CN107271526A - 一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法 - Google Patents

一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，其包括如下步骤：a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；c)对每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；d)根据公式：计算所分离的各个成分的电泳淌度；e)结合寡糖的电荷质量比与电泳淌度之间的如下线性关系：

Description

一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法
技术领域
本发明是涉及一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，属于分析化学和药物分析技术领域。
背景技术
肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA；D-葡萄糖醛酸，GlcA)和葡萄糖胺(α-D葡萄糖胺，GlcN)所构成的二糖重复单元组成的具有不同链长的一类线性硫酸化粘多糖，具有良好的抗凝血和抗血栓的特性，用于治疗手术后所引发的静脉血栓栓塞。依诺肝素钠是由猪肠黏膜提取的肝素先经酯化得到肝素钠苄基酯衍生物，再通过碱性条件下β-消除裂解生成的低分子量肝素。由于硫酸化位点和硫酸化程度的差异，加上碱性条件的降解，使依诺肝素钠结构更为复杂。依诺肝素钠重均分子量在3800-5000之间，分子量分布范围要求：小于2000Da不超过20％；2000到8000Da之间的应大于68％；分子量超过8000Da不超过18％。
一条具备药理活性的肝素链通常含有三硫酸化二糖区，低硫酸化二糖区和一种独特的抗凝血酶结合五糖结构单元。肝素的抗凝血活性绝大部分是由该五糖序列贡献的。需要指出的是，肝素糖链中含有抗凝血酶结合五糖结构单元的糖链只有20％～50％(通常为三分之一)。含有抗凝血酶结合五糖结构单元的糖链被称为高亲和肝素。还有些糖链可能含有不止一个抗凝血酶结合五糖结构单元，因而表现出更强的抗凝血活性。在依诺肝素钠生产过程中，碱性降解过程包括两个竞争性的化学反应：β-消除和苄基酯水解。降解后得到平均分子量在4500左右的低分子肝素寡糖链(US5389618)。依诺肝素钠寡糖链中依然保留了原来肝素糖链中反映抗凝血活性的五糖结构，在依诺肝素钠中五糖结构单元约占15％～25％。
肝素类药物中抗凝血酶结合五糖结构单元较为复杂，其序列通常可以表示为AGA*IA，各个糖残基对肝素与抗凝血酶之间的亲和力是不同的。如图1所示：星号标示的糖是一种少有的3-O-硫酸化GlcN残基，它是肝素与抗凝血酶结合不可或缺的；菱形标记的三个硫酸基团对于肝素与抗凝血酶的高亲和结合也是必不可少的；椭圆形标记的硫酸基团略微重要；半月形标记的GlcA残基也是必需的；与五糖序列非还原端相连的IdoA残基(方形)虽然对抗凝血酶结合不是必需的，但是其始终会出现在肝素的抗凝血酶结合区；图中还显示了一些竞争结合抗凝血酶的天然变异体，例如：N-硫酸化取代第一个氨基糖残基的N-乙酰化和3-O-硫酸化残基的6-O-硫酸化。
除此以外，肝素类药物的五糖结构单元含量不同，导致他们具有生物不等效性，这给其应用造成很多不便。综合以上原因使得对肝素类药物的五糖结构单元的定性定量分析任务非常艰巨，到目前为止，肝素类药品都是通过生化测试的方法确定效价，这种实验方法复杂，结果重现性差，而且只能进行相对定量。U.R.Desai等(Pharmacy and PharmacologyCommol/Lunications,1(1995)349-353)发展了核磁的方法测定了肝素类药物糖链含有的平均五糖结构单元的个数，能够反映多种药物的抗FXa活性，这种方法不依赖生化测试，更加直接简捷。但是核磁共振仪成本较高，维护和操作复杂，对专业技能要求较高，难于实现大范围普及使用。因此，亟需一种可对肝素类药品中的五糖结构单元直接、简便的定性和定量分析的方法。
本申请的发明人多年来致力于依诺肝素钠精细结构的定性定量分析研究，并且申请了相关专利，例如：中国专利CN201280000857.2公开了一种基于毛细管电泳的依诺肝素钠精细结构测定方法，该专利采用混合肝素酶将依诺肝素钠完全酶解，接着通过毛细管电泳对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-环苷结构的寡糖进行分离，然后根据完全酶解后所得到的寡糖的电荷质量比与其电泳淌度之间的线性关系对分离峰所对应的酶解产物，即：构成依诺肝素结构的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-环苷结构的寡糖进行鉴定，以实现对依诺肝素钠精细结构的分析。虽然采用此方法可以对依诺肝素钠中的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-环苷结构的寡糖进行鉴定，但是该方法不能实现对其中的五糖结构单元的定性和定量测定，因此还不能真正实现对依诺肝素钠中的精细结构的完全的定性和定量分析，还不能满足依诺肝素钠的质量控制要求。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，以实现对依诺肝素钠中的精细结构的完全的定性和定量分析，以满足依诺肝素钠的质量控制要求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，包括如下步骤：
a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品按亲和活性进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；
b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及步骤a)所制备的多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；
c)对步骤b)所得到的每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；
d)根据公式：计算步骤c)所分离的各个成分的电泳淌度，其中：LT和LD分别是毛细管的总长和有效长度，V为分离电压，t为迁移时间；
e)结合寡糖的电荷质量比与电泳淌度之间的如下线性关系：对每一个完全酶解产物的毛细管电泳图中的分离峰所对应的酶解产物进行鉴定，以定性确定出五糖结构单元酶解片段的分离峰；其中：Z/M为寡糖电荷质量比，μ为对应的电泳淌度；
f)根据所确定的五糖结构单元酶解片段的分离峰的峰面积，采用面积百分数归一化方法，定量计算出五糖结构单元的含量。
作为优选方案，步骤a)中所述的抗凝血酶III的亲和色谱柱的制备，包括如下步骤：
①使过量的依诺肝素钠样品与抗凝血酶III进行孵育，以激活抗凝血酶III并占据其活性位点；
②使活性位点被保护的抗凝血酶III以共价键固定到色谱柱内的水化填料上。
所述抗凝血酶III为野生型或重组型。
作为进一步优选方案，进行孵育的缓冲溶液的pH为8.0～8.5、是由150～250mmol/L的碳酸氢钠溶液与450～550mmol/L的氯化钠溶液形成。
作为进一步优选方案，依诺肝素钠与抗凝血酶III的质量比为2.5:1～5:1。
作为进一步优选方案，所述的水化填料是由NHS或CNBr官能团化的琼脂糖。
作为进一步优选方案，1毫升水化填料中含抗凝血酶III的质量≤5毫克。
步骤a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱制备不同亲和活性组分的步骤包括：
Ⅰ)洗脱抗凝血酶III所结合的依诺肝素钠；
Ⅱ)平衡色谱柱；
Ⅲ)上样；
Ⅳ)进行梯度洗脱和色谱分离。
作为优选方案，步骤Ⅰ)采用含有1.5～4.0mol/L(以2.0～3.0mol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱。
作为优选方案，步骤Ⅱ)采用含有5～30mmol/L(以10～20mmol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液进行平衡10～20分钟。
作为优选方案，步骤Ⅲ)先采用含有5～30mmol/L(以10～20mmol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液溶解样品，配制成浓度为10～140mg/mL(以40～100mg/mL较佳)的样品溶液，然后以进样量为1～30μL(以5～20μL较佳)进行上样。
作为优选方案，步骤Ⅳ)进行梯度洗脱的条件为：
0～15分钟：A相为100％，B相为0；
15～20分钟：A相为65％～75％，B相为25％～35％；
20～35分钟：A相为0％，B相为100％；
所述的A相为含有5～30mmol/L(以10～20mmol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液，所述的B相为含有1.5～4.0mol/L(以2.0～3.0mol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液。
作为优选方案，步骤Ⅳ)进行色谱分离的条件为：
流动相为pH7.0～8.0(以7.2～7.6较佳)、浓度为5～20mmol/L(以10～15mmol/L较佳)的Tris-HCl缓冲溶液；
分离时，流动相和色谱柱均保持1～15℃(以4～10℃较佳)；
检测波长为紫外230～235nm。
作为优选方案，步骤b)中所述的混合肝素酶包括肝素酶I(EC 4.2.2.7.)，肝素酶II(无EC号)和肝素酶III(EC 4.2.2.8.)中的至少两种。
作为进一步优选方案，所述混合肝素酶是包含肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合溶液。
作为更进一步优选方案，所述混合肝素酶是由肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III按体积比为1:1:1混合得到。
作为优选方案，步骤c)进行毛细管电泳分离的分析条件为：石英毛细管总长为50～100cm，柱内径为25～75μm；缓冲溶液含有150～300mmol/L Tris-H3PO4和1～5mmol/L的MgCl2，pH为1.5～4.0，使用前需加入0.1～5.0％质量浓度、分子量范围为5000～100000的聚乙二醇；毛细管电泳时使用电压为-15～-30kV；采用压力进样，进样压力为1～5psi，进样时间为5～30s；在最后一个单硫酸化二糖(ΔIIA)出峰之后施加1～10psi的压力，将ΔIVA推向检测窗口实现检测；电泳时毛细管柱温为10～40℃，检测波长为紫外230-235nm。
作为进一步优选方案，步骤c)进行毛细管电泳分离分析的条件为：石英毛细管总长为70～100cm，柱内径为40～60μm；缓冲溶液含有200～250mmol/L Tris-H3PO4和2～4mmol/L的MgCl2，pH为2～4，使用前需加入1～3％质量浓度、分子量范围为10000～50000的聚乙二醇；毛细管电泳时使用电压为-15～-25kV；采用压力进样，进样压力为1～3psi，进样时间为10～20s；在最后一个单硫酸化二糖(ΔIIA)出峰之后施加4～6psi的压力，将ΔIVA推向检测窗口实现检测；电泳时毛细管柱温为20～30℃，检测波长为紫外230-232nm。
作为最优方案，步骤c)进行毛细管电泳分离分析的条件为：石英毛细管总长为80cm，柱内径为50μm；缓冲溶液含有200mmol/L Tris-H3PO4和2.5mmol/L的MgCl2，pH为2.5，使用前需加入1.25％质量浓度、分子量为10000的聚乙二醇；毛细管电泳时使用电压为-25kV；采用压力进样，进样压力为1psi，进样时间为10s；在最后一个单硫酸化二糖(ΔIIA)出峰之后施加5psi的压力，将ΔIVA推向检测窗口实现检测；电泳时毛细管的柱温为25℃，检测波长为紫外232nm。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明通过采用亲和色谱分离与毛细管电泳分离分析相结合的技术，不仅首次实现了对依诺肝素钠五糖结构单元的定性定量分析，而且同时实现了对依诺肝素钠中的二糖、三糖、四糖和1,6-环苷寡糖结构的更准确分析，真正实现了对依诺肝素钠中的精细结构的完全的定性和定量分析，为依诺肝素钠的质量控制提供了一种科学便捷的分析手段，具有显著的工业应用价值。
附图说明
图1为背景技术中肝素抗凝血酶结合五糖序列：AGA*IA：A为GlcNAc6SO3或GlcNSO36SO3；A*为GlcNSO36SO3；G为GlcA；I为IdoA2SO3；
图2为本发明中的依诺肝素钠亲和富集色谱图；
图3为本发明依诺肝素钠和不同亲和组分完全酶解产物的毛细管电泳分离分析谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。
实施例
一、样品溶液的配制
(1)孵育缓冲溶液的配制：分别称取840.07mg碳酸氢钠，1.461g氯化钠溶解于40mL水中，用1M盐酸溶液调至pH 8.3后，将溶液转至50mL容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤。
(2)结合缓冲溶液的配制：分别称取302.85mg三(羟甲基)氨基甲烷，2.1915g氯化钠溶解于230mL水中，用1M盐酸溶液调至pH 7.4后，将溶液转至250mL容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤。
(3)洗脱缓冲溶液的配制：分别称取302.85mg三(羟甲基)氨基甲烷，29.22g氯化钠溶解于230mL水中，用1M盐酸溶液调至pH 7.4后，将溶液转至250mL容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤。
(4)缓冲溶液A：量取乙醇胺1.512mL，称取1.461g氯化钠溶解于40mL水中，用1M盐酸溶液调至pH 8.3后，将溶液转至50mL容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤。
(5)缓冲溶液B：分别称取410.20mg乙酸钠，1.461g氯化钠溶解于40mL水中，用1M盐酸溶液调至pH 4.0后，将溶液转至50mL容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤。
(6)pH 7.0的醋酸钠/醋酸钙溶液的配制：分别称取10mg牛血清白蛋白，32mg醋酸钙溶解于60mL水中，加入580μL冰醋酸，用2M的NaOH溶液调至pH 7.0后，将溶液转至100mL容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤。
(7)磷酸钾pH 7.0缓冲液的配制：68mg磷酸二氢钾和10mg牛血清白蛋白溶于30毫升水中。用氢氧化钾将溶液调至pH7.0，然后将溶液移至50毫升容量瓶中，加水定容。
(8)依诺肝素酶溶液的配制：三种肝素酶分别用磷酸钾pH 7.0缓冲液溶解，得到的酶溶液浓度的为0.4IU/mL；溶液放置-20oC保存待用。
(9)肝素酶I，II，III混合酶溶液的配制：将上述方法配置的肝素酶溶液按体积比为1:1:1的比例混合。
(10)亲和色谱分析依诺肝素钠样品溶液的配制：称取肝素钠样品80mg，用1mL流动相A相溶解，配制成80mg/mL的溶液。
(11)酶解反应依诺肝素钠样品溶液的配制：称取肝素钠样品20mg，用1mL水溶解，配制成20mg/mL的溶液。
(12)依诺肝素钠样品完全酶解反应：分别量取20μL依诺肝素钠样品溶液，70μL的醋酸钠－醋酸钙溶液(pH 7.0)，和100μL肝素酶(I,II,III)混合溶液，缓慢地混合均匀，置于25℃的水浴中反应48h；待酶解完全后，进样分析。
二、抗凝血酶III亲和色谱柱的制备
1)将5mg抗凝血酶III和20mg依诺肝素钠溶于孵育缓冲溶液中，4℃孵育15min，以激活抗凝血酶III并保护亲和位点，避免在固定过程中活性位点的反应；
2)将激活后的抗凝血酶III溶液加入到NHS活化(NHS活化基团可以高速率高产率的与含有氨基的抗体或酶反应从而得到固定抗体或酶的色谱柱)的HiTrap NHS-activated HP预装柱(该预装柱事先用1mmol/L HCl，4℃下进行清洗，以除去活化住中的储存溶液异丙醇，使其处于最佳反应条件下)中，4℃反应4h，待所有加入的抗凝血酶III被固定上后，依次使用缓冲溶液A、缓冲溶液B、缓冲溶液A冲柱，4℃静置4h后再依次使用缓冲溶液B、缓冲溶液A、缓冲溶液B冲柱洗去活化未偶联的NHS基团，并洗去非特异性吸附的蛋白，制得所述抗凝血酶III亲和色谱柱。
制得的抗凝血酶III亲和色谱柱使用洗脱缓冲溶液洗脱起保护作用的依诺肝素钠，暴露出柱上抗凝血酶III的亲和位点，即可用于不同亲和活性依诺肝素钠的富集。
三、不同抗凝血酶III亲和活性依诺肝素钠的分离制备
将三根1mL制备好的抗凝血酶III亲和柱串联使用。
首次使用前，需先运行一针空白以验证亲和色谱柱中起保护作用的依诺肝素钠已被彻底洗脱从而排除干扰。
进样之前需首先使用结合缓冲液平衡色谱柱10～20min。
色谱梯度洗脱条件为：0～15min为A相100％，15～20min为A相65％～75％，20～35min为A相为0％，其中A相为上述结合缓冲液，B相为上述洗脱缓冲液；依诺肝素钠样品浓度为80mg/mL，进样量为10μL；色谱分离时，流动相和色谱柱均保持4～10℃(以保持抗凝血酶III的活性)；检测波长为紫外232nm；通过亲和色谱分离制备，得到依诺肝素钠的低亲和组分、中等亲和组分和高亲和组分三个不同亲和活性的组分(如图2所示)。
为避免浓缩后的三个组分中的高浓度盐影响后续酶解过程，因此，先对分离出的三个组分分别通过旋转蒸发仪预浓缩，然后分别通过体积排阻色谱彻底脱盐后再浓缩备用。
四、毛细管电泳条件及五糖结构单元酶解片段的确定
所用毛细管电泳仪为贝克曼毛细管电泳仪(PACE MDQ CE)。
石英毛细管柱内径50μm，外径370μm，总长81.7cm，有效长度71.5cm；缓冲溶液含200mmol/L Tris-H3PO4和2mmol/L MgCl2，pH为2.5，使用前加入1.25％质量浓度(m/v)聚乙二醇(分子量为10000)；进样压力1psi，时间10s；分离电压-25kV；在单硫酸化寡糖ΔIIA出峰之后(约33min)施加5psi压力，将ΔIVA推向检测窗口从而得到检测；柱温25℃；检测波长紫外232nm。
因由现有技术可知：依诺肝素钠经完全酶解后的产物中，存在以下4种1，6-环苷结构的寡糖：
存在以下结构的三糖(Trisaccharide)：
存在如下结构的8个二糖：
及ΔIISgal和ΔIVSgal，它们是由IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和IdoA(2S)-GlcNS-的2-O-去硫酸化生成2种半乳糖醛酸形式：
还存在以下三种结构的四糖：ΔIIA-IISglu、ΔIIA-IVSglu(S.Yamada,et al.,J.Biol.Chem.；270(7),4780-4787(1993))、ΔIIS-IISglu表示：
上述这些四糖链为能够抵抗酶的降解作用，并能反映抗凝血酶III亲和力的序列片段，其中第三种四糖ΔIIS-IISglu为本发明新鉴定的四糖。
上述的二糖、三糖、四糖和1,6-环苷寡糖结构鉴定亦可参见美国药典(SecondSupplement，USP-NF，Chemical Tests/<207>1,6-Anhydro Derivative for Enoxaparin Sodium)。
另外，由于电泳淌度是物质的物理化学常数，在特定温度下和固定pH值的缓冲溶液中，特定的物质具备固定的电泳淌度，因此可以作为带电物质(或离子)的定性的依据。
根据电泳淌度的计算公式1，由实验条件可以计算出各个成分的电泳淌度。
公式中LT和LD分别是毛细管的总长和有效长度，V为分离电压，t为迁移时间。
公式2为电泳淌度与物质的电荷/质量比呈线性关系方程。
公式中Z为离子的有效电荷，η为溶液的粘度，r为离子半径。
依诺肝素钠18个完全酶解产物的结构如前所述。
本发明直接使用依诺肝素钠完全酶解产物中的7个带有SO3 2-的二糖(ΔIVA，ΔIS，ΔIIIS，ΔIIS，ΔIA，ΔIIA，ΔIIIA)的电泳淌度(μ)对其电荷质量比Z/M作图，线性回归分析可以得到描述电泳淌度μ和电荷质量比Z/M之间关系的线性方程，根据线性方程推算其它寡糖的电泳淌度并作为定性依据。
通过改进，本发明根据酶解产物中的寡糖的电荷质量比Z/M与其电泳淌度μ之间如下的线性关系对酶解产物中各个寡糖进行定性鉴定：
方程中Z/M为寡糖电荷质量比；μ为对应的电泳淌度。
根据完全酶解产物中各个寡糖的电荷质量比，由方程3可以计算出相应的电泳淌度(理论值)列于表1中。此外，表1还给出了依诺肝素钠完全酶解产物中寡糖的其它物理化学常数，包括分子量、每个糖单元所带的SO3 2-数、电荷质量比和实测的电泳淌度。
表1.依诺肝素钠完全酶解产物中寡糖的物理化学常数
需要特别指出的是，在分离条件pH2.5时所有的磺酸钠都是解离的，因此，本发明中计算电荷质量比时使用寡糖的磺酸根离子的分子量，且电荷数为寡糖的总电荷数，这样得到的结果更加准确。通过不同寡糖的理论值和实测值的对比也可以验证这一点。
因此，根据依诺肝素钠及其三个不同亲和组分的完全酶解产物的电泳图(见图3所示)，我们可以先确定图3中除了峰18以外的其它17个峰，即：峰1-9依次为ΔIS、ΔIIIS、ΔIIS、ΔIA、ΔIVS、ΔIIIA、ΔIIA、ΔIVA、ΔIISgal、ΔIVSgal；峰11-17依次为ΔIIA-IISglu、ΔIIA-IVSglu、Trisaccharide、1,6-AnhydroΔIS-IS、1,6-Anhydro ΔIS、1,6-Anhydro ΔIIS和1,6-Anhydro ΔIIS epi。
由于五糖结构单元的酶解产物在依诺肝素钠低亲和组分中几乎没有，中等亲和组分中含有少许，而在高亲和组分中含量最多，进一步通过对比三个不同亲和组分完全酶解产物的电泳图，并结合寡糖的电泳淌度，可以确定依诺肝素钠的五糖结构单元酶解片段的分离峰为四糖ΔIIA-IISglu、ΔIIA-IVSglu和ΔIIS-IISglu，分别对应峰11、12和18，分别简称四糖11、12和18，其中峰18是之前工作中未能鉴定的四糖，从而完成了对依诺肝素钠中的五糖结构单元酶解片段的分离峰的定性分析。
五、实际样品中五糖结构定量分析
因电泳图中各组分的峰面积与寡糖的摩尔浓度成正比，因此本发明根据各组分的峰面积，采用面积百分数归一化方法，对三个四糖实现定量测定，ΔIIA-IISglu、ΔIIA-IVSglu和ΔIIS-IISglu总的质量百分含量即五糖结构单元的质量百分含量公式如下所示：
式中MW11、MW12和MW18分别代表四糖11、12和18的分子量，Area11、Area12和Area18分别代表四糖11、12和18在电泳图中的峰面积，MWx，Areax分别代表完全酶解产物中各个寡糖成分的分子量和在电泳谱图上相应的峰面积；
依诺肝素钠样品中五糖结构单元的摩尔百分数(Pentasaccharide％)可以由如下公式计算：
式中MW代表依诺肝素钠的重均分子量。
因而，根据图3和上述公示，可计算得到依诺肝素钠中五糖结构单元的摩尔百分含量(已知依诺肝素钠重均分子量为4500)，完成对依诺肝素钠中五糖结构单元的定量分析。
按照上述方法，我们对赛诺菲两批样品(Clexane 1和Clexane 2)、欧洲药典依诺肝素钠标准品(EP CRS)、美国药典标准品(USP CRS)和杭州九源两批样品(W20140101和W20140604)分别进行了测定分析，通过计算得到六个依诺肝素钠样品中五糖结构单元的摩尔百分含量，详见表2所示。
表2实际样品中五糖结构单元的摩尔百分含量
样品 五糖含量％
Clexane 1 25.85±2.0％
Clexane 2 26.76±1.2％
EP CRS 26.92±2.2％
USR CRS 27.26±2.4％
W20140101 28.35±1.7％
W20140604 29.95±1.8％
由表2的分析结果表明：采用本发明的方法能实现对依诺肝素钠样品中的五糖结构单元的定性和定量分析，具有可行性，可做为依诺肝素钠的质量控制分析的方法。

Claims (16)

1.一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品按亲和活性进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；
b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及步骤a)所制备的多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；
c)对步骤b)所得到的每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；
d)根据公式：计算步骤c)所分离的各个成分的电泳淌度，其中：LT和LD分别是毛细管的总长和有效长度，V为分离电压，t为迁移时间；
e)结合寡糖的电荷质量比与电泳淌度之间的如下线性关系：对每一个完全酶解产物的毛细管电泳图中的分离峰所对应的酶解产物进行鉴定，以定性确定出五糖结构单元酶解片段的分离峰；其中：Z/M为寡糖电荷质量比，μ为对应的电泳淌度；
f)根据所确定的五糖结构单元酶解片段的分离峰的峰面积，采用面积百分数归一化方法，定量计算出五糖结构单元的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述的抗凝血酶III的亲和色谱柱的制备包括如下步骤：
①使过量的依诺肝素钠样品与抗凝血酶III进行孵育，以激活抗凝血酶III并占据其活性位点；
②使活性位点被保护的抗凝血酶III以共价键固定到色谱柱内的水化填料上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：依诺肝素钠与抗凝血酶III的质量比为2.5:1～5:1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行孵育的缓冲溶液的pH为8.0～8.5、是由150～250mmol/L的碳酸氢钠溶液与450～550mmol/L的氯化钠溶液形成。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：1毫升水化填料中含抗凝血酶III的质量≤5毫克。
6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于：所述的水化填料是由NHS或CNBr官能团化的琼脂糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱制备不同亲和活性组分的步骤包括：
Ⅰ)洗脱抗凝血酶III所结合的依诺肝素钠；
Ⅱ)平衡色谱柱；
Ⅲ)上样；
Ⅳ)进行梯度洗脱和色谱分离。
8.根据权利要求1或2或3或5或7所述的方法，其特征在于：所述抗凝血酶III为野生型或重组型。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤Ⅰ)采用含有1.5～4.0mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤Ⅱ)采用含有5～30mmol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液进行平衡10～20分钟。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤Ⅲ)先采用含有5～30mmol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液溶解样品，配制成浓度为10～140mg/mL的样品溶液，然后以进样量为1～30μL进行上样。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤Ⅳ)进行梯度洗脱的条件为：
0～15分钟：A相为100％，B相为0；
15～20分钟：A相为65％～75％，B相为25％～35％；
20～35分钟：A相为0％，B相为100％；
所述的A相为含有5～30mmol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液，所述的B相为含有1.5～4.0mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤Ⅳ)进行色谱分离的条件为：
流动相为pH7.0～8.0、浓度为5～20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液；
分离时，流动相和色谱柱均保持1～15℃；
检测波长为紫外230～235nm。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b)中所述的混合肝素酶包括肝素酶I，肝素酶II和肝素酶III中的至少两种。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述混合肝素酶是包含肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合溶液。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)进行毛细管电泳分离的分析条件为：石英毛细管总长为50～100cm，柱内径为25～75μm；缓冲溶液含有150～300mmol/LTris-H3PO4和1～5mmol/L的MgCl2，pH为1.5～4.0，使用前需加入0.1～5.0％质量浓度、分子量范围为5000～100000的聚乙二醇；毛细管电泳时使用电压为-15～-30kV；采用压力进样，进样压力为1～5psi，进样时间为5～30s；在最后一个单硫酸化二糖出峰之后施加1～10psi的压力；电泳时毛细管柱温为10～40℃，检测波长为紫外230-235nm。
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