KR20060132741A - Ｈｐｌｃ를 사용하여 특정 구성 헤파린 또는 저분자량헤파린을 정량하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헤파린 또는 저분자량 헤파린을 분석하는 방법에 관한 것으로서, 분석될 샘플을 헤파리나제의 작용에 의해 해중합시키고, 이어서 적절하다면 수득된 해중합물을 환원시킨 후, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석을 실시함을 특징으로 한다.
헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파리나제, 고성능 액체 크로마토그래피

Description

ＨＰＬＣ를 사용하여 특정 구성 헤파린 또는 저분자량 헤파린을 정량하는 방법{METHOD FOR QUANTITATIVELY DETERMINING SPECIFIC CONSTITUTING HEPARINS OR LOW MOLECULAR WEIGHT HEPARINS USING HPLC}
본 발명의 실시양태는 분류된 헤파린 또는 분류되지 않는 헤파린의 샘플에서 1,6-안하이드로 구조 또는 아세틸화 당을 갖는 성분의 함량을 검출 또는 정량화하는 방법에 관한 것이다.
헤파린은 천연 원료부터 추출된 글리코사미노글리케인 계의 생물학적 활성 성분이고, 유효한 응고 방지성 및 항혈전성을 갖는다. 특히, 헤파린은 수술후 정맥 혈전증의 치료에 유용하다.
원료 헤파린으로부터 저분자량 헤파린(LMWH)를 생성하기 위하여, 더욱 긴 헤파린성 폴리사카라이드 쇄는 더욱 짧은 저분자량의 쇄로 파쇄되어야 한다. 이것은 화학적 또는 효소적 해중합에 의해 실시된다. 생성물은 약 5,000Da의 LMWH 폴리사카라이드 쇄의 평균 분자량을 가질 수 있다. 분류되지 않는 헤파린과 같은 LMWH은 폴리사카라이드 쇄 일부를 따라 분포된 특정 펜타사카라이드 서열에서 ATIII에 결 합함으로써 응고를 억제한다.
승인된 제품의 LMWH 제조자 각각은 별도의 해중합 공정을 사용한다. 두 제조자가 동일한 공정을 사용하지 않는다면, 공정 차이로 인해 별도의 화학 구조를 갖는 LMWH를 형성하며, 따라서 약물학적 활성이 다르며, 따라서 다른 증상의 임상학적 용도로서 승인되고 있다. 형성된 LMWH는 제조에 사용된 해중합 공정에 의해 구조적으로 구별되고 있다(린하르트(R.J. Linhardt)등의 문헌[Seminars in Thombosis and Hemostatis 1999; 25(3 Supp .): 5-16] 참조). 그 결과, LMWH는 헤파린 보다 더욱 비균질성이다. 각각 다른 공정으로 인해 폴리사카라이드 쇄는 독특하고 더욱 복잡한 구조적 변경을 일으킨다. 이러한 변경은 쇄 길이 및 쇄 서열뿐만 아니라, 구조적 특징에서의 차이를 포함한다. 결과적으로, LMWH가 다르면 약물학적 프로파일이 다르고 승인된 임상학적 증상도 다르다.
에녹사파린(enoxaparin) 나트륨은 아벤티스(Aventis)로부터 입수할 수 있으며, 미국에서 에녹사파린 나트륨 주사 형태로 등록상표명 로베녹스(Lovenox)(다른 나라에서는 등록상표명 클렉세인(Clexane))로 시판되고 있다. 일반적으로, 에녹사파린 나트륨은 돼지 창자 장막으로부터 유도된 헤파린 벤질 에스터의 알칼리 분해에 의해 수득된다. 이것의 구조는 예를들면 쇄의 비환원 말단에서 2-O-설포-4-엔피라노즈우론산 기 및 쇄의 환원 말단에서 2-N,6-O-디설포-D-글루코사민을 가짐을 특징으로 한다. 평균분자량은 약 4500달톤이다. 분자량 분포는 다음과 같다:
2000달톤 미만 20% 이하
2000 내지 8000달톤 68% 이상
8000달톤 초과 18% 이하
에녹사파린 나트륨의 제조에는 글루코사민의 6-O-탈황산화가 포함되며, 하기에 도시된 바와 같이, "1,6-안하이드로"라 불리우는 유도체의 형성을 초래한다(국제 특허 출원(WO) 제 01/29055 호 참조):
Figure 112006068515982-PCT00001
이러한 유형의 유도체는 말단 글루코사민이 6-O-황산화된 올리고사카라이드 쇄에 대해서만 수득된다.
말단이 1,6-안하이드로 결합으로 변형된 올리고사카라이드의 비율이 에녹사파린 나트륨의 올리고사카라이드 혼합물의 구조적 특징이며, 이것을 측정하는 것이 가능하다. 현재의 지식을 기반으로, 에녹사파린 나트륨의 성분 중 15% 내지 25%는 쇄의 환원 말단에서 1,6-안하이드로 구조를 갖는다. 그러므로, 본 발명의 실시양태는 분류되지 않은 헤파린 및 분류된 헤파린을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 사용된 "분류된 헤파린"은 약물 목록으로서 등록상표명 로베녹스/등록상표명 클렉세인을 인용하고 있는 출원에서 당국에 의해 승인을 구하고 있는, 해중합이 실시된 임의의 헤파린, 예를들면 에녹사파린 나트륨을 포함하는 저분자량 헤파린(LMWH) 및 임의의 LMWH을 지칭한다.
도 1은 황산화 디사카라이드(△Is)의 UV 스펙트럼과 아세틸화 디사카라이드(△Ia)의 UV 스펙트럼을 비교한, 아세틸화 올리고사카라이드의 선택적 검출을 도시한 것으로, x축은 파장(nm)을 나타내고, y축은 흡광도(mAmps)를 나타낸다.
도 2는 NaBH4로의 환원 전과 후에 헤파리나제로 해중합된 에녹사파린의 크로마토그래피적 분리(가는 흑색선의 시그널은 234nm에서의 UV이고, 굵은 흑색선의 시그널은 202 내지 234nm에서의 UV이다)를 도시한 것으로, x축은 용출 시간(분)을 나타내고, y-축은 흡광도(mAmps)를 나타낸다.
도 3은 NaBH4로의 환원 전과 후에 헤파리나제로 해중합된 헤파린의 크로마토그래피적 분리(가는 흑색선의 시그널은 234nm에서의 UV이고, 굵은 흑색선의 시그널은 202 내지 234nm에서의 UV이다)를 도시한 것으로, x축은 용출 시간(분)을 나타내 고, y-축은 흡광도(mAmps)를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 분석방법은 다음과 같다:
분석하고자 하는 샘플을 헤파리나제의 작용에 의해 해중합시킨 다음, 경우에 따라, 수득된 탈중합체를 환원시키고, 이어서 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석을 수행한다. 따라서, 상기 정의한 바와 같은 방법은, 말단이 1,6-안하이드로 결합("1,6-안하이드로 기")으로 변형된 올리고사카라이드 쇄의 존재를 검출하여 분석됨을 특징으로 한다.
관련된 실시양태에서, 분석하고자 하는 샘플은 헤파리나제, 예를들면 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7.), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8.)(각각의 헤파리나제는 0.5단위/ml로서 존재함)의 혼합물로 철저하게 해중합된다(상기 효소는 그램피안 엔자임(Grampian Enzymes) 그룹에 의해 시판되고 있다).
따라서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 분류되지 않은 헤파린 또는 분류된 헤파린의 분석 방법에 관한 것이다:
(a) 샘플을 헤파리나제의 작용에 의해 해중합시키는 단계,
(b) 경우에 따라, 해중합물을 환원시키는 단계 및
(c) 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 단계 (a) 또는 (b)의 샘플을 분석하는 단계.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 헤파리나제가 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7.), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8.)의 혼합물 형태인, 상기 정의한 바와 같은 방법에 관한 것이다. 이어서, 이렇게 제조된 해중합물은 1,6-안하이드로 형태(국제특허출원(WO) 제 01/72762 호에 기술된 제품)가 아닌 환원 말단을 환원시키기 위해 처리될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 해중합물은 아세트산 나트륨 중의 NaBH4 용액으로 처리되어 1,6-안하이드로 형태가 아닌 환원 말단을 환원시킨다, 최종적으로, 하기 기술되는 디사카라이드 1 및 2를 정량하기 위해, 헤파리나제로 해중합된 저분자량 헤파린 샘플을 NaBH4와 같은 환원제의 작용에 의해 환원시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 해중합된 헤파린이 계속해서 환원되는, 상기 정의한 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명은 환원제가 NaBH4인, 상기 정의한 바와 같은 방법에 관한 것이다. 리튬 또는 칼륨과 같은, 보로하이드라이드의 다른 알칼리 금속 염이 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법에 의해, "1,6-안하이드로" 유도체를 함유하지 않는 다른 저분자량 헤파린으로부터 에녹사파린 나트륨이 분명하게 구별될 수 있다. 환원하자면, 본 발명의 방법으로 저분자량 헤파린이 에녹사파린 나트륨의 약리화학적 특징을 충족시키지 않기 때문에 당연히 상이하다고 주장할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 예를들면 에녹사파린 나트륨의 제조 공정의 표준화를 제공하고 균일한 뱃치를 산출하기 위해, 샘플의 공정내부 제어(in-process control) 동안 산업 공정에 사용될 수 있다.
효소 해중합 및 환원 말단의 선택적 환원 후, 에녹사파린 나트륨의 1,6-안하이드로 유도체는 4가지의 필수 형태, 즉 디사카라이드 1, 디사카라이드 2, 디사카라이드 3 및 테트라사카라이드 1로 존재한다. 따라서, 본 발명은 또한 해중합 반응 동안 수득된 1,6-안하이드로 잔기가 하기를 포함하는 상술된 방법에 관한 것이다.
Figure 112006068515982-PCT00002
최종 디사카라이드 단위에 1,6-안하이드로 말단을 함유하며 상기 최종 디사카라이드의 우론산에 2-O-황산염을 지니지 않는 모든 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 헤파리나제에 의해 완전히 해중합되어 디사카라이드 1 및 2 형태가 된다. 반면에, 상기 최종 사카라이드가 우론산에 2-O-황산염을 함유하는 경우와 상기 최종 사카라이드가 만노사민 형태인 경우, 1,6-안하이드로 유도체는 테트라사카라이드 1의 형태(헤파리나제에 대해 내성인 형태)이다.
트라이사카라이드 1(하기 참조)은 또한 혼합물로서 존재한다. 이것은 하기 구조를 생성시키는 또 다른 분해 공정(에녹사파린 나트륨의 화학적 해중합 동안 관측된 박리 현상)으로부터 유도된다.
Figure 112006068515982-PCT00003
혼합물의 다른 구성성분은 에녹사파린 나트륨 만의 유일한 특징이 아니다. 물론 헤파린 쇄의 8개의 기본적인 디사카라이드가 존재한다. 이러한 8개의 기본적인 디사카라이드는 특히 시그마(Sigma)사에 의해 시판되고 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 다음과 같은 다른 디사카라이드, 즉 기원물질으로서 2-갈락투론산의 형성을 유도하는 -IdoA(2S)-GlcNS(6S)- 및 -IdoA(2S)-GlcNS-의 알칼리성 2-O-탈황산화를 갖는 디사카라이드 △IISgal 및 △IVSgal가 혼합물 중에서 규명되었다. 이러한 디사카라이드는 통상적으로 헤파린의 원래 구조로 존재하지 않는다(데사이(U.M. Desai) 등의 [Arch. Biochem. Biophys, 306 (2) 461-468(1993)] 참조):
Figure 112006068515982-PCT00004
3-O-황산화 글루코사민을 함유하는 올리고사카라이드는 헤파리나제에 의한 분해에 내성이 있으며 테트라사카라이드 형태로 존재한다.
대부분의 저분자량 헤파린의 경우, 헤파린은 돼지 점막으로부터 추출되며, 이러한 기본적인 테트라사카라이드는 하기에 나타냈다. 이러한 테트라사카라이드는 효소적 해중합에 대해 내성이 있으며 안티트롬빈 III에 대한 친화성을 갖는 서열을 가지고 있다. 이러한 테트라사카라이드는 다음과 같은 기호로 나타내진다: △IIa-IIsglu 및 △IIa-IVsglu(야마다(S. YAMADA), 요시다(K. YOSHIDA), 수기우라(M. SUGIURA), 크후(K-H KHOO), 모리스(H.R. MORRIS), 델(A. DELL)의 문헌[J. Biol. Chem.; 270(7), 4780-4787 (1993)] 참조).
Figure 112006068515982-PCT00005
헤파리나제로 분해된 혼합물의 최종 구성성분은 글리코세린 및 △GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser이다(수가하라(K. Sugahara) 등의 문헌[J. Biol. Chem.; 270(39), 22914-22923 (1995)]; 수가하라의 문헌[J.Biol.Chem.; 267(3), 1528-1533 (1992)] 참조). 후자는 일반적으로 에녹사파인 나트륨 중에 거의 존재하지 않는다(실시예 5의 NMR 참조).
Figure 112006068515982-PCT00006
다른 양태에서, 본 발명은 1,6-안하이드로 기를 검출하는 크로마토그래피 공정을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 방법은 해중합 후 수득된 다양한 올리고사카라이드를 분리하고 선택적으로 NaBH4와 같은 환원제로 처리하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 여러 올리고사카라이드의 분리는 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 실시될 수 있다. 하나의 양태에서, HPLC는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 관련된 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 강한 음이온 교환 크로마토그래피(SAX)이다.
본원에서, 용어 "강한 음이온 교환 크로마토그래피"(SAX)는 약 pH 2 내지 12 범위에서 일정한 유효 양성 전하를 유지하는 임의의 수지 상에서 실시된 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피에서는 4차 암모늄 교환 기로 작용화된 고형 지지체를 사용한다. 예를들면, 등록상표명 스페리소브(Spherisorb) SAX(미국 매샤츄세츠 밀포드 소재의 워터스 코포레이션(Waters Corp))와 같은 칼럼은 약 5㎛의 입자 크기를 갖는 것을 사용하며, 약 25cm의 칼럼 길이 및 약 1mm 내지 약 4.6mm의 칼럼 직경을 사용할 수 있다.
사용된 장비는, 용출 구배가 형성되고, 아세틸화 당의 선택적 검출에 적당한 UV 검출기가 구비되어 있는 임의의 크로마토그래피일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, UV 검출기는 구성성분의 UV 스펙트럼을 생성하고, 약 2개의 상이한 파장의 흡광도 간의 차이로부터 산출된 복합 시그널을 기록하는 다이오드 어레이이다. 이러한 다이오드 어레이 검출기로 아세틸화된 올리고사카라이드의 특이 검출이 가능하다. 관련 실시양태에서, 200nm 까지의 UV 영역에서 투명한 HPLC 이동상이 사용된다. 이러한 실시양태에서, 염화물의 부식력에 견디기 위해 부동태화된 크로마토그래피를 필요로 하는 추가적인 단점을 갖는 NaCl에 기초하는 통상의 이동상은 배제시키고 있다. 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 이동상은 과염소산나트륨, 메탄설포네이트 또는 인산염에 기초한 이동상을 포함하지만, 이것으로 한정되지는 않는다. 하나의 실시양태에서, 이동상은 암모늄 메탄 설포네이트의 수용액이다.
그러므로, 또한 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하는 상술된 분석 방법에 관한 것으로, 이때 약 200nM 내지 약 400nM의 UV 영역에서 투명한 이동상이 사용되고 있다.
특정 실시양태에서, 강한 음이온 크로마토그래피 분리는 약 2.0 내지 약 6.5의 pH에서 실시된다. 관련 실시양태에서, 약 3의 pH 영역이 사용될 것이다. 예를들면, pH는 pH 3에서의 완충력을 갖는 이동상에 염을 첨가함으로써 조절될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 과염소산염 보다 큰 pH 3에서의 완충력을 갖는 인산염과 같은 염이 사용된다. 예시적인 크로마토그래피성 분리 조건은 다음과 같다:
이동상:
용매 A: NaH2PO4, 2.5mM, H3PO4를 첨가하여 pH 2.9가 되도록 함.
용매 B: 1N NaH2PO4 중에서의 NaClO4, 2.5mM, H3PO4를 첨가하여 pH 3.0이 되도록 함.
용출 구배는 다음과 같다.
T= 0분: %B=3; T=40분: %B=60; T=60분: %B=80
적당한 온도는 예를들면 약 40 내지 약 50℃이고, 펌프 유속은 사용되는 칼럼에 따라 선택된다.
SAX 크로마토그래피에 의해 샘플을 정제하는 방법은 본 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를들면 SAX 방법은 라이스(K. G. Rice) 및 린하르트(R. J. Linhardt)의 문헌[Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989)], 란크재르(A. Larnkjaer)등의 문헌[Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995)]; 및 국제특허공개(WO) 제 90/01501 호(실시예 2)에 기술되어 있다. 이러한 참조문헌 내용의 전체가 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 분류되지 않은 헤파린 또는 분류된 헤파린에서 관측되는 특이 기를 검출하는 방법이다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 헤파린 또는 LMWH 기의 UV 검출의 특이성을 증가시킨다. 비아세틸화 폴리사카라이드 모두가 소정의 pH에서 매우 유사한 UV 스펙트럼을 가지기 때문에, 비아세틸화 사카라이드의 흡광성이 소멸되도록 선택된 2 파장에서의 흡광도 간의 차이를 시그널로서 취함으로써 아세틸화 당을 선택적으로 검출할 수 있다.
예시적인 방식으로 기술된 바와 같이, 202nm 및 230nm가 검출 및 참조 파장으로서 선택될 수 있으며, 202 내지 230nm의 시그널이 기록될 수 있다. 당 기술분야의 숙련가들은, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 파장의 선택은 이동상의 pH에 따라 좌우된다(pH가 최적이 되도록 수 nm의 조절이 필요하다)는 것을 이해할 것이다.
둘 이상의 파장에서 흡광도를 동시에 측정할 수 있는 임의의 UV 검출기가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, DAD 1100 검출기(아길런트 테크놀로지(Agilent Technologies)사로부터 입수됨)가 사용된다. 이러한 실시양태에서, 한편에서는 234nm에서, 다른 한편에서는 202 내지 230nm에서 이중 검출이 수행될 것이다. 아세틸화 올리고사카라이드의 선택적 검출의 원리는, 황산화디사카라이드 △Is의 UV 스펙트럼을 아세틸화 디사카라이드 △Ia의 UV 스펙트럼과 비교한 도 1에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한 검출방법에 의해 아세틸화 당을 선택적으로 검출할 수 있는, 상술된 분석 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 분석 방법은 SAX 크로마토그래피에 의한 분리를 사용하며, 비아세틸화 사카라이드의 흡광성이 소멸되도록 선택된 두 개의 파장에서의 흡광도 간의 차이를 측정함으로써 아세틸화 당을 선택적으로 검출한다.
상술한 4개의 1,6-안하이드로 잔기의 정량에는 혼합물의 모든 다른 구성성분에 대한 크로마토그래피 시스템에서의 충분한 선택성을 요구한다. 그러나, 일반적으로 공동 용출되는 2개의 디사카라이드 1 및 2는 △IIa에 대해 거의 분해되지 않는데, 특히 이는 후자, 즉 디사카라이드 2가 이것의 2개의 α 및 β아노머 형태로 존재하기 때문이다.
2개의 디사카라이드 1 및 2은, NaOH를 첨가하여 pH 13이 된 △IIs의 수용액 중의 실온에서 상기 디사카라이드가 수시간 내에 형성되기 때문에 용이하게 규명될 수 있다. 그러나, 이중 검출이 사용되는 경우, 아세틸화 올리고사카라이드 △IVa, △IIa, △IIIa, △Ia, △IIa-IVs glu 및 △IIa-IIs glu 가 용이하게 규명될 수 있다.
피크의 분리 원인은 한편으로는 아노머 형태 때문이며, 보다 적은 정도로는, △IIs, △IIIs 및 △Is가 올리고사카라이드 쇄의 말단위치에 있을 때에 부분적으로 존재하는 글루코사민↔만노사민 에피머화 때문이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 디사카라이드 1 및 2는, 헤파리나제에 의해 이미 해중합된 저분자량 헤파린 샘플을 NaBH4의 작용에 의해 환원시킴으로써 정량화된다.
Figure 112006068515982-PCT00007
이러한 환원은 말단 올리고사카라이드 고리를 개환시킴으로써 α↔β 아노머화를 생략한다는 잇점을 갖고 있다. 수득된 크로마토그램은 아노머화가 생략되기 때문에 보다 단순하다. 더욱이, △IIa의 환원으로 컬럼상에서의 이것의 체류가 감소되며, 디사카라이드 1 및 2의 분석이 용이해진다.
하기 도 2 및 3에 기술된 크로마토그램의 예는 이러한 현상들과 본 방법의 잇점을 명료하게 설명한다.
하기 실시예는 본 발명의 여러 특징을 예시하기 위한 것이다. 당 기술분야의 숙련가들은 본 발명이 하기 예시된 실시양태로 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1: 효소적 해중합의 일반적 설명
효소적 해중합이 본 발명에서 어떻게 실시되고 사용되는 지에 대한 일반적인 설명이 하기에 기술된다.
20mg/ml의 분석하고자 하는 에녹사파린 나트륨을 함유한 용액 50㎕, 2mM 아세트산 칼슘을 함유하는 pH 7.0의 100mM 아세트산/NaOH 용액 200㎕ 및 BSA 1mg/ml를 3개의 헤파리나제의 모액 50㎕와 혼합하여 효소적 해중합을 실온에서 48시간 동안 실시하였다. 헤파리나제를 -30℃에서 저장하였다. 헤파리나제는 완충 용액 중에 있으며, 각 헤파리나제에 대한 역가는 0.5IU/ml이다(완충 용액 조성: 2mg/ml의 소 혈청 알부민(BSA)로 보충된 0.01mol/l 농도의 pH 7의 KH2PO4 수용액).
사용하기 직전에 제조된 100mM의 아세트산 나트륨에 30g/l NaBH4 용액 10㎕를 첨가함으로써 헤파리나제로 해중합된 생성물 60㎕에서 환원을 실시하였다.
실시예 2:
실시예 1의 일반적 설명에 따라 수득된 디사카라이드 3의 NMR
D2O에서의 양성자 스펙트럼, 400 MHz, T=298K, δ(ppm): 3.34 (1 H, dd, J=7 및 2Hz, H2), 3.72 (1H, t, J=8Hz, H6), 3.90 (1H, m, H3), 4.03 (1H, s, H4), 4.20 (1H, d, J=8Hz, H6), 4.23 (1H, t, J=5Hz, H3'), 4.58 (1H, m, H2'), 4.78 (1H, m, H5), 5.50 (1H, s, H1), 5.60 (1H, dd, J=6 및 1Hz, H'), 6.03 (1H, d, J=5Hz, H4').
실시예 3:
실시예 1의 일반적 설명에 따라 수득된 테트라사카라이드 1의 NMR
D2O에서의 양성자 스펙트럼, 400 MHz, T=298K, δ(ppm): 3.15 (1H, s, H2), 3.25 (1H, m, H2"), 3.60 (1H, m, H3"), 3.70 및 4.70 사이 (14H, 분해되지 않은 복합물, H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5', H4"/H5"/H6", H2"'/H3"'), 4.75 (1H, m, H5), 5.20 및 5.40 사이 (2H, m, H1' 및 H1"), 5.45 (1H, m, H1'"), 5.56 (1H, m, H1), 5.94 (1H, d, J=5Hz, H4).
실시예 4:
실시예 1의 일반적 설명에 따라 수득된 트리사카라이드 1의 NMR
D2O에서의 스펙트럼, 600 MHz, (δ(ppm)): 3.28 (1H, m), 3.61 (1H, t, 7Hz), 3.79 (1H, t, 7Hz), 3.95 (1H, d, 6Hz), 4.00 (1H, s), 4.20 (1H, m), 4.28 (2H, m), 4.32 (1H, d, 4Hz), 4.41 (1H, s), 4.58 (1H, s), 4.61 (1H, s), 4.90 (1H, 넓은 s), 5.24 (1H, s), 5.45 (1H, s), 5.95 (1H, s).
실시예 5:
본 발명에 따라 수득된 △GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser의 NMR
D2O에서의 스펙트럼, 500 MHz (δ(ppm)): 3.30 (1H, t, 7Hz), 3.34 (1H, t, 8Hz), 3.55 (1H, t, 7Hz), 3.60 (1H, t, 7Hz), 3.63 및 3.85 사이 (10H, m), 3.91 (2H, m), 3.96 (1H, dd, 7 및 2Hz), 4.02 및 4.10 사이 (3H, m), 4.12 (1H, d, 2Hz), 4.18 (1H, m), 4.40 (1H, d, 6Hz), 4.46 (1H, d, 6Hz), 4.61 (1H, d, 6Hz), 5.29 (1H, d, 3Hz), 5.85 (1H, d, 3Hz).
실시예 6: 정량화의 원리
환원 용액으로 수득된 크로마토그램에서의 1,6-안하이드로 함량은 규정화된 면적 방법에 의해 측정된다.
불포화 우론산의 몰 흡광 계수는 상수로서 취해지며, 결과적으로 폴리사카라이드의 반응 계수는 분자량에 비례한다.
본 발명에 따른 방법에서, 혼합물 중에 함유된 모든 불포화 올리고사카라이드는 5500mol-1.l.cm-1에 상당하는 동일한 몰 흡광성을 갖는다는 폭넓게 승인되는 가설로 설정되었다. 따라서, 두 개의 공용출된 1,6-안하이드로 잔기, 디사카라이드 1 및 2가 함께 합해졌다. 그러므로, 출발 물질인 분류되지 않은 헤파린 또는 분류된 헤파린중의 해중합된 혼합물의 모든 구성물, 예를들면 1,6-안하이드로 유도체 또는 아세틸화 당 유도체의 구성성분의 중량%를 측정할 수 있다. 피크 7, 8, 13 및 19에 상응하는 4개의 1,6-안하이드로 유도체, 즉 디사카라이드 1, 디사카라이드 2, 디사카라이드 3 및 테트라사카라이드 1에 있어서, 중량%는 다음과 같은 수학식 1, 2 및 3으로부터 계산된다:
Figure 112006068515982-PCT00008
Figure 112006068515982-PCT00009
Figure 112006068515982-PCT00010
면적7, 면적8, 면적13 및 면적19는 각각의 피크 7, 8, 13 및 19의 면적에 상응한다. 이들 4개의 화합물 각각의 몰 질량은 각각 443, 443, 545 및 1210이다. ΣMwx·면적x는 상응하는 생성물의 몰 질량에 의한 크로마토그램 각각의 피크 면적 비에 상응한다.
Mw가 연구된 저분자량 헤파린의 평균 질량인 경우, 1,6-안하이드로 고리로 종결되는 올리고사카라이드의 백분율은 하기 수학식 4로 산출된다:
Figure 112006068515982-PCT00011
유사하게, 분류되지 않은 헤파린 및 분류된 헤파린으로부터 선택된 샘플 물질 중의 다른 성분의 중량%를 측정할 수 있다.
정확한 분자량은 크로마토그램 상의 확인된 피크으로부터 얻을 수 있다(표 1 참조):
올리고사카라이드 환원 후 올리고사카라이드 분자량
1 1 741
2 20 401
3 3 734
4 21 461
5 22 461
6 23 503
7 7 443
8 8 443
9 24 503
10 25 563
11 26 563
12 27 563
13 13 545
14 28 605
15 29 1066
16 30 665
17 31 965
18 32 1168
19 19 1210
도 2 및 3의 피크 번호에 대응하는 사카라이드의 이름이 하기에 기술되어 있다:
1: △GlcAβ1-3 Galβ1-3 Galβ1-4 Xyl β1-O-Ser
2: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루코피라노실 나트륨 염
3: △GlcAβ1-3 Galβ1-3 Galβ1-4 Xylβ1-O-CH2-COOH
4: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔갈락토피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루코피라노즈 이나트륨 염
5: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루코피라노실 나트륨 염
6: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실 이나트륨 염
7: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루코피라노즈 이나트륨 염(디사카라이드 1)
8: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시-2-설파미도-β-D-만노피라노즈 이나트륨 염(디사카라이드 2)
9 : 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루코피라노실 이나트륨 염
10: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔갈락토피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-β-D-글루코피라노즈 삼나트륨 염
11: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-β-D-글루코피라노실 삼나트륨 염
12: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루코피라노실 삼나트륨 염
13: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥스-4-엔피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루코피라노즈 삼나트륨염(디사카라이드 3)
14: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실 삼나트륨 염
15: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6- O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시 -2-설파미도-3-O-설포-α-D-글루코피라노실) 오나트륨 염
16: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실 사나트륨 염
17: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-3,6-디-O-설포-α-D-글루코피라노실) 육나트륨염
18: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-D-글루코피라노실-(1→4)-2-O-설포-α-L-아이도피라노실우론산 육나트륨 염
19: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-0-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-2-O-설포-α-L-아이도피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시설파미도-β-D-만노피라노즈, 육나트륨 염(테트라사카라이드 1)
20: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루시톨 나트륨 염
21: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루시톨 이나트륨 염
22: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루시톨 이나트륨 염
23: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 이나트륨 염
24: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루시톨 이나트륨 염
25: 4-데옥시-α-L-트레오헥센갈락토피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-β-D-글루시톨 삼나트륨 염
26: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
27: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
28: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
29: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6- O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시 -2-설파미도-3-O-설포-α-D-글루시톨) 오나트륨 염
30: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
31: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6- O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시 -2-설파미도-3,6-디-0-설포-α-D-글루시톨) 육나트륨 염
32: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-0-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-2-O-설포-α-L-아이도피라노실우론산 육나트륨 염(NaBH4에 의해 환원된 형태)
사용된 약어:
IdoA: α-L-아이도피라노실우론산
GlcA: β-D-글루코피라노실우론산;
△GlcA: 4,5-불포화산: 4-데옥시-α-L-트레오-헥센피라노실우론산;
Gal: D-갈락토스;
Xyl: 자일로즈;
GlcNAc: 2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루코피라노즈;
GlcNS: 2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루코피라노즈;
2S: 2-O-설페이트,
3S: 3-O-설페이트,
6S: 6-O-설페이트.
본 발명은 그의 진의 또는 필수 속성으로부터 벗어남이 없이 다른 특정 형태로 구현될 수 있다.

Claims (49)

  1. 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는, 분류되지 않은 헤파린 및 분류된 헤파린으로부터 선택된 물질 샘플에서 성분들의 함량을 정량하는 방법:
    (a) 효소적 방법에 의해 상기 샘플을 해중합시키는 단계; 및
    (b) 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 단계 (a)의 해중합된 샘플 중의 성분의 양을 검출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 효소적 방법이 하나 이상의 헤파리나제를 사용하여 실시되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 효소적 방법이 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8)의 혼합물을 사용하여 실시되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 분류된 헤파린은 에녹사파린 나트륨인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)에서 사용된 고성능 액체 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)에서 사용된 고성능 액체 크로마토그래피가 강한 음이온 교환 크로마토그래피(SAX)인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피가 등록상표명 스페리소브(Spherisorb) SAX 칼럼을 사용하여 실시되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 약 200nm 내지 약 400nm의 파장을 갖는 UV 광에 투명한 이동상에서 실시되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 과염소산나트륨, 메탄설포네이트 염 및 인산 염으로부터 선택된 하나 이상의 염을 포함하는 이동상에서 실시되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 과염소산 나트륨 염을 포함하는 이동상에서 실시되는 방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피가 약 2.0 내지 약 6.5의 pH에서 실시되는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피가 약 3의 pH에서 실시 되는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 이동상이 pH 약 3.0으로 유지된 과염소산 나트륨 용액을 포함하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 해중합된 샘플이 하기 중 임의의 하나로부터 선택된 하나 이상의 올리고사카라이드 쇄를 포함하는 방법.
    Figure 112006068515982-PCT00012
    Figure 112006068515982-PCT00013
  15. 제 1 항에 있어서, 해중합된 샘플은, 말단이 1,6-안하이드로 결합으로 개질된 하나 이상의 올리고사카라이드 쇄를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 하나 이상의 올리고사카라이드 쇄가 하기 중 임의의 하나로부터 선택되는 방법.
    Figure 112006068515982-PCT00014
  17. 제 4 항에 있어서, 해중합된 샘플이 하기 중 임의의 하나로부터 선택되는 하나 이상의 1,6-안하이드로 잔기를 포함하는 방법.
    Figure 112006068515982-PCT00015
  18. 제 17 항에 있어서, 하나 이상의 1,6-안하이드로 잔기가 샘플의 중량 평균 분자량의 15% 내지 25% 범위인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 단계 (b)의 해중합된 샘플에서 검출된 성분이 아세틸화 당인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 아세틸화 당 및 비아세틸화 당 둘다가 흡수하는 파장에서 측정된 흡광도를, 비아세틸화 당이 아닌 아세틸화 당이 흡수하는 파장에서 측정 된 흡광도로부터 뺌으로써 아세틸화 당이 선택적으로 검출되는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 검출된 아세틸화 당이 아세틸화 올리고사카라이드 △IVa, △IIa, △IIIa, △Ia, △IIa-IVs glu 및 △IIa-IIs glu 로부터 선택되는 방법.
  22. 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는, 에녹사파린 나트륨 샘플에서 1,6-안하이드로 잔기의 함량을 정량하는 방법:
    (a) 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8)의 혼합물을 사용하여 상기 샘플을 해중합시키는 단계; 및
    (b) 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 단계 (a)의 해중합된 샘플에서 1,6-안하이드로 잔기의 양을 검출하는 단계.
  23. 제 22 항에 있어서, 1,6-안하이드로 잔기의 양이 샘플의 평균 올리고사카라이드 분자량의 15% 내지 25% 범위인 방법.
  24. 하기 단계 (a), (b) 및 (c)를 포함하는, 분류되지 않은 헤파린 및 분류된 헤파린으로부터 선택된 물질 샘플에서 성분의 함량을 정량하는 방법:
    (a) 효소적 방법에 의해 상기 샘플을 해중합시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 해중합된 샘플을 환원시키는 단계; 및
    (c) 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 단계 (b)의 환원된 샘플에서 성분의 양을 검출하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 효소적 방법이 하나 이상의 헤파리나제를 사용하여 실시되는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 효소적 방법이 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8)의 혼합물을 사용하여 실시되는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 단계 (a)의 해중합된 샘플의 환원이 환원제에 노출시켜 실시되는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 환원제가 NaBH4, 또는 보로하이드라이드 음이온의 알칼리 금속 염인 방법.
  29. 제 24 항에 있어서, 분류된 헤파린이 에녹사파린 나트륨인 방법.
  30. 제 27 항에 있어서, 환원제가 1,6-안하이드로 형태가 아닌 에녹사파린 나트 륨의 훤원 말단를 환원시키는 방법.
  31. 제 24 항에 있어서, 단계 (c)에서 사용된 고성능 액체 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
  32. 제 24 항에 있어서, 단계 (c)에서 사용된 고성능 액체 크로마토그래피가 강한 음이온 교환 크로마토그래피(SAX)인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피가 등록상표명 스페리소브(Spherisorb) SAX 칼럼을 사용하여 실시되는 방법.
  34. 제 24 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 약 200nm 내지 약 400nm의 파장을 갖는 UV 광에 투명한 이동상에서 실시되는 방법.
  35. 제 24 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 과염소산나트륨, 메탄설포네이트 염 및 인산 염으로부터 선택된 하나 이상의 염을 포함하는 이동상에서 실시되는 방법.
  36. 제 24 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 과염소산 나트륨 염을 포함하는 이동상에서 실시되는 방법.
  37. 제 32 항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피가 약 2.0 내지 약 6.5의 pH에서 실시되는 방법.
  38. 제 32 항에 있어서, 강한 음이온 교환 크로마토그래피가 약 3의 pH에서 실시되는 방법.
  39. 제 24 항에 있어서, 고성능 액체 크로마토그래피가 pH 약 3.0으로 유지된 과염소산 나트륨 용액을 포함하는 이동상을 이용하는 방법.
  40. 제 28 항에 있어서, 해중합된 샘플이 하기 중 임의의 하나로부터 선택된 하나 이상의 올리고사카라이드 쇄를 포함하며, 이때 올리고사카라이드 쇄가 환원 형태인 방법.
    Figure 112006068515982-PCT00016
    Figure 112006068515982-PCT00017
  41. 제 24 항에 있어서, 해중합된 샘플은, 말단이 1,6-안하이드로 결합으로 개질 된 하나 이상의 올리고사카라이드를 포함하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 하나 이상의 올리고사카라이드 쇄가 하기 중 임의의 하나로부터 선택되는 방법.
    Figure 112006068515982-PCT00018
  43. 제 29 항에 있어서, 해중합된 샘플이 하기를 포함하는 1,6-안하이드로 잔기의 혼합물을 포함하는 방법.
    Figure 112006068515982-PCT00019
  44. 제 43 항에 있어서, 1,6-안하이드로 잔기의 혼합물이 샘플의 중량 평균 분자량의 15% 내지 25% 범위인 방법.
  45. 제 24 항에 있어서, 단계 (b)의 해중합된 샘플에서 검출된 성분이 아세틸화 당인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 아세틸화 당 및 비아세틸화 당 둘다가 흡수하는 파장에서 측정된 흡광도를, 비아세틸화 당이 아닌 아세틸화 당이 흡수하는 파장에서 측정 된 흡광도로부터 뺌으로써 당이 선택적으로 검출되는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 검출된 아세틸화 당이 아세틸화 올리고사카라이드 △IVa, △IIa, △IIIa, △Ia, △IIa-IVs glu 및 △IIa-IIs glu 로부터 선택되는 방법.
  48. 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는 에녹사파린 나트륨 샘플에서 1,6-안하이드로 잔기의 함량을 정량하는 방법:
    (a) 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8)의 혼합물을 사용하여 상기 샘플을 해중합시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 해중합된 샘플을 환원시키는 단계; 및
    (c) 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 단계 (b)의 환원된 샘플에서 1,6-안하이드로 잔기의 양을 검출하는 단계.
  49. 제 48 항에 있어서, 1,6-안하이드로 잔기의 양이 샘플의 중량 평균 분자량의 15% 내지 25% 범위인 방법.
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