CN102206690A - 一种肝素寡糖的制备方法 - Google Patents

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李海生
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Abstract

一种肝素寡糖的制备方法，包括如下步骤：1)肝素的酶法降解：取肝素20mg，溶解于1ml反应液Digestion Buffer中，加入肝素酶I、II、III各500uL，37℃恒温振荡反应72小时，其中每12小时补充一次肝素酶，反应结束后，100℃水浴加热15min，并在12000rpm下高速离心10min，取上清备用；2)肝素寡糖的分级纯化：将步骤1得到的寡糖片段经过Bio-gelP2柱进行分级纯化，收集冻干，即得成品。

Description

一种肝素寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种肝素寡糖的制备方法。
背景技术
肝素寡糖与普通肝素相比，同等剂量下，抗凝作用小于肝素，抗血栓作用却明显强于肝素，其分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长，不与肝素结合蛋白结合，有更稳定的量效关系，较少与血小板结合，不易引起血小板减少。所以，肝素寡糖既能有效防止血栓形成，又能减少出血等不良反应，是一种安全有效的抗血栓药物，可作肝素替代物。不同聚合度的肝素寡糖能和不同蛋白因子作用，从而呈现不同的生物学作用。所以，肝素寡糖的生产具有重要意义。现有技术有化学裂解法和酶解法，化学裂解法肝素反应剧烈，工艺复杂，肝素活性功能不同程度被破坏。酶解法反应条件温和，产率高，对环境无毒性，操作简便，易控制，成为当前生物学研究的热点，国内外作了一些相关研究，但目前尚未出现一种成本比较低的酶解法生产工艺。
发明内容
本发明要解决的问题在于提供一种肝素酶的制备方法。
一种肝素寡糖的制备方法，包括如下步骤：
1)肝素的酶法降解：取肝素20mg，溶解于1ml反应液Digestion Buffer(25mM醋酸铵，25μMCaCl2，0.25μg/ml BSA，pH7.4)中，加入肝素酶I、II、III各500uL，37℃恒温振荡反应72小时，其中每12小时补充一次肝素酶，反应结束后，100℃水浴加热15min，并在12000rpm下高速离心10min，取上清备用。
2)肝素寡糖的分级纯化：将步骤1得到的寡糖片段经过Bio-gel P2柱进行分级纯化，收集冻干，即成成品。
经过降解的肝素寡糖片段，在链端具有不饱和双键，因此在232nm可测得明显的紫外吸收值。收集分级后的流出组分，通过测定紫外吸收，可以确定寡糖片段的出峰位置。
本发明工艺简单，操作方便，可实现较高产率。
附图说明
图1是肝素寡糖分级示意图。
具体实施方式
本发明一种实施例，一种肝素寡糖的制备方法，包括如下步骤：
1)肝素的酶法降解：取肝素20mg，溶解于1ml反应液Digestion Buffer(25mM醋酸铵，25μMCaCl2，0.25μg/ml BSA，pH7.4)中，加入肝素酶I、II、III各500uL，37℃恒温振荡反应72小时，其中每12小时补充一次肝素酶，反应结束后，100℃水浴加热15min，并在12000rpm下高速离心10min，取上清备用。
2)肝素寡糖的分级纯化：将步骤1得到的寡糖片段经过Bio-gel P2柱进行分级纯化，收集冻干，即成成品。
经过降解的肝素寡糖片段，在链端具有不饱和双键，因此在232nm可测得明显的紫外吸收值。收集分级后的流出组分，通过测定紫外吸收，可以确定寡糖片段的出峰位置。如图1所示，dp2为二糖峰，收集冻干，即为二糖样。
与发明类似的同类方法的等效变换，均落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种肝素寡糖的制备方法，包括如下步骤：
1)肝素的酶法降解：取肝素20mg，溶解于1ml反应液Digestion Buffer中，加入肝素酶I、II、III各500uL，37℃恒温振荡反应72小时，其中每12小时补充一次肝素酶，反应结束后，100℃水浴加热15min，并在12000rpm下高速离心10min，取上清备用；
2)肝素寡糖的分级纯化：将步骤1得到的寡糖片段经过Bio-gel P2柱进行分级纯化，收集冻干，即得成品。
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