CN116875657A - 一种重组巴曲酶的糖蛋白的定量分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组巴曲酶的糖蛋白定量分析方法，通过选择合适的溶解缓冲液，保证检测标准品以及检测样品的良好的线性关系，利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，通过比色建立标准曲线来测定样品中糖蛋白的含量。重复性实验表明，采用所述溶液对于不同浓度的重组巴曲酶均具有较好的重复性。通过对样品中的巴曲酶进行定量分析，测定结果与市面上常用的测定糖蛋白的试剂盒结果近似，表明本发明的方法具有较高的准确性。

Description

一种重组巴曲酶的糖蛋白的定量分析方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种重组巴曲酶的糖蛋白的定量分析方法。
背景技术
巴曲酶是一种单链糖蛋白，总氨基酸数为231个，分子量39～43kDa，属于丝氨酸蛋白酶类分子，它作用于哺乳动物血浆中纤维蛋白原A链中的Arg16-Gly17间的肽键，进而交联聚合成纤维蛋白Ⅰ多聚体，促进出血部位血小板聚集产生止血效应，并激活血管内皮释放组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)，发挥抗血栓的作用。据报道，巴曲酶在临床上已被广泛应用于不稳定性心绞痛、高黏血症等多种疾病的治疗和闭塞性心脑血管血栓性疾病的预防，疗效确切，不良反应低微。
因为大量生产从蛇中纯化的巴曲酶是有限的，产生重组蛋白质的方法已由众多研究者进行了深入研究。目前，临床应用的立止血和巴曲亭是从巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离纯化的天然巴曲酶。
糖蛋白是蛋白质中的氨基酸侧链被糖基化修饰后的蛋白质，广泛存在于生物体中，具有特殊的生物学功能。研究糖蛋白的传统方法一般是将糖链切掉并分离纯化后再分别进行研究。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)一一这一软电离生物质谱技术，可直接测定糖蛋白的平均分子量及糖含量，应用蛋白酶切及内切糖普酶酶切相结合的方法，可确定糖基化位点及糖苷键类型。
P.pastoris表达系统兼具原核和真核体系遗传背景清楚、操控简便和正确产生糖基化的特点，蛇毒类凝血酶分子中有不同含量的糖基化而糖基对蛋白的空间结构和酶活性都起稳定作用。因此，采用合适的方法对于酵母表达的巴曲酶重组蛋白的糖基化水平的准确检测可以在一定程度上反映表达蛋白的稳定性和活性，以显示表达系统的表达效果。
当前通用的方法为：糖基在糖苷酶的作用下与糖蛋白分离。由于糖基无紫外吸收，因此糖基检测需对糖基进行荧光标记2-AB(2-aminobenzamide)。通过Dextran Ladder标准品对寡糖的保留时间进行校正和归一化，获得寡糖的GU值。通过与寡糖GU数据库的匹配可以实现主要寡糖的结构鉴定。配合高分辨质谱采集寡糖质量数，进一步对寡糖的具体结构进行确认和验证。采用该方法均无法进行绝对定量。
另外可以使用。Thermo公司生产的糖蛋白碳水化合物分析试剂盒(Code No:23260)和糖蛋白标准品冻干粉Set(Code No:23259)，可进行定量分析。该方法在但是所用到的试剂盒为进口，货期受进口影响，同时试剂盒价格昂贵，操作复杂并存在以下问题：线性相关性差，R2在0.95左右，不能满足分析方法R2≥0.995要求；应快速检测，放置时间不宜过长，会导致结果的OD值偏高；回收率差，通过加标，其回收率均小于50％；重复性差，6次测定的结果RSD在20％左右。
基于上述的限制，找到一种检测重组巴曲酶糖蛋白的方法，以用于检测糖基化的水平具有重要的意义。
发明内容
本发明公开了一种重组巴曲酶的糖蛋白的分析方法。
本发明采用硫酸-苯酚法，其原理为：利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，对于我们样品量比较少，故采用酶标仪进行进样分析。
对毕赤酵母菌发酵生产的重组巴曲酶的糖蛋白进行定量分析，同时克服重组巴曲酶原液中缓冲液的干扰，获得较好的线性范围，其重复性和准确性均能满足要求。使用D-甘露醇为标准品，比较容易获得。
本发明公开了一种重组巴曲酶的糖蛋白定量分析方法，包括如下步骤：
1)标准品溶液的制备，将D-甘露糖用溶液按比例稀释相应的倍数浓度；
2)待测样品溶液的制备，取毕赤酵母重组表达的巴曲酶浓缩原液，用相应的溶液进行稀释；
3)加酚类物质和硫酸：分别取标准品溶液或待测样品溶液200μL，加入6％酚类物质溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应；
4)酶标仪读板：分别吸取样品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样，用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
5)根据测定的OD值，建立标准曲线，应用计算机软件进行读数和数据分析。
优选的，步骤1)和步骤2)中采用的溶液为20mM PBS+0.15M NaCl。
优选的，所述溶液的pH值为6.0。
优选的，所述步骤1)中的浓度为0mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL。
优选的，所述酚类物质选自苯酚、间苯二酚、萘酚、α-萘酚或间苯二酚中的一种。
优选的，所述酚类物质为苯酚。
本发明公开了一种定量检测重组巴曲酶的糖蛋白的试剂盒，包括：含有氯化钠的PBS溶液，酚类物质，浓硫酸以及D-甘露糖。
优选的，所述PBS浓度为20mM，所述氯化钠浓度为0.15M。
优选的，所述酚类物质选自苯酚、间苯二酚、萘酚、α-萘酚或间苯二酚中的一种。
优选的，所述溶液的pH值为6.0。
本发明公开了一种测定蛋白糖基化的适用缓冲液的方法，包括：
1)将待测样品蛋白和标准品分别溶于所述缓冲液；
2)加酚类物质和硫酸：分别取标准品溶液或待测样品溶液200μL，加入6％酚类物质溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应；
3)酶标仪读板：分别吸取样品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样，用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
4)根据测定的OD值，建立线性曲线，应用计算机软件进行读数和数据分析。
优选的，通过线性曲线的R2值判断所述缓冲液是否适用于所述蛋白定量测定糖基化水平。
优选的，所述R2值大于0.995，则表明所述缓冲液适合用于所述蛋白定量测定糖基化水平。
本发明提供了一种适用于苯酚-硫酸法测定重组巴曲酶糖蛋白的方法，通过选择合适的溶解缓冲液，保证检测标准品以及检测样品的良好的线性关系，重复性实验表明，采用所述溶液对于不同浓度的巴曲酶均具有较好的重复性。通过对样品中的巴曲酶进行定量分析，测定结果与市面上常用的测定糖蛋白的试剂盒结果近似，表明本发明的方法具有较高的准确性。
附图说明
图1.双蒸水作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
图2.20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
图3.20mM Tris-Cl(pH7.0)作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
图4.20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
图5.双蒸水作为溶液溶解重组巴曲酶的标准曲线图；
图6.20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
图7.20mM Tris-Cl(pH7.0)作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
图8.20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)作为溶液溶解D-甘露糖作为标准溶液的标准曲线图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1标准品溶解缓冲液的选择确定
苯酚-硫酸法的检测原理在于，在酸性条件下，碳水化合物会生成多种呋喃化合物，而呋喃类化合物可以进一步与酚类物质反应生成有色化合物，通过建立标准曲线，比色测定待测物质的碳水化合物的浓度。
因此，根据不同的含有碳水化合物的物质的特点，选择合适的缓冲液来进行溶解测定，对于检测的准确性以及稳定性具有重要意义。
本实施例首先选择4种不同的溶液，首先进行标准品的溶解测定，进行初步筛选。
这四种溶液分别为：双蒸水、20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)、20mM Tris-Cl(pH7.0)、20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)。
1)标准品溶液的制备
将0.5mg/mLD-甘露糖溶液用四种溶液(双蒸水、20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)、20mM Tris-Cl(pH7.0)、20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0))分别稀释至0mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL；
2)加苯酚和硫酸：分别取不同溶液溶解的标准品溶液200μL，加入6％苯酚溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应，每种溶液的每种浓度标准品分别做三个平行的反应管；
3)酶标仪读板：分别吸取标准品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样。
用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
4)应用计算机软件进行读数和数据分析。以标准品吸光度OD值(A)对浓度作曲线，其中每种溶液的每种浓度标准品的OD值取三管测试的平均OD值。
4种溶液对应测定的标准品的平均OD值分别如下表1所示，其对应的标准曲线分别如图1-图4。
表1：4种溶液测定的D-甘露糖溶液的平均OD值
从图1-图4测定的结果来看，这四种溶液建立的标准曲线的R2值均能达到0.995以上，具有良好的线性关系，其中采用双蒸水作为溶剂制备标准蛋白溶液，获得的标准曲线线性效果最好，其R2值达到0.9983，表明这四种溶液对于将D-甘露糖作为标准品溶解制备标准溶液都是合适的。
实施例2样品溶解缓冲液的选择确定
对于确定的标准品的标准曲线合适的4种溶液(双蒸水、20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)、20mM Tris-Cl(pH7.0)、20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0))，进一步采用待检测的样品重组巴曲酶进行溶解，查看不同溶液的线性关系。
1)取毕赤酵母重组表达的巴曲酶浓缩原液(蛋白浓度约为0.5g/mL)，分别采用4种溶液(双蒸水、20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)、20mM Tris-Cl(pH7.0)、20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0))配制成原始的浓度约为0.5mg/mL，然后分别用对应的溶液进行稀释成蛋白浓度为0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL；
2)加苯酚和硫酸：分别取不同溶液溶解的样品溶液200μL，加入6％苯酚溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应，每种溶液的每种浓度样品分别做三个平行的反应管；
3)酶标仪读板：分别吸取样品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样。用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
4)应用计算机软件进行读数和数据分析。以样品吸光度OD值(A)对浓度作曲线，其中每种溶液的每种浓度样品的OD值取三管测试的平均OD值。
4种溶液对应测定的样品的平均OD值分别如下表2所示，其对应的线性曲线分别如图5-图8。
表2：4种溶液测定的重组巴曲酶样品溶液的平均OD值
从图5-图8测定的结果来看，这四种溶液配制的重组巴曲酶样品建立的线性曲线的R2值存在较大差异，其中20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)的线性最好，R2值达到0.9968，而其他的三种溶液(双蒸水、20mM Tris-Cl(pH7.0)、20mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0))的线性较差。我们推测，此处的测定结果可能是由于不同的溶液对于重组巴曲酶糖蛋白的溶解性差异造成的，其中，重组巴曲酶糖蛋白在20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)的溶解性最好，通过稀释不同的浓度的溶液，其反应出最好的线性的曲线，而在其他的三种溶液中相对溶解度较差，因此，线性曲线较差。
实施例3样品缓冲液测定的重复性实验
1)采用实施例2中两种线性表现较好的溶液(20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)、Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0))分别配制两种特定浓度(0.02mg/mL以及0.08mg/mL)的重组巴曲酶蛋白。
2)加苯酚和硫酸：分别取不同溶液溶解的样品溶液200μL，加入6％苯酚溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应，每种溶液的每种浓度样品分别做20个平行的反应管；
3)酶标仪读板：分别吸取样品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样。用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
4)应用计算机软件进行读数和数据分析。
2种溶液对应测定的样品的OD值分别如下表3-表6所示。
表3：20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)重复性测定(0.2mg/mL)数值
0.245 0.261 0.257 0.241 0.260
0.265 0.247 0.266 0.268 0.269
0.252 0.255 0.253 0.244 0.267
0.259 0.249 0.270 0.271 0.258
计算获得，标准偏差SD为0.01，检测精密性达到3.63％，表明具有较好的重复性。
表4：20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)重复性测定(0.8mg/mL)数值
1.021 0.988 0.991 0.983 1.013
0.997 0.982 1.014 1.059 1.124
0.992 0.985 0.976 0.994 1.022
1.031 0.979 0.990 0.989 1.033
计算获得，标准偏差SD为0.04，检测精密性达到3.47％，表明具有较好的重复性。
表5：Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)重复性测定(0.2mg/mL)数值
0.285 0.263 0.293 0.288 0.251
0.274 0.257 0.296 0.274 0.280
0.307 0.311 0.277 0.255 0.281
0.243 0.247 0.255 0.239 0.271
计算获得，标准偏差SD为0.02，检测精密性达到7.65％，表明重复性相对较差。
表6：Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)重复性测定(0.8mg/mL)数值
0.985 1.013 0.963 0.884 1.055
0.972 0.951 1.002 1.043 0.879
1.007 1.104 0.972 0.955 1.024
1.106 0.879 0.953 0.947 1.075
计算获得，标准偏差SD为0.07，检测精密性达到6.81％，表明重复性相对较差。
从表3-表6的重复性检测结果来看，采用20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)对于Na2HPO4-NaH2PO4(pH7.0)来讲，在两种浓度下均具有较好的重复性。
实施例4重组巴曲酶糖蛋白检测准确性
1)取毕赤酵母重组表达的巴曲酶浓缩原液(蛋白浓度约为0.5g/mL)，采用溶液20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)进行稀释成蛋白浓度约为0.5mg/mL；
2)加苯酚和硫酸：取溶液溶解的样品溶液200μL，加入6％苯酚溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应，分别做三个平行的反应管；
3)酶标仪读板：分别吸取样品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样。用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
4)按照实施例1中采用20mM PBS+0.15M NaCl(pH6.0)建立的标准曲线，计算样品中糖蛋白的含量。
表6：重组表达的巴曲酶(0.5mg/mL)OD值检测结果
对于测定计算的平均OD值为0.763，根据标准曲线方程，y＝17.446x+0.0359，获得糖基化蛋白的浓度为0.042mg/mL，表明该重组蛋白具有极高的糖基化水品。
同时采用市售的Thermo公司生产的糖蛋白碳水化合物分析试剂盒(Code No:23260)，对上述样品重组表达的巴曲酶(0.5mg/mL)，进行测定，主要操作步骤如下：
(1)样品的处理：用糖蛋白检测试剂溶液将重组巴曲酶原液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml。
(2)取试剂盒中6种标准蛋白配制的标准蛋白溶液各0.2ml分别加入6支试管中，空白对照为0.2ml糖蛋白检测缓冲液；
(3)依次在各管中加入0.1ml 10mM高碘酸钠溶液；
(4)用旋涡混合器充分混匀30秒种，室温放置10分钟；
(5)依次在各管中加入0.3ml 0.5％的糖蛋白检测试剂溶液；
(6)用旋涡混合器混匀30秒，室温放置1小时；
(7)分光光度计用糖蛋白检测缓冲液进行调零；
(8)用分光光度计测定各管反应液550nm波长处的OD550值；
(9)以糖蛋白的糖百分含量为纵坐标，OD550值为横坐标，绘制标准曲线。
(10)分别取0.2ml稀释后的重组巴曲酶原液，加入到2支试管中。
(11)按照上述操作，并计算样品在550nm波长处的OD550的平均值。
(12)计算：将待测样品的OD550值代入标准曲线，计算出样品的糖百分含量。
测定结果约为0.039mg/mL，表明本发明的方法测定的结果和市售的进口试剂盒的测定结果相近，具有较高的准确性。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种重组巴曲酶的糖蛋白定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)标准品溶液的制备，将D-甘露糖用溶液按比例稀释相应的倍数浓度；
2)待测样品溶液的制备，取毕赤酵母重组表达的巴曲酶浓缩原液，用相应的溶液进行稀释；
3)加酚类物质和硫酸：分别取标准品溶液或待测样品溶液200μL，加入6％酚类物质溶液100μL涡旋混合，快速加入浓硫酸500μL，混匀后，离心，置室温下40min，冰浴终止反应；
4)酶标仪读板：分别吸取样品反应溶液各200μL至96孔板，双复孔平行上样，用酶标仪读取515nm波长OD(A)值。
5)根据测定的OD值，建立标准曲线，应用计算机软件进行读数和数据分析。
2.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中采用的溶液为20mM PBS+0.15M NaCl。
3.根据权利要求2所述的定量分析方法，其特征在于所述溶液的pH值为6.0。
4.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述步骤1)中的浓度为0mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述酚类物质选自苯酚、间苯二酚、萘酚、α-萘酚或间苯二酚中的一种。
6.根据权利要求5所述的定量分析方法，其特征在于，所述酚类物质为苯酚。
7.一种定量检测重组巴曲酶的糖蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：含有氯化钠的PBS溶液，酚类物质，浓硫酸以及D-甘露糖。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述PBS浓度为20mM，所述氯化钠浓度为0.15M。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述酚类物质选自苯酚、间苯二酚、萘酚、α-萘酚或间苯二酚中的一种。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述溶液的pH值为6.0。
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