JP6169552B2 - 2−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 - Google Patents
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Description
(1)還元末端が2−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって,
還元末端を有する糖鎖と2−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して,該還元末端と該2−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後,該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し,該イミンを還元させることにより,還元末端が2−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと,
該反応液にトルエンを添加し,該標識化糖鎖を沈殿させるとともに,未反応の2−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと,
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して,該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを,
この順で含んでなるものである方法。
(2)該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて,カラムに充填される樹脂の排除限界が,1.5×103Daを超えないものである上記(1)に記載の方法。
(3)該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて,カラムに充填される樹脂の排除限界が,6.5×102〜7.5×102Daである上記(1)に記載の方法。
(4)該糖鎖が,糖蛋白質から切り出して得られるものである,上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)該糖蛋白質が,組換え糖蛋白質である,上記(4)に記載の方法。
(6)該糖蛋白質が,イズロン酸−2−スルファターゼ,α−ガラクトシダーゼA,酸性スフィンゴミエリナーゼ,α−L−イズロニダーゼ,N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ(グルコシルセラミダーゼ),ガルスルファーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA),血液凝固第VII因子,血液凝固第VIII因子,血液凝固第IX因子等の血液凝固因子,エリスロポエチン,インターフェロン,トロンボモジュリン,卵胞刺激ホルモン,甲状腺刺激ホルモン,GM−CSF,G−CSF,M−CSF,及び抗体からなる群から選択されるものである,上記(4)又は(5)に記載の方法。
組換え体ヒトイズロン酸−2−スルファターゼ(rhl2S)の精製品を,公知の手法を用いて準備した(米国特許公報5798239)。rhl2S溶液にN−グリコシダーゼF(ロシュ・ダイアグノスティックス製)を加えて振り混ぜ,2〜8℃で3時間静置した。次いで反応液を95℃で5分間加熱してグリコシダーゼを失活させてから減圧乾固した。
上記の減圧乾固させた糖鎖に,20μLの2−アミノピリジン溶液(150mgの2−アミノピリジンを50μLの酢酸に溶解したもの)を加えて振り混ぜ,80℃で1時間反応させた。次いで,20μLのボラン−ジメチルアミン錯体溶液(20mgのボラン−ジメチルアミン錯体を100μLの酢酸に溶解したもの)を加えて振り混ぜ,80℃で1時間反応させた。次いで,100μLのトルエンを加えて振り混ぜた後,遠心して,糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去した。このトルエンによる抽出操作を,更に2回繰り返して行い,未反応の2−アミノピリジンを除去した。また,最後のトルエン抽出の際には,沈殿を残すようにして,可能な限りの溶液を除去した。ここで除去したトルエンを含む液は,有機溶媒廃棄用の容器に回収した。次いで,沈殿させた糖鎖を滅圧乾固させた後,50μLの水に溶解して糖鎖溶解液とし,これをゲルろ過カラムクロマトフィーに付して,アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマトフィーは,純水で平衡化させたSEPHADEXTMG−10(カラム径5mm,カラム長150mm,GEヘルスケア)に糖鎖溶解液を付し,次いで,室温で8mL/分の流速で0.1%(v/v)酢酸水溶液を通して,蛍光検出器(励起波長320nm,蛍光波長400nm)で蛍光強度をモニターしながら行った。このとき得られたクロマトグラムを図1に示す。図1において,ピークAがアミノピリジン標識化糖鎖に由来するピークである。分取したアミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を凍結乾燥した後,1mLの水に溶かし,減圧乾固した。
(1)装置
島津HPLCシステムLC−20A(島津製作所)に順相クロマトグラフィー用カラム(AsahipakTM NH2P−50 4E(4.6mm I.D.×250mm),官能基:アミノプロピル基,昭和電工)をセットした。カラムオーブンでカラムを50℃に加熱するとともに,カラムの流出口の下流に蛍光検出器を設置し,カラム通過後の溶液に,励起光として波長320nmの紫外線を照射し,波長400nmの蛍光を検出するようにした。
(2)移動相の調製
移動相として,0.1%(v/v)酢酸水溶液(溶液A)と,0.5M NaClを含有する0.1%(v/v)酢酸水溶液(溶液B)とを調製した。
(3)操作手順
上記の減圧乾固したアミノピリジン標識化糖鎖を溶液Aに溶解し,試料溶液とした。還元糖分析システムのオートサンプラーに,溶液Aと溶液Bをセットし,溶液Aと溶液Bの体積比率が70:30である溶液でカラムを平衡化した後,試料溶液をカラムに負荷した。
順相クロマトグラフィーによる分析の結果,アミノピリジン標識化糖鎖がピークA〜Eとして検出された(図2)。ピークEは,アミノピリジン標識されたマンノース6リン酸を含む糖鎖に由来するものであった。
Claims (6)
- 還元末端が2−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって,
還元末端を有する糖鎖と2−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して,該還元末端と該2−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後,該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し,該イミンを還元させることにより,還元末端が2−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと,
該反応液にトルエンを添加し,該標識化糖鎖を沈殿させるとともに,未反応の2−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと,
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して,該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを,
この順で含んでなるものである方法。 - 該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて,カラムに充填される樹脂の排除限界が,1.5×103Daを超えないものである請求項1に記載の方法。
- 該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて,カラムに充填される樹脂の排除限界が,6.5×102〜7.5×102Daである請求項1に記載の方法。
- 該糖鎖が,糖蛋白質から切り出して得られるものである,請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 該糖蛋白質が,組換え糖蛋白質である,請求項4に記載の方法。
- 該糖蛋白質が,イズロン酸−2−スルファターゼ,α−ガラクトシダーゼA,酸性スフィンゴミエリナーゼ,α−L−イズロニダーゼ,N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ,グルコセレブロシダーゼ,ガルスルファーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素,組織プラスミノーゲンアクチベーター,血液凝固第VII因子,血液凝固第VIII因子,血液凝固第IX因子等の血液凝固因子,エリスロポエチン,インターフェロン,トロンボモジュリン,卵胞刺激ホルモン,甲状腺刺激ホルモン,GM−CSF,G−CSF,M−CSF,及び抗体からなる群から選択されるものである,請求項4又は5に記載の方法。
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