BRPI0606619B1 - método de análise de oligossacarídeos, a partir do plasma sangüíneo - Google Patents

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Abstract

método de análise de oligossacarídeos, a partir do plasma sangüíneo. a presente invenção refere-se a um método de análise dos oligossacarídeos, que constituem as heparinas de baixo peso molecular e as heparinas de peso molecular muito baixo, a partir do plasma sanguíneo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE ANÁLISE DE OLIGOSSACARÍDEOS, A PARTIR DO PLASMA SANGÜÍ-NEO'\ A presente invenção refere-se a um método de análise dos olí-gossacarídeos que constituem as heparinas de baixo peso molecular e as heparinas de muito baixo peso molecular, a partir do plasma sangüíneo.
As heparinas são agentes biologicamente ativos da família dos glicosaminoglicanos, e que têm propriedades anticoagulantes particularmente úteis. As heparinas de baixo peso molecular (HBPM) e as heparinas de muito baixo peso molecular (HTBPM) são preparadas por corte das cadeias polissacarídicas longas de heparina em cadeias mais curtas de baixo peso molecular.
Os oligossacarídeos que constituem as HBPM e as HTBPM são habitualmente caracterizados pelos parâmetros macroscópicos, tais como sua massa molecular média ou atividades biológicas como, por exemplo, a atividade aXa (Ul/mg). Esta, que mede a interação com a antitrombina III, é a mais comumente utilizada.
Todavia, a medida desses parâmetros macroscópicos ou dessas atividades biológicas não permite responder a várias questões cruciais. Em particular, é impossível fazer a análise dos perfis farmacocinéticos dos diferentes oligossacarídeos que constituem as HBPM e as HTBPM, baseando-se nesses critérios. Por exemplo, a atividade aXa só considera as espécies afins da AT III, isto é, aproximadamente 20% da mistura somente; por conseguinte, o comportamento de 80% dos oligossacarídeos não pode ser medido. Além disso, a contribuição de cada espécie, que constitui a mistura afim, não pode ser determinada.
Portanto, é impossível determinar precisamente a concentração plasmática de cada oligossacarídeo e, com mais razão ainda, seu perfil far-macocinético, por simples medida de sua atividade aXa. Ora, esses perfis forneceriam informações muito preciosas para melhorar a posologia dos medicamentos à base de HBPM e de HTBPM.
Para poder analisar o comportamento dos diferentes oligossaca- rídeos que constituem uma HBPM ou uma HTBPM no plasma sanguíneo, é preciso poder separar completamenta e reprodutivelmente esses oligossaca-rídeos dos outros constituintes do plasma, as proteínas em particular. Os métodos descritos na técnica anterior recorrem a tratamentos proteásicos sustentados (Volpi et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta., 1243 (1): 49-58).
Os.métodos de cromatografia ou eletroforese permitem a análise dos diferentes constituintes da HBPM. Por exemplo, a eletroforese capilar (EC) é utilizada para a separação dos oligossacarídeos de heparina (Guerri-ni et al., Glyoobiology, 2002,12; 713-719; Linhardt et al.. BioMethods, 1997, 9; 183-197). Todavia, a seletividade da EC é antes de tudo fraca em relação à cromatografia líquida. Também é possível, em certos casos, utilizar a es-pectrofotometria de massa MALDI-TOF para a análise dos oligossacarídeos heparínicos, mas ela não pode ser aplicada às misturas complexas, sem mesmo mencionar seu preço elevado.
Dessa forma, a análise dos oligossacarídeos sulfatados, como aqueles que constituem as HBPM e as HTBPM é feita sobretudo por cromatografia líquida de elevado desempenho (CLHP). Foi recentemente descrito um método de análise das HBPM, consistindo em uma despolimerização enzimática seguida de uma redução, se for o caso, e de uma dosagem por CLHP (WO 2004/027087). Um pedido europeu recente (EP04290789.9) divulga um método de dosagem dos oligossacarídeos que constituem as HBPM è as HTBPM por cromatografia de troca de ânions CTA-SAX. Esse método recorre a uma cromatografia trocadora de ânions conduzida sobre um sal de amônio quaternário, em particular o cetil metil amônio, adsorvldo dinamicamente sobre uma coluna de sílica de fase inversa e que mantém uma carga positiva nftida e constante em uma faixa de pH compreendida entre 2 e 12. Esse método pode implicar um tratamento prévio, despolimeri-zaçâo ou separação por cromatografia de exclusão, antes da análise das HBPM e das HTBPM por CLHP sobre coluna CTA-SAX. A presente invenção tem por objetivo um método de análise dos oligossacarídeos a partir do plasma sangüineo, caracterizado pelo fato de ser feito nas seguintes duas etapas: - um tratamento da amostra de plasma sanguíneo, - uma dosagem por CLHP.
Esse método não implica nem a despolimerização enzimática, nem o fracionamento por cromatografia de exclusão dos oligossacarídeos presentes na amostra de plasma sanguíneo antes da dosagem por CLHP. Ao contrário, segundo esse método, a amostra de plasma sanguíneo é tratada por filtragem, de forma a separar os oligossacarídeos, que são encontrados no filtrado, contaminadores plasmáticos, em particular proteínas, que permanecem no concentrado. A invenção tem, portanto, mais particularmente por objetivo um método tal como definido mais acima, no qual a amostra de plasma sanguíneo é tratada por filtragem. A invenção tem particularmente por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de as moléculas, cujo peso molecular é superior a 30 kDa, serem retidas no concentrado. Para permitir uma quantificação do método de tratamento da amostra de plasma sangüíneo e verificar a reprodutibilidade desse tratamento de uma amostra à outra, acrescenta-se, se for o caso, uma aferição interna na amostra. Essa aferição deve ser um oligossacarídeo, se possível próximo estruturalmente do produto dosado, que é misturado ao plasma exatamente antes da filtragem. A invenção tem, portanto, também por objetivo um método, tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de um oligossacarídeo prova ser acrescentado à amostra de plasma exatamente antes da filtragem.
Embora a maior parte dos oligossacarídeos seja separada das proteínas pela filtragem, é possível que uma parte permaneça presa por interações eletrostáticas com o concentrado. Nesse caso, é necessário fazer uma ou várias lavagens do concentrado em uma solução salina. A invenção tem, portanto, também por objetivo um método tal como definido mais acima e caracterizado pelo fato de o concentrado ser lavado pelo menos uma vez em uma solução salina. De acordo com a invenção, a solução salina é, de preferência, uma solução de cloreto de potássio. A invenção tem mais particularmente por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de a concentração da solução salina, após adição ao concentrado, ser superior ou igual a 1M, e particularmente esse método no qual a concentração salina é superior ou igual a 2M.
Após uma ou várias lavagens com uma solução salina, o concentrado é lavado com água, se for o caso. A invenção tem, portanto, por objetivo um método tal como definido mais acima que compreende, após uma lavagem pelo menos do concentrado em uma solução salina, uma etapa de lavagem com água. O filtrado original é reunido com os filtrados provenientes das lavagens e o conjunto é diluído 5 vezes na água. Essa diluição permite reconcentrar de novo a totalidade dos oligossacarídeos, após a injeção sobre a coluna cromatográfica, evitando qualquer alargamento dos picos causado por uma concentração salina muito elevada. Exatamente antes da injeção, o pH da solução é ajustado em 3 por adição de MC11N.
Segundo o método, de acordo com a invenção, a totalidade do filtrado e, se for o caso, das lavagens é injetada diretamente e analisada por CLHP. A CLHP trocadora de ânions é o método separador o mais adaptado a essa mistura complexa. Em particular, utiliza-se para a CLHP uma coluna de troca de ânions com enxerto de amônio quaternário por ligação covalente. Esse tipo de coluna oferece a vantagem de poder utilizar como fase móvel o pèrclorato, o que é impossível com uma coluna. CTA-SAX, por causa da forte complexação entre perclorato e CTA. A invenção tem, portanto, também por objetivo um método tal como definido mais acima, no qual os oligossacarídeos são dosados por CLHP trocadora de ânions. Ela tem mais particutarmente por objetivo um método tal como definido mais acima no qual os oligossacarídeos são dosados por CLHP sobre coluna de troca de ânions com enxerto do amônio quaternário por ligação covalente.
As colunas de tipo lonPAc AS11 (Dionex), de granulometria 9-13 μιη e de comprimento de 25 cm, podem ser utilizadas. Todos os diâmetros de colunas clássicas, compreendidos entre 1 mm e 4,6 mm são utilizáveis, mas são utilizados, de preferência, colunas de diâmetro de 2 mm. Em um âmbito mais geral, as colunas de diâmetro menor, por exemplo 1 mm, podem ser utilizadas, necessitando de fato de uma quantidade de plasma menor, e permitindo também um ganho em sensibilidade da análise. A aparelhagem pode ser um cromatógrafo, permitindo a formação de gradiente de purificação com um detector UV. Será utilizado, de preferência, um detector munido de uma barra de diodos, que permite realizar espectros UV dos constituintes e registrar sinais complexos, resultantes da diferença entre as absorbâncias com dois comprimentos de onda diferentes e permitindo a detecção dos oligossacarideos acetilados dentre os compostos de origem plasmática. A utilização de uma fase móvel transparente até 200 nm permite facilitar a diferenciação dos constituintes. A fase móvel utilizada no caso, será, de preferência, uma solução de perclorato de sódio, mas os sais de metano sulfonato ou fosfato podem também ser utilizados. A invenção tem, portanto, por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de utilizar uma fase móvel transparente até 200 nm. Em particular, a invenção tem por objetivo um método, tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de a fase móvel ser uma solução de perclorato de sódio, de metano-sulfonato ou de fosfato. A invenção tem, particularmente, por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de a fase móvel ser uma solução de perclorato de sódio. O pH preconizado para a separação está compreendido entre 2 e 6,5. Preferencialmente, será utilizado um pH próximo de 3. Esse pH será obtido por adição de um sal, tal como o fosfato que possui um poder tampão com pH = 3 melhor do que aquele dos percloratos. A titulo de exemplo, serão dadas a seguir condições padrão de separação cromatográfica: - solvente A: NaH2P04 2,5 mM levado ao pH 2,9 por adição de H3PO4 - solvente B: NaCICXi 1N - NaH2P04 2,5 mM levado ao pH 3,0 por adição H3PO4. O gradiente de purificação pode ser 0 seguinte: T = 0 min : %B = 3; T = 40 min: %B = 60; T = 60 min: %B = 80 Para uma coluna de 2 mm de diâmetro, a vazão escolhida será, por exemplo, de 0,22 ml/min e a temperatura da coluna de 40°C.
Os oligossacarídeos presentes nas amostras de plasma filtrado são detectados por UV. Como os poli-sacarídeos não acetilados têm todos, i com um pH determinado, um espectro UV quase idêntico, é possível detectar seletivamente os açúcares acetilados, tomando-se como sinal a diferença entre as absorbâncias com dois comprimentos de onda escolhidos, de tal forma que a absortividade dos sacarídeos não acetilados se anula.
No caso abaixo serão escolhidos 202 nm e 230 nm como com-i primentos de onda de referência e anotar-se-á o sinal 202 - 230 nm. É evidente que, para o técnico, a escolha do comprimento de onda será dependente do pH da fase móvel, ajustes de alguns nm podendo ser necessários para estar no ótimo dessas condições. O detector o mais adaptado a essa técnica é o detector DAD da sociedade Agilent Technologies. Nesse caso, realiza-se uma dupla detecção sobre cada amostra, com 234 nm por um lado e, por outro, com 202 - 230 nm. Pode-se, também, realizar uma tripla detecção, medindo, a mais, a absorbância de cada amostra com 280 nm, o que permite verificar que o sinal não está contaminado por resíduos protéicos. A presente invenção tem, portanto, por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de o método de detecção permitir seletivamente detectar os açúcares acetilados. A presente invenção tem também por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de o método de detecção seletiva dos açúcares acetilados ser feito, tomando-se como sinal a diferença entre a absorbância com dois comprimentos de ondas escolhidos de tal forma que a absortividade dos sacarídeos não acetilados se anule. A presente invenção tem, portanto, particularmente por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de o método de detecção seletiva dos açúcares acetilados ser feita, medindo-se a absorbância com 202 - 230 nm e 234 nm. A presente invenção tem, portanto, particularmente por objetivo um método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de o méto- do de detecção seletiva dos açúcares acetilados ser feita, medindo-se a ab-sorbância com 202 - 230 nm, 234 nm e 280 nm. O método definido mais acima permite mais particularmente a-nalisar todos os oligossacarídeos β-insaturados. Mais particularmente, ela se aplica aos oligossacarídeos que constituem a enoxaparina, a octaparina, a bemiparina e a tinzaparina.
Exemplo experimental Modo operacional Tratamento do plasma.
Uma amostra do plasma volume compreendido entre 100 e 1000 μ| é retirada e, se for o caso, a aferição interna é acrescentada a esta. Após homogeneização, a solução resultante é introduzida em um cartucho de ultra-filtragem UltrafreeOõ de 30KD (Millipore) previamente enxaguada por 250 μΙ de água por centrifugação durante 5 minutos a 10000 rpm. O plasma é introduzido na parte superior do cartucho em uma ou duas vezes, caso as quantidades a serem filtradas sejam superiores a 500 μΙ. O cartucho é centrifugado a 10000 rpm entre uma e duas horas, depois o filtrado é retirado. Se for o caso, a segunda parte do plasma a filtrar é introduzida na parte superior do cartucho e este é centrifugado de novo. A quantidade exata de plasma introduzida terá sido pesada. O cartucho é centrifugado até que o resíduo protéico na parte superior do cartucho represente apenas 10% da parte inicial. O filtrado é retirado e acrescenta-se ao concentrado 210 μΙ de KCI3M por ml de plasma filtrado.
Após homogeneização, o cartucho é centrifugado a 10000 rpm entre 1 e 4 horas. O cartucho é centrifugado até que o resíduo protéico na parte superior do cartucho represente apenas 10% da parte inicial. O segundo filtrado é retirado e acrescenta-se uma segunda vez ao concentrado 210 μΙ de KCI 3M por ml de plasma filtrado. Após homogeneização, o cartucho é centrifugado a 10000 rpm entre 1 e 4 horas. O cartucho é centrifugado até que o resíduo protéico na parte superior do cartucho represente apenas aproximadamente 10% da parte inicial. O terceiro filtrado é retirado e são acrescentados 250 μΙ de água por ml de plasma filtrado.
Após homogeneização, o cartucho é centrifugado a 10000 rpm entre 1 e 4 horas. O cartucho é centrifugado até que o resíduo protéico na parte superior do cartucho represente apenas 10% da parte inicial.
Os filtrados são reunidos, diluídos 5 vezes na água e a totalidade é injetada diretamente em CLHP de troca de ânions. Exatamente antes da injeção, o pH da solução injetada é ajustado em 3 por adição de HCI1N. Método CLHP O plasma filtrado é analisado por CLHP de troca de íons. As colunas utilizadas são colunas lonPAc A$11 (Dionex), de comprimento de 25 cm e de diâmetro interno de 2 mm. O detector utilizado é um espectrofotó-metro UV munido de uma barra de diodos. A totalidade do pH é injetada após ajuste do pH em 3 por adição de HCI N. A vazão escolhida é de 0,22 ml/min; a temperatura da coluna é de 40°C. A purificação é realizada em modo gradiente. As duas soluções utilizadas são: solvente A: NaH2PC>4 2,5 mM, levado ao pH 2,9 por adição de H3PO4. solvente B: NaCI04 1N, NaH2P04 2,5 mM, levado ao pH 3,0 por adição de H3PO4. O gradiente de purificação é 0 seguinte: T = 0 min; % B .= 3; T = 40 min: % B = 60; T - 60 min: % B - 80.
Exemplo 1 Segue a transformação de uma mistura de três octassacarideos no sangue de cães machos beagle. Esses três octassacarideos, simbolizados Allallslsls, Alsllallsls e óllallslsls1,6'anldro são os principais octassacarideos afins das frações octassacarideos do Lovenox®. Eles possuem uma forte afinidade com 0 ATIII e, por conseguinte, uma atividade antitrombótica. A mistura é administrada por via subcutânea em três cães machos Beagle, a uma dose alvo sobre cada um desses três constituintes de 0,5 mg/kg. A solução de administração é uma solução com 0,9% de NaCI da mistura dos três octassacarídeos à concentração alvo de 0,5 mg/ml.
As retiradas sangüineas de 5 ml são realizadas nos tempos 0; 25 minutos; 30 minutos; 1 hora; 2 horas; 4 horas; 6 horas; 8 horas; 24 horas; 30 horas e 48 horas após a administração. As retiradas sangüineas são coletadas em tubos contendo 400 μΙ de uma mistura CTAD (citrato, teofilina, adenosina, dipiradamol). Após homogeneização, a solução é centrifugada a 3000 g durante 15 minutos a 15°C. O que flutua plasmático é recuperado e conservado a -20°C até o uso.
Para o tratamento do plasma antes da injeção CLHP, aproximadamente 1 ml de plasma é retirado e pesado, ao qual são adicionados 50 μΙ de uma solução da aferição interna a uma concentração de aproximadamente 0,02 g/l.
Escolhe-se a aferição interna, de forma que seja estruturalmente a mais próxima possível dos produtos a analisar. Sua estrutura é dada abaixo. 0 tetrassacarídeo utilizado permite corrigir a influência potencial das variações do rendimento de extração. O plasma é tratado e analisado por CLHP.
Os resultados obtidos foram representados na tabela 1. Os cro-matogramas correspondentes estão representados na Figura 1.
Tabela 1: sequência da concentração plasmática (μΜ) dos 3 octassacarí-deos em função do tempo, após administração.
Exemplo 2 Uma HTBPM de massa molecular média 2500 Da é administrada na dose alvo de 1,4 mg/kg em voluntários humanos. Coletas sanguíneas são feitas nos tempos: 0; 25 minutos; 30 minutos; 75 minutos; 1 h; 1h 25; 1 h 30; 2 horas; 2 h 30; 3 horas; 3 h 30; 4 horas; 4 h 30; 5 horas; 6 horas; 7 horas; 8 horas; 9 horas; 10 horas; 12 horas; 14 horas e 24 horas após a administração. A HTBPM utilizada sendo uma mistura complexa de oligossaca-rídeos, o estudo foi limitado a certos elementos escolhidos dessa mistura.
Por outro lado, como não foi encontrada aferição interna que não interferisse a nível cromatográfico em um dos constituintes da mistura, a dosagem foi feita, tomando-se como coeficiente de resposta molar aquele obtido no exemplo 1 sobre os octassacarídeos afins.
Os resultados colocam em evidência uma diferença muito grande de comportamento dentre os oligossacarídeos que constituem a heparina de baixo peso molecular estudada. Os oligossacarídeos que têm uma atividade Axa têm uma cinética de eliminação muito mais lenta do que os outros oligossacarídeos sulfatados o que é irrevelável a partir de uma seqúência de atividade Axa.
Os resultados obtidos foram representados na tabela 2. Os cro-matogramas correspondentes foram representados na Figura 2.
Tabela 2: seqüência da concentração plasmática (μΜ) dos principais oligos-sacarídeos em função do tempo, após administração.
Figurai: acompanhamento cromatográfico da farmacocinética de 3 octassacarídeos para o cão 1.
Figura 2: acompanhamento cromatográfico dos principais oligossacarf-deos que constituem uma heparina de peso molecular muito baixo, em função do tempo, após administração.
REIVINDICAÇÕES

Claims (18)

1. Método de análise de oligossacarídeos a partir de plasma sangüíneo, caracterizado pelo fato de ser feito nas seguintes duas etapas: a. um tratamento da amostra por filtragem, depois, b. uma dosagem por Cromatografia Líquida Elevado Desempenho (CLHP), em que as moléculas, cujo peso molecular é superior a 30 kDa, são retidas no concentrado; em que um oligossacarídeo prova é acrescentado ao plasma antes da filtragem, e em que o referido método comporta um método de detecção que permite detectar seletivamente os açúcares aceti-lados que é feito tomando-se como sinal a diferença entre absorbância com dois comprimentos de onda escolhidos de tal forma que a absortividade dos sacarídeos não acetilados se anule.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o concentrado ser lavado pelo menos uma vez em uma solução salina.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a solução salina ser uma solução de cloreto de potássio.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de a concentração da solução salina, após a adição do concentrado ser superior ou igual a 1M.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de a concentração da solução salina, após a adição do concentrado ser igual ou superior a 2M.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o concentrado ser lavado pelo menos uma vez em uma solução salina, depois lavado com água.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de a totalidade do filtrado e, se for o caso, das lavagens ser injetada e analisada por CLHP.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o método cromatográfico ser uma cromatografia por troca de ânion.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o método cromatográfico ser uma cromatografia por troca de ânion sobre coluna de troca de ânions com enxerto do amônio quaternário por ligação covalente.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de utilizar uma fase móvel transparente até 200 nm.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a fase móvel ser uma solução de perclorato de sódio, de metano sulfonato ou de fosfato.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a fase móvel ser uma solução de perclorato de sódio.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o método de detecção seletiva dos açúcares acetilados ser feito, medindo-se a absorbância em 202 - 230 nm e 234 nm.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o método de detecção seletiva dos açúcares acetilados ser feito, medindo-se a absorbância em 202 - 230 nm, 234 nm e 280 nm.
15. Aplicação do método, como definido na reivindicação 1, à dosagem dos oligossacarídeos β-insaturados.
16. Aplicação do método, como definido na reivindicação 1, à dosagem da enoxaparina, a octaparina, a bemiparina ou a tinzaparina.
17. Aplicação do método, como definido na reivindicação 1, à dosagem de um ou vários octassacarídeos apresentados a seguir:
18. Aplicação do método, como definido na reivindicação 1, à dosagem de um ou vários dos seguintes oligossacarídeos.
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