CN104792896A - 一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物，所述肝素酶组合物为肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量活性比为3:1。通过本发明的肝素酶组合物可以彻底的酶解依诺肝素钠形成并经还原制得1,6-酐衍生物，且含量均在合格范围，本发明的肝素酶组合物不用肝素酶I减少了酶杂质的引入，使方法更可靠，是对几大药典方法的重要补充，具有很高的实际使用价值和意义。

Description

一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测依诺肝素钠中1,6酐含量的不含肝素酶Ⅰ的肝素酶组合物及其应用与其检测方法，属于医药生物技术领域。

背景技术

依诺肝素钠(Enoxaparin Sodium,ES)是一种低分子肝素钠盐，由猪肠粘膜肝素苄基酯衍生物进行碱解聚而获得，美国专利US005389618A详述了这种依诺肝素钠制备过程。美国药典和欧洲药典等对于依诺肝素钠的质量控制有着诸多要求，除了对效价、分子量分布、重金属含量和试剂残留含量等理化项目检测外，还要求测定1,6-酐含量。由于1,6-酐环结构低聚糖链的百分数是依诺肝素钠低聚糖混合物的特征，药典中规定其1,6-酐环结构需占全部糖单元的15％-25％。基于依诺肝素钠的结构与组成的高度复杂性，目前常规的检测尚难以涉及其分子的细节结构，在结构确证与质量标准控制上存在一定的不确定性。

美国药典描述了一种1,6-酐含量测定方法(USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”)，是利用三种肝素酶等量混合，酶解依诺肝素钠样品两天，产物再经还原后HPLC分析。但实际应用中按此方法进行，其结果往往不能符合标准，主要原因在于肝素酶性质特别，往往酶解过程无法完成彻底，使得样品性能不能判断。特别是肝素酶I不稳定，价格高，选择性差，不同来源的肝素酶对1,6-酐含量测定方法影响很大。所以导致该方法的稳定性差，重复性差，至今该方法只是一个一般检测方法，而没有作为依诺肝素的质检放行方法。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物及其检测方法。

本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：

一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物，所述肝素酶组合物为肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量活性比为3:1。

优选地，所述肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ为酶溶液或冻干酶粉。

优选地，所述肝素酶组合物用于依诺肝素钠的特异性酶解还原制得1,6-酐衍生物。

优选地，所述肝素酶组合物酶解还原制得1,6-酐衍生物包括如下步骤，

S1，完全酶解依诺肝素钠步骤，在待酶解的依诺肝素钠溶液中加入肝酶素组合物，置于室温下酶解至少24小时；

S2，还原酶解后样品步骤，在经过酶解后的样品中添加硼氢化钠溶液涡旋混合进行室温的还原，并经过滤膜的过滤；

S3，还原产物的HPLC检测，对S2中的还原产物按照以下色谱条件进行检测：

S4，分析图谱得出糖单元种类和含量；

根据色谱图的分离度，得出洗脱还原产物为1,6-酐衍生物，并按照公式计算还原产物中1,6-酐摩尔百分含量，1,6-酐摩尔百分含量为 $100\&times;\frac{\mathrm{Mw}}{\mathrm{\&Sigma;M}{w}_x\&times;\mathrm{Ax}}\&times;(A_1+A_2+A_3);$

三种主要的1,6-酐衍生物的摩尔百分含量的计算，三种所述1,6-酐衍生物分别包括4#峰1,6-anhydro_IIS与1,6-anhydro_IIS^epi、9#峰1,6-anhydro_IS和11#峰1,6-anhydro_IS–IS^epi；以上三种衍生物均在USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”中有详细的阐述：

其中Mw：依诺肝素钠平均分子量；Mwx：各个衍生物x的相对分子量；Ax：各个衍生物x的峰面积；A1：1,6-AnhydroΔIs的峰面积；A2：1,6-AnhydroΔIIs的峰面积；A3：1.6-AnhydroΔIs-Is的峰面积

S5，判断1,6-酐衍生物中1,6-酐含量是否合格；当1,6-酐衍生物中1,6-酐含量的摩尔百分含量结果在15—25％范围内，则判定为合格，否则即判定为不合格。

本发明突出效果为：本发明中的肝素酶组合物以肝素酶Ⅱ为主，不使用肝素酶Ⅰ可以彻底的分解，而且酶解时间从USP32等指定的2天缩短为1天或以内，不用肝素酶I减少了酶杂质的引入，使方法更可靠，是对几大药典方法的重要补充，具有很高的实际使用价值和意义。解决了目前几大药典未能准确解决的1,6-酐二糖分析难题。

本发明的肝素酶组合物能更彻底的酶解依诺肝素钠原理为，实际应用中与肝素(Heparin)有关的裂解酶有三种：肝素酶Ⅰ(HeparinaseⅠ)、肝素酶Ⅱ(HeparinaseⅡ)和肝素酶Ⅲ(HeparinaseⅢ)。

肝素酶Ⅰ的降解底物为肝素，肝素酶Ⅲ的降解底物为硫酸乙酰肝素(Heparin sulfate，HS)，肝素酶Ⅱ的选择性比较广泛，可以降解肝素和硫酸乙酰肝素。具体来说，肝素酶Ⅰ可以降解肝素糖链中最丰富的二糖重复单元结构-GlcNS6S-IdoA2S为代表的链接，而肝素酶Ⅲ可以降解以HS中含量丰富的氨基葡萄糖和未硫酸化的糖醛酸相连的键，即-GlcNAc(6S)-GlcA-之间的链接。而肝素酶Ⅱ的作用范围最广，可以降解以上两种链接，剪切反应的主要产物是二糖。依诺肝素钠的糖链中上述二糖重复单元结构-GlcNS6S-IdoA2S为主要单元，低硫酸化和未硫酸化的二糖单元较少，因此酶切应以肝素酶Ⅰ和/或肝素酶Ⅱ为主，肝素酶Ⅲ为辅。肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的酶切位点如下：

肝素酶的水解类型，即外切或者内切，在学术界一直存在争论，通常认为肝素酶Ⅰ是以外切的方式为主，而肝素酶Ⅱ则是底物依赖性的，作用于小分子底物时是外切，而增加底物分子的长度，则以内切为主。对于肝素酶Ⅲ，一般都认为其是以内切方式作用的。三种肝素酶降解底物的选择性以及水解类型，对肝素和硫酸乙酰肝素这一类多糖的结构和序列分析极为重要。

但三种肝素酶混合在一起共同作用于特定底物时，表现方式却比上述有更大的差异。在以肝素或依诺肝素钠为底物时，三种酶的作用情况不尽相同。

肝素酶Ⅰ作用更为迅速，短时间(1-2小时)内即以外切方式为主将80％以上肝素或依诺肝素切成二糖、四糖、六糖直至十二糖等的短链寡糖，而此后这些短链寡糖却很难进一步降解为二糖或四糖，表现出肝素酶Ⅰ对选择的酶切位点有一定的偏好性，易于优先切开特定位点形成小分子寡糖，而对于该小分子寡糖链中仍存在的酶切位点却不再作用或作用很弱，表现为对底物大小等的依赖性。

肝素酶Ⅱ的作用则相对缓慢的多，需要较长的时间(4-12小时)将80％以上肝素或依诺肝素切成短链寡糖，但其寡糖产物以二糖、四糖为主，肝素酶II降解肝素更为彻底。

根据上文所述，肝素酶Ⅱ是可以作用于肝素酶Ⅰ的作用位点，其完全可以替代肝素酶Ⅰ的酶切功能。在有肝素酶Ⅰ存在时，肝素酶Ⅰ往往作用最快，但其酶切特异性又不强，产物往往有很多的四糖、六糖直至十二糖等寡糖，这些寡糖在被肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ进一步酶切时的作用效果很差。而在不使用肝素酶Ⅰ，仅使用肝素酶Ⅱ、或和肝素酶Ⅲ的情况下，短时间内酶切虽不快，但产物更多的是二糖、四糖，总体使底物酶切为二糖和四糖的时间大大缩短，仅1天即可。同时，通过本发明也克服了本领域技术员认为的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ共同作用才能更好的酶解依诺肝素钠的技术偏见。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1是本实施例中的高效液相色谱示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种肝素酶组合物，所述肝素酶组合物为肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量比为3:1。本发明的肝素酶组合物可彻底特异性酶解依诺肝素钠，且酶解还原产物中1,6酐含量均能控制于15—25％内。

以下具体描述本发明中的肝素酶组合物的具体应用：

步骤(1)：依诺肝素钠的完全酶解

a、依诺肝素钠的完全酶解步骤中溶液的配制：

溶液A：10mM的磷酸二氢钾溶液，具体配置为称取136mg的磷酸二氢钾，用约40mL的超纯水溶液后，以2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入20mg的小牛白蛋白，摇匀，并以超纯水定容至100mL，过滤得到10mM的磷酸二氢钾溶液。

溶液B：100mM的醋酸钠溶液，具体配置为移取0.57mL的冰醋酸于烧杯中，加入约80mL的超纯水，加入32mg的醋酸钙，搅拌使之溶解。以2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入10mg小牛白蛋白，摇匀，并以超纯水定容至100mL，过滤得到100mM的醋酸钠溶液。

溶液C：称取90mg硼氢化钠，溶于1000μL超纯水中，涡旋混匀，0.22μm滤膜过滤。(该溶液现配现用)

肝素酶溶液：使用溶液A将肝素酶Ⅱ稀释至1.2IU/mL，肝素酶Ⅲ稀释至0.4IU/mL，分装后-20℃以下冻存。以上肝素酶购买自苏州国镝医药科技有限公司，和其它市售公司。一般由于各个厂家出产的肝素酶的浓度和数量等均有差异，所以在配置时具体需要根据肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ的包装进行调整。

依诺肝素钠标准品溶液：精密称取20mg的依诺肝素钠标准品(批号2F013A)于洁净离心管中，加入1.0mL的超纯水溶解，震荡混匀。

依诺肝素钠样品溶液1：精密称取20mg的依诺肝素钠样品1(常州千红批号56110518002)于洁净离心管中，加入1.0mL的超纯水溶解，震荡混匀。

依诺肝素钠样品溶液2：精密称取20mg的依诺肝素钠样品2(淮安麦德森批号120727)于洁净离心管中，加入1.0mL的超纯水溶解，震荡混匀。

流动相A：称取364mg的磷酸二氢钠，溶于约900mL的超纯水中，用磷酸调节pH为3.0，水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤。

流动相B：称取70g的一水合高氯酸钠，溶于约400mL的流动相A中，用磷酸调节pH为3.0，再以流动相A定容至500mL，0.22μm滤膜过滤。

b、依诺肝素钠的完全酶解：

于离心管中一次加入20μL的依诺肝素钠样品溶液(或样品溶液1、样品溶液2)、140μL的溶液B、30μL的肝素酶Ⅱ溶液和10μL的肝素酶Ⅲ溶液，涡旋混匀，室温下酶解24小时。

步骤(2)：依诺肝素钠酶解液的硼氢化钠还原

向上述步骤(1)b中的依诺肝素钠酶解液加入32μL的溶液C，涡旋混匀，室温下还原4小时；再以0.45μm滤膜过滤于内插管中。步骤(3)：酶降解、还原产物的SAX-HPLC分析

色谱条件：

流动相梯度表：

时间(min)	流动相A％	流动相B％
			0	97	3
20	65	35
			40	20	80
60	0	100
			70	97	3

系统平衡好后，依次将依诺肝素钠标准品和其它试品的酶降解还原溶液分别进样分析，使用标准品图谱来鉴别下表中列出的二糖和四糖等衍生物的峰。以还原的ΔⅠS(reducedΔⅠS，保留时间约35min)作为参照，各个峰的相对保留时间和分子量见表1：

表1：各个峰对应的保留时间及分子量表。

衍生物	相对保留值	分子量(Da)
			Unidentified	＜0.20	741
ReducedΔⅣA	0.20	401
			Unidentified	0.20-0.46	741
ReducedΔⅣS	0.46	461
			Unidentified	0.46-0.48	483
ReducedΔⅡA	0.48	503

Unidentified	0.48-0.52	503
			1,6-AnhydroΔⅡS	0.52	443
Unidentified	0.52-0.57	503
			ReducedΔⅢA	0.57	503
Unidentified	0.57-0.66	533
			ReducedΔⅡS	0.66	563
Unidentified	0.66-0.76	563
			ReducedΔⅢS	0.76	563
Unidentified	0.76-0.85	583
			ReducedΔⅠA	0.85	605
1,6-AnhydroΔⅠS	0.88	545
			Unidentified	0.88-0.97	635
ReducedΔⅡA-ⅣSglu	0.97	1066
			ReducedΔⅠS	1.00	665
ΔⅠS	1.04	665
			Unidentified	1.04-1.10	1228
ReducedΔⅡA-ⅡSglu	1.10	1168
			Unidentified	1.10-1.28	1228
1,6-AnhydroΔⅠS-ⅠS	1.28	1210
			Unidentified	＞1.28	1228

其中，1,6-AnhydroΔⅡS根据色谱柱分离度，将以两种峰(甘露糖胺和葡萄糖胺)的形式被洗脱出来，两者均被认为是1,6-anhydro-△ⅡS。

步骤(3)：数据处理

A、系统适应性：

a、峰面积比：依诺肝素钠标准品的酶解还原产物的1,6-AnhydroΔⅠS-ⅠS与1,6-AnhydroΔⅠS的峰面积比不大于1.15；标准品及试品的酶解还原产物的ΔⅠS与还原后的ΔⅠS峰面积比不大于0.02。

b、分离度：ReducedΔⅠA和1,6-AnhydroΔⅠS峰的分离度不小于1.5。

c、计算依诺肝素钠标准品中1,6-酐衍生物，的含量，结果应在标准品所标识含量的±1.5％范围内。所述1,6-酐衍生物包括4#峰1,6-anhydro_IIS(与1,6-anhydro_IIS^epi)、9#峰1,6-anhydro_IS和11#峰1,6-anhydro_IS–IS^epi。

B、结果计算：

三种主要的1,6-酐衍生物的摩尔百分含量的计算：

其中Mw：依诺肝素钠平均分子量(4500)；

Mw_x：各个衍生物x的相对分子量(见表1)；

Ax：各个衍生物x的峰面积；

A₁：1,6-AnhydroΔIs的峰面积；

A₂：1,6-AnhydroΔIIs的峰面积；

A₃：1.6-AnhydroΔIs-Is的峰面积；

C、结果判断：

在分析图谱结果满足A中系统适应性要求的情况下，按B计算三种1,6-酐衍生物的摩尔百分含量，其结果在15-25％范围内判定为合格，否则为不合格。

步骤(4)：结果

依诺肝素钠标准品、试品1和试品2的1,6-酐衍生物HPLC图谱，如说明书附图所示，分析的结果按步骤(3)数据处理进行整理，结果如下：

由此可见，本发明中的肝素酶组合物以肝素酶Ⅱ为主，不使用肝素酶Ⅰ可以彻底的分解。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物，其特征在于：所述肝素酶组合物为肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量活性比为3:1。

2.如权利要求1所述一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物，其特征在于：所述肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ为酶溶液或冻干酶粉。

3.如权利要求1所述一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物的应用，其特征在于：所述肝素酶组合物用于依诺肝素钠的特异性酶解还原制得1,6-酐衍生物。

4.如权利要求3所述一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物的应用，其特征在于：所述肝素酶组合物酶解还原制得1,6-酐衍生物包括如下步骤，

S1，完全酶解依诺肝素钠步骤，在待酶解的依诺肝素钠溶液中加入肝酶素组合物，置于室温下酶解至少24小时；

S2，还原酶解后样品步骤，在经过酶解后的样品中添加硼氢化钠溶液涡旋混合进行室温的还原，并经过滤膜的过滤；

S3，还原产物的HPLC检测，对S2中的还原产物按照以下色谱条件进行检测：

S4，分析图谱得出糖单元种类和含量；

根据色谱图的分离度，得出洗脱还原产物为1,6-酐衍生物，并按照公式计算还原产物中1,6-酐摩尔百分含量，1,6-酐摩尔百分含量为

三种主要的1,6-酐衍生物的摩尔百分含量的计算，三种所述1,6-酐衍生物分别包括4#峰1,6-anhydro_IIS与1,6-anhydro_IIS^epi、9#峰1,6-anhydro_IS和11#峰1,6-anhydro_IS–IS^epi；

其中Mw：依诺肝素钠平均分子量；Mwx：各个衍生物x的相对分子量；Ax：各个衍生物x的峰面积；A1：1,6-AnhydroΔIs的峰面积；A2：1,6-AnhydroΔIIs的峰面积；A3：1.6-AnhydroΔIs-Is的峰面积

S5，判断1,6-酐衍生物中1,6-酐含量是否合格；当1,6-酐衍生物中1,6-酐含量的摩尔百分含量结果在15—25％范围内，则判定为合格，否则即判定为不合格。