measured in the sample (hereinafter referred to as “Glycoprotein”)
  • step (iii) Determining the ratio of the glycoprotein to be measured to the target protein in the sample from the concentration of the protein to be measured in step Gv). 1] The method described.
  • Step (i) Force The method according to [1] or [2], which is performed in the presence of one or more surfactants.
  • Step (ii) Strength This is a step of allowing oxidase acting on a sugar amino acid to act on the produced sugar amino acid to remove the generated hydrogen peroxide, and step (iii) comprises sugar An oxidase that acts on an oligopeptide is allowed to act on the generated glyco-oligopeptide.
  • step (ii) The removal of the product in step (ii) is removal of peroxyhydrogen using catalase.
  • step (m) is a measurement of hydrogen peroxide peroxydase using peroxidase and an oxidative coloring chromogen.
  • [6] Glycoprotein strength to be measured The method according to any one of [1] to [5], which is hemoglobin Ale.
  • a reagent for measuring a glycoprotein to be measured in a sample containing two or more types of glycoproteins which is a proteolytic enzyme and a glycoprotein other than the glycoprotein to be measured.
  • Enzyme that acts on glycated amino acids and z or glycoligopeptides that are produced, glycated amino acids and glycated amino acids that are produced from glycated proteins other than glycated proteins to be measured Reagents for removing products produced by reaction with enzymes that act on Z or sugar oligopeptides, sugars to be measured, glycoproteins to be produced, sugars to be produced amino acids and Z or sugars to be produced
  • the reagent according to [8] further comprising a reagent for measuring the target protein.
  • the reagent according to [8] or [9] further comprising one or more surfactants.
  • Glycoamino acids that also generate glycoproteins other than the glycoprotein to be measured and enzymes that act on Z or glycopeptides are oxidases that act on glycoamino acids.
  • Enzyme power S acting on glycosylation amino acid and Z or glycated oligopeptide generated from glycosylation protein to be measured, oxidase acting on glycated oligopeptide [8] to [10]! The reagent according to 1.
  • reagents for measuring products produced by reaction with enzymes that act on amino acids and Z or sugar oligopeptides are reagents containing peroxidase and oxidative chromogenic chromogen [8] ⁇ The reagent according to any one of [11].
  • Target protein strength The reagent according to any one of [9] to [13], which is hemoglobin.
  • a kit for measuring a glycoprotein to be measured in a sample containing two or more types of glycoproteins (A) a first reagent containing a proteolytic enzyme, and (B) a measurement Glycated amino acids generated from glycated proteins other than glycated proteins and enzymes that act on Z or glycated oligopeptides, and glycated amino acids and Z or glycated oligopeptides generated from glycated proteins other than glycated proteins to be measured and the glycated amino acids And a second reagent containing a reagent for removing the product produced by the reaction with Z or an enzyme that acts on the glycated oligopeptide, and (C) a glycated amino acid and Z that also produce a glycoprotein strength to be measured.
  • enzyme acting on saccharide oligopeptide and saccharide protein power to be measured Generated saccharide amino acid and Z or saccharide oligopeptide Kit, characterized in that it comprises a third reagent comprising a reagent for measuring the products formed by the reaction with an enzyme that acts on the Ti ⁇ Amino acids and Z or glycated oligopeptide, a. [0016] [16] The kit according to [15], further comprising a fourth reagent for measuring the target protein.
  • Glycoamino acids that also generate glycoproteins other than the glycoprotein to be measured and enzymes acting on Z or glycopeptides are oxidases that act on glycoamino acids. Any one of [15] to [17], which is an enzyme force S acting on a glycosylation amino acid and Z or a glycosylated oligopeptide generated from a glycoprotein to be measured, and an oxidase acting on a glycosylated oligopeptide Kit.
  • the reagent for removing the product produced by the reaction with the enzyme is a reagent containing catalase, and the glycated amino acid and Z or glycoligopeptide produced from the glycated protein to be measured and the saccharide Reagents for measuring products produced by reaction with enzymes that act on amino acids and Z or glycooligopeptides are reagents containing baroxidase and oxidative chromogenic chromogen [15] ⁇
  • a method, a reagent, and a kit for accurately measuring a glycoprotein to be measured in a sample containing two or more glycoproteins are provided.
  • FIG. 1 shows the correlation between the measurement using the kit for measuring HbAlc of the present invention and the measurement by immunization.
  • the sample used in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it contains two or more glycoproteins, for example, whole blood, plasma, serum, blood cells, cell samples, urine, spinal fluid, sweat, Examples include tears, saliva, skin, mucous membranes, biological samples such as hair, and foods.
  • whole blood, plasma, serum, blood cells and the like are preferable. These samples may be used after pretreatment such as hemolysis, separation, dilution, concentration, and purification.
  • a protein constituting a glycated protein to be measured is referred to as a target protein.
  • a protein constituting a glycated protein to be measured is referred to as a target protein.
  • hemoglobin is used as a target protein for glycated hemoglobin such as HbAlc
  • albumin is used as a target protein for glycated albumin.
  • glycoproteins may be used as the proteins constituting the glycated proteins, that is, the types of the target proteins constituting the glycated proteins only when the types of the target proteins are different.
  • the glycoproteins are distinguished from each other as different structures.
  • a protein in which the terminal amino acid of hemoglobin ⁇ chain is glycated that is, the target protein hemoglobin is a complex consisting of ⁇ chain and j8 chain
  • a protein with a glycated a chain and a protein with a ⁇ -chain glycated a sample containing only hemoglobin as a protein also contains two or more types of glycoproteins of the present invention. Included in the sample.
  • a glycated protein in which a sugar is bound to a specific amino acid position to be measured is measured from a mixture of glycoproteins in which the sugar is bound to different amino acid positions in the target protein molecule of the same species.
  • a mixture of glycoproteins is also included in two or more glycoproteins.
  • the target protein hemoglobin j8 chain when measuring HbAlc, is composed of the ⁇ -amino group of the palin residue at the end of the ⁇ chain of hemoglobin and the ⁇ of the lysine residue in the amino acid sequence of the hemoglobin ⁇ chain.
  • a sample containing only hemoglobin j8 chain as a protein also contains two or more types of glycoproteins of the present invention Included in the sample.
  • the glycoprotein to be measured is not particularly limited as long as it is a protein that receives glycoprotein. It is preferred that the protein be meaningful to measure the glycated protein concentration to be measured and z or the ratio of the target protein concentration to the protein concentration to be measured.
  • proteins that receive glycosylation present in the living body include matrix proteins, intracellular proteins, enzymes, plasma proteins, hormones, and the like.
  • matrix proteins include collagen, myelin, fibronectin, fibrin and the like.
  • membrane proteins include erythrocyte glucose transport protein, erythrocyte spectrin, erythrocyte membrane protein, and endothelial cell membrane protein.
  • intracellular proteins include hemoglobin A, lens crystallin, tubulin, and calmodulin.
  • Enzymes include, for example, cathebsin B, lysozyme, spleen riboase, copper Z zinc superoxide dismutase, carbonic acid dehydratase, j8-N acetylenohexoxamidase, anoreconore dehydrogenase, anoredose reductase, aldehyde reductase, Examples include sorbitol dehydrogenase and Na + / K + —ATPase.
  • plasma proteins examples include albumin, immunoglobulin, apo A 1, apo ⁇ — ⁇ , apo ⁇ , apo C—I, apo E, haptoglobin, ferritin, transferrin, ⁇ 1-antitrypsin, plasminogen, plasminogen
  • examples include activator, fibrinogen, fibrin, antithrombin III, ⁇ 2-microglobin, and cell mouth plasmin.
  • hormones include thyroid hormone and insulin.
  • Hemoglobin is a tetramer with a molecular weight of 64,500 consisting of two polypeptides, a chain and j8 chain.
  • the 3 amino acid sequence at the N-terminus of the ⁇ chain of hemoglobin is palin-simple isine-serine, and the 3 amino acid sequence at the terminus of the j8 chain is palin-histidine-leucine.
  • Hb Ale is defined as the glycosylated N-terminal palin of the j8 chain.
  • hemoglobin is known to have multiple sugar chain sites in the molecule (The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127).
  • Serum albumin has a molecular weight of 69,000, and it is known that four lysine residues in the molecule are glycosylated (The Journal of Biological Chemistry (1986), 261, 13542- 13545).
  • saccharide hemoglobin, HbAlc, saccharide albumin and the like are preferably exemplified as the saccharide protein to be measured.
  • “sugar ⁇ amino acid” means that a reducing sugar such as glucose is combined with one molecule of amino acid
  • “sugar ⁇ oligopeptide” means a reducing sugar such as glucose and an oligopeptide.
  • the peptide is combined! /.
  • a peptide of a glycosyl oligopeptide refers to a peptide having a number of amino acid residues in the range of 2 to 10, preferably in a range of 2 to 6.
  • the glycoside oligopeptide peptide is defined as a peptide having a length that the enzyme acts on, and usually has 2 to 6 amino acid residues.
  • a peptide and a protein having a length of 11 or more amino acid residues that are not acted on by oxidase are glycosylated, and these are collectively referred to as “glycoprotein”.
  • proteolytic enzyme that can be used in the present invention may be used as long as it acts on the glycated protein to be measured contained in the sample.
  • proteases derived from animals, plants, and microorganisms can be used. Can be mentioned.
  • proteases derived from animals include elastase, trypsin, chymotrypsin, pepsin, bovine spleen protease, leucine aminopeptidase from pig liver, catepsin, calpain (Calpain), Protease type I, Protease type XX (above, Sigma), Aminopeptidase M ⁇ Canoleboxypeptidase A (above, Boehringer Mannheim), Pancreatin (Pancreatin: Wako Pure Chemical Industries, Sigma) and the like.
  • Plant-derived proteases include, for example, kallikrein, ficin, papain, chymopapain, bromelain, carboxypeptidase W (above, Sigma), papain W- 40, Bromelain F (manufactured by Amano Enzym Co., Ltd.) and the like.
  • microorganism-derived protease examples include the following (1) to (14).
  • Protease from the genus Bacillus Subtilisin, protease type-VIII, protease type-IX, protease type-X, protease Type-XV, Protease type-XXIV, Protease type-XXVII, Protease type-XXXI, Proteinase TypeVII, Bacillus liquor-formis-derived protease (above, manufactured by Sigma), Thermolysin (above, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Orientase-90N, Orientase-10NL, Orientase-22BF, Orientase-Y, Orientase-5 BL, Nucleicin (above, manufactured by HIBI Co., Ltd.), Pro Leather FG-F, Protease NL “AMANO”, Protease S “Amano” G, Protease N “Amano” G (above, manufactured by Amano Enzyme), GODO-BNP
  • Penicillium-derived protease PD enzyme (manufactured by Kikkoman), protease B “Amano” (manufactured by Amano Enzyme), Dexin 1 (manufactured by Nagase ChemteX), etc.
  • Streptomyces-derived protease also known as Pronase
  • Protease-XXI above, Sigma
  • Actinase-AS above, Actinase-AF
  • Actinase-E above , Manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Alkalofilic Proteinase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • pronase E manufactured by Roche, Calbiochem-Nopaiochem, Sigma
  • pronase manufactured by Boehringer Mannheim
  • Clostridium-derived protease clostripain, non-speci? C eutrautal protease, collagenase TypelA (manufactured by Sigma), etc.
  • the target protein when the target protein is hemoglobin, proteases derived from the genus Pacillus, Aspergillus, Streptomyces, and Trityratium are preferred because they have a large effect on human hemoglobin.
  • proteases from the genus Bacillus are preferred.
  • the target protein is albumin
  • microorganism-derived proteases belonging to the genus Bacillus and Streptomyces are preferable because they have a large effect on human albumin.
  • the concentration of the proteolytic enzyme is preferably from 0.01 to 100, OOOU / mL in the reaction solution, more preferably from 0.:! To 10, OOOUZmL.
  • two or more kinds of enzymes can be used in combination.
  • the proteolytic enzyme used in the present invention is not colored.
  • one having an absorbance at a wavelength of 300 to 800 nm of lOOmAbs or less is preferably 0 to: LOmAbs Is more preferable.
  • proteolytic enzymes that have been purified by various chromatograms, salting out, dialysis, activated carbon treatment, etc. to reduce the above-mentioned absorbance.
  • Examples of the enzyme that acts on the saccharide amino acid and Z or saccharide oligopeptide that can be used in the present invention include the saccharide amino acid that also generates the saccharide protein power in the sample by the action of the proteolytic enzyme. And any substance that acts on Z or glycopeptides May be used.
  • Examples of the enzyme that acts on glycoamino acids and Z or glycooligopeptides include oxidase, kinase, dehydrogenase and the like that act on glycoamino acids and Z or glycated oligopeptides.
  • glycated amino acids in which the a-amino group is saccharified and enzymes that act on Z or glycated oligopeptides are preferred.
  • glycated albumin an enzyme that acts on a glycated amino acid and a glycated glycated ⁇ -amino group and a glycated oligopeptide.
  • the oxidase in the present invention acts on saccharide amino acids and saccharides or glycine oligopeptides and oxygen produced by causing a glycated protein to act on a proteolytic enzyme, and hydrogen peroxide and amino acids or oligopeptides, etc.
  • a proteolytic enzyme e.g., a proteolytic enzyme
  • hydrogen peroxide and amino acids or oligopeptides e.
  • oxidase there is no particular limitation as long as it produces oxidase, and examples thereof include fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, ketoamine oxidase and the like.
  • oxidase examples include saccharide-amino acids glycated with ⁇ -amino groups and oxidases acting on ⁇ or glycoligopeptides, glycated amino acids glycated with ⁇ -amino groups, and Examples thereof include oxidase acting on Z or oligosaccharide peptides.
  • a-amino groups act on glycosylated amino acids and Z or glycosyl oligopeptides
  • the oxidase include, for example, the genus Corvnebacterium, the Neocosmospora genus (eg NBRC-7590, etc.), the Coniochae iil genus (eg ATCC36547 etc.), the genus Arusrum, the pyrenocateta From the genus, from the genus Leptosphere (for example, NBRC7480), from the genus Ophiobora, from the genus Carbularia, from the genus Forma (JP 2004-275013), And fructosyl peptide oxidase (Japanese Patent Laid-Open No.
  • oxidase that acts on sugar amino acids and Z or sugar oligosaccharides in which an a-amino group is glycated examples include sugar glycol amino acids in which the ⁇ -amino group is glycated and / or Or an oxidase that acts on a sugar oligosaccharide peptide may be mentioned.
  • fructosyl peptide oxidase FPOX-CE fructosyl peptide oxidase FPOX-EE
  • fructosyl amino acid oxidase FAOX-TE fructosyl amino acid oxidase FAOD-E
  • Kikkoman ginger family Plant-derived fructosyl peptide oxidase
  • WO04 / 038034 plant-derived fructosyl peptide oxidase (WO04 / 038033) belonging to the family Rosaceae, Grapeaceae or Apiaceae.
  • the ⁇ -amino group specifically acts on a saccharide amino acid and saccharide or saccharide oligopeptide having a sugar chain, and the saccharide amino acid having an OC amino group substantially glycated.
  • oxidases that do not act include genetically engineered fructosamine oxidase (FODVII; manufactured by Asahi Kasei Corporation; WO02 / 06111 9).
  • an enzyme having sufficient activity even in the state of coexisting with a proteolytic enzyme acting on a sugar amino acid and sugar or glycopeptide having an ex-amino group and an ⁇ -amino group.
  • An example is genetically modified fructosamine oxidase (FODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation).
  • the concentration of the enzyme is preferably from 0.01 to L, OOOUZmL in the reaction solution, more preferably from 0.1 to LOOUZmL.
  • two or more kinds of enzymes can be used in combination.
  • kinase In the presence of ATP, a kinase that acts on saccharide amino acids and z or saccharide oligopeptides that can be used in the present invention acts on saccharide amino acids and / or saccharide oligopeptides, and ADP and There is no particular limitation as long as it is a kinase that produces a phosphoglycosylated amino acid and a Z or phosphorylated glycated oligopeptide, but for example, an enzyme that acts on ⁇ -fructosyllysine And fructosyl lysine 6-kinase (The Journal of Biological Chemistry (2002), 277, 42523-42529). Examples of kinases that act on oc fructosyl valine and ⁇ -fructosyl valyl leucine include cruciferous plant-derived flucyl amino acid kinase (JP 2005-58157).
  • the concentration of the enzyme is preferably a concentration of 0.001 to 1, OOOUZmL or more in the reaction solution, and preferably 1 to: LOOU / mL.
  • two or more kinds of enzymes can be used in combination.
  • a surfactant coexists when a proteolytic enzyme is allowed to act.
  • surfactants include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and nonionic surfactants that preferably coexist with amphoteric surfactants, Anionic surfactants and amphoteric surfactants are particularly preferred.
  • Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene polycyclic ether, polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene Alkylamine, alkylenediamine Polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, fatty acid alcohol amide
  • Examples include sugar fatty acid esters.
  • polyoxyethylene alkyl ether examples include polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene dodecyl ether, and the like.
  • polyoxyethylene alkyl ether examples include polyoxyethylene octyl ether, polyoxyethylene ethylene ether, and the like. It is.
  • polyoxyethylene polycyclic phenol ethers examples include polyoxyethylene dibenzyl phenyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene (distyrenated) phenol ether, and polyoxyethylene (tristyrene).
  • Fuel ether and the like examples include polyoxyethylene dibenzyl phenyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene (distyrenated) phenol ether, and polyoxyethylene (tristyrene).
  • polyoxyethylene polyoxypropylene condensate examples include a polyoxyethylene polyoxypropylene copolymer, a polyoxyethylene polyoxypropylene random polymer, and the like.
  • polyoxyethylene alkylamine examples include polyoxyethylene dodecylamine.
  • alkylene diamine polyoxyethylene polyoxypropylene condensate examples include ethylenediaminetetrapolyoxyethylene.polyoxypropylene.block polymer.
  • polyoxyethylene fatty acid esters examples include polyoxyethylene glycol monolaurate, polyoxyethylene glycol monostearate, polyoxyethylene glycol distearate, polyoxyethylene glycol monooleate, and the like.
  • polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester examples include polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monostearate.
  • polyoxyethylene sorbitan monolaurate examples include polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monostearate.
  • reate and polyoxyethylene sorbitan trioleate examples include polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate.
  • sorbitan fatty acid esters examples include sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan distearate, sorbitan tristearate, sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, sorbitan sesquioleate and the like. Can be mentioned.
  • Examples of the polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester include polyoxyethylene sorbitol tetraoleate.
  • Examples of the polyoxyethylene alkylamine include polyoxyethylene dodecylamine, polyoxyethylene stearylamine and the like.
  • Examples of glycerin fatty acid esters include stearic acid monoglyceride and oleic acid monoglyceride.
  • fatty acid alkanol amides examples include lauric acid diethanolamide and the like.
  • sucrose fatty acid ester examples include sucrose palmitate, sucrose stearate, and the like.
  • nonionic surfactants those having a polyoxyethylene chain are particularly preferred, for example, polyoxyethylene octyl vinyl ether, polyoxyethylene monolaurate sorbitan, polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene Examples include ethylene polycyclic phenyl ether, polyoxyethylene octyl phenyl ether, and polyoxyethylene dodecylamine.
  • Examples of the cationic surfactant include aliphatic amine salts and aliphatic quaternary ammonium salts.
  • aliphatic amine salts examples include higher aliphatic amines such as monododecylamine, monostearylamine, distearylamine, and tristearylamine, and inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, or acetic acid, lactic acid, and citrate. And salts with lower carboxylic acids and the like. Specific examples include dodecylamine acetate and stearylamine acetate.
  • Examples of aliphatic quaternary ammonium salts include dodecyl trimethyl ammonium, stearyl trimethyl ammonium, cetyl trimethyl ammonium, octadecyl trimethyl ammonium, hexane.
  • Examples include salts of higher aliphatic ammonium such as decyltrimethyl ammonium, alkyldimethylbenzyl ammonium, didecyldimethyl ammonium, benzyldimethyltetradecyl ammonium, etc. with chlorine, bromine, etc. .
  • dodecyltrimethylammonium chloride stearyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium chloride, octadecyltrimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride, alkyldimethylbenzylammonium chloride , Didecyldimethylammonium chloride, benzyldimethyltetra
  • dodecyltrimethylammonium chloride stearyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium chloride, octadecyltrimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride, alkyldimethylbenzylammonium chloride , Didecyldimethylammonium chloride, benzyldimethyltetra
  • decyl ammo-um chloride stearyltrimethylammonium chloride
  • cetyltrimethylammonium chloride
  • anionic surfactant examples include carboxylate, sulfonate, ester sulfate, phosphate ester, cholate and the like.
  • carboxylate examples include salts with higher fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and oleic acid, and alkali metals such as sodium and potassium.
  • alkali metals such as sodium and potassium.
  • Specific examples include potassium oleate, sodium lauroyl sarcosine, N-myristoyl-N-methyl-13-alanine sodium, polyoxyethylene dodecyl ether sodium acetate, and the like.
  • sulfonates examples include alkylbenzene sulfonic acids such as dodecylbenzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acids such as dipropylnaphthalenesulfonic acid and dibutylnaphthalenesulfonic acid, sulfosuccinic acids such as dioctylsulfosuccinic acid, and the like. And salts with sodium. Specific examples include sodium dodecylbenzenesulfonate, sodium dipropylnaphthalenesulfonate, sodium dibutylnaphthalenesulfonate, and sodium dioctylsulfosuccinate.
  • alkylbenzene sulfonic acids such as dodecylbenzenesulfonic acid
  • naphthalenesulfonic acids such as dipropylnaphthalenesulfonic acid and dibutylnaphthalenesulf
  • Examples of the sulfate ester salt include a higher alcohol sulfate ester salt, a polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salt, a polyoxyethylene polycyclic ether ether sulfate ester salt, and the like.
  • Examples of the salt include sodium salt and ammonium salt.
  • Specific examples of higher alcohol sulfate ester salts include, for example, sodium dodecyl sulfate, ammonium dodecyl sulfate, etc.
  • Specific examples of polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salts include, for example, polyoxyethylene dodecyl ether sodium sulfate, etc.
  • Specific examples of S and polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfates include sodium polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfates and the like.
  • Examples of phosphoric acid ester salts include monoalkyl phosphoric acid ester salts and polyoxyethylene alkyl ether phosphoric acid ester salts.
  • Examples of the salt include sodium salt and potassium salt.
  • Specific examples of monoalkyl phosphate ester salts include, for example, sodium monostearyl phosphate, sodium monododecyl phosphate, etc.
  • Specific examples of polyoxyethylene alkyl ether phosphate salts include, for example, polyoxyethylene Examples include potassium lenddecyl ether phosphate.
  • Examples of the cholate include sodium cholate.
  • anionic surfactants those having a polyoxyethylene chain are particularly preferred, and specific examples include polyoxyethylene polycyclic phenol ether sulfate.
  • amphoteric surfactants include betaines, glycines, alanines, 2-alkylimidazoline derivatives, amin oxides, and alkylamino salts.
  • betaines include alkylbetaines, carboxybetaines, and sulfobetaines.
  • alkylbetaines examples include N-dodecylbetaine.
  • carboxybetaines examples include amidopropyl betaine laurate, betaine dodecyl dimethylaminoacetate, N laureuil N, 1 carboxymethyl 1 N, sodium hydroxychetylethylenediamine.
  • sulfobetaines examples include lauric acid amidopropyl hydroxysulfobetaine.
  • Examples of glycines include sodium dodecyldiaminoethyldaricin.
  • the Aranin such N - Okutodeshiru - beta- ⁇ la Nin sodium, New Misuchiri Le one 13 ⁇ La Nin sodium, and sodium lauryl aminopropionic acid and the like.
  • Examples of the derivatives of 2-alkylimidazoline include 2-alkyl ⁇ force ruboxymethyl ⁇ hydroxy imidazolyl umbetaine such as 2-lauroyl- ⁇ -carboxymethyl ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ hydroxyethyl imidazolium umbetaine.
  • amine oxides examples include dodecyldimethylamine oxide, dihydroxyethyldecylamine oxide, polyoxyethylene coconut oil alkyldimethylamine oxide, and the like.
  • alkylamino salts examples include sodium dodecylaminodiacetate.
  • amphoteric surfactants amine oxides and betaines are particularly preferred. Most preferred are oxides.
  • examples of the amine oxides include dodecyldimethylamine oxide, dihydroxyethyldecylamine oxide, polyoxyethylene oil alkyldimethylamine oxide, and the like.
  • examples of betaines include dodecyl dimethylamino acetate betaine.
  • the concentration of these surfactants used is preferably 0.0001 to 20%, more preferably 0.001 to 10%, as the concentration in the reaction solution.
  • As the surfactant a plurality of surfactants can be used in combination.
  • the aqueous medium used in the present invention is preferably a force buffer solution such as deionized water, distilled water, buffer solution and the like.
  • a force buffer solution such as deionized water, distilled water, buffer solution and the like.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris buffer), phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
  • Good buffering agents include, for example, 2 morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminonic acid (ADA), piperazine 1 N, N, 1 bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPE S), N— (2 acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino 1 2-hydroxypropanesulfone Acid (MOPSO), N, N bis (2-hydroxyethyl) 2 aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] 2 aminoethanesulfonic acid (TES), 2- [4- (2-Hydroxyethyl) 1-piperadyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 3- [N, N bis
  • TAPS N cyclohexyl 2 aminoethanesulfur
  • CHES phonic acid
  • CAPSO N-cyclohexyl-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid
  • CAPS N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but 0.001 to 2.
  • OmolZL is preferred 0.005 to 1. OmolZL is more preferred.
  • the measurement of glycoprotein to be measured in a sample containing two or more glycoproteins of the present invention can be performed by sequentially performing the following steps (i) to (iii) in an aqueous medium. .
  • the reaction temperature of the reaction in each step is, for example, 10 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C, and the reaction time is 1 second to 60 minutes, preferably 1 to: LO minutes. is there. Step (i) and step (ii) can be performed simultaneously.
  • the reaction in which the proteolytic enzyme in step (i) is allowed to act is preferably performed in the presence of the aforementioned surfactant. It should be noted that the proteolytic enzyme need not be inactivated after step (i) as long as it does not affect the reaction in step (ii) and / or step (iii). Alternatively, the enzyme can be prevented from acting in step (ii) and / or step (iii) by centrifugation, membrane filtration, addition of an inhibitor or the like.
  • the step of removing a product (hereinafter referred to as product A) in the reaction liquid in step (ii) is a process for generating the product in the reaction liquid in step (iii). This means that the product is not involved in the measurement of the product (hereinafter referred to as product B) and is converted into the enzyme.
  • step (ii) a method for removing the product A in the step (ii) can be appropriately selected by those skilled in the art in combination with the method for measuring the product B in the step (iii).
  • the combination of enzyme reactions used in step (ii) and step (iii) is not particularly limited.
  • step (ii) and Z or step (iii) the sugar amino acid and Z or sugar salt are used.
  • the product produced by the action of an oxidase that acts on the oligopeptide include hydrogen peroxide, amino acid, oligopeptide and the like.
  • step (ii) and Z or step (iii) as a product produced by reacting a kinase that acts on a sugar amino acid and Z or a sugar oligopeptide in the presence of ATP
  • a kinase that acts on a sugar amino acid and Z or a sugar oligopeptide examples thereof include phosphoglycosyl amino acids, phosphate glycosyl oligopeptides, ADP and the like.
  • glucose 6-phosphate, amino acid, etc. are mentioned as a product produced by allowing a deglycase that acts on a phosphorylated glycated amino acid to act on the product.
  • deglycases that act on phosphorylated glycated amino acids include E. coli-derived deglycases that act on fructosyl lysine-6-phosphate (The Journal of Biological Chemistry (2002), 277, 42523-42529).
  • step (ii) and Z or step (iii) dehydrogenase acting on sugar amino acid and Z or sugar oligosaccharide is caused to act in the presence of oxidized coenzyme.
  • oxidized coenzyme For example, when NADP is used as the acid coenzyme, the product is reduced coenzyme NADPH and dehydrogenated glycosyl amino acid and Z or glycosyl oligopeptide, such as complement
  • examples of the product include reduced type pyro quinoline quinone and dehydrogenated saccharide amino acid and Z or saccharide oligopeptide.
  • Examples of the method for removing the product in step (ii) include a method for removing peroxyhydrogen generated by the action of oxidase, a method for removing amino acids or oligopeptides, and the like.
  • a method for removing hydrogen peroxide. preferable.
  • Examples of the method for removing hydrogen peroxide include a method for using enzymes such as peroxidase and catalase, a method for allowing reducing substances such as various metals to act, and the like.
  • step (m) If it does not affect the measurement reaction without stopping the enzyme reaction, if it affects the measurement reaction in step (iii), such as heating, cooling, centrifugation, membrane filtration, addition of inhibitors, etc. It is preferable to adjust so that the enzyme does not act in step (iii) depending on the method. Moreover, it is preferable to carry out the removal reaction using an enzyme immobilized on a carrier, a column or the like, because an operation for deactivating the enzyme reaction is not required. Catalase can be inactivated by adding an inhibitor such as sodium azide.
  • the reducing substance remaining in the reaction solution after the reaction with the hydrogen peroxide is the same as that in the step (iii). It is preferable not to affect the measurement response.
  • a method for removing the peracid-hydrogen generated in step (ii) using a reducing substance a method in which the reducing substance is fixed and brought into contact with the reaction solution is preferable.
  • Removal of product A can be achieved by, for example, producing hydrogen peroxide produced by the action of glycoside amino acids and Z or glycoside oligopeptides produced from glycoproteins other than the glycoprotein to be measured.
  • Other oxidases having different substrate specificities from the oxidase acting on the glycated amino acids and Z or glycoligopeptides to be measured.
  • a method suitable for carrying out the measurement by measuring the hydrogen peroxide produced by is described below.
  • the removal of peracid-hydrogen in the step (ii) can be removed by, for example, a peracid-hydrogen removal reagent.
  • the peroxide removal reagent include, in addition to catalase, one of a peroxidase active substance such as bar oxidase and an acid-coupled chromogen described later (that is, phenol-based or ar phosphorus-based hydrogen). And a combination with a donor compound or a coupler such as 4-aminoantipyrine).
  • catalase is used as the peracid hydrogen removal reagent, the catalase is allowed to act on the peroxyhydrogen in step (ii) to convert the peracid hydrogen into water and oxygen. Can do.
  • a peroxyd active substance such as peroxidase as a peroxyd hydrogen-removing reagent and an acid-coupled chromogen described later (that is, a phenolic or aromatic phosphorus donor)
  • a peroxide as a peroxyd hydrogen-removing reagent and an acid-coupled chromogen described later (that is, a phenolic or aromatic phosphorus donor)
  • the hydrogen peroxide is allowed to react with the oxidative coupling type chromogen in the presence of a peroxide active substance. It can be removed by generating colored material.
  • the concentration of catalase in the case of using catalase as a peracid-hydrogen removal reagent is not particularly limited as long as it is a concentration capable of removing hydrogen peroxide generated in step (ii).
  • a concentration of 0.1 to 10, OOOUZmL in the liquid is preferred, and a concentration of 10 to 2, OOOU / mL is more preferred.
  • the concentration of the peroxidative active substance is determined by the peroxidative activity. There is no particular limitation as long as the concentration is such that a colorless substance can be produced by the reaction of the substance with hydrogen peroxide.
  • the concentration of peroxidase is preferably 1 to: LOOUZmL in the reaction solution, more preferably 2 to 50 UZmL. .
  • the acid coupling type chromogen used as a peracid hydrogen removal reagent is a combination of an oxidative coupling type chromogen used as a reagent for peroxyhydrogen measurement, that is, phenol. It is one component in the combination of a diol-type or a phosphorus-type hydrogen donor compound and a coupler such as 4-aminoantipyrine. Phenolic or ar phosphorus-based hydrogen donor compounds and couplers such as 4-aminoantipyrine react with hydrogen peroxide in the presence of peroxidases such as peroxidase to oxidize. Produces dyes by coupling reaction
  • coupler examples include 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone, and the like.
  • phenol-based hydrogen donor compounds examples include phenol, 4-chlorophenol, 3 methylphenol, 2,4 dichroic phenol, 2,6 dichroic phenol, 2, 4, 6-triclonal phenol, 3,5 dichloromethane. 1-hydroxybenzenesulfonic acid, 2,4 dibromophenol, 2,4,6 tribromophenol, 3-hydroxy-2,4,6 triiodobenzoic acid (HTIB) and the like.
  • Examples of the a-phosphorus hydrogen donor compound include N- (3 sulfopropyl) a-line, N-ethyl N- (2-hydroxy-1-3-sulfopropyl) 3-methylaline (TOO S), N-ethyl N— (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylayu (MAOS), N-ethylyl N— (2 hydroxy-l-sulfopropyl) 3, 5 Dimethyoxyline (DAOS), N-ethylyl N— (3-sulfopropyl) -3-methyl-line (TOPS) , N- (2-Hydroxy-1-3-sulfopropyl) -3,5-Dimethoxy-line (H DAOS), N, N Dimethyl-3-methyl-line, N, N Di (3-sulfopropyl) -3, 5 —Dimethoxy-line, N-ethyl N— (3-sulfopropyl
  • the coupler, the phenolic hydrogen donor compound, or the vinylic hydrogen donor compound is not particularly limited as long as the generated hydrogen peroxide can be removed, but is preferably 0.05 to 4 gZL, more preferably 0.1 to 2 gZL.
  • step (ii) of the present invention when catalase is used as the peroxyhydrogen removing reagent, it is preferable that a catalase inhibitor is present in step (iii).
  • Catalase inhibition examples of the agent include sodium azide, HS, HCN, NH 4 OH, 3-amino 1, 2, 4-to
  • the concentration used is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits catalase activity and does not affect the measurement of hydrogen peroxide generated in step (iii). 0.5 to 60 mmol ZL, more preferably 1 to 30 mmol / L.
  • the peroxyhydrogen generated in the step (m) of the present invention can be measured using, for example, an optical method or an electrochemical method.
  • the optical method include an absorbance method and a luminescence method.
  • Specific examples include an optical measurement method using a hydrogen peroxide measurement reagent and an electrochemical measurement method using a hydrogen peroxide / hydrogen electrode.
  • the hydrogen peroxide measurement reagent is a reagent for converting the produced hydrogen peroxide to a detectable substance.
  • a detectable substance for example, a coloring substance such as a coloring substance or a luminescent substance is preferable.
  • the hydrogen peroxide measuring reagent contains an oxidation chromogenic chromogen and a peroxidase active substance such as peroxidase.
  • a peroxidase active substance such as peroxidase.
  • the oxidative coloring type chromogen include the aforementioned acid coupling type chromogen and the leuco type chromogen described later.
  • the hydrogen peroxide measuring reagent contains a chemiluminescent substance.
  • chemiluminescent substances include bioluminescent substances, and examples thereof include luminol, isoluminol, lucigenin, attalizium ester, and oxalate ester.
  • a reagent containing a peroxidation active substance such as an oxidative coloring chromogen and peroxidase
  • hydrogen peroxide is oxidized in the presence of the peroxidation active substance.
  • a reagent for measuring hydrogen peroxide containing a chemiluminescent substance hydrogen peroxide reacts with the chemiluminescent substance to generate photons, and the generated photons are measured to measure hydrogen peroxide. can do.
  • the oxidative coupling type chromogen reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase, and generates a dye by an oxidative coupling reaction. It is the original.
  • a coupler such as 4-AA and a phenol-based or aryl-based hydrogen donor compound form a dye by an oxidative coupling reaction.
  • the leuco chromogen is hydrogen peroxide in the presence of peroxidase and other peroxidative substances. It is a chromogen that reacts with and produces a pigment alone.
  • CCAP carboxymethylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) -10H phenothiazine
  • MCDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) -10H phenothiazine
  • step (ii) a coupler or a phenol-based or aniline-based hydrogen donor compound is used as a peracid-hydrogen removing reagent, and in step (iii), as a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the hydrogen peroxide measurement in step (iii) is performed by using the coupler or the phenolic or ar phosphorus hydrogen donor compound used in step (ii). It can be used as a reagent.
  • a coupler is used as a peracid-hydrogen removal reagent
  • step (iii) a phenol-based or aryl phosphorus-based hydrogen donor compound may be added.
  • a force bracket such as 4-AA may be added in step (iii).
  • the concentration of the peracid-active substance is not particularly limited as long as it is suitable for the measurement, but when peroxidase is used as the peracid-active substance, 1-100 UZmL is preferred 2-50 UZmL is more preferred.
  • the concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 gZL, and more preferably 0.02 to 5 g / L force! / ⁇ .
  • the electrode to be used is not particularly limited as long as it is a material that exchanges electrons with hydrogen peroxide.
  • the electrode to be used is not particularly limited as long as it is a material that exchanges electrons with hydrogen peroxide.
  • Measurement methods include amperometry, potentiometry, A well-known method such as monorometry can be used. This is achieved by interposing an electron carrier in the reaction between the oxidase or substrate and the electrode, and determining the resulting oxidation, reduction current, or amount of electricity.
  • any substance having an electron transfer function can be used, and examples thereof include substances such as phuctocene derivatives and quinone derivatives.
  • step (m) When an oxidase is used in step (m), a peroxyhydrogen and an ⁇ -ketoaldehyde form are produced, so a peroxyhydrogen produced by the action of glucose oxidase on the produced ⁇ -ketoaldehyde. Can be measured with high sensitivity.
  • step (ii) when an ex-ketoaldehyde compound is produced in step (ii), the a-ketoaldehyde compound and glucose are removed in advance in step (ii).
  • step (ii) When a kinase is used in the reaction of step (ii), the reaction is stopped if the enzyme used in the measurement of step (m) does not act on the phosphorylated glycated amino acid and Z or glycopeptide. It can be used as it is without.
  • a deglycase that specifically acts on the phosphorylated saccharide amino acid and Z or saccharide oligopeptide. It is possible to degrade phosphorylated glycated amino acids and Z or glycated oligopeptides by acting.
  • ATP changes in the reaction system in which ATP is coexisted in the reaction system, and glycated amino acid and Z or glycopeptide are phosphorylated by the kinase.
  • the amount can be measured by known methods.
  • step (ii) When dehydrogenase is used in the reaction of step (ii), the enzyme used in the measurement of step (m) does not act on the dehydrogenated glycated amino acid and Z or glycated oligopeptide. It can be used as it is without stopping the reaction.
  • step (m) When dehydrogenase is used in the reaction of step (m), measurement is performed by coexisting oxidized coenzyme in the reaction system and measuring the consumption of oxidized coenzyme or the production of reduced coenzyme. Power sugar protein can be quantified.
  • Produced reduced coenzyme For example, direct measurement using a known technique such as measurement with a colorimeter at a wavelength around 340 nm which is the maximum absorption wavelength range, or the generated reduced coenzyme can be converted to various diaphorases or phenols.
  • pyroguchi quinoline quinone can be used as a coenzyme, for example, by coexisting an electron mediator in the reaction system and measuring the amount of coenzyme change using an electrochemical method. I'll do it.
  • the glycoprotein to be measured is determined by, for example, the method using the aforementioned dehydrogenase. Can be measured.
  • any method may be used as long as it can accurately measure the target protein.
  • the target protein to be measured may be only a non-glycated protein or a glycoprotein of the protein.
  • the absorbance method colorimetric method
  • the parallax refraction method are known, and these methods are widely used.
  • the absorbance method is a method for measuring the ultraviolet absorption, visible absorption, and infrared absorption of a substance solution and calculating the solution concentration.
  • the parallax refraction method is a method for deriving the solution concentration from the difference in refractive index, and is mainly used for substances that are difficult to apply the colorimetric method, such as sugars.
  • the substance is an electrolyte
  • the solution concentration is measured from ion concentration and electrical conductivity.
  • any method can be used as long as it is a known method for measuring hemoglobin.
  • Such methods include, for example, the methemoglobin method, cyan methemoglobin method, azide methemoglobin method, sodium dodecyl sulfonate (SLS) method, alkali hematine method, green chromophore formation method or oxyhemoglobin method.
  • SLS sodium dodecyl sulfonate
  • alkali hematine method alkali hematine method
  • green chromophore formation method or oxyhemoglobin method.
  • the optical wavelength of the sample is changed at an absorption wavelength specific to the denatured hemoglobin obtained by denaturing hemoglobin in the sample with a tetrazolium compound.
  • a method for measuring the amount of chemical conversion can be used.
  • albumin any known method for measuring albumin can be used.
  • albumin-specific dyes such as bromcrezo monore green, bromcreso monoreperpnore, bromophenolenorenore, methinore orange, or 2- (4'-hydroxybenzeneazo) benzoic acid. The method to use etc. are mentioned.
  • the ratio of the glycoprotein to be measured to the target protein means the ratio of the content or concentration of the target protein in the same sample to the content or concentration of the glycoprotein to be measured in the sample.
  • a standard curve was prepared using the target protein at a known concentration and the glycoprotein to be measured at a known concentration. The calibration curve can be used to determine the target protein concentration in the sample and the sugar protein concentration to be measured. Both concentration forces can also calculate the ratio of glycoprotein to be measured relative to the target protein.
  • the sample containing the glycoprotein to be measured and the protein of interest can be separated from the biological sample as necessary.
  • the separation method include centrifugation, filtration, and a method using a blood cell separation membrane.
  • the separation method by centrifugation can separate whole blood into blood cells, plasma or serum.
  • the blood cells can be washed with an isotonic solution such as physiological saline to obtain washed blood cells from which plasma-derived components have been removed.
  • a sample containing blood cells such as whole blood, blood cells, and washed blood cells can be diluted with a hypotonic solution for hemolysis.
  • the hypotonic solution may be any solution as long as it can lyse blood cells, but includes water, buffer solution, and the like, and preferably contains an additive such as the aforementioned surfactant.
  • Examples of methods for preparing washed blood cells include the following methods.
  • HbAlc in a sample is measured will be specifically described with reference to the selection of the enzyme used in step (ii) and step (iii), but the present invention is not limited to this.
  • Fru-Val fructosyl valine derived from glycated hemoglobin
  • Fru-V-His fructosyl noryl histidine
  • Fru-Va fructosyl norleuleucine derived from sugar-hemoglobin with a-chain N-terminal norrin residue
  • Fru-Lys fructosyl lysine derived from the sugar ⁇ of the ⁇ -amino group of the lysine residue inside the a chain and Z or j8 chain
  • glycoproteins such as Fru-Lys are also produced from glycoproteins other than the glycoprotein to be measured, such as glycoprotein albumin.
  • Fru-VaH "Iis and Fru-Va ⁇ Leu should be measured specifically.
  • HbAlc measure Fru-Va His specifically. do it.
  • Table 1 shows the theoretical specificity patterns of enzymes for Fru-Val-His, Fru-Val, Fru-Lys, and Fru-Va ⁇ Leu. ⁇ indicates that the enzyme acts, and X indicates that the enzyme does not.
  • Enzymes that act on saccharide oligopeptides include type 1 to type 9, type 11, type 13 and type 15, and Fru-VaH" Iis Examples of the enzymes that act on the above include type 1 to type 8.
  • Examples of enzymes that act on Fru-Val-His but not on Fru-Va ⁇ Leu include Type 2, Type 4, Type 6, and Type 8.
  • step (ii) and step (iii) the target glycoamino acid and Z or glycooligopeptide can be measured.
  • the enzyme combinations that can be used in step (ii) and step (iii) include, for example, the enzyme combinations shown in Example 1 and Example 2 in Table 2.
  • Fru- By using a proteolytic enzyme or the like that does not produce Val or Fru-Lys, for example, combinations of enzymes shown in Example 3 or Example 4 in Table 2 can be used.
  • step (ii) sugar amino acids originally present in the sample are also removed.
  • a measurement system is similarly constructed for glycoproteins other than HbAlc, (a) Chromatography and mass spectrometry analysis of glycoproteins and Z or glycopeptides produced by proteinases Identification by methods such as capillary electrophoresis, (b) glycated amino acids and Z derived from glycated proteins other than the glycated protein without reacting with the identified glycated amino acids and Z or glycated oligopeptides Alternatively, a measurement system can be constructed by a procedure of selecting an enzyme that reacts with a glycated oligopeptide and an enzyme that reacts with the identified saccharide amino acid and Z or saccharide oligopeptide.
  • the substrate specificity of an enzyme such as fructosylamine oxidase used in the present invention can be determined using, for example, a glycosylamino acid and Z or glycosyl oligopeptide having a known structure. This can be confirmed by using the reagent A and the reagent for examining the substrate specificity of the enzyme such as the sample below.
  • the sugar amino acid and Z or sugar oligopeptide in the sample may have any concentration, for example, a constant concentration such as 1 mol ZL is prepared. Prepare this sample (0.15 mL)
  • reaction start 1 5 minutes after the start, add reagent A50 L, and continue to react at 37 ° C for 5 minutes. Reaction start 1
  • reaction absorbance ⁇ A calculated by the above is obtained as ImAbs or more, it can be determined that there is reactivity. For example, when the reaction absorbance for another substrate is 50% or less with respect to the reaction absorbance ⁇ A for a certain substrate, it can be determined that there is no reactivity to the other substrate.
  • the reagent for measuring glycoprotein to be measured and the measurement kit of the present invention can be used in the method for measuring glycoprotein to be measured of the present invention.
  • the reagent for measuring glycoprotein to be measured of the present invention can take the form of a kit as a form suitable for storage, transportation and distribution. Examples of the kit include a 2-reagent system and a 3-reagent system.
  • the reagent for measuring glycoproteins to be measured of the present invention includes a proteolytic enzyme, a glycated amino acid produced from a glycated protein other than the glycated protein to be measured, an enzyme acting on Z or a glycated oligopeptide, Glycoproteins other than power sugar protein Proteins produced by the reaction of Glycoamino acids and Z or Glycooligopeptides with enzymes that act on the Glycoamino acids and Z or glycated oligopeptides , Amino acid and zygote amino acid produced from the glycoprotein to be measured, enzyme acting on Z or glycopeptide, and glycated amino acid and glycated amino acid to be produced It is produced by the reaction of Z or sugar oligopeptide with the enzyme acting on the sugar amino acid and Z or sugar oligopeptide. Reagent including for measuring the product to be.
  • kits of the kit for measuring glycoprotein to be measured of the present invention include kits of the following embodiments.
  • Kit 1 (3-reagent kit)
  • (B) Enzyme acting on glycated amino acid and Z or glycated oligopeptide generated from glycated protein other than glycated protein to be measured, and glycated protein to be measured Eliminates the product produced by the reaction of the sugar amino acid and z or sugar oligosaccharide peptide produced from the other glycoprotein and the enzyme acting on the sugar amino acid and Z or sugar oligopeptide.
  • a second reagent comprising a reagent for;
  • Kit 2 (2-reagent kit)
  • A Proteolytic enzyme, generated from glycated protein other than glycated protein to be measured, glycated amino acid and glycated protein produced from glycated protein other than glycated protein to be measured, and glycated protein other than glycated protein to be measured
  • a first reagent comprising a reagent for removing a product produced by the reaction of the glycated amino acid and Z or glyco-oligopeptide with an enzyme acting on the glyco-amino acid and Z or glyco-oligopeptide;
  • the kit of the present invention is 3 from the viewpoint of suppressing the degradation of the enzyme acting on glycosylation amino acid and Z or glycosylation oligopeptide produced from the glycosylated protein other than the glycosylated protein to be measured by the proteolytic enzyme.
  • a reagent system is preferred.
  • Proteolytic enzyme used in the measurement reagent and measurement kit of the present invention glycated amino acid produced from glycated protein other than the glycated protein to be measured, enzyme acting on Z or saccharide oligopeptide, sugar to be measured ⁇ Glycoprotein strength other than protein Products produced by the reaction of glycamino acids and Z or glycoligopeptides with enzymes that act on the glycaminoacids and Z or glycated oligopeptides Reagents for removing sugars, amino acids that also produce glycoproteins to be measured and enzymes that act on Z or glycopeptides, and glycoproteins to be produced Reagents for measuring the product produced by the reaction of the saccharide amino acid and z or saccharide oligopeptide with the enzyme acting on the saccharide amino acid and z or saccharide oligopeptide, respectively, The above-mentioned thing is mentioned.
  • a hydrogen peroxide remover that removes hydrogen peroxide generated by the action of oxidase
  • a glucose remover that removes glucose
  • an amino acid that removes amino acids or oligopeptides
  • a force including an oligopeptide remover and the like A peracid-hydrogen remover is preferred.
  • Examples of the product measuring reagent in the step (m) of the present invention include a peroxy hydrogen measuring reagent.
  • the hydrogen peroxide removal reagent is contained in the second reagent.
  • the third reagent contains a catalase activity inhibitor.
  • the catalase activity inhibitor include the aforementioned catalase activity inhibitors.
  • a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and one oxidative coupling type chromogen is used as a peracid hydrogen removal reagent, the peroxidative active substance and the oxidative coupling type color are used. Since the drug substance also serves as a component of the hydrogen peroxide measurement reagent !, it is not necessary to remove or inactivate the hydrogen peroxide removal reagent.
  • the measurement reagent and measurement kit of the present invention may contain a measurement standard substance such as a standard protein, if necessary.
  • the measurement reagent and measurement kit of the present invention may contain a reagent for measuring the target protein, if necessary.
  • the hemoglobin measurement reagent is methemoglobin method, cyan methemoglobin method, Examples include known hemoglobin measuring reagents used in the id methemoglobin method, the sodium dodecyl sulfonate (SLS) method, the alkali hematin method, the green chromophore formation method, the oxyhemoglobin method, and the like.
  • the measurement reagent and measurement kit of the present invention may contain a buffer, a stabilizer, a preservative, an influential substance removing agent, a nonspecific reaction inhibitor, and the like, if necessary.
  • the buffer include the aforementioned buffer.
  • the stabilizer include ethylenediamintetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride, amino acids, albumins, dextran, calcium chloride, and calcium acetate.
  • antiseptics include sodium azide and antibiotics.
  • As the influence substance removing agent for example, ascorbate oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid can be mentioned.
  • the non-specific reaction inhibitor include polymer compounds such as dextran sulfate.
  • the measurement kit of the present invention may be lyophilized or dissolved in the reaction solution.
  • the kit can be used by dissolving in the aforementioned aqueous medium or reaction solution.
  • the kit may contain reagents for dissolving the lyophilized reagent.
  • the content of the proteolytic enzyme in the measurement kit of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to: L, 000, OOOU / mL. A content of 100, OOOU / mL is more preferable.
  • the content of the fructosyl aminoxidase of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to: L, OOOU / mL. A content of LOOU / mL is more preferable.
  • the content of the surfactant in the kit of the present invention is preferably such that the concentration when dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 20%, more preferably 0.01 to 10%. .
  • the content of catalase in the kit is 0.1 to 10 and OOOU / mL when dissolved in an aqueous medium. A content of 10-2, OOOU / mL is more preferred.
  • the content of the catalase activity inhibitor in the kit is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 5 to 600 mmol ZL. A content of 90 mmol ZL is more preferable.
  • the peroxidase in the kit and the acid coupling type color in the case of using a reagent containing peroxidase and one kind of acid coupling type chromogen as the peracid hydrogen removing reagent.
  • the content of the active ingredient is preferably 1 to 600 U / mL, 0.05 to 8 g / L in concentration in a state dissolved in an aqueous medium, preferably 2 to 150 U / mL, 0.1 to More preferred content is 4g / L.
  • Content of peroxidase and acid-coupled chromogen in kit when using reagent containing peroxidase and acid-coupled chromogen as peroxyhydrogen measurement reagent are preferably dissolved in an aqueous medium at a concentration of 1 to 600 U / mL, 0.5 to 40 g / L, preferably 2 to 150 UZmL, and a content of 1 to 20 g / L. More preferred.
  • Amphital 20N Dodecyldimethylamine oxide, manufactured by Kao Corporation
  • New Coal 723 (POE polycyclic phenol ether; manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.)
  • Nonidet P-40 (POE octyl ether; manufactured by Fluka)
  • kit comprising the following reagents
  • the substrates Fru-Val and Fru-Lys were prepared using the method of Hashiba et al. (Hashiba H, J. Agric. Food. Chem. 24:70, l 976).
  • Tris buffer ( ⁇ 7.5) lOOmmol / L Tris buffer ( ⁇ 7.5) lOOmmol / L
  • First reagent 490 1 ⁇ is supplemented with 210 L of second reagent and 37 ° C. For 5 minutes. The reaction mixture was heated at 95 ° C for 5 minutes and then cooled on ice. Furthermore, it is obtained by centrifuging (5, OOOrpm) for 10 minutes at 4 ° C. 115 L of 100 mmol / L Tris buffer (pH 7.5) was added to 35 / z L of the supernatant, and the mixture was heated at 37 ° C for 1 minute, and then the absorbance (AO ′) at 750 ° C. was measured.
  • Tris buffer pH 7.5
  • Table 3 shows the measured values for each kit.
  • saccharide other than saccharide amino acids and Z or saccharide oligopeptides to be measured is generated in the reaction solution by the action of enzymes that act on amino acids and Z or sugar oligosaccharides. It has been shown that by removing the product, the sugar amino acid and z or sugar oligopeptide to be measured can be selectively measured.
  • Second reagent Reagent containing product removal reagent
  • Blood samples were collected from healthy individuals and diabetics, mixed by inversion, and 4 volumes of distilled water were added to 1 volume of whole blood to obtain a standard product.
  • HbAlc % M straight was measured and its concentration was measured according to the usage amount of Detamina HbAlc (manufactured by Kyowa Medettas).
  • HbAlc Glycoprotein to be measured
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇
  • samples samples from healthy individuals and diabetics whose concentrations were measured in (1) and distilled water were used as hemoglobin measurement kits using hemoglobin ⁇ -test ⁇ (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Hemoglobin concentration was measured according to the usage and dose of hemoglobin ⁇ —test ⁇ . From the obtained hemoglobin concentration, the amount of hemoglobin ( ⁇ g) in a total reaction volume of 200 ⁇ L of this reaction system was calculated.
  • HbAlc glycated protein to be measured
  • hemoglobin target protein
  • Figure 1 shows the correlation between ⁇ ′ calculated in (4) and the ratio (HbAlc%) calculated in (5).
  • the vertical axis represents ⁇ ′ obtained by the enzymatic method using the measurement kit of the present invention, and the horizontal axis
  • Figure 1 shows the HbAlc% obtained by immunoassay using Detamina HbAlc reagent, and the values for each sample are plotted. As shown in Fig. 1, there is a good correlation and straight line between the two. Sex was recognized. Therefore, it was shown that HbA lc in a sample can be measured by the measurement method of the present invention.
  • the measuring method of the glycoprotein which should be measured in a sample, a measuring reagent, and a measuring kit useful for diagnosis of diseases, such as diabetes, are provided.

Abstract

　二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法であって、水性媒体中、（ｉ）試料中の該二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに分解する工程、（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖化タンパク質の測定方法。

Description

糖化タンパク質の測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、糖ィ匕タンパク質の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。
背景技術
[0002] 生体試料、食品等には、タンパク質のァミノ基がグルコース等の還元糖と非酵素的 に結合して生成する多種類の糖ィ匕タンパク質が含有されている。特に血中のタンパ ク質であるヘモグロビン、アルブミン等は、血中のグルコース濃度に依存して、それぞ れ糖ィ匕ヘモグロビン、糖ィ匕アルブミン等を生成し、また、各タンパク質は生体中で一 定の半減期を持つことから、これら糖ィ匕タンパク質は、過去の一定期間の平均血糖 値を反映しており、糖尿病患者の血糖の指標として臨床の現場で日常的に測定され ている。
[0003] 糖ィ匕タンパク質の測定方法としては、 HPLC法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法 、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定方法、糖化タンパク質及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチド及び Z又は糖ィ匕アミノ酸に作用する酵素を用いる酵素測定 方法などが知られている。酵素測定方法は操作が比較的簡便であり、安価であると いう利点を有する。
糖ィ匕タンパク質の酵素測定方法としては、例えば糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリ ゴペプチドに作用するフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ (特許文献 1)、フルクトシル ペプチドォキシダーゼ (特許文献 2〜7)、フルクトシルアミノ酸キナーゼ (特許文献 8) を用いる方法等が知られて 、る。
[0004] 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む生体試料中の測定すべき構造の糖ィ匕タンパク質 を分別測定する方法としては、測定すべき構造の糖ィ匕タンパク質を選択的に加水分 解させることにより生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドを測定する 方法が知られている。例えばヘモグロビンの β鎖 Ν末端が糖ィ匕されている糖ィ匕タン パク質、即ちヘモグロビン Ale (以下、 HbAlcと略記する）のみを選択的に測定する ために、糖ィ匕ヘモグロビン若しくはそのフラグメントから a鎖 N末端の糖化アミノ酸及 び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドを生じる作用よりも 13鎖 N末端の糖化アミノ酸及び Z又 は糖ィ匕オリゴペプチドを生じる作用が大き、、プロテアーゼを用いる方法 (特許文献 9) が知られている。
[0005] また、検体中に元々存在する、測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕化合物であ る、例えば測定値の誤差のもととなる遊離の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプ チド等の影響を除去するため、この遊離の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプチ ドを除 ヽた検体中に存在する糖化タンパク質を測定する方法 (特許文献 10及び 11) が知られている。
また、試料中の糖ィ匕タンパク質に、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼを作用させて 、その酸ィ匕還元反応を測定することにより糖ィ匕タンパク質を測定する方法であって、 前記試料中に糖ィ匕タンパク質とは別に存在する糖ィ匕アミノ酸を除去することを目的と して、前記酸化還元反応に先立ち、前記糖ィ匕アミノ酸にフルクトシルアミノ酸ォキシダ ーゼを作用させて分解し、テトラゾリゥム化合物及びアジ化ナトリウムの存在下で、前 記酸化還元反応を行う糖化タンパク質の測定方法 (特許文献 12)が知られて 、る。
[0006] また、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、 pH4. 0〜7. 0でフルクトシ ルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生 成物を pH4. 0〜7. 0にて測定することを特徴とする、フルクトシルペプチド又はフル クトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法 (特許文献 1 3)が知られている。さらに、カタラーゼを共存させたプロテアーゼ含有試薬を用いた 糖ィ匕タンパク質の定量方法 (特許文献 14)が知られて 、る。
特許文献 1：国際公開第 W097Z13872号パンフレット
特許文献 2：特開 2001— 95598公報
特許文献 3：特開 2003 - 235585公報
特許文献 4：特開 2005— 110657公報
特許文献 5：国際公開第 WO04Z038033号パンフレット
特許文献 6：国際公開第 WO04Z038034号パンフレット
特許文献 7:国際公開第 WO04Z275013号パンフレット
特許文献 8：特開 2005 - 58157公報 特許文献 9：特開 2004— 344052公報
特許文献 10 :特開 2004— 113014公報
特許文献 11：国際公開第 WO03Z033729号パンフレット
特許文献 12：国際公開第 WO03Z064683号パンフレット
特許文献 13：国際公開第 WO05Z049857号パンフレット
特許文献 14:特開 2004— 49063公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タン ノ ク質を正確に測定する方法、試薬及びキットを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は、二種以上の糖化タンパク質を含む試料にタンパク質分解酵素を作用さ せて、糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドを生成させ、測定すべき糖化タン ノ ク質以外の糖ィ匕タンパク質由来の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドを 予め除去した後、測定すべき糖ィ匕タンパク質由来の糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕ォ リゴペプチドを測定することを特徴とする、試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質を選 択的に測定する方法を提供するものである。
[0009] 本発明は、以下の [1]〜[21]に関する。
[1] 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の測 定方法であって、水性媒体中、（i)試料中の該二種以上の糖ィ匕タンパク質にタンパク 質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を分解する工程、 (ii)測定すベ き糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖ィ匕 オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去するェ 程、（m)測定すべき糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴ ペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含 む糖ィ匕タンパク質の測定方法。
[0010] [2] さらに、（iv)試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質を構成するタンパク質 (以下
、対象タンパク質という）の濃度を測定する工程、及び、（V)工程 (iii)で測定した試料中 の測定すべき糖ィ匕タンパク質の濃度と、工程 Gv)で測定した試料中の対象タンパク質 の濃度とから、試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の対象タンパク質に対する割合 を決定する工程を含む [ 1 ]記載の方法。
[0011] [3] 工程 (i)力 一種又は二種以上の界面活性剤の存在下に行われる [1]又は [ 2]記載の方法。
[4] 工程 (ii)力 糖ィ匕アミノ酸に作用するォキシダーゼを該生成した糖ィ匕ァミノ 酸に作用させ、生成する過酸化水素を除去する工程であり、かつ、工程 (iii)が、糖ィ匕 オリゴペプチドに作用するォキシダーゼを該生成した糖ィヒオリゴペプチドに作用させ
、生成する過酸ィ匕水素を測定することにより行われる [ 1]〜 [3]の 、ずれかに記載の 方法。
[0012] [5] 工程 (ii)での生成物の除去が、カタラーゼを用いる過酸ィ匕水素の除去であり
、工程 (m)での生成物の測定が、パーォキシダーゼと酸化発色型色原体とを用いる 過酸ィヒ水素の測定である [ 1]〜 [4]の 、ずれかに記載の方法。
[6] 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 ヘモグロビン Aleである [1]〜 [5]のいずれ かに記載の方法。
[0013] [7] 対象タンパク質力 ヘモグロビンである [2]〜 [6]のいずれかに記載の方法
[8] 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の測 定用試薬であって、タンパク質分解酵素、測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タ ンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素、 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用す る酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖ィ匕タン ノ ク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素、並 びに、測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺ プチドと当該糖化アミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドに作用する酵素との反応に より生成する生成物を測定するための試薬を含むことを特徴とする試薬。
[0014] [9] さらに、対象タンパク質を測定するための試薬を含む [8]記載の試薬。 [10] さらに、一種又は二種以上の界面活性剤を含む [8]又は [9]記載の試薬。
[11] 測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素が、糖ィ匕アミノ酸に作用するォキ シダーゼであり、測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖 化オリゴペプチドに作用する酵素力 S、糖化オリゴペプチドに作用するォキシダーゼで ある [8]〜 [10]の!、ずれかに記載の試薬。
[12] 測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドと当該糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチド に作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラー ゼを含む試薬であり、測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又 は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する 酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーォキシダーゼ及 び酸化発色型色原体を含む試薬である [8]〜 [11]の ヽずれかに記載の試薬。
[13] 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 ヘモグロビン Aleである [8]〜 [12]のいず れかに記載の試薬。
[14] 対象タンパク質力 ヘモグロビンである [9]〜 [13]のいずれかに記載の試 薬。
[15] 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の 測定用キットであって、（A)タンパク質分解酵素を含む第一試薬と、（B)測定すべき 糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリ ゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパ ク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及 び Z又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去 するための試薬を含む第二試薬と、 (C)測定すべき糖ィ匕タンパク質力も生成する糖 化アミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖ィ匕タ ンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を 測定するための試薬を含む第三試薬と、を含むことを特徴とするキット。 [0016] [16] さらに、対象タンパク質を測定するための第四試薬を含む [15]記載のキッ
[17] タンパク質分解酵素を含む第一試薬が、一種又は二種以上の界面活性 剤を含む試薬である [ 15]又は [ 16]記載のキット。
[18] 測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素が、糖ィ匕アミノ酸に作用するォキ シダーゼであり、測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成した糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖 化オリゴペプチドに作用する酵素力 S、糖化オリゴペプチドに作用するォキシダーゼで ある [15]〜 [17]のいずれかに記載のキット。
[0017] [19] 測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドと当該糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチド に作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラー ゼを含む試薬であり、かつ、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及 び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作 用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、バーオキシダ ーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である [ 15]〜 [ 18]の 、ずれかに記載のキ ッ卜。
[0018] [20] 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 ヘモグロビン Aleである [15]〜 [19]のい ずれかに記載のキット。
[21] 対象タンパク質力 ヘモグロビンである [16]〜 [20]のいずれかに記載の やット。
発明の効果
[0019] 本発明により、二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパ ク質を正確に測定する方法、試薬及びキットが提供される。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明の HbAlc測定用キットを用いた測定と、免疫法による測定との間の相関 を示す。
発明を実施するための最良の形態 [0021] (試料及び測定対象物）
本発明の測定方法に用いられる試料としては、二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む 試料であれば特に制限はなぐ例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄 液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料、及び食品等が挙げられる。試 料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましい。これらの試料は、溶血、分離、 希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。
[0022] 本発明にお 、て、測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質を対象タンパク 質という。例えば HbAlcなどの糖ィ匕ヘモグロビンに対してヘモグロビンを、糖化アル ブミンに対してアルブミンを対象タンパク質と 、う。
本発明にお!、て種類の異なる糖ィ匕タンパク質としては、糖化タンパク質を構成する タンパク質、即ち対象タンパク質の種類が異なる場合だけでなぐ糖化タンパク質を 構成する対象タンパク質の種類が同一であっても、該糖ィ匕タンパク質がそれぞれ異 なる構造として区別される場合も挙げられる。
[0023] 例えばヘモグロビン β鎖の Ν末アミノ酸が糖ィ匕されたタンパク質、即ち HbAlcを特 異的に測定する場合、対象タンパク質であるヘモグロビンは、 α鎖と j8鎖と力 なる 複合体であり、 a鎖が糖化されたタンパク質と β鎖が糖化されたタンパク質の二種の 糖ィ匕タンパク質を含みうるので、タンパク質としてヘモグロビンのみを含む試料も、本 発明の二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料に含まれる。
[0024] さらには、同一種の対象タンパク質分子内の異なるアミノ酸位置に糖が結合してい る糖ィ匕タンパク質の混合物から、測定すべき特定のアミノ酸位置に糖が結合した糖 化タンパク質を測定する場合、該糖ィ匕タンパク質の混合物も二種以上の糖ィ匕タンパ ク質に包含される。
例えば HbAlcを測定する場合、対象タンパク質であるヘモグロビン j8鎖は、へモ グロビンの β鎖の Ν末のパリン残基の α—ァミノ基と、ヘモグロビン β鎖のアミノ酸配 列中のリジン残基の ε —ァミノ基とが糖ィ匕されているヘモグロビン j8鎖の二種類の糖 化タンパク質を含みうるので、タンパク質としてヘモグロビン j8鎖のみを含む試料も、 本発明の二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料に含まれる。
[0025] 測定すべき糖ィ匕タンパク質としては、糖ィ匕を受けるタンパク質であれば特に制限は ないが、測定すべき糖化タンパク質濃度及び z又は測定すべきタンパク質濃度に対 する対象タンパク質濃度の割合を測定する意味があるタンパク質であることが好まし い。
生体内に存在する糖ィ匕を受けるタンパク質としては、例えばマトリックスタンパク質、 細胞内タンパク質、酵素、血漿タンパク質、ホルモン等が挙げられる。
[0026] マトリックスタンパク質としては、例えばコラーゲン、ミエリン、フイブロネクチン、フイブ リン等が挙げられる。膜タンパク質としては、例えば赤血球グルコース輸送タンパク質 、赤血球スぺクトクリン、赤血球膜タンパク質、内皮細胞膜タンパク質等が挙げられる 。細胞内タンパク質としては、例えばヘモグロビン A、水晶体クリスタリン、チューブリン 、カルモジュリン等が挙げられる。酵素としては、例えばカテブシン B、リゾチーム、脾 リボアーゼ、銅 Z亜鉛スーパーオキサイドジムスターゼ、炭酸デヒドラターゼ、 j8— N ァセチノレへキソサミ-ダーゼ、ァノレコーノレデヒドロゲナーゼ、ァノレドースレダクタ一 ゼ、アルデヒドレダクターゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、 Na+/K+—ATPァーゼ 等が挙げられる。血漿タンパク質としては、例えばアルブミン、免疫グロブリン、アポ A 1、アポ Α—Π、アポ Β、アポ C— I、アポ E、ハプトグロビン、フェリチン、トランスフェリン 、 α 1—アンチトリプシン、プラスミノーゲン、プラスミノーゲンァクチベータ、フイブリノ 一ゲン、フイブリン、アンチトロンビン III、 β 2—ミクログロビン、セル口プラスミン等が挙 げられる。ホルモンとしては、例えば甲状腺ホルモン、インスリン等が挙げられる。
[0027] ヘモグロビンは、 a 鎖及び j8鎖の 2本のポリペプチドからなる分子量 64, 500の 4 量体である。ヘモグロビンの α鎖の N末端の 3アミノ酸配列はパリン一口イシンーセリ ンであり、 j8鎖の Ν末端の 3アミノ酸配列はパリン—ヒスチジン—ロイシンである。 Hb Aleは、 j8鎖の N末端パリンが糖ィ匕されたものと定義されている。また、ヘモグロビン は分子内に複数の糖ィ匕部位を有することが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127)。
[0028] 血清アルブミンは、分子量 69, 000で、分子内の 4力所のリジン残基が糖ィ匕されるこ とが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1986), 261 , 13542-13545)。 本発明では、糖ィ匕ヘモグロビン、 HbAlc、糖ィ匕アルブミン等が測定すべき糖ィ匕タン ノ ク質として好ましく例示される。 [0029] (糖化アミノ酸及び糖化オリゴペプチド）
本発明において、「糖ィ匕アミノ酸」とは、グルコース等の還元糖とアミノ酸 1分子が結 合しているものであり、「糖ィ匕オリゴペプチド」とは、グルコース等の還元糖とオリゴぺ プチドが結合して!/、るものである。本発明にお 、て糖ィ匕オリゴペプチドのペプチドと は、アミノ酸残基数が 2〜10の範囲のものをいい、 2〜6の範囲のものが好ましい。
[0030] 特に、本発明において、後述するォキシダーゼを用いる場合は、糖ィ匕オリゴぺプチ ドのペプチドとは該酵素が作用する長さのペプチドとして定義され、通常アミノ酸残 基数が 2〜6の範囲のものを 、う。ォキシダーゼが作用しな 、アミノ酸残基が 11以上 の長さのペプチド及びタンパク質が糖ィ匕されて 、るものを併せて「糖ィ匕タンパク質」と いう。
[0031] (タンパク質分解酵素）
本発明に使用しうるタンパク質分解酵素は、試料中に含まれる測定すべき糖化タン パク質に作用するものであればいかなるものを用いてもよぐ例えば動物、植物、微 生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
[0032] 動物由来のプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ（Elastase)、トリプシン（Tryp sin),キモトリブシン（Chymotrypsin)、ペプシン（Pepsin)、牛脾臓プロテアーゼ、ブタ 肝由来ロイシンアミノぺプチダーゼ、カテブシン（Cathepsin)、カルパイン（Calpain)、 プロテアーゼタイプ I、プロテアーゼタイプ XX (以上、シグマ社製）、アミノぺプチ ダーゼ M (Aminopeptidase M)ゝカノレボキシぺプチダーゼ A (Carboxypeptidase A) ( 以上、ベーリンガ一'マンハイム社製）、パンクレアチン（Pancreatin :和光純薬工業社 製、シグマ社製)等が挙げられる。
[0033] 植物由来のプロテアーゼとしては、例えばカリクレイン（Kallikrein)、フイシン（Ficin) 、パパイン（Papain)、キモパパイン（Chymopapain),ブロメライン、カルボキシぺプチダ ーゼ W (以上、シグマ社製）、パパイン W-40、ブロメライン F (以上、天野ェンザィム社 製)等が挙げられる。
微生物由来のプロテアーゼとしては、例えば下記 (1)〜(14)が挙げられる。
[0034] (1)バチルス (Bacillus)属由来プロテアーゼ；ズブチリシン (Subtilisin)、プロテアーゼ タイプ- VIII、プロテアーゼータイプ- IX、プロテアーゼータイプ- X、プロテアーゼ タイプ- XV、プロテアーゼータイプ- XXIV、プロテアーゼータイプ- XXVII、プロテ ァーゼ タイプ- XXXI、プロティナーゼ TypeVII、バチルスリケ-フオルミス由来プロテ ァーゼ (以上、シグマ社製)、サーモリシン (以上、和光純薬社製)、オリエンターゼ -90N 、オリエンターゼ- 10NL、オリエンターゼ -22BF、オリエンターゼ- Y、オリエンターゼ- 5 BL、ヌクレイシン（以上、エイチビィアイ株式会社製）、プロレザー FG-F、プロテア一 ゼ NL「ァマノ」、プロテアーゼ S「ァマノ」 G、プロテアーゼ N「ァマノ」 G (以上、天野ェン ザィム社製）、 GODO- BNP、 GODO- BAP、 GODO高純度プロテアーゼ（以上、合同 酒清社精製）、プロチン- AC 10F、プロチン- NL10、プロチン- NC25、プロチン- NY10、 プロチン- PC10F、プロチン PS10、デスキン、デビレイス、ビォソーク、サモアーゼ -P C10F、サーモリシン（以上、大和化成社製）、トヨチーム NEP、中性プロテアーゼ（以 上、東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デユラザィム、バイ オフイードプロ、ァノレカラーゼ、 NUE、ピラーゼ、クリア一レンズプロ、エバラーゼ、ノ ボザィム- FM、ボラン（以上、ノボノルディスクバイオインダストリ一社製）、ェンチロン -NBS、ェンチロン- SA (以上、洛東化成工業社製)、ナガーゼ (Nagarse)、ピオブラー ゼ APL- 30、ビオプラーゼ SP- 4FG、ビオプラーゼ XL- 416F、ビオプラーゼ AL- 15FG、 ぺクチナーゼ XP-534 (以上、ナガセケムテックス社製)、ァロアーゼ AP-10、プロテア ーゼ YB、（以上、ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ- N、コロラーゼ- 7089、ベロン W (以上、樋口商会社製）、キラザィム P-l、デイスパーゼ (以上、ロシュ社製)、サチラ イシン（ベーリンガ^ ~ ·マンハイム社製）、プロティナ一ゼ?^、プロティナーゼ Bacterial Subtilisin (以上、フル力社製）、プロナーゼ E (科研製薬社製)等。
(2)ァスペルギルス (Aspergillus)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ- ΧΙΠ、 -XIX 、 -XXIII (以上、シグマ社製）、スミチーム - MP、スミチーム- AP、スミチーム- LP L、ス ミチーム- LP20、スミチーム- FP、ェンザィム P-3 (以上、新日本化学工業株式会社製 )、オリエンターゼ- 20A、オリエンターゼ- ONS、オリエンターゼ- ON5、テトラーゼ S (以 上、エイチビィアイ株式会社製）、ゥマミザィム G、ニューラーゼ 、ニューラーゼ F3G、 プロテアーゼ A「ァマノ」 G、プロテアーゼ K「ァマノ」、プロテアーゼ M「ァマノ」 G、プロ テアーゼ P「ァマノ」 3G (以上、天野ェンザィム社製）、アルカリプロテアーゼ、酸性プ 口テアーゼ、モノレシン、 AOプロテアーゼ、ぺプチダーゼ（以上、キッコ一マン社製）、 プロチン- F、プロチン- FN、プロチン- FA (以上、大和化成社製）、デナプシン 2P、デ ナチーム- SA-7、デナチーム- AP、デナザィム AP (以上、ナガセケムテックス社製）、 プロテアーゼ YP- SS、パンチダーゼ -NP- 2、パンチダーゼ -P (以上、ヤクルト薬品ェ 業社製）、サカナーゼ (科研製薬社製）、フレーバーザィム（ノボノルディスクバイオイ ンダストリー社製）、ベロン PS (樋口商会社製）、プロティナーゼ 6 (フルカネ土製）、プロ テアーゼ A5 (協和化成社製)等。
[0036] (3)リゾパス (Rhizopus)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ XVIII (シグマ社製）、 ぺプチダーゼ R、ニューラーゼ F (以上、天野ェンザィム社製）、 XP-415 (ナガセケム テックス社製)等。
(4)ぺ-シリウム (Penicillium)由来プロテアーゼ； PD酵素（キッコーマン社製）、プロ テアーゼ B「ァマノ」（天野ェンザィム社製）、デォキシン 1 (ナガセケムテックス社製） 等。
[0037] (5)ストレプトマイセス (Streptomvces)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ XIV (別 称 Pronase) 、プロテアーゼ -XXI (以上、シグマ社製）、ァクチナーゼ -AS、ァクチナ ーゼ -AF、ァクチナーゼ -E (以上、科研製薬社製）、 Alkalofilic Proteinase (東洋紡 社製）、プロナーゼ E (ロシュ社製、カルビオケム―ノパイオケム社製、シグマ社製）、 プロナーゼ (ベーリンガー ·マンハイム社製)等。
[0038] (6)スタフイロコッカス (Staphylococcus)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ XVII ( シグマ社製）、エンドプロティナーゼ Glu- C (ベーリンガ一'マンハイム社製）、 V8プロ テアーゼ (タカラ社製、和光純薬社製)等。
(7)クロストリジゥム（Clostridium)由来プロテアーゼ：クロストリパイン、ノンスぺシフィ ツクユユートラルプロテアーゼ、コラゲナーゼ TypelA (以上、シグマ社製）等。
[0039] (8)リソパクター (Lvsobacter)由来プロテアーゼ；エンドプロティナーゼ Lys-C (シグ マ社製)等。
(9)グリフオラ (G i^k)由来プロテアーゼ；メタ口エンドべプチダーゼ（Metalloendope ptidase；シグマ社製）等。
(10)酵母 (Yeast)由来プロテアーゼ；プロティナーゼ A (Proteinase A；シグマ社製） 、カノレボキシぺプチダーゼ Y (Carboxvpeptidase Y;ベーリンガー 'マンハイム社製） 等。
[0040] (11)トリチラチウム (Tritirachium)由来プロテアーゼ；プロティナーゼ K (Proteinase K ；シグマ社製、ロシュ社製、和光純薬社製)等。
(12)サーマス (Thermus)由来プロテアーゼ；アミノぺプチダーゼ T(AminopeptidaseT ；ベーリンガー ·マンハイム社製)等。
(13)シユードモナス (Pseudomonas)由 プロテアーゼ：エンドプロティナーゼ Asp-N (Endoproteinase Asp- N；和光純薬社製)等。
[0041] (14)ァクロモパクター (Achromobacter)由来プロテアーゼ；リジノレエンドぺプチダー ゼ（Lysylendopeptidase)、ァクロモぺプチダーゼ（以上、和光純薬社製）、 AP-Kタカ ラ社製)等。
[0042] 本発明の測定方法においては、対象タンパク質がヘモグロビンである場合には、パ チルス属、ァスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテア ーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大きいので好ましぐ特にバチルス属由来の プロテアーゼが好まし ヽ。また対象タンパク質がアルブミンである場合にはバチルス 属及びストレブトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用 が大きいので好ましい。
[0043] タンパク分解酵素の濃度としては、反応液中で 0. 01-100, OOOU/mLの濃度 であることが好ましく、 0.：!〜 10, OOOUZmLであることがより好ましい。また、本発 明にお 、ては、 2種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
また本発明に使用するタンパク質分解酵素は着色していないものが好ましぐ例え ば該タンパク質分解酵素の 1, OOOUZmLの水溶液において波長 300〜800nmの 吸光度が lOOmAbs以下であるものが好ましく 0〜： LOmAbsがより好ましい。タンパク 質分解酵素は各種クロマトグラム、塩析、透析、活性炭処理等で精製し上述の吸光 度を減少させたものを使用するのが好まし 、。
[0044] (糖化アミノ酸及び 又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素）
本発明に使用しうる糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素と しては、前記タンパク質分解酵素の作用により、試料中の糖ィ匕タンパク質力も生成さ れる糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するものであれば如何なるも のを用いてもよい。
[0045] 糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素としては、例えば糖ィ匕 アミノ酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに作用するォキシダーゼ、キナーゼ、デヒドロ ゲナーゼ等があげられる。
糖ィ匕ヘモグロビンを測定対象とする場合には、 a -ァミノ基が糖化された糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素が好まし 、。糖ィ匕アルブミンを測 定対象とする場合には、 ε -ァミノ基が糖化された糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕オリゴ ペプチドに作用する酵素が好ましい。
[0046] (才キシダーゼ）
本発明におけるォキシダーゼとしては、糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作 用させて生成した糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕オリゴペプチドと酸素とに作用し、過 酸ィ匕水素及びアミノ酸若しくはオリゴペプチド等が生成するォキシダーゼであれば特 に制限はな 、が、例えばフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ、フルクトシルペプチドォ キシダーゼ、ケトァミンォキシダーゼ等が挙げられる。
[0047] 該ォキシダーゼとしては、 ε -ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ォ リゴペプチドに作用するォキシダーゼ、 α -ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するォキシダーゼなどが挙げられる。
ε -アミノ基が糖化された糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するォ キシダーゼとしては、例えばギペレラ (Gibberella)属（例えば IFO-6356等）又はァス ペルギルス（Aspergillus)属（例えば IFO- 6365、 -4242、 -5710、 FERM BP- 5684等） 由来フルクトサミンォキシダーゼ、カンジダ (Candida)属由来フルクトシルァミンデグリ カーゼ、ぺニシリウム (Penicillium)属（例えば IFO- 4651、 -6581 , -7905, -5748, -7994 、 -4897、 -5337、 FERM BP- 5475等）由来、トリコスポロン (TrichosDoron)属（例えば FE RM P- 17134)由来、フサリウム（Ε Ϊ 1)属（例えば IFO- 4468、 -4471、 -6384、 -770 6、 -9964、 -9971、 -31180、 -9972、 FERM BP-5010等）由来フルクトシルアミノ酸分解 酵素、アクレモニゥム (Acremonium)属由来又はデバリオマイゼス (Debarvomvces)属 由来ケトァミンォキシダーゼ等が挙げられる。
[0048] a -ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するォ キシダーゼとしては、例えばコリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属由来、ネオコスモ スポラ (Neocosmospora)属 (例えば NBRC- 7590等）由来、コ-オケチジゥム (Coniochae i i l)属（例えば ATCC36547等）由来、ァルスリュウム属由来、ピレノケータ属由来 、レプトスフエリア（例えば NBRC7480等）属由来、オフィオボラス属由来、カーブラリア 属由来、フォーマ属由来のフルクトシルァミンォキシダーゼ（特開 2004-275013)、ュ ウベ-シリウム属（例えば ATCC 18547等）由来、コ-ォ力エタ属（例えば NISL 9330等 )由来フルクトシルペプチドォキシダーゼ（特開 2003— 235585)等が挙げられる。なお 、 a -ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するォ キシダーゼとしては、前述の ε -ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕 オリゴペプチドに作用するォキシダーゼも挙げられる。
[0049] この他、例えばフルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX- CE、フルクトシルペプチド ォキシダーゼ FPOX- EE、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ FAOX- TE、フルクトシル アミノ酸ォキシダーゼ FAOD-E (以上、キッコ一マン社製）、ショウガ科に属する植物 由来フルクトシルペプチドォキシダーゼ（WO04/038034)、バラ科、ブドウ科又はセリ 科に属する植物由来フルクトシルペプチドォキシダーゼ (WO04/038033)等が挙げら れる。
[0050] ε -ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕オリゴペプチドに特異的に 作用し、実質的に OCァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸には作用しないォキシダーゼ としては遺伝子操作フルクトサミンォキシダーゼ（FODVII；旭化成社製; WO02/06111 9)が挙げられる。
さらに、 exーァミノ基及び ε—ァミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ォ リゴペプチドに作用し、タンパク質分解酵素と共存させた状態でも充分な活性を有す る酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンォキシダーゼ (FODII；旭化成 社製)が挙げられる。
[0051] 該酵素の濃度としては、反応液中で 0. 01〜： L , OOOUZmLの濃度であることが好 ましぐ 0. 1〜： LOOUZmLであることがより好ましい。また、本発明においては、 2種 類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
[0052] (キナーゼ） 本発明に使用しうる糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するキナー ゼとしては、 ATPの存在下、糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用し、 A DPとリン酸ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び Z又はリン酸ィ匕された糖ィ匕オリゴペプチドとを生 成するキナーゼであれば特に制限はないが、例えば ε フルクトシルリジンに作用 する酵素としては、フルクトシルリジンー6—キナーゼ（The Journal of Biological Che mistry (2002), 277, 42523-42529)等が挙げられる。また、 oc フルクトシルバリン及 び α -フルクトシルバリルロイシンに作用するキナーゼとしてはアブラナ科植物由来フ ルクシルアミノ酸キナーゼ（特開 2005-58157)等が挙げられる。
[0053] 該酵素の濃度としては、反応液中で 0. 001〜1 , OOOUZmL以上の濃度であるこ と力 S好ましく、 1〜： LOOU/mLであることがより好ましい。また、本発明においては、 2 種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
[0054] (界面活性剤）
本発明においてタンパク質分解酵素を作用させる際に界面活性剤を共存させるの が好ましい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活 性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤を共存させることが好ましぐ非ィォ ン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が特に好ましい。
[0055] 非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリ ォキシエチレンアルキルフエ-ルエーテル、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテ ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミ ン、アルキレンジァミン ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシ エチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン 脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸 エステル、脂肪酸アル力ノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
[0056] ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンセチルェ 一テル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンォレイルエーテ ル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルフエ-ルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレン ォクチルフエ-ルエーテル、ポリオキシエチレンノユルフェ-ルエーテル等が挙げら れる。
[0057] ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンジべ ンジルフエニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフエニルエーテル、ポリオキ シエチレン（ジスチレン化）フエ-ルエーテル、ポリオキシエチレン（トリスチレン化）フ ェ-ルエーテル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物としては、例えばポリオキシエチレン ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンランダム重 合体等が挙げられる。
[0058] ポリオキシエチレンアルキルァミンとしては、例えばポリオキシエチレンドデシルアミ ン等が挙げられる。
アルキレンジァミン ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物としては、例え ばエチレンジアミンテトラポリオキシエチレン.ポリオキシプロピレン.ブロックポリマー 等が挙げられる。
[0059] ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレングリコール モノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレング リコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノォレエート等が挙げられる
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレンソ ルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシェ チレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリ ォキシエチレンソルビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート 等が挙げられる。
[0060] ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノ パルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリス テアレート、ソルビタンモノォレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキォレ エート等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えばテトラオレイン酸ポ リオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。 [0061] ポリオキシエチレンアルキルァミンとしては、例えばポリオキシエチレンドデシルアミ ン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルと しては、例えばステアリン酸モノダリセライド、ォレイン酸モノグリセライド等が挙げられ る。
脂肪酸アル力ノールアミドとしては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げら れる。
[0062] ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリ ン酸エステル等が挙げられる。
これら非イオン性界面活性剤の中でも、特にポリオキシエチレン鎖を有するものが 好ましぐ例えばポリオキシエチレンォクチルフヱ-ルエーテル、ポリオキシエチレン モノラウリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリオキシ エチレン多環フエニルエーテル、ポリオキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリ ォキシエチレンドデシルァミン等が挙げられる。
[0063] 陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族ァミン塩、脂肪族 4級アンモ-ゥム 塩等が挙げられる。
脂肪族ァミン塩としては、例えばモノドデシルァミン、モノステアリルァミン、ジステア リルァミン、トリステアリルァミン等の高級脂肪族ァミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或 いは酢酸、乳酸、クェン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられる。具体的に は、例えばドデシルァミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。
[0064] 脂肪族 4級アンモ-ゥム塩としては、例えばドデシルトリメチルアンモ-ゥム、ステア リルトリメチルアンモ-ゥム、セチルトリメチルアンモ-ゥム、ォクタデシルトリメチルアン モ-ゥム、へキサデシルトリメチルアンモ-ゥム、アルキルジメチルベンジルアンモ- ゥム、ジデシルジメチルアンモ-ゥム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモ-ゥム等 の高級脂肪族アンモニゥム等と塩素、臭素等との塩等が挙げられる。具体的には、例 えばドデシルトリメチルアンモ -ゥムクロライド、ステアリルトリメチルアンモ -ゥムクロラ イド、セチルトリメチルアンモ -ゥムクロライド、ォクタデシルトリメチルアンモ -ゥムクロ ライド、へキサデシルトリメチルアンモ -ゥムクロライド、アルキルジメチルベンジルアン モ -ゥムクロライド、ジデシルジメチルアンモ -ゥムクロライド、ベンジルジメチルテトラ デシルアンモ -ゥムクロライド等が挙げられる。
[0065] 陰イオン性界面活性剤としては、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステ ル塩、リン酸エステル塩、コール酸塩等が挙げられる。
カルボン酸塩としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸 、ォレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が 挙げられ。具体的には、例えばォレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、 N—ミリストイル— N—メチル— 13—ァラニンナトリウム、ポリオキシエチレンドデシル エーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。
[0066] スルホン酸塩としては、例えばドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼン スルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナ フタレンスルホン酸、ジォクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等 との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、 ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、 ジォクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。
[0067] 硫酸エステル塩としては、例えば高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシェチ レンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫 酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、アンモ-ゥム塩等が 挙げられる。高級アルコール硫酸エステル塩の具体例としては、例えばドデシル硫酸 ナトリウム、ドデシル硫酸アンモ-ゥム等力 ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫 酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸ナ トリウム等力 S、ポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸エステル塩の具体例とし ては、例えばポリオキシエチレン多環フエニルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる
[0068] リン酸エステル塩としては、例えばモノアルキルリン酸エステル塩、ポリオキシェチレ ンアルキルエーテルリン酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム 塩、カリウム塩等が挙げられる。モノアルキルリン酸エステル塩の具体例としては、例 えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノドデシルリン酸ナトリウム等力 ポリオキシェ チレンアルキルエーテルリン酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシェチ レンドデシルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。
[0069] コール酸塩としては、例えばコール酸ナトリウム等が挙げられる。
陰イオン性界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン鎖を有するものが特に好ましく 、具体例としては、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫酸エステル塩等が挙 げられる。
両性界面活性剤としては、例えばべタイン類、グリシン類、ァラニン類、 2—アルキ ルイミダゾリンの誘導体類、ァミンオキサイド類、アルキルアミノ塩類等が挙げられる。 ベタイン類としては、例えばアルキルべタイン類、カルボキシベタイン類、スルホベタ イン類等が挙げられる。
[0070] アルキルべタイン類としては、例えば N—ドデシルべタイン等が挙げられる。
カルボキシベタイン類としては、例えばラウリン酸アミドプロピルべタイン、ドデシルジ メチルァミノ酢酸べタイン、 N ラウロイルー N，一カルボキシメチル一 N，ーヒドロキ シェチルエチレンジァミンナトリウム等が挙げられる。
スルホベタイン類としては、例えばラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン 等が挙げられる。
[0071] グリシン類としては、例えばドデシルジアミノエチルダリシンナトリウム等が挙げられ る。
ァラニン類としては、例えば N—ォクトデシル— β—ァラニンナトリウム、 Ν ミスチリ ル一 13—ァラニンナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等が挙げられる。
2 -アルキルイミダゾリンの誘導体類としては、例えば 2—ラウロイル -Ν-カルボキ シメチル Ν ヒドロキシェチルイミダゾリ-ゥムベタイン等の 2 -アルキル Ν 力 ルボキシメチルー Ν ヒドロキシェチルイミダゾリ-ゥムベタイン等が挙げられる。
[0072] ァミンオキサイド類としては、例えばドデシルジメチルァミンオキサイド、ジヒドロキシ ェチルドデシルァミンオキサイド、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルジメチルァミン オキサイド等が挙げられる。
アルキルアミノ塩類としては、例えばドデシルァミノジ酢酸ナトリウム等が挙げられる [0073] 両性界面活性剤の中でも、特にアミンオキサイド類、ベタイン類が特に好ましぐアミ ンオキサイド類が最も好ましい。ァミンオキサイド類としては、例えばドデシルジメチル ァミンオキサイド、ジヒドロキシェチルドデシルァミンオキサイド、ポリオキシエチレンャ シ油アルキルジメチルァミンオキサイド等が挙げられる。ベタイン類としては、例えば ドデシルジメチルァミノ酢酸べタイン等が挙げられる。
[0074] 尚、これら界面活性剤の使用濃度は、反応液中の濃度として、 0. 0001〜20%が 好ましぐ 0. 001〜10%がより好ましい。また界面活性剤は、複数の界面活性剤を 併用して用いることができる。
[0075] (水性媒体）
本発明において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液 等が挙げられる力 緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤（トリス緩衝剤）、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、 グッドの緩衝剤等が挙げられる。
[0076] グッドの緩衝剤としては、例えば 2 モルホリノエタンスルホン酸（MES)、ビス（2— ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル)メタン（Bis— Tris)、 N— (2—ァセトァ ミド)イミノニ酢酸 (ADA)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2—エタンスルホン酸） (PIPE S)、 N— (2 ァセトアミド） - 2-アミノエタンスルホン酸 (ACES)、 3 -モルホリノ一 2 —ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） 2 アミノエタンスルホン酸（BES)、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 2 アミノエタンスルホン酸 (TES)、 2— [4- (2- ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕エタンスルホン酸（HEPES)、 3—〔N, N ビ ス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ〕— 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 - 2-ヒドロキシ 3—ァミノプロパンスルホン酸 (TA PSO)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）（POPSO)、 3 —〔4— (2 ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕 2 ヒドロキシプロパンスルホン 酸（HEPPSO)、 3—〔4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル〕プロパンスル ホン酸〔（H) EPPS〕、 N 〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Tricine)、 N, N
—3 ァミノプロパンスルホン酸（TAPS)、 N シクロへキシル 2 アミノエタンスル ホン酸（CHES)、 N -シクロへキシル 3 ァミノ 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸 (CAPSO)、 N シクロへキシル—3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPS)等が挙げ られる。
[0077] 緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、 0. 001〜2.
OmolZLが好ましぐ 0. 005〜1. OmolZLがより好ましい。
[0078] (測定方法）
本発明の二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の 測定は、水性媒体中、下記 (i)〜(iii)の工程を順次行うことによって行うことができる。
(i)試料中の二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該糖化タ ンパク質を糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに分解する工程、
(ii)測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を 除去する工程、
(iii)測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプ チドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程。
[0079] 各工程の反応の反応温度としては、例えば 10〜50°Cで、好ましくは 20〜40°Cで あり、反応時間としては、 1秒間〜 60分間、好ましくは 1〜： LO分間である。工程 (i)と 工程 (ii)は、同時に行うこともできる。
工程 (i)のタンパク質分解酵素を作用させる反応は、前述の界面活性剤の存在下 に行うのが好ましい。なお、タンパク質分解酵素は、工程 (ii)及び/又は工程 (iii)の反 応に影響を及ぼさなければ、工程 (i)を行った後に、特に失活させなくともよいが、加 熱、冷却、遠心分離、膜濾過、阻害剤の添加等によって該酵素が工程 (ii)及び/又は 工程 (iii)で作用することがな 、ようにすることもできる。
[0080] 工程 (ii)における、反応液中に生成する生成物（以下、生成物 Aと 、う）を除去する 工程とは、該生成物を工程 (iii)で反応液中に生成する生成物（以下、生成物 Bという )の測定に関与しな 、物質に酵素変換することを意味する。
なお、工程 (iii)における生成物 Bの測定方法との組み合わせで、工程 (ii)の生成物 Aの除去方法は、当業者が適宜選択できる。 [0081] 即ち、工程 (ii)及び工程 (iii)に使用する酵素反応の組み合わせは特に制限はな 、 工程 (ii)及び Z又は工程 (iii)において、糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプチ ドに作用するォキシダーゼを作用させて生成する生成物としては、過酸化水素、アミ ノ酸、オリゴペプチド等が挙げられる。
[0082] 工程 (ii)及び Z又は工程 (iii)にお 、て、糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプチ ドに作用するキナーゼを ATP存在下で作用させて生成する生成物としては、リン酸 化糖ィ匕アミノ酸、リン酸ィ匕糖ィ匕オリゴペプチド、 ADP等が挙げられる。さらに生成物に リン酸化糖化アミノ酸に作用するデグリカーゼを作用させて生成する生成物としては 、グルコース 6—リン酸、アミノ酸等が挙げられる。リン酸化糖化アミノ酸に作用する デグリカーゼとしては、例えばフルクトシルリジンー6—リン酸に作用する大腸菌由来 デグリカーゼ（The Journal of Biological Chemistry (2002) , 277, 42523-42529)等が 例示される。
[0083] 工程 (ii)及び Z又は工程 (iii)にお 、て、糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプチ ドに作用するデヒドロゲナーゼを酸化型補酵素の存在下で作用させて生成する生成 物としては、例えば酸ィ匕型補酵素として NADPを用いた場合、生成物としては還元 型補酵素 NADPHと脱水素化された糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチド、 例えば補酵素としてピロ口キノリンキノンを用いた場合、生成物としては、還元型ピロ 口キノリンキノンと脱水素化された糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドが挙げ られる。
[0084] 以下、工程 (ii)及び工程 (iii)に基質特異性の異なる 2種類のォキシダーゼを使用し
、測定する場合について詳細に説明する。
工程 (ii)の生成物の除去方法としては、ォキシダーゼの作用により生成する過酸ィ匕 水素を除去する方法、アミノ酸もしくはオリゴペプチドを除去する方法等が挙げられる 力 過酸化水素を除去する方法が好ましい。
[0085] 過酸化水素を除去する方法としては、パーォキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素を作 用させる方法、各種金属等の還元性物質を作用させる方法等が挙げられる。
工程 (ϋ)でパーォキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素を作用させる場合、工程 (m)の 測定反応に影響を及ぼさなければ酵素反応を停止しなくてもょ ヽが、工程 (iii)の測 定反応に影響を及ぼす場合、加熱、冷却、遠心分離、膜ろ過、阻害剤の添加などの 方法によって該酵素が工程 (iii)で作用することがな 、ように調整するのが好まし 、。 また酵素反応を失活させる操作を必要としない点で、担体、カラム等に固定ィ匕した酵 素を用いて除去反応を行うのが好ましい。カタラーゼは、例えばアジィ匕ナトリウム等の 阻害剤を添加して失活させることができる。
[0086] また、工程 (ii)で生成する過酸化水素を還元性物質を用いて除去する場合、該過 酸化水素と反応後の反応液中に残存する還元性物質は、工程 (iii)の測定反応に影 響を及ぼさないようにするのが好ましい。還元性物質を用いて、工程 (ii)で生成する 過酸ィ匕水素除去する方法としては、還元性物質を固定ィ匕して反応液に接触させる方 法が好ましい。
生成物 Aの除去を、例えば測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質から 生成した糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用するォキシダーゼの作 用により生成する過酸化水素を除去することにより行い、生成物 Bの測定を、測定す べき糖ィ匕タンパク質力 生成した糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用 する前記ォキシダーゼとは基質特異性の異なる他のォキシダーゼにより生成する過 酸化水素を測定することにより行う場合に好適な方法を以下に記載する。
[0087] 工程 (ii)の過酸ィ匕水素の除去は、例えば過酸ィ匕水素除去試薬により除去すること ができる。該過酸化水除去試薬としては、例えばカタラーゼ以外に、バーオキシダ一 ゼ等の過酸ィ匕活性物質と後述の酸ィ匕カップリング型色原体の片方 (即ち、フエノール 系もしくはァ-リン系水素供与体ィ匕合物又は 4ーァミノアンチピリン等のカプラー）との 組み合わせ等が挙げられる。過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は 、工程 (ii)においてカタラーゼを該過酸ィヒ水素に作用させて該過酸ィヒ水素を水と酸 素に変換することにより除去することができる。
[0088] 過酸ィヒ水素除去試薬としてパーォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質と後述の酸ィ匕 カップリング型色原体の片方 (即ち、フ ノール系もしくはァ-リン系水素供与体ィ匕合 物又は 4—ァミノアンチピリン等のカプラー）との組み合わせを用いる場合は、該過酸 化水素を過酸化活性物質の存在下、該酸化カップリング型色原体と反応させて、無 色の物質を生成させることによって除去することができる。
[0089] 過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のカタラーゼの濃度としては 、工程 (ii)で生成する過酸化水素を除去可能とする濃度であれば特に制限はな 、が 、反応液中で 0. 1〜10, OOOUZmLの濃度であることが好ましぐ 10〜2, OOOU/ mLの濃度であることがより好ま 、。
過酸ィヒ水素除去試薬としてパーォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質と酸ィヒカツプリ ング型色原体の片方との組み合わせを使用する場合、過酸化活性物質の濃度として は、該過酸化活性物質と過酸化水素との反応により、無色の物質が生成し得る濃度 であれば特に制限はな、。過酸ィ匕活性物質としてパーォキシダーゼを用いる場合、 パーォキシダーゼの濃度としては、反応液中で 1〜： LOOUZmLの濃度であることが 好ましぐ 2〜50UZmLの濃度であることがより好ましい。
[0090] 過酸ィ匕水素除去試薬として使用される酸ィ匕カップリング型色原体は、過酸ィ匕水素 測定用試薬として使用される酸化カップリング型色原体の組み合わせ、即ち、フエノ ール系又はァ-リン系水素供与体ィ匕合物と 4ーァミノアンチピリン等のカプラーとの 組み合わせにおける 1つの構成成分である。フエノール系又はァ-リン系水素供与 体ィ匕合物と 4ーァミノアンチピリン等のカプラーとは、パーォキシダーゼ等の過酸ィ匕活 性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する
[0091] カプラーとしては、例えば 4ーァミノアンチピリン（4— AA)、 3—メチルー 2 べンゾ チアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フエノール系水素供与体化合物としては、例えばフエノール、 4ークロロフヱノール、 3 メチルフエノール、 2, 4 ジクロ口フエノール、 2, 6 ジクロ口フエノール、 2, 4, 6 —トリクロ口フエノール、 3, 5 ジクロロ一 2 ヒドロキシベンゼンスルホン酸、 2, 4 ジ ブロモフエノール、 2, 4, 6 トリブロモフエノール、 3 ヒドロキシ 2, 4, 6 トリヨ一 ド安息香酸 (HTIB)等が挙げられる。
[0092] ァ-リン系水素供与体化合物としては、例えば N—（3 スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3—メチルァ-リン（TOO S)、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメチルァユリ ン（MAOS)、 N—ェチルー N— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3, 5 ジメト キシァ-リン（DAOS)、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル）—3—メチルァ-リン (TOPS) , N- (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） -3, 5—ジメトキシァ-リン（H DAOS)、 N, N ジメチルー 3—メチルァ-リン、 N, N ジ（3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） 3—メトキシァ- リン（ADPS)、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル）ァ-リン（ALPS)、 N—ェチ ルー N— (3—スルホプロピル） -3, 5—ジメトキシァ-リン（DAPS)、 N— (3—スル ホプロピル） -3, 5—ジメトキシァ-リン（HDAPS)、 N—ェチルー N— (3—スルホプ 口ピル） - 3, 5 ジメチルァ-リン（MAPS)、 N—ェチルー N— (2 ヒドロキシ— 3— スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン (ADOS)、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ — 3—スルホプロピル）ァ-リン（ALOS)、 N—ェチルー N— (3—メチルフエ-ル） N，—サクシ-ルエチレンジァミン（EMSE)、 N—ェチルー N— (3—メチルフエ-ル） — N，—ァセチルエチレンジァミン、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプ 口ピル）—4—フルォロ— 3, 5—ジメトキシァ-リン（F— DAOS)、 N ェチル N— ( 2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3, 5 ジメトキシ一 4 フルォロア-リン（FD AOS) 、 N—スルホプロピルァ-リン（HALPS)、 N—ェチルー N— (3—メチルフエ -ル） N ァセチルエチレンジァミン（EMAE)、 N— (2—カルボキシェチル） N —ェチル— m—トルイジン（CEMB) 、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ）—3—ホス ホプロピル一 m—トルイジン（EHSPT) 、 N, N ビス一（4—スルホブチル） 3—メ チルァ-リン（ TODB)、 N—ェチルー N— (2—サクシ-ルアミノエチル） m—トル ィジン (ESET)等が挙げられる。
[0093] 過酸ィ匕水素除去試薬としてカプラー又はフエノール系もしくはァ-リン系水素供与 体化合物を使用する場合、該カプラー、該フ ノール系水素供与体化合物、該ァニ リン系水素供与体化合物の濃度としては、生成した過酸化水素を除去可能とする濃 度であれば特に限定はされないが、好ましくは 0. 05〜4gZL、より好ましくは 0. 1〜 2gZLである。
[0094] 本発明の工程 (ii)において、過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は 、工程 (iii)においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害 剤としては、例えばアジ化ナトリウム、 H S、 HCN、 NH OH、 3—ァミノ一 1, 2, 4—ト
2 2
リアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程 (iii) で生成する過酸ィ匕水素の測定に影響を及ぼさない濃度であればとくに限定はされな いが、好ましくは 0. 5〜60mmolZL、より好ましくは l〜30mmol/Lである。
[0095] 本発明の工程 (m)において生成する過酸ィ匕水素は、例えば光学的手法又は電気 化学的手法を用いて測定することができる。光学的手法としては、例えば吸光度法、 発光法等が挙げられる。具体的には、過酸化水素測定試薬を用いた光学的測定法 、過酸ィ匕水素電極を用いた電気化学的測定法等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬は、生成した過酸ィヒ水素を検出可能な物質へ変換するため の試薬である。検出可能な物質としては、例えば発色物質、発光物質等が挙げられ る力 発色物質が好ましい。
[0096] 検出可能な物質が発色物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色 原体及びパーォキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体として は、例えば前述の酸ィ匕カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。 検出可能な物質が発光物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、化学発光物質 を含む。化学発光物質としては、生物発光物質も含まれ、例えばルミノール、イソルミ ノール、ルシゲニン、アタリジ-ゥムエステル、シユウ酸エステル等が挙げられる。
[0097] 過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーォキシダーゼ等の過酸 化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在 下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成し、生成した色素を測定することにより 、過酸ィ匕水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定 試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフオトンを生じ、生 じたフォトンを測定することにより、過酸ィ匕水素を測定することができる。
[0098] 前述のように、酸化カップリング型色原体は、パーォキシダーゼ等の過酸ィ匕活性物 質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原 体である。前述のように、 4—AA等のカプラーとフエノール系又はァ-リン系水素供 与体化合物とが酸化カップリング反応により色素を生成する。
ロイコ型色原体は、パーォキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素 と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、 10— N カルボキシメ チルカルバモイル— 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン（CCAP)、 10— N—メチルカルバモイルー 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン (MCDP)、 N- (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）—4, 4，一ビス（ジメチルァミノ） ジフエ-ルァミンナトリウム塩（DA— 64)、 10— (カルボキシメチルァミノカルボ-ル） —3, 7 ビス（ジメチルァミノ）フエノチアジンナトリウム塩（DA— 67)、 4, 4，—ビス（ ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミン、ビス〔3—ビス（4—クロ口フエ-ル)メチル 4—ジメ チルァミノフエ-ル〕ァミン（BCMA)、 N, N, N，，N，，N，，，N，，—へキサ— 3—スルホ プロピル一 4, 4' , 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン (TPM— PS)、ジァミノベンチジン 、ヒドロキシフエニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフエ二レンジァミン 等が挙げられる。
[0099] 工程 (ii)にお 、て、過酸ィ匕水素除去試薬としてカプラー又はフエノール系もしくはァ 二リン系水素供与体化合物を使用し、工程 (iii)において、過酸化水素測定試薬とし て酸化カップリング型色原体を使用する場合、工程 (ii)において使用する該カプラー 又は該フ ノール系もしくは該ァ-リン系水素供与体ィ匕合物を工程 (iii)における過酸 化水素測定試薬として使用することができる。過酸ィ匕水素除去試薬としてカプラーを 用いた場合には、工程 (iii)において、フエノール系もしくはァ-リン系水素供与体ィ匕 合物を添加すればよぐまた、過酸ィ匕水素除去試薬としてフエノール系もしくはァ-リ ン系水素供与体ィ匕合物を用いた場合には、工程 (iii)において、 4— AA等の力ブラ 一を添カ卩すればよい。
[0100] 過酸ィ匕水素の測定において、過酸ィ匕活性物質の濃度は測定に適した濃度であれ ば特に制限はないが、過酸ィ匕活性物質としてパーォキシダーゼを用いる場合は、 1 〜100UZmLが好ましぐ 2〜50UZmLがより好ましい。また、酸化発色型色原体 の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、 0. 01〜10gZLが好まし く、 0. 02〜5g/L力より好まし!/ヽ。
[0101] 過酸化水素を過酸化水素電極を用いて測定する場合、使用する電極は、過酸ィ匕 水素との間で電子を授受する材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金 若しくは銀等が挙げられる。測定方法としてはアンべロメトリー、ポテンショメトリー、ク 一ロメトリー等の公知の方法を用いることができる。ォキシダーゼ又は基質と電極との 間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を 柳』定することちでさる。
[0102] 電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例え ばフエ口セン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またォキシダーゼ反応に より生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電 流又はその電気量を測定することができる。
ォキシダーゼを工程 (m)に用いる場合は、過酸ィ匕水素と α—ケトアルデヒド体が生 成するので、生成する α—ケトアルデヒド体にグルコースォキシダーゼを作用させて 生成する過酸ィ匕水素を併せて測定することにより、高感度に測定することができる。
[0103] 前述の場合、工程 (ii)で ex—ケトアルデヒド体が生成する場合は、予め工程 (ii)で aーケトアルデヒド体及びグルコースを除去する。
工程 (ii)の反応にキナーゼを使用する場合は、リン酸化された糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドに対して、工程 (m)の測定に用いる酵素が作用しない場合 は、反応を停止することなくそのまま使用することができる。
[0104] また、工程 (ii)の反応に用いる酵素としてキナーゼを使用する場合は、リン酸化され た糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに対して、特異的に作用するデグリカ ーゼを作用させてリン酸化された糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリゴペプチドを分解 することができる。
工程 (m)の反応にキナーゼを使用する場合は、反応系内に ATPを共存させて、糖 化アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドがキナーゼによってリン酸ィ匕される反応に 伴う ATPの変化量を公知の方法によって測定することができる。
[0105] 工程 (ii)の反応にデヒドロゲナーゼを使用する場合は、脱水素化された糖化アミノ 酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに対して、工程 (m)の測定に用いる酵素が作用し ない場合は、反応を停止することなくそのまま使用することができる。
工程 (m)の反応にデヒドロゲナーゼを使用する場合は、反応系内に酸化型補酵 素を共存させ、酸化型補酵素の消費量又は還元型補酵素の生成量を測定すること により、測定すべき糖ィ匕タンパク質を定量することができる。生成する還元型補酵素 の測定は、例えばその極大吸収波長域である 340nm付近の波長にて比色計で測 定する等公知の技術を用いた直接的方法や、生成した還元型補酵素を各種ジァフ オラーゼ、又はフエナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及び-トロテトラゾリゥム 、 WST— 1、 WST— 8 (以上、同仁ィ匕学研究所社製）に代表される各種テトラゾリゥム 塩等の還元系発色試薬を用いた間接的方法等により行うことができ、またこれ以外の 公知の方法により測定することもできる。
[0106] また補酵素として例えばピロ口キノリンキノン (PQQ)を用いることができ、例えば反 応系に電子メディエータを共存させ、電気化学的手法を用いて補酵素の変化量を測 定することちでさる。
本発明に基づく糖ィ匕タンパク質の測定方法にぉ 、て、ケトァミン構造を認識する酵 素を用いる場合には、例えば前述のデヒドロゲナーゼを用いた場合の方法により、測 定すべき糖ィ匕タンパク質を測定することができる。
[0107] (対象タンパク質の測定）
本発明の対象タンパク質の測定方法は、対象タンパク質を正確に測定できる方法 であれば如何なる方法を用いてもよい。なお、測定する対象タンパク質は、糖化され ていないタンパク質だけであっても、該タンパク質の糖ィ匕体を含んでもよい。対象タン パク質の測定方法としては、吸光度法 (比色法)や視差屈折法が公知であり、これら の方法は広く用いられている。吸光度法 (比色法）は、物質溶液の紫外吸収や、可視 吸収、赤外吸収を測定し、溶液濃度を算出する方法である。一方、視差屈折法は屈 折率の違いから溶液濃度を導出する方法であり、主に糖類などのように比色法を適 用しにくい物質に対して利用されている。また、物質が電解質である場合には、ィォ ン濃度や電気伝導度から溶液濃度の測定が行われている。
[0108] 例えば対象タンパク質がヘモグロビンである場合には、公知のヘモグロビンを測定 する方法であれば如何なる方法も用いることができる。このような方法には、例えばメ トヘモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、ァザイドメトヘモグロビン法、ドデシルス ルホン酸ナトリウム（SLS)法、アルカリへマチン法、緑色発色団形成法又はォキシへ モグロビン法等が挙げられる。また、試料中のヘモグロビンをテトラゾリゥム化合物で 変性させ得られた変性ヘモグロビンに特異的な吸収波長で、前記試料の光学的変 化量を測定する方法等を用いることができる。
[0109] さらにまた、対象タンパク質がアルブミンである場合には、公知のアルブミンを測定 する方法であれば如何なる方法も用いることができる。このような方法には、例えばブ ロムクレゾ一ノレグリーン、ブロムクレゾ一ノレパープノレ、ブロモフエノーノレブノレー、メチノレ オレンジ、又は 2- (4'-ヒドロキシベンゼンァゾ)安息香酸等のアルブミン特異的な色 素を用いる方法等が挙げられる。
[0110] (測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合の算出方法）
本発明において、測定すべき糖ィ匕タンパク質の対象タンパク質に対する割合とは、 試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の含量又は濃度に対する同一試料中の対象タ ンパク質の含量又は濃度の割合を意味する。測定すべき糖ィ匕タンパク質の対象タン パク質に対する割合を算出する方法としては、標準品として既知濃度の対象タンパク 質及び既知濃度の測定すべき糖ィ匕タンパク質をそれぞれ用いて検量線を作成し、そ の検量線を用いて試料中の対象タンパク質濃度及び測定すべき糖ィ匕タンパク質濃 度を決定することができる。両者の濃度力も対象タンパク質に対する測定すべき糖ィ匕 タンパク質の割合を算出することができる。
[0111] (試料の調製方法）
測定すべき糖ィ匕タンパク質及び対象タンパク質を含む試料は、必要に応じて生体 試料から分離することができる。分離方法としては、遠心、濾過、血球分離膜を用い た方法等が挙げられる。例えば遠心による分離方法は、全血を血球、血漿もしくは血 清に分離することができる。必要に応じて、該血球を生理食塩水等の等張液で洗浄 することで、血漿由来の成分を除去した洗浄血球を得ることもできる。
[0112] 試料として血球を用いる場合は、全血、血球、洗浄血球等の血球を含む試料を低 張液で希釈して溶血することができる。低張液としては、血球を溶血させることができ れば如何なる溶液でもよいが、水、緩衝液等が挙げられ、前述の界面活性剤等の添 加剤を含むのが好ましい。
[0113] 洗浄血球の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、 25°Cで 5分間、遠心分離（ 3, OOOrpm)を行う。遠心分離後、上澄みの血漿は除去する。下層部分の血球層 1 容に対して、 4容の生理食塩水を追加し、転倒混和後、 25°Cで 5分間、遠心分離（3 , OOOrpm)を行う。遠心分離後、上澄みの生理食塩水を除去する。この洗浄操作を 3回繰り返した後、洗浄された血球層 1容に対して 9容の蒸留水を添加し、洗浄血球 を得ることができる。
[0114] (工程 (ii)と工程 (iii)で使用する酵素の選択）
工程 (ii)と工程 (iii)で使用する酵素の選択にっ 、て試料中の HbAlcを測定する 場合を例に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
[0115] HbAlcを含む精製ヘモグロビン試料にタンパク質分解酵素を作用させることにより 、 β鎖 Ν末端のノ リン残基が糖ィ匕された糖ィ匕ヘモグロビンに由来するフルクトシルバ リン（以下、 Fru-Valと略記する）及びフルクトシルノリルヒスチジン（以下、 Fru-V -Hi sと略記する）、 a鎖 N末端のノリン残基が糖ィ匕された糖ィ匕ヘモグロビンに由来する Fr u-Val及びフルクトシルノ リルロイシン（以下、 Fru-Va卜 Leuと略記する）、 a鎖及び Z 又は j8鎖の内部のリジン残基の ε ーァミノ基の糖ィ匕に由来するフルクトシルリジン（ 以下、 Fru-Lysと略記する）等の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドが生成 する。
[0116] さらに試料が全血の場合、例えば糖ィ匕アルブミンなど血液中の測定すべき糖ィ匕蛋 白質以外の糖ィ匕タンパク質からも例えば Fru-Lys等の糖ィ匕アミノ酸が生成する。
即ち、精製ヘモグロビンを含む試料又は全血を含む試料にタンパク質分解酵素を 作用させると、例えば Fru-Va卜 His、 Fru-Val, Fru-Lys, Fru-Va卜 Leu等が生成し、 Fr u- Va His及び Fru- Va卜 Leuは糖ィ匕ヘモグロビンに由来し、 Fru- Va Hisは、 HbAlc に特異的に由来する。
従って、糖ィ匕ヘモグロビンを測定するには、例えば Fru-VaH"Iis及び Fru-Va卜 Leu を特異的に測定すればよぐ HbAlcを測定する場合は、 Fru-Va Hisを特異的に測 定すればよい。
第 1表は、 Fru-Val-His, Fru-Val, Fru-Lys, Fru-Va卜 Leuに対する酵素の理論的な 特異性のパターンを示す。〇印は、酵素が作用することを、 X印は酵素が作用しな いことを示す。
[0117] [表 1] 第 1表
Figure imgf000033_0001
[0118] ここで、糖ィ匕アミノ酸即ち Fru-Val及び Z又は Fru-Lysにのみ作用し、糖ィ匕オリゴぺ プチド、即ち Fru-VaH"Iisと Fru-Va卜 Leuとに作用しない酵素としては、タイプ 10、タイ プ 12、及びタイプ 14に属する酵素が挙げられる。
糖ィ匕オリゴペプチド即ち Fru-VaH"Iis及び Z又は Fru-Va卜 Leuに作用する酵素とし ては、タイプ 1〜タイプ 9、タイプ 11、タイプ 13及びタイプ 15があげられ、 Fru-VaH"Iis に作用する酵素としてはタイプ 1〜タイプ 8が挙げられる。
[0119] Fru-Val- Hisに作用し、 Fru-Va卜 Leuに作用しない酵素としては、タイプ 2、タイプ 4、 タイプ 6、タイプ 8が挙げられる。
これらの酵素を工程 (ii)及び工程 (iii)に組み合わせて使用すれば目的とする糖ィ匕 アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドを測定することができる。
HbAlcの測定にぉ 、ては、工程 (ii)と工程 (iii)で使用し得る酵素の組み合わせとし て、例えば第 2表の例 1及び例 2に示す酵素の組み合わせが挙げられる。また、 Fru- Val又は Fru-Lysが生成しないタンパク質分解酵素等を用いることによって、例えば第 2表の例 3又は例 4に示す酵素の組み合わせも使用できる。
[表 2]
第 2表
Figure imgf000034_0001
[0121] なお、前述の HbAlcの測定方法に置いては、工程 (ii)で、試料中にもともと存在す る糖ィ匕アミノ酸も除去される。
先行文献等の情報により特定の酵素が第 1表に記載したどのタイプに属するか分 類することができる。例えばタイプ 2に属する酵素として、 FPOX-CE (キッコーマン社 製）力 タイプ 4に属する酵素として、 FPOX- EE (キッコーマン社製）力 タイプ 10に属 する酵素として、 FAOD-E (キッコーマン社製）、タイプ 11に属する酵素として、フルク トシルアミノ酸キナーゼ（特開 2005— 58157)力 タイプ 12に属する酵素として、 FA OX-TE (キッコーマン社製）力 タイプ 14に属する酵素として、遺伝子操作フルクトサ ミンォキシダーゼ FODVII (旭化成社製; WO02Z061119)挙げられる。
[0122] HbAlc以外の糖ィ匕タンパク質について同様に測定系を構築する場合、 （a)タンパ ク質分解酵素によって生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドの、クロ マトグラフィ、質量分析、キヤピラリー電気泳動法等の方法による同定、（b)同定された 糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドには反応せず、当該糖化タンパク質以 外の糖化タンパク質に由来する糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに反応 する酵素、及び、同定された糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドに反応する 酵素の選択、という手順により、測定系を構築することができる。
[0123] 本発明にお 、て使用するフルクトシルァミンォキシダーゼ等の酵素の基質特異性 は、既知の構造の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドを用いて、例えば以 下の試薬 A及び試料カゝらなる酵素の基質特異性検討用試薬を用いて確認すること ができる。
[0124] 試薬 A 発色試薬
卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
西洋わさび由来パーォキシダーゼ 9. 78U/mL
DA- 64 0. O25mmol/L
フルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX- CE 10U/mL
試料
卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチド (基質）
1 μ moレし
[0125] 上記試料中の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドは 、かなる濃度でもよく 、例えば一定濃度、例えば 1 molZLを調製する。この調製した試料 (0. 15mL)を
、 37°Cで 1分間加温した後に 750nmにおける吸光度 AO を測定する。続いて、反応 基
開始 5分後に試薬 A50 Lを添加して、続けて 37°Cで 5分間反応させる。反応開始 1
0分後に 750nmにおける吸光度 A1 を測定する。反応吸光度 Δ A を下記式
基 基
[0126] [数 1]
Δ 基 丄基 ~ 0基
[0127] により算出する。同様に、コントロールとして、糖ィ匕アミノ酸又は糖ィ匕オリゴペプチド水 溶液の代わりに精製水を使用して測定を行い、 ΔΑコントロールを下記式
[0128] [数 2] Aコン ト口一ノレ一 1 コン ト口一ノレ Λ 0 コン ト口一ノレ
[0129] により算出する。測定の結果の判定は、測定対象とする糖ィ匕タンパク質を特異的に 測定する目的において、当業者が適宜選択できるが、例えば下記式
[0130] [数 3] Δ Α = Δ A基一 Δ Aコントロール
[0131] により算出した反応吸光度 Δ Aが ImAbs以上得られた場合、反応性があると判定す ることができる。また、例えばある基質に対する反応吸光度 Δ Aに対し、他の基質に 対する反応吸光度が 50%以下の場合、他の基質に対しては反応性がないと判定す ることちでさる。
[0132] (測定すべき糖化タンパク質測定用試薬及び測定用キット）
本発明の測定すべき糖ィ匕タンパク質測定用試薬及び測定用キットは、本発明の測 定すべき糖ィ匕タンパク質の測定方法に使用することができる。本発明の測定すべき 糖ィ匕タンパク質測定用試薬は、保存、運搬、流通に適した形態として、キットの形態 をとり得る。キットの形態としては、 2試薬系、 3試薬系等が挙げられる。
[0133] 本発明の測定すべき糖ィ匕タンパク質測定用試薬は、タンパク質分解酵素、測定す べき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖 化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質 力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z 又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去する ための試薬、測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕 オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する糖 化アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴ ペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含 む。
[0134] 本発明の測定すべき糖ィ匕タンパク質測定用キットとしては、例えば以下の態様のキ ットが挙げられる。
[0135] キット 1 (3試薬系キット）
以下の 3つの試薬を含むキット。
(A)タンパク質分解酵素を含む第一試薬；
(B)測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖ィ匕タンパク質以 外の糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該 糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する 生成物を除去するための試薬を含む第二試薬；
(c)測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプ チドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及 び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作 用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第三試薬。
[0136] キット 2 (2試薬系キット）
以下の 2つの試薬を含むキット。
(A)タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生 成する糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定 すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は 糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵 素との反応により生成する生成物を除去するため試薬を含むの第一試薬；
(B)測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺプ チドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及 び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作 用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第二試薬。
[0137] タンパク質分解酵素による、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素の分解を抑制 する観点から、本発明のキットは 3試薬系が好ましい。
本発明の測定用試薬及び測定用キットにおいて使用されるタンパク質分解酵素、 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タ ンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕ァミノ 酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を 除去するための試薬、測定すべき糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する 糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリ ゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬と しては、それぞれ、前述のものが挙げられる。
[0138] 以下、工程 (ii)及び工程 (iii)の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用 する酵素として、特異性の異なるォキシダーゼを使用する場合の試薬構成について 詳細に説明する。
工程 (ii)の生成物の除去試薬としては、ォキシダーゼの作用により生成する過酸ィ匕 水素を除去する過酸化水素除去剤、グルコースを除去するグルコース除去剤、ァミノ 酸若しくはオリゴペプチドを除去するアミノ酸もしくはオリゴペプチド除去剤等が挙げ られる力 過酸ィ匕水素除去剤が好ましい。
[0139] 本発明の工程 (m)の生成物測定試薬としては、過酸ィ匕水素測定試薬が挙げられる
3試薬系のキットにおいては、過酸化水素除去試薬は、第二試薬に含有される。過 酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合は、第三試薬はカタラーゼ活性 阻害剤を含む。該カタラーゼ活性阻害剤としては、前述のカタラーゼ活性阻害剤が 挙げられる。過酸ィ匕水素除去試薬としてパーォキシダーゼ等の過酸ィ匕活性物質と 1 種類の酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合、該過酸化活性物質と 該酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定試薬の構成成分も兼ねて!/ヽるので 、特に過酸化水素除去試薬を除去又は不活性化する必要はなぐ第三試薬に、発 色に必要なもう一方の酸ィ匕カップリング発色型色原体を含有させればよい。また、過 酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合においても、過酸ィ匕水素測定試 薬中の一部の構成成分、特に、 1種類の酸化カップリング型色原体は第二試薬に含 有されてもよい。
[0140] 本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、標準タンパク質等の 測定用標準物質が含有されてもょ 、。
また本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、対象タンパク質を 測定するための試薬が含有されてもょ ヽ。対象タンパク質がヘモグロビンの場合は、 ヘモグロビン測定試薬としては、メトヘモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、ァザ イドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（SLS)法、アルカリへマチン法 、緑色発色団形成法又はォキシヘモグロビン法等に用いられる公知のヘモグロビン 測定試薬が挙げられる。
[0141] 本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、それぞれ緩衝剤、安 定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、非特異反応抑制等が含有されてもよい。緩衝剤 としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレン ジァミン四酢酸（EDTA)、シユークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アルブミン、 デキストラン、塩ィ匕カルシウム及び酢酸カルシウム等の塩類等が挙げられる。防腐剤 としては、例えばアジィ匕ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質除去剤として は、例えばァスコルビン酸の影響を消去するためのァスコルビン酸ォキシダーゼ等が 挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合物等が 挙げられる。
[0142] 本発明の測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でも よい。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、当該キットは前述の水性媒体 又は反応液に溶解して使用することができる。凍結乾燥された状態のキットを用いる 場合には、必要に応じて、該キットに凍結乾燥試薬を溶解するための試薬等が含有 されてちょい。
本発明の測定用キットにおけるタンパク質分解酵素の含量としては、水性媒体で溶 解された状態での濃度が 0. 01〜： L, 000, OOOU/mLとなる含量が好ましぐ 0. 1 〜100, OOOU/mLとなる含量がより好ましい。
[0143] 本発明のフルクトシルァミンォキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された 状態での濃度が 0. 01〜： L, OOOU/mLとなる含量が好ましぐ 0. 1〜： LOOU/mL となる含量がより好ましい。
本発明のキットにおける界面活性剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態 での濃度が 0. 001〜20%となる含量が好ましぐ 0. 01〜10%となる含量がより好ま しい。
[0144] 過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のキットにおけるカタラーゼ の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 1〜10, OOOU/mLと なる含量が好ましぐ 10-2, OOOU/mLとなる含量がより好ましい。また、過酸化水 素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のキットにおけるカタラーゼ活性阻害剤 の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 5〜600mmolZLとなる含 量が好ましぐ l〜90mmolZLとなる含量がより好ましい。
[0145] 過酸ィ匕水素除去試薬剤としてパーォキシダーゼと 1種類の酸ィ匕カップリング型色原 体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーォキシダーゼ及び該酸ィ匕カップ リング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が 1 〜600U/mL、 0. 05〜8g/Lとなる含量力 S好ましく、 2〜150U/mL、 0. l〜4g /Lとなる含量がより好ま 、。
[0146] 過酸ィヒ水素測定試薬としてパーォキシダーゼと酸ィヒカップリング型色原体を含む 試薬を使用する場合のキットにおけるパーォキシダーゼ及び該酸ィ匕カップリング型色 原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が 1〜600U /mL、 0. 5〜40g/Lとなる含量が好ましぐ 2〜150UZmL、 l〜20g/Lとなる含 量がより好ましい。
[0147] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら 限定するものではない。尚、本実施例においては、下記の試薬を使用した。
トリス緩衝剤 (和光純薬工業社製）
フルクトシルノ リルヒスチジン (Fru-Va卜 His) (ペプチド研究所社製）
プロテアーゼ N「ァマノ」 G (天野ェンザィム社製）
フルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX-CE (キッコーマン社製）
フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ FAOD-E (キッコーマン社製）
フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ FAOX-TE (キッコーマン社製）
西洋わさび由来パーォキシダーゼ (東洋紡績社製）
カタラーゼ (東洋紡績社製）
DA-64 (和光純薬工業社製）
MCDP (協和メデッタス社製）
アンヒトール 20N (ドデシルジメチルァミンオキサイド；花王社製）
ニューコール 723 (POE多環フエ-ルエーテル；日本乳化剤社製） Nonidet P— 40 (POEォクチルフエ-ルエーテル； Fluka社製）
実施例 1
[0148] フルクトシルオリゴペプチドの特異的測定（1)
下記の試薬からなるキット（コントロールキット、キット A、キット B)を調製した。尚、基 質 Fru- Val及び Fru- Lysは、ハシバらの方法（Hashiba H, J.Agric.Food.Chem.24:70, l 976)を用いて調製した。
[0149] コントローノレキット
第 1試薬
トリス緩衝液 (PH7. 5) lOOmmol/L
Fru— Vaト His Χ μ mol/L
Figure imgf000041_0001
トリス緩衝液 (ρΗ7. 5) lOOmmol/L トリス緩衝液 (ρΗ7. 5) lOOmmol/L
フルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX- CE lOU/mL
西洋わさび由来ペルォキシダーゼ 9. 78U/mL
DA- 64 0. O25mmol/L
キット A
第 1試薬
トリス緩衝液 (PH7. 5) lOOmmol/L
Fru— Val 5. 6 ^ mol/L
Fru— Lys 5. 6 ^ mol/L
Fru— Vaト His Χ μ mol/L
(X= : 0, 1. 4, 2. 8, 5. 6) トリス緩衝液 (pH7. 5) lOOmmol/L 卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
フルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX- CE 10U/mL
西洋わさび由来ペルォキシダーゼ 9. 78U/mL
DA- 64 0. O25mmol/L
キット B
第 1試薬
トリス緩衝液 (PH7. 5) lOOmmol/L
Fru-Val 5. 6 ^ mol/L
Fru-Lys 5. 6 ^ mol/L
Fru— Vaト His Χ μ mol/L
0, 1. 4, 2. 8, 5. 6) トリス緩衝液 (pH7. 5) 100mmol/L
フルクトシルアミノ酸ォキシダ' -ゼ FAOD- E 10U/mL
カタラーゼ 300U/mL 卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
フルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX- CE 10U/mL
西洋わさび由来ペルォキシダーゼ 9. 78U/mL
DA— 64 0. O25mmol/L
実施例 2
フルクトシルオリゴペプチドの特異的測定（2)
二種以上の糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドを含む試料中の測定すベ きの糖ィ匕オリゴペプチドの分別測定を検証するため、実施例 1の各キットを用いて、 以下の実験を行った。
Fru- Va卜 Hisの濃度が 0, 1. 4, 2. 8, 5. 6 molZLとなるように調製した第 1試薬 490 1^に、第 2試薬 210 Lを添カ卩し、 37°Cで 5分間反応させた。反応液を 95°Cで 5分間加熱した後、氷冷した。更に、 4°Cで 10分間遠心分離（5, OOOrpm)し、得られ た上清 35 /z Lに 100mmol/Lトリス緩衝液（pH7. 5)を 115 L添加し、 37°Cで 1分 間加温した後に 750應における吸光度 (AO' )を測定した。続いて、反応開始 5分後 に第 3試薬 50 Lを添加して、続けて 37°Cで 5分間反応させた。反応開始 10分後に 750應における吸光度 (A1 ' )を測定した。反応吸光度 Δ A'を以下の式
[0153] [数 4]
Δ A ? = A 1 ' - A O '
[0154] により算出した。
各キットを用いた測定における測定値を第 3表に示す。
[0155] [表 3]
d表
Figure imgf000043_0001
[0156] 第 3表から明らかなように、キット Aではコントロールキットに対し、反応吸光度が増 大した。これは、反応液中に一定濃度で共存させた Fru-Lys及び Fru-Valを消去して おらず、 Fru-Lys及び Fru-Val由来の過酸化水素を、 Fru-V -His由来の過酸化水素 と同時に測定しているためである。一方、キット Bでは、コントロールキットを用いた場 合とほぼ同様の反応吸光度が得られた。これは、第 2試薬中に含まれる FAOD— E及 びカタラーゼを作用させることにより、反応液中に一定濃度で共存させた Fru-Lys及 び Fru-Valを除去し、共存させた Fru-Lys及び Fru-Val由来の過酸化水素をほとんど 測定することなく、測定対象物である Fru-VaH"Iis由来の過酸化水素を選択的に測 定していることを示唆する。
[0157] 以上より、二種以上の糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドが存在する反応 液中にお 、て、測定すべき糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチド以外の糖ィ匕 アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じ る生成物を除去することによって、測定すべき糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴぺ プチドを選択的に測定できることが示された。
実施例 3
[0158] HbAlc測定用キット
下記の試薬力もなる HbAlc測定用キットを調製した。
第 1試薬：タンパク質分解酵素を含む試薬
卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
プロテアーゼ N「ァマノ」 G 5, OOOU/mL
アンヒトール 20N 0. 5%
ニューコール 723 0. 1%
第 2試薬：生成物除去試薬を含む試薬
卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ FAOD- E 10U/mL
フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ FAOX- TE 10U/mL
カタラーゼ 300UZmL
第 3試薬：生成物測定試薬を含む試薬
卜リス緩衝液（ρΗ7. 5) 100mmol/L
フルクトシルペプチドォキシダーゼ FPOX- CE 10U/mL
西洋わさび由来ペルォキシダーゼ 9. 78U/mL
MCDP 0. O25mmol/L
Nonidet P—40 0. 1%
実施例 4
[0159] 試料中の HbAlcの測定
(1)測定用試料の調製〜試料中の HbAlc濃度の測定
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、全血 1容に対して 4容の蒸 留水を添加し、標準品を得た。
また、健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、 25°Cで 5分間遠心分 離 (3, OOOrpm)した。遠心分離後、下層部分の血球層を蒸留水で 100倍希釈した もの、及び蒸留水をデタミナ一 HbAlc (協和メデッタス社製)の用法'用量に従って HbAlc(%M直を測定し、濃度を測定した。
(2)実施例 3のキットを用いた試料中の HbAlc (測定すべき糖ィ匕タンパク質)の測定 試料として、 (1)で濃度を測定した健常人及び糖尿病患者由来の試料及び蒸留水 を、測定用キットとして、実施例 3のキットを用いて、各試料中の HbAlc濃度を次の 手順により測定した。
[0160] 実施例 3のキット中の第 1試薬 50 μ L及び試料 20 μ Lを反応容器に分注し 25°Cで 1分間反応させた後、反応液を 95°Cで 5分間加熱し氷冷した。 4°Cで 10分間遠心分 離（5, OOOrpm)し、得られた上清を以下の反応に供した。
上記上清 35 μ Lに第 2試薬 1 μ Lセルに分注し、 37°Cで 5分間反応させた後、反応 液を 95°Cで 5分間加熱し氷冷した。更に、 4°Cで 10分間遠心分離（5, OOOrpm)し、 得られた上清 35 μ Lに 100mmol/Lトリス緩衝液（ρΗ7. 5)を 115 μ L添カロし、 37 °Cで 1分間加温した後に、 660nmにおける吸光度 (AO )を測定した。続いて、反応
X
開始 5分後に第 3試薬 50 Lを添加して、続けて 37°Cで 5分間反応させた。反応開 始 10分後に 660nmにおける吸光度 (A1 )を測定した。反応吸光度 ΔΑは、下記
X X
の式
[0161] [数 5]
Δ ΑΧ = Α 1 Χ - Α Ο χ
[0162] より算出した。
(3)試料中のヘモグロビン (対象タンパク質)の測定
試料として、 (1)で濃度を測定した健常人及び糖尿病患者由来の試料並びに蒸留 水を、ヘモグロビン測定用キットとして、ヘモグロビン Β—テストヮコー（和光純薬工業 社製)を用いて、各試料中のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビン Β—テストヮコ一の用 法 ·用量に従って測定した。得られたヘモグロビン濃度より、本反応系の反応液総量 200 μ L中のヘモグロビン量（ μ g)を算出した。
(4)試料中のヘモグロビン (対象タンパク質）に対する HbAlc (測定すべき糖ィ匕タン パク質)の割合の算出 (2)で得られた反応吸光度 Δ Aを、（3)で得られたヘモグロビン量で除して、へモ
X
グロビン l /z g当たりの反応吸光度（ΔΑ' )を算出し、試料中のヘモグロビン (対象タ
X
ンパク質）に対する HbAlc (測定すべき糖化タンパク質)の割合の指標とした。
(5)免疫法を用 、た試料中のヘモグロビン (対象タンパク質）に対する HbAl c (測定 すべき糖化タンパク質)の割合の算出
デタミナ一 HbAlc (協和メデッタス社製)の用法 *用量に従って、（1)で濃度を測定 した各試料中のヘモグロビン (対象タンパク質）に対する HbAlc (測定すべき糖化タ ンパク質)の割合 (HbAlc%)を測定した。
(6)本発明の方法と免疫法との相関
(4)で算出した ΔΑ' と、（5)で算出した割合 (HbAlc%)との相関関係を図 1に示
X
す。縦軸に本発明の測定キットを用いた酵素法による測定で得られた ΔΑ' を、横軸
X
にデタミナ一 HbAlc試薬を用いた免疫法による測定で得られた HbAlc%を取り、 各試料についての値をプロットしたところ、図 1に示すように、両者の間で、良好な相 関関係及び直線性が認められた。従って、本発明の測定方法により、試料中の HbA lcを測定できることが示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、糖尿病等の疾患の診断に有用な、試料中の測定すべき糖ィ匕タン パク質の測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の測定方法 であって、水性媒体中、（i)試料中の該二種以上の糖ィ匕タンパク質にタンパク質分解 酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を分解する工程、 (ii)測定すべき糖ィ匕 タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリゴぺ プチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、 (m) 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチド に作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖ィ匕タ ンパク質の測定方法。
[2] さらに、（iv)試料中の測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質 (以下、対象タ ンパク質という)の濃度を測定する工程、及び、（V)工程 (iii)で測定した試料中の測定 すべき糖化タンパク質の濃度と、工程 (iv)で測定した試料中の対象タンパク質の濃度 とから、試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の対象タンパク質に対する割合を決定 する工程を含む請求項 1記載の方法。
[3] 工程 (0が、一種又は二種以上の界面活性剤の存在下に行われる請求項 1又は 2記 載の方法。
[4] 工程 (ii)が、糖化アミノ酸に作用するォキシダーゼを該生成した糖化アミノ酸に作用 させ、生成する過酸化水素を除去する工程であり、かつ、工程 (iii)が、糖ィ匕オリゴぺ プチドに作用するォキシダーゼを該生成した糖ィヒオリゴペプチドに作用させ、生成す る過酸ィ匕水素を測定することにより行われる請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。
[5] 工程 (ii)での生成物の除去が、カタラーゼを用いる過酸化水素の除去であり、工程 (iii) での生成物の測定が、パーォキシダーゼと酸化発色型色原体とを用いる過酸化水 素の測定である請求項 1〜4のいずれかに記載の方法。
[6] 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 ヘモグロビン Aleである請求項 1〜5のいずれかに記 載の方法。
[7] 対象タンパク質力 ヘモグロビンである請求項 2〜6のいずれかに記載の方法。
[8] 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の測定用試 薬であって、タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質 から生成する糖ィヒアミノ酸及び z又は糖ィヒオリゴペプチドに作用する酵素、測定す べき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z又は糖 化オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素 との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質 から生成する糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒオリゴペプチドに作用する酵素、並びに、 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチド と当該糖化アミノ酸及び Z又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生 成する生成物を測定するための試薬を含むことを特徴とする試薬。
さらに、対象タンパク質を測定するための試薬を含む請求項 8記載の試薬。
さらに、一種又は二種以上の界面活性剤を含む請求項 8又は 9記載の試薬。
測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素が、糖ィ匕アミノ酸に作用するォキシダーゼで あり、測定すべき糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴぺ プチドに作用する酵素力 S、糖化オリゴペプチドに作用するォキシダーゼである請求項
8〜10のいずれかに記載の試薬。
測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用す る酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試 薬であり、測定すべき糖ィ匕タンパク質力も生成する糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕オリ ゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素との反 応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーォキシダーゼ及び酸ィ匕発色 型色原体を含む試薬である請求項 8〜 11の 、ずれかに記載の試薬。
測定すべき糖ィ匕タンパク質力 ヘモグロビン Aleである請求項 8〜 12のいずれかに 記載の試薬。
対象タンパク質力 ヘモグロビンである請求項 9〜 13のいずれかに記載の試薬。 二種以上の糖ィ匕タンパク質を含む試料中の測定すべき糖ィ匕タンパク質の測定用キッ トであって、（A)タンパク質分解酵素を含む第一試薬と、（B)測定すべき糖ィ匕タンパ ク質以外の糖ィ匕タンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチド に作用する酵素、並びに、測定すべき糖ィ匕タンパク質以外の糖ィ匕タンパク質力も生 成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖 化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための 試薬を含む第二試薬と、 (C)測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及 び Z又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は 糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するため の試薬を含む第三試薬と、を含むことを特徴とするキット。
[16] さらに、対象タンパク質を測定するための第四試薬を含む請求項 15記載のキット。
[17] タンパク質分解酵素を含む第一試薬が、一種又は二種以上の界面活性剤を含む試 薬である請求項 15又は 16記載のキット。
[18] 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素が、糖ィ匕アミノ酸に作用するォキシダーゼで あり、かつ、測定すべき糖ィ匕タンパク質から生成した糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ォ リゴペプチドに作用する酵素力 S、糖ィヒオリゴペプチドに作用するォキシダーゼである 請求項 15〜 17のいずれかに記載のキット。
[19] 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用す る酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試 薬であり、かつ、測定すべき糖ィ匕タンパク質力 生成する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖 化オリゴペプチドと当該糖ィ匕アミノ酸及び z又は糖ィ匕オリゴペプチドに作用する酵素 との反応により生成する生成物を測定するための試薬力 パーォキシダーゼ及び酸 化発色型色原体を含む試薬である請求項 15〜18のいずれかに記載のキット。
[20] 測定すべき糖ィ匕タンパク質力 ヘモグロビン Aleである請求項 15〜 19のいずれかに 記載のキット。
[21] 対象タンパク質力 ヘモグロビンである請求項 16〜20のいずれかに記載のキット。
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