BRPI0509068B1

BRPI0509068B1 - método para quantificar a quantidade de componentes em uma amostra de material selecionado de heparinas não fracionadas e heparinas fracionadas

Info

Publication number: BRPI0509068B1
Application number: BRPI0509068A
Authority: BR
Inventors: Christian Viskov; Pierre Mourier
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2015-11-03
Also published as: EP1730200B1; AR048113A1; NO20064809L; RU2006137370A; EP1730200A1; CA2558563A1; MA28483B1; JP2007530932A; ZA200606730B; BRPI0509068A; CN1934135A; KR20060132741A; WO2005090409A1; AU2005223360A1; IL177604A0; EP1580197A1

Abstract

métodos para determinar quantitativamente heparinas de constituição específica ou heparinas de baixo peso molecular usando hplc. método para analisar heparinas ou heparinas de baixo peso molecular caracterizado pelo fato de que a amostra a ser ensaiada é despolimerizada pela ação de heparinases e, então, se apropriado, o despolimerizado obtido é reduzido e então uma análise é efetuada por cromatografia líquida de alto desempenho.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA QUANTIFICAR A QUANTIDADE DE COMPONENTES EM UMA AMOSTRA DE MATERIAL SELECIONADO DE HEPARINAS NÃO-FRACIONADAS E HEPARINAS FRACIONADAS".

Uma modalidade da presente invenção é um método para detectar ou quantificar a quantidade de componentes tendo uma estrutura de 1,6-anidro ou açúcares acetilados em uma amostra de heparinas fracionadas ou heparinas não-fracionadas.

Heparinas são agentes biologicamente ativos da família da gli-cosaminoglicana, extraídas de fontes naturais, e têm valiosas propriedades anticoagulantes e antitrombóticas. Em particular, elas são úteis no tratamento de tromboses venosas pós-operatórias.

Para criar heparinas de baixo peso molecular (LMWH) de hepa-rina original, as cadeias mais longas de polissacarídeos heparínicos devem ser quebradas em cadeias mais curtas de peso molecular mais baixo. Isso pode ser feito tanto por despolimerização química como enzimática. O resultado pode ser pesos moleculares médios para cadeias de polissacarídeos de LMWH de aproximadamente 5.000 Da. LMWHs, como heparina não-fracionada, inibem coagulação por ligação a ATUI em sequências de pentas-sacarídeos particulares distribuídas ao longo de algumas das cadeias de polissacarídeos.

Cada fabricante de LMWH de um produto aprovado utiliza um processo de despolimerização distinto. A menos que dois fabricantes usem o mesmo processo, essa distinção de processo resulta em LMWHs com estruturas químicas distintas, e, portanto, de atividade farmacológica diferente e diferentes indicações aprovadas para uso clínico. As LMWHs resultantes são estrutural mente diferenciadas pelos processos de despolimerização usados para sua fabricação (R.J. Linhardt et ai., Seminars in Thrombosis and He-mostatis 1999; 25(3 Supl.): 5-16). Como resultado, LMWHs são mais heterogêneas que heparina. Cada processo diferente causa modificações estruturais únicas e altamente complexas às cadeias de polissacarídeos. Essas modificações incluem diferenças nos comprimentos de cadeia e sequências de cadeia, bem como nas impressões digitais estruturais. Consequentemente, as diferentes LMWHs têm perfis farmacológicos diferentes e diferentes indicações clínicas aprovadas.

Enoxaparina sódica é disponível da Aventis e vendida nos E.U.A na forma de injeção de enoxaparina sódica, sob a marca registrada Love-nox® (Clexane® em agluns outros países). Em geral, enoxaparina sódica é obtida por degradação alcalina de éster benzílico de heparina derivado de mucosa intestinal de porco. Sua estrutura é caracterizada, por exemplo, por um grupo ácido 2-0-sulfo-4-enopiranosurônico na extremidade não redutora e uma 2-N,6-0-dissulfo-D-glicosamina na extremidade redutora da cadeia. O peso molecular médio é de cerca de 4.500 daltons. A distribuição de peso molecular é: <2.000 dáltons <20% 2.000 a 8.000 dáltons 568% >8.000 dáltons £18% Na fabricação de enoxaparina sódica, há uma 6-O-dessulfação da glicosamina levando à formação de derivados denominados Ί ,6 anidro” (Pedido de Patente Internacional WO 01/29055), como mostrado abaixo: Esse tipo de derivado é somente obtido para cadeias de oligos-sacarídeo cuja glicosamina terminal seja 6-O-sulfatada. A percentagem de cadeias de oligossacarídeo cuja extremidade é modificada com ligação 1,6-anidro é uma característica estrutural da mistura de oligossacarídeos da enoxaparina sódica e deve ser possível medi-la. Com base no conhecimento atual, entre 15% e 25% dos componentes de enoxaparina sódica têm uma estrutura 1,6-anidro na extremidade redutora de sua cadeia.

Portanto, uma modalidade da presente invenção proporciona um método para analisar heparinas não-fracionadas e heparinas fracionadas. “Heparinas fracionadas” como usado aqui se refere a qualquer heparina que sofra despolimerização, por exemplo, heparinas de baixo peso molecular (LMWH), incluindo enoxaparina sódica e qualquer LMWH solicitando aprovação de uma autoridade reguladora em conformidade com um pedido que cite Lovenox®/ Clexane® (injeção de heparina sódica) como a droga listada.

Em uma modalidade, o método de análise de acordo com a invenção é o seguinte: A amostra a ser ensaiada é despolimerizada pela ação de hepa-rinases e então, quando apropriado, o despolimerizado obtido é reduzido e então análise é efetuada por cromatografia líquida de alto desempenho. O método, como definido acima, é, portanto, caracterizado pelo fato de que o despolimerizado é analisado para detectar a presença de cadeias de oligossacarídeos cuja extremidade é modificada com uma ligação 1,6-anidro (“grupos 1,6-anidro").

Em uma modalidade relacionada, a amostra a ser ensaiada é inicialmente despolimerizada exaustivamente com uma mistura de heparina-ses, por exemplo, heparinase 1 (EC 4.2.2.7.), heparinase 2 (heparina liase II) e heparinase 3 (EC 4.2.2.8.), por exemplo, com cada heparinase estando presente como 0,5 unidade/mL. (Essas enzimas são comercializadas pelo grupo enzimas Grampian).

Um objetivo da invenção é, portanto, um método para analisar heparinas não-fracionadas ou heparinas fracionadas, compreendendo as seguintes etapas: (a) despolimerização da amostra pela ação de heparinases (b) se apropriado, redução do despolimerizado (c) análise da amostra da etapa (a) ou (b) por cromatografia líquida de alto desempenho.

Em uma modalidade, o objetivo da invenção é o método conforme definido acima, em que as heparinases estão na forma de uma mistura de heparinase 1 (EC 4.2.2.7.), heparinase 2 (heparina liase II), e heparinase 3 (EC 4.2.2.8). O despolimerizado assim preparado pode ser então tratado para reduzir as extremidades redutoras que não estão na forma de 1,6-anidro (produtos descritos no Pedido de Patente WO 01/72762). Em uma modalidade, o despolimerizado pode ser tratado com uma solução de Na-NH4 em acetato de sódio para reduzir as extremidades redutoras que não estão na forma 1,6-anidro. Finalmente, de modo a ser capaz de quantificar os dissacarídeos 1 e 2 descritos abaixo, a amostra de heparina de baixo peso molecular, despolimerizada com heparinases, pode ser reduzida pela a-ção de um agente redutor tal como NaBH4.

Portanto, um objetivo da invenção é 0 método como definido a-cima, em que a heparina despolimerizada é então reduzida.

Um objetivo da invenção é adicionalmente um método como definido acima, em que 0 agente redutor á NaBHí. Outros sais de metais alcalinos de boroidreto, tal como de lítio ou potássio, podem ser usados.

Os métodos de ensaio, de acordo com a invenção, possibilitam se diferenciar claramente enoxaparina sódica de outras heparinas de baixo peso molecular que não contêm derivados de Ί ,6-anidro”. Inversamente, os métodos da invenção tornam possível se verificar que heparinas de baixo peso molecular não têm as características psícoquímicas de enoxaparina sódica e, portanto, são diferentes por natureza.

Os métodos, de acordo com a invenção, podem, por exemplo, ser aplicados ao processo industrial em controle no processo de amostras de modo a proporcionar padronização dos processos para fabricar enoxaparina sódica e para obter bateladas uniformes.

Depois da despolimerização enzimática e redução ótica das extremidades redutoras, os derivados de 1,6-anidro de enoxaparina sódica e-xistem em 4 formas essenciais, isto é, dissacarídeo 1, dissacarídeo 2, dissa-carídeo 3 e tetrassacarídeo 1. Portanto, é também um objetivo da invenção o método conforme descrito acima, em que os resíduos de 1,6-anidro obtidos durante a reação de despolimerização incluem os seguintes: Todos os oligossacarídeos ou polissacarídeos que contêm a extremidade 1,6-anidro na unidade de dissacarídeo terminal e que não possuem um 2-O-sulfato no ácido urônico de dito dissacarídeo terminal são completamente despolimerizados pelas heparinases e estão na forma dos dissa-carídeos 1 e 2. Por outro lado, quando o sacarídeo terminal contém 2-O-sulfato no ácido urônico e quando ele está na forma de manosamina, o derivado de 1,6-anidro está na forma de tetrassacarídeo 1 (forma resistente a heparinases). O trissacarídeo 1 (vide abaixo) pode também estar presente na mistura. Ele é derivado de um outro processo de degradação que leva à estrutura abaixo (fenômeno de descamação observado durante a despolimerização química de enoxaparina sódica).

Os outros constituintes da mistura não são somente característicos da enoxaparina sódica. Existem, naturaimente, os 8 dissacarídeos e!e-mentares da cadeia de heparina. Esses 8 dissacarídeos elementares são comercializados entre outros pela companhia Sigma.

Outros dissacarídeos foram identificados na mistura pelo método de acordo com a invenção: os dissacarídeos AIISgai e AIVSgai, que têm como sua 2-O-dessulfatação alcalina de origem de -ldoA{2S)-GlcNS{6S)- e -ldoA(2S)-GlcNS-, levando à formação de 2 ácidos galacturônicos. Eles não estão usualmente presentes na estrutura original da heparina (U.M. Desai et al., Arch. Biochem. Biophys., 306(2) 461-468 (1993)).

Oligossacarídeos contendo glicosaminas 3-O-sulfatadas resistem à divagem por heparinases e permanecem presentes na forma de te-trassacarídeos.

No caso da maioria das heparinas de baixo peso molecular, a heparina é extraída de mucosa de porco, e esses tetrassacarídeos principais estão representados abaixo. Esses tetrassacarídeos são resistentes à des-polimerização enzimática e refletem as seqüências com afinidade por anti- trombina III. Esses tetrassacarídeos são simbolizados como a seguir: Alla-J]sgiu e AlIa-jVSgij. (S. YAMADA, K. YOSHIDA, M.SUGIURA, K-H KHOO, H.R. MORRIS, A. DELL, J. Biol. Chem.; 270(7), 4780-4787 (1993)). O constituinte final da mistura clivada com heparinases é glico-serina AGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser terminal (K. Sugahara, et al., J. Biol. Chem.; 270(39), 22914-22923 (1995); K. Sugahara, et al.; J. Biol. Chem.; 267(3), 1528-1533 (1992)). O último está geralmente quase que ausente da enoxa-parina sódica (vide RMN no Exemplo 5).

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um processo cromatográfico para detectar grupos 1,6-anidro. Em uma modalidade, o método envolve separar os vários oligossacarídeos obtidos após despolimeri-zação e opcionalmente tratamento com um agente redutor tal como NaBH4. A separação dos vários oligossacarídeos de acordo com a presente invenção pode ser efetuada por HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho). Em uma modalidade, a HPLC é uma cromatografia de troca aniônica. Em uma modalidade relacionada, a cromatografia de troca aniôni-ca é uma cromatografia de troca aniônica forte (SAX).

Como usado aqui, o termo "cromatografia de troca aniônica forte” (SAX) engloba cromatografia de troca aniônica conduzida em qualquer resina que mantém uma carga positiva pura constante na faixa de pH de cerca de 2-12. Em certas modalidades da invenção, cromatografia de troca aniônica forte usa um suporte sólido funcionalizado com grupos de troca de amônio quaternário. Por exemplo, colunas tais como Spherisorb® SAX (Wa-ters Corp., Milford MA) podem ser usadas tendo tamanho de partícula de cerca de 5 pm, um comprimento de coluna de cerca de 25 cm e um diâmetro de coluna entre cerca de 1 mm e cerca de 4,6 mm. O equipamento usado pode ser qualquer cromatógrafo que permita a formação de um gradiente de eluição e que esteja equipado com um detector de UV adequado que é adequado para detecção seletiva de açúcares acetilados. Em uma modalidade da invenção, o detector de UV é uma série de diodos que permite a geração dos espectros em UV dos constituintes e permite que sinais complexos resultantes da diferença entre a absor-bância em 2 comprimentos de onda diferentes sejam registrados. Tal detector de série de diodos permite a detecção específica de oligossacarídeos acetilados. Em uma modalidade relacionada, fases móveis de HPLC que são transparentes na região UV até 200 nm são usadas. Nessa modalidade, são excluídas fases móveis convencionais com base em NaCI, que têm a desvantagem adiciona! de requerer um cromatógrafo passivado de modo a resistir ao poder corrosivo dos cloretos. Fases móveis que podem ser usadas de acordo com essa modalidade da invenção incluem, mas sem limitação, fases móveis baseadas em perclorato de sódio, sais de metanossulfonato ou sulfonato. Em uma modalidade, a fase móvel é uma solução aquosa de metanosulfonato de amônio.

Portanto, é também um objetivo da invenção um método de análise conforme definido acima por separação por cromatografia de troca aniônica, em que uma fase móvel que é transparente na região UV de cerca de 200 nM a cerca de 400 nM é usada.

Em certas modalidades, a separação por cromatografia aniônica forte é realizada em um pH de cerca de 2,0 a cerca de 6,5. Em uma modalidade relacionada, será usado um pH na região de cerca de 3. O pH pode ser controlado, por exemplo, por adição de um sal à fase móvel que possui um poder de tamponamento em pH = 3. Em certas modalidades da invenção, é usado um sal tal como um sal de fosfato, que tem uma capacidade de tamponamento maior em pH 3 que aquele de percloratos. Condições de separação cromatográficas exemplificativas são dadas abaixo.

Fase Móvel: Solvente A: NaH2P04,2,5 mM, ajustado para pH 2,9 por adição de H3P04. Solvente B: NaCIÜ4 em NaH2P041N, 2,5 mM, ajustado para pH 3,0 por adição de H3PO4 O gradiente de eluição pode ser 0 seguinte: T = 0 min; %B = 3; T = 40 minutos: %B = 60; T = 60 min: %B = 80.

Uma temperatura adequada, por exemplo, de cerca de 40°C a cerca de 50°C, e taxa de fluxo de bombeamento é selecionado de acordo com a coluna usada.

Outros métodos de purificar amostras por cromatografia SAX são conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, métodos SAX são descritos por K. G. Rice e R. J. Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989); A. Larnkjaer et ai., Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995); e no pedido de patente WO 90/01501 (Exemplo 2). O conteúdo dessas referências é aqui incorporado em sua totalidade.

Um outro aspecto da invenção é um método para detectar grupos específicos encontrados em heparinas não-fracionadas ou heparinas fracionadas.

Em uma modalidade, esse método aumenta a especificidade da detecção de heparina ou grupos LMWH. Como polissacarídeos não-acetilados têm todos, em um dado pH, um espectro em UV razoavelmente similar, é possível detectar seíetivamente os açúcares acetilados por considerar como sinal a diferença entre a absorbância em 2 comprimentos de onda selecionados de modo que a absortividade dos sacarídeos não-acetilados seja cancelada.

Como ilustrado abaixo, a título de exemplo, 202 nm e 230 nm podem ser escolhidos como comprimentos de onda de detecção e de referência e o sinal de 202-230 nm pode ser registrado. Aquele versado na técnica apreciaria que a escolha do comprimento de onda que pode ser usado de acordo com a invenção dependerá do pH da fase móvel (ajustes de uns poucos nm podem ser necessários de modo a ficar no valor ótimo do pH).

Qualquer detector de UV que possa medir simultaneamente ab-sorbância em dois ou mais comprimentos de onda pode ser usado na invenção. Em uma modalidade da invenção, o detector DAD 1100 da companhia Agilent Technologies é usado. Nessa modalidade, a detecção dupla será efetuada a 234 nm, por um lado, e a 202-230 nm, por outro lado. O princípio da detecção seletiva de oligossacarídeos acetilados está ilustrado na Figura 1, na qual o espectro em UV de um dissacarídeo sulfatado Ais é comparado com aquele de um dissacarídeo acetilado Ala.

Também um objetivo da presente é, portanto, um método para análise como definido acima, em que o método de detecção torna possível seletivamente detectar açúcares acetilados.

Em certas modalidades, o método para análise usa separação por cromatografia SAX, e açúcares acetilados são seletivamente detectados por medição da diferença entre a absorbância em dois comprimentos de onda diferentes escolhidos de modo que a absortividade dos sacarídeos não-acetilados é cancelada. A quantificação dos quatro resíduos de 1,6-anidro descritos acima requer uma seletividade suficiente do sistema cromatográfico em relação a todos os outros constituintes da mistura. Contudo, os dois dissacarídeos 1 e 2, que são co-eluídos em geral, são fracamente resolvidos com respeito a Alia, especialmente conforme o último está presente na forma de seus dois α e β anômeros. A identidade dos dois dissacarídeos 1 e 2 pode ser facilmente verificada porque eles se formam em umas poucas horas, à temperatura ambiente, em uma solução aquosa de Al Is ajustada para pH 13 por adição de NaOH. Contudo, se detecção dupla é usada, os oligossacarídeos acetila-dos AlVa, Alia, Allla, Ala, Alla-jVsgiu e Alla-IISgiu são facilmente identificáveis.

As causas de separação dos picos são as formas anoméricas, por um lado, e em uma menor extensão a epimerização de glicosamina <-*■ manosamina que está parcialmente presente para Alls, Allls e Ais, quando eles estão na posição terminal na cadeia de oligossacarídeos.

Em certas modalidades da invenção, os dissacarídeos 1 e 2 são quantificados por redução da amostra de heparina de baixo peso molecular, previamente despolimerizada por heparinases, via a ação de NaBH4. α anômero + β anômero Essa redução tem a vantagem de eliminar os α <->■ β anomeris-mos por abertura do anel do oligossacarídeo terminal. O cromatograma obtido é mais simples já que os anomerismos são eliminados. Além disso, a redução de Alia reduz sua retenção na coluna e permite fácil ensaio dos dissacarídeos 1 e 2.

Os exemplos de cromatogramas descritos nas figuras 2 e 3 ilustram claramente esses fenômenos e as vantagens desse método.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 ilustra a detecção seletiva de oligossacarídeos aceti-lados em que o espectro em UV de um dissacarídeo Ais sulfatado é comparado com aquele de um dissacarídeo Ala acetílado, em que o eixo x representa comprimento de onda (nm) e o eixo y representa absorbância (mAmps). A figura 2 mostra a separação cromatográfica de enoxaparina despolimerizada com heparinases antes e depois de redução com NaBH4 (sinal no negro fino: UV em 234 nm; sinal em negro grosso: UV em 202-234 nm), em que o tempo de eluição no eixo x (minutos) e a absorbância no eixo y (mAmps). A figura 3 mostra a separação cromatográfica de heparina des-polimerizada com heparinases antes e depois da redução com NaBH4 (sinal em negro fino: UV em 234 nm; sinal em negro grosso: UV em 202-234 nm), em que o tempo de eluição no eixo x (minutos) e o eixo y representa absor-bância (mAmps).

Exemplos Os exemplos abaixo têm a intenção de ilustrar várias características da invenção. Aquele versado na técnica apreciará que a invenção não está limitada às modalidades exemplificadas abaixo.

Exemplo 1: Descrição Geral de Despolimerização Enzimática O seguinte é uma descrição geral sobre como a despolimerização enzimática é realizada e pode ser usada na presente invenção. A despolimerização enzimática é efetuada por 48 horas à temperatura ambiente por mistura de 50 pl_ de uma solução contendo 20 mg/mL de enoxaparina sódica a ser ensaiada, 200 pL de uma solução 100 mM de ácido acético/NaOH, em pH 7,0, contendo acetato de cálcio 2 mM. e 1 mg/mL de BSA com 50 pL da solução de estoque das 3 heparinases. As heparinases são estocadas a -30°C. As heparinases estão em uma solução tampão e o título para cada heparinase é de 0,5 UI/mL (composição da solução tampão: solução aquosa de pH 7 de KH2PO4 a uma concentração de 0,01 mol/L e suplementada com albumina sérica bovina (BSA) em 2 mg/mL). A redução é efetuada em 60 pL do produto despolimerizado com as heparinases por adição de 10 pL de uma solução de 30 g/l de NaBH4 em acetato de sódio 100 mM preparado imediatamente antes de uso.

Exemplo 2 RMN do Dissacarídeo 3 obtido de acordo com a descrição geral do Exemplo 1 Espectro de Próton em D2O, 400MHz, T = 298K, δ em ppm: 3,34 (1H, dd, J=7 e 2Hz, H2), 3,72 (1H, t, J=8Hz, H6), 3,90 (1H, m, H3), 4,03 (1H, s, h4), 4,20 (1H, d, J=8Hz, H6), 4,23 (1H, t, J=5Hz, H3’), 4,58 (1H, m, H2’), 4,78 (1H, m, H5), 5,50 (1H, s, H1), 5,60 (1H, dd, J=6 e 1Hz, H1’), 6,03 (1H, d, J=5Hz, H4’).

Exemplo 3 RMN do Tetrassacarídeo 1 obtido de acordo com a descrição geral do Exemplo 1 Espectro de Próton em D20,400MHz, T = 298K, δ em ppm: 3,15 (1H, s, H2), 3,25 (1H, m, H2"), 3,60 (1H, m, H3”), entre 3,70 e 4,70 (14H, complexo não resolvido, H3/H4/H6, H27H37H47H5’, H47H57H6'', H27H3'"), 4,75 (1H, m, H5), entre 5,20 e 5,40 (2H, m, H1’ e H1”), 5,45 (1H, m, ΗΓ), 5,56 (1H, m, H1), 5,94 (1H, d, J=5Hz, H4).

Exemplo 4 RMN do Trissacarídeo 1 obtido de acordo com a descrição gera! do Exemplo 1 Espectro em D20,600MHz, (Õ em ppm): 3,28 (1H, m), 3,61 (1H, t, 7Hz), 3,79 (1H, t, 7Hz), 3,95 (1H, d, 6Hz), 4,00 (1H, s), 4,20 (1H, m), 4,28 (2H, m), 4,32 (1H, d, 4Hz), 4,41 (1H, s), 4,58 (1H, s), 4,61 (1H, s), 4,90 (1H, s amplo), 5,24 (1H,s), 5,45 (1H, s), 5,95 (1H,s).

Exemplo 5 RMN de AGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser obtido de acordo com a presente invenção.

Espectro em D20, 500MHz (δ em ppm): 3,30 (1H, t, 7Hz), 3,34 (1H, t, 8Hz), 3,55 (1H, t, 7Hz), 3,60 (1H, t, 7Hz), entre 3,63 e 3,85 (10H, m), 3,91 (2H, m), 3,96 (1H, dd, 7 e 2Hz), entre 4,02 e 4,10 (3H, m), 4,12 (1H, d, 2Hz), 4,18 (1H, m), 4,40 (1H, d, 6Hz), 4,46 (1H, d, 6Hz), 4,61 (1H, d, 6Hz), 5,29 (1H, d, 3Hz), 5,85 (1H, d, 3Hz).

Exemplo 6: Principio da Quantificação O teor de 1,6-anidro no cromatograma obtido com a solução reduzida é determinado pelo método de percentagem de área normalizada. O coeficiente de absortividade molar dos ácidos urônicos insatu-rados é considerado como constante, e, conseqüentemente, o fator de resposta de um polissacarídeo é proporcional a sua massa molecular.

Nos métodos de acordo com a invenção, é feita a hipótese amplamente aceita de que todos os oligossacarídeos insaturados contidos na mistura têm a mesma absortividade molar, igual a 5.500 moM.l.cirf1.

Os dois resíduos de 1,6-anidro co-eluídos, dissacarídeos 1 e 2, são integrados juntos.

Portanto, é possível determinar a percentagem em peso de todos os constituintes da mistura despolimerizada na heparina não-fracionada inicial ou heparina fracionada, por exemplo, constituintes tais como derivados de 1,6-anidro, ou derivados de açúcares acetilados. Para os quatro derivados de 1,6-anidro, isto é dissacarídeo 1, disscarídeo 2, dissacarídeo 3, e tetrassacarídeo 1, que correspondem aos picos 7,8,13, e 19, as seguintes percentagens em peso foram obtidas: Área7, Áreas, Áreai3 e Área-ig correspondem às áreas de cada um dos picos 7, 8,13, e 19. As massas molares de cada um destes 4 compostos são 443, 443, 545, e 1210, respectivamente. Σ Mwx. Áreax corresponde à razão da área de cada pico do cromatograma pela massa molar do produto correspondente.

Se Mw é a massa média da heparina de baixo peso molecular estudada, a percentagem de cadeias de oligossacarídeos terminando com um anel 1,6-anidro é obtido do seguinte modo: Favor formatar equação acima Similarmente, a percentagem em peso de outros compostos em uma amostra de material selecionado de heparinas não-fracionadas e hepa-rinas fracionadas pode ser determinada. A massa molecular exata é atribuída a todos os picos identifica- dos nos cromatogramas {vide Tabeía 1): Tabela 1 Os seguintes referem-se à nomenclatura dos sacarídeos que correspondem aos números de picos das Figuras 2 e 3. 1: 2: sal (1—>4)-2-desóxi-2-acetamido-a-D-glicopiranosil sódico de ácido 4-desóxi-a-treo-hexenopiranossulfônico 3; 4: sal (1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-p-D-glicopiranose dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-4-enogalactopiranosilurônico 5. sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-ct-D-glicopiranosil sódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 6: sal (1^4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurôníco 7: sal (1 ->4)-1,6-anidro-2-desóxi“2-sulfamido-p-D-glicopiranose dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-4-piranosilurônico (dissacarídeo 1) 8: sal (1^4)-1,6-anidro-2-desóxi-2-sulfamido-P-D-manopiranose dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-4-piranosilurônico (dissacarídeo 2) 9: sal{1^4)—2-desóxi-2-acetamido-a-D-glicopiranosil dissódico de ácido 4-desóxi-2-0“Sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico; 10: sal (1-»4)—2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-p-D-glicopiranose trissódico de ácido 4-desóxi-a“L-treo-hex-4-enogalactopiranosilurônico 11: sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-p-D-glicopiranosil trissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 12: sal (1—>4)—2-desóxi-sulfamido-a-D-glicopiranosil trissódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 13: sal (1 —>4)—1,6-anidro-2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glicopirano-sil trissódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico (dissacarídeo 3) 14: sal (1->4)—2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopirano-sil trissódico de ácido 4-desóxi-O-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 15: sal (1 —>4)—2-desóxi-2-acetamido-3-0-sulfo-a-D-glicop'ira-nosil pentassódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico-ácido-ácido (1->4)-2-desóxi-e-acetoamido-6-0-sulfo-ct-D-glicopiranosil-(1->4)-p-D-glicopiranosilurônico 16: sal (1->4)—2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil tetrassódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 17: sal (1-^4)—2-desóxi-2-sulfamido-316-di-0-sulfo-a-D-glicopi-ranosil hexassódico de ácido 4-desóxí-a-L-treo-hexenopiranosilurônico-ácido (1-»4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil-(1-»4)-P-D-glicopiranosilurônico 18: sal hexassódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico-ácido (1->4)—2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-D-L- glicopiranosil-(1 —>-4)—2-O-sulfo-a-L-idopiranosil urônico 19: sal (1 ->4)-1,6-anidro-2-desóxi-sulfamido-P-D-manopiranose hexassódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranossu!fônico-ácido (1 -^4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil'(1 ->4)-2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurônico (tetrassacarídeo 1) 20: sal (1—>4)-2-desóxi-2-acetamido-a-D-glicitol sódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico; 21: sal {1—>4)-2-desóxi-2-sulfamido-p-D-glicitol dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosiíurônico 22: sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glicitol dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopíranosilurônico 23: sai (1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicitol dissódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 24: sal (1^4)-2-desóxi-2-acetamido-a-D-glicitol dissódico de á-cido 4-desóxi—2-O-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 25: sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-P-D-glicitol tríssódi-co de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenogalactopiranosilurônico 26: sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-ct-D-glicitol trissódi-co de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 27: sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glicitol trissódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 28: sal (1—>4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicitol trissódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 29: sal (1-»4)-2-desóxi-2-sulfamido-3-0-siilfo-a-D-glicitol pentas-sódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico-ácido (1—>4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicoprinosil-(1->4)-P-D-glicopira-nosilurônico 30: sal (1^4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicitol trissódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hexenopiranosilurônico 31: sal (1~»4)-2-desóxi-2-sulfamido-3,6-di-0-sulfo-a-D-glcitol) hexassódico de ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico-ácido (1—>4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosilurônÍco 32: sal hexassódico de ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo- hexenopiranosilurônico-ácido (1 ->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil-(1->4)-2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurônico (forma reduzida com NaBH4).

Abreviaturas Usadas: IdoA: ácido a-L-idopiranosilurônico GlcA: ácido β-D-glicopiranosilurônico; AGIca: ácido 4,5-insaturado: ácido 4-desóxi-a-L-treo-hexenopiranosilurônico; Gal: D-galactose;

Xyl: xilose;

GlcNAc: 2-desóxi-2-acetamido-a-D-glicopiranose;

GlcNS: 2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glicopiranose; 2S: 2-O-sulfato, 3S: 3-O-sulfato, 6S: 6-O-sulfato. A presente invenção pode ser realizada de outras formas específicas sem se desviar do espírito ou atributos essenciais da mesma.

Claims

1. Método para quantificar a quantidade de componentes em uma amostra de material selecionado de heparinas não-fracionadas e hepa-rinas fracionadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) despolimerizar a dita amostra por um método enzimático; e (b) detectar a quantidade do composto na amostra despolimeri-zada da etapa (a) por cromatografia líquida de alto desempenho.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método enzimático é efetuado usando-se pelo menos uma he-parinase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método enzimático é efetuado usando-se uma mistura de he-parinase 1 (EC 4.2.2.7.), heparinase 2 (heparina liase II) e heparinase 3 (EC 4.2.2.8.).

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a heparina fracionada é enoxaparina sódica.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho usada na etapa (b) é cromatografia de troca aniônica.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho na etapa (b) é uma cromatografia de troca aniônica forte (SAX).

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica forte é efetuada usando-se uma coluna Spherisorb® de SAX.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho é efetuada em uma fase móvel que é transparente na luz UV com comprimentos de onda de cerca de 200 nm a cerca de 400 nm.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho é efetuada em uma fase móvel que compreende pelo menos um sal selecionado de perclorato de sódio, sais de metanossulfonato, e sais de fosfato.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho é efetuada em uma fase móvel que compreende sais de perclorato de sódio.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica forte é efetuada em um pH de cerca de 2,0 a cerca de 6,5.

12. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica forte é efetuada em um pH de cerca de 3.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase móvel compreende uma solução de perclorato de sódio que é mantida em cerca de pH 3,0.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra despolimerizada compreende pelo menos uma cadeia de oligossacarídeo selecionada de qualquer uma das seguintes: trissacarídeo 1 dissacarídeo 1 dissacarídeo 2 dissacarídeo 3 tetrassacarídeo 1

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra despolimerizada compreende pelo menos uma cadeia de oligossacarídeo cuja extremidade é modificada com uma ligação 1,6-anidro.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma cadeia de oligossacarídeo é qualquer uma escolhida das seguintes: ou

17. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra despolimerizada compreende pelo menos um resíduo de 1,6-anidro selecionado de qualquer um dos seguintes:

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um resíduo de 1,6-anidro varia de 15% a 25% do peso molecular ponderai médio da amostra.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os componentes detectados na amostra despolimerizada da etapa (b) são açúcares acetilados.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os açúcares acetilados são seletivamente detectados por subtração de uma absorbância medida em um comprimento de onda no qual tanto açúcares acetilados como não-acetilados absorvem de uma absorbância medida em um comprimento de onda no qual açúcar acetilado absorve, mas o não-acetilado não absorve.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe- Io fato de que os açúcares acetilados são selecionados de oligossacarídeos acetilados AlVa, Alia, Al lia, Ala, Alla-IVsgiu e Alla-llsnin.

22. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 e 4 para quantificar a quantidade de resíduos de 1,6-anidro em uma amostra de enoxapa-rina sódica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) despolimerizar a dita amostra usando uma mistura de hepa-rinase 1 (EC 4.2.2.7.), heparinase 2 (heparina liase II), e heparinase 3 (EC 4.2.2.8. ): e (b) detectar a quantidade dos resíduos de 1,6-anidro na amostra despolimerizada da etapa (a) por cromatografia líquida de alto desempenho.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a quantidade dos resíduos de 1,6-anidro varia de 15% a 25% do peso molecular médio de oligoassacarídeo da amostra.

24. Método de acordo com a reivindicação 1 para quantificar a quantidade de componentes em uma amostra de material selecionado de heparinas não-fracionadas e heparinas fracionadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) despolimerizar a dita amostra por um método enzimático; e (b) reduzira amostra despolimerizada da etapa (a); (c) detectar a quantidade dos componentes na amostra reduzida de (b) por cromatografia líquida de alto desempenho.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o método enzimático é efetuado usando pelo menos uma heparinase.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o método enzimático é efetuado usando uma mistura de heparinase 1 (EC 4.2.2.7.), heparinase 2 (heparina liase II), e heparinase 3 (EC 4.2.2.8.).

27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a redução da amostra despolimerizada da etapa (a) é efetuada por exposição a um agente redutor.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe- Io fato de que o agente redutor é NaBH4 ou um sal de metal alcalino do ânion de boroidreto.

29. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a heparina fracionada é enoxaparina sódica.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a redução reduz as extremidades redutoras da enoxaparina sódica que estão na forma 1,6-anidro.

31. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho usada na etapa (c) é uma cromatografia de troca aniônica.

32. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho usada na etapa (c) é cromatografia de troca aniônica forte (SAX).

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica forte é efetuada usando-se uma coluna Spherisorb® de SAX.

34. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho é efetuada em uma fase móvel que é transparente na luz UV com comprimentos de onda de cerca de 200 nm a cerca de 400 nm.

35. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho é efetuada em uma fase móvel que compreende pelo menos um sal selecionado de perclo-rato de sódio, sais de metanossulfonato, e sais de fosfato.

36. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho é efetuada em uma fase móvel que compreende sais de perclorato de sódio.

37. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica forte é efetuada em um pH de cerca de 2,0 a cerca de 6,5.

38. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica forte é efetuada em um pH de cerca de 3.

39. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a cromatografia líquida de alto desempenho utiliza uma fase móvel que compreende uma solução de perclorato de sódio que é mantida em cerca de pH 3,0.

40. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a amostra despolimerizada compreende pelo menos uma cadeia de oligossacarídeo selecionada de qualquer uma das seguintes: trissacarídeo 1 em que a cadeia de oligossacarídeo está em sua forma reduzida,

41, Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a amostra despolimerizada compreende pelo menos uma cadeia de oligossacarídeo cuja extremidade é modificada com uma ligação 1,6-anidro.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma cadeia de oligossacarídeo é selecionada de qualquer uma das seguintes:

43. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a amostra despolimerizada compreende uma mistura de resíduos de 1,6-anidro compreendendo:

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a mistura de resíduos de 1,6-anidro varia de 15% a 25% do peso molecular ponderai médio da amostra.

45. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pe- Io fato de que os componentes detectados na amostra despolimerizada da etapa (b) são açúcares acetilados.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que os açúcares são seletivamente detectados por subtração de uma absorbância medida em um comprimento de onda no qual tanto açúcares acetilados como não-acetilados absorvem de uma absorbância medida em um comprimento de onda no qual o açúcar acetilado absorve, mas não-acetilado não absorve.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que os açúcares acetilados detectados são selecionados de oli-gossacarídeos acetilados AlVa, Alia, Al lia, Ala, Alla-IVsgiu e AlIa-liSnin.

48. Método de acordo com as reivindicações 1, 3 e 4 para quantificar a quantidade de resíduos de 1,6-anidro em uma amostra de enoxapa-rina sódica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) despolimerizar a dita amostra usando-se uma mistura de he-parinase 1 (EC 4.2.2.7.), heparinase 2 (heparina liase II), e heparinase 3 (EC 4.2.2.8.): (b) reduzira amostra despolimerizada da etapa (a); e (c) detectar a quantidade dos resíduos de 1,6-anidro na amostra reduzida da etapa (b) por cromatografia líquida de alto desempenho.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a quantidade dos resíduos de 1,6-anidro varia de 15% a 25% do peso molecular ponderai médio da amostra.