JP6169552B2

JP6169552B2 - ２−アミノピリジンによる糖鎖の標識法

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Publication number: JP6169552B2
Application number: JP2014212074A
Authority: JP
Inventors: 智樹深津; 哲雄横山
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2034-09-29
Also published as: JP2015091953A

Description

本発明は，還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法に関する。

糖蛋白質の糖鎖構造の分析方法として，糖蛋白質をトリプシン処理し，次いでグリコシダーゼで処理して，糖蛋白質から糖鎖を遊離させた後，この糖鎖を２−アミノピリジンで標識（２−アミノピリジン標識）し，これを順相カラムクロマトグラフィーに付して分離分析する方法が知られている（非特許文献１）。

糖鎖の２−アミノピリジン標識は，例えば，糖鎖を含む試料に，２−アミノピリジン溶液を添加して加熱反応させてイミンを形成させた後，ボラン−ジメチルアミン錯体溶液を添加して加熱し，イミンを還元することにより行われる（非特許文献１）。次いで，未反応の２−アミノピリジン等を除去するため，反応後の溶液を，トリエチルアミンとメタノールの１：１混合液，及びトルエンを添加してから乾燥させて乾燥物とし，この乾燥物を，メタノール及びトルエンに溶解させた後，再度乾燥させてから，水性溶媒に溶解させ，この溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，２−アミノピリジン標識された糖鎖を分取する。このように，糖鎖を２−アミノピリジンで標識する方法は，トルエン等の人体に有害な有機溶媒を気化させて除去する工程を含む（特許文献１，非特許文献２）。従って，糖鎖を２−アミノピリジンで標識するために使用する特殊な装置（ＴａｋａｒａＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮｍｏｄｅｌ４０００（タカラバイオ社））が市販されていた。

特開平２００５−２４１３８９号公報

ＫｕｒａｙａＮ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２，１２２−６（１９９２）ＫｏｎｄｏＡ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４．２１６９−７０（１９９０）

上記背景の下で，本発明の目的は，還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための新たな方法を提供することである。

上記目的に向けた研究において，本発明者は，鋭意検討を重ねた結果，糖鎖の還元末端を２−アミノピリジン標識させる反応において，反応過程において気化させて除去する有機溶媒の量を減じることができる新たな方法を見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって，
還元末端を有する糖鎖と２−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して，該還元末端と該２−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後，該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し，該イミンを還元させることにより，還元末端が２−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと，
該反応液にトルエンを添加し，該標識化糖鎖を沈殿させるとともに，未反応の２−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと，
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである方法。
（２）該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，１．５×１０^３Ｄａを超えないものである上記（１）に記載の方法。
（３）該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，６．５×１０^２〜７．５×１０^２Ｄａである上記（１）に記載の方法。
（４）該糖鎖が，糖蛋白質から切り出して得られるものである，上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）該糖蛋白質が，組換え糖蛋白質である，上記（４）に記載の方法。
（６）該糖蛋白質が，イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体からなる群から選択されるものである，上記（４）又は（５）に記載の方法。

本発明によれば，多量のトルエンを気化させることなく，還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得ることができる。

組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼに由来する糖鎖を２−アミノピリジン標識して得た反応物を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付したきの結果を示すクロマトグラム。縦軸は蛍光強度（任意単位），横軸は還元糖標準溶液負荷完了後の経過時間（分），ピークＡは還元糖に由来するピークを示す。２−アミノピリジン標識された糖鎖を順相クロマトグラフィーで分析した結果を示す図。縦軸と横軸は図１に同じ，ピークＡ〜Ｅは２−アミノピリジン標識された還元糖に由来するピークを示す。

糖又は糖鎖の還元末端においては，環状構造をとる糖が開環して鎖状構造となったときにアルデヒド基又はケトン基が生じ得る。本発明において，２−アミノピリジン標識（又はアミノピリジン標識）というときは，糖又は糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンと反応させることによりイミンを形成させ，次いでのこのイミンをボラン−ジメチルアミン錯体等を用いて還元させることにより，糖又は糖鎖の還元末端に２−アミノピリジンを付加させることをいう。また，本発明において，２−アミノピリジン標識化糖鎖，アミノピリジン標識化糖鎖，又は標識化糖鎖というときは，２−アミノピリジン標識（又はアミノピリジン標識）された糖又は糖鎖のことをいう。

アミノピリジン標識における，糖又は糖鎖の還元末端と２−アミノピリジンとを反応させてイミンを形成させる反応の一例を，下記の式（Ｉ）に示す。式（Ｉ）で示された反応は，糖鎖の還元末端に位置するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と２−アミノピリジンとの反応である。

アミノピリジン標識における，イミンをボラン−ジメチルアミン錯体により還元させる反応の一例を下記の式（ＩＩ）に示す。式（ＩＩ）で示された反応は，式（Ｉ）の反応で生じたイミンの，ボラン−ジメチルアミン錯体による還元反応である。

本発明において，糖鎖の還元末端と２−アミノピリジンとを反応させてイミンを形成させるときの温度及び時間は，かかる反応が促進される温度及び時間であれば特に限定はないが，好ましくは７５〜８５℃で４０分〜２時間であり，より好ましくは約８０℃で約１時間である。また，ボラン−ジメチルアミン錯体により該イミンを還元させるときの温度及び時間は，かかる反応が促進される温度及び時間であれば特に限定はないが，好ましくは７５〜８５℃で４０分〜２時間であり，より好ましくは約８０℃で約１時間である。

本発明において，ボラン−ジメチルアミン錯体により該イミンを還元することにより，糖鎖の還元末端をアミノピリジンで標識する反応は完了する。しかし，反応後の溶液中には未反応の２−アミノピリジンが残存するので，糖鎖の分析を行うためには，上記還元反応後の溶液から未反応の２−アミノピリジンを除去する必要がある。未反応の２−アミノピリジンは，還元反応後の溶液にトルエンを添加し，トルエンで抽出することにより除去することができる。

未反応の２−アミノピリジンを除去するために還元反応後の溶液に添加するトルエンの量は，好ましくは当該溶液の２〜４倍容であり，より好ましくは約２．５倍容である。トルエンを添加して混和した後，遠心分離又は静置して，糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去する。このトルエンにより未反応の２−アミノピリジンの除去する操作（トルエン抽出）は，好ましくは３〜５回，より好ましくは３回繰り返して行われる。最後のトルエン抽出の際には，沈殿を残すようにして，可能な限りの溶液を除去する。ここで除去したトルエンを含む液は，有機溶媒廃棄用の容器に回収されるので，この過程でトルエンが気化することはほとんどない。

トルエンにより未反応の２−アミノピリジンを除去した後，沈殿した糖鎖は乾燥される。このときの乾燥は，好ましくは減圧乾燥により行われる。このときトルエンが気化するが，その量は極わずかである。

減圧乾燥されたアミノピリジン標識化糖鎖は，水性溶媒に溶解されて，次いでゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付される。ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより，トルエン抽出により除去されなかった未反応の２−アミノピリジンが更に除去されるとともに，バファー交換がされる。このとき，アミノピリジン標識化糖鎖を溶解させるための水性溶媒は，好ましくは純水である。また，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに用いるカラムに充填されるべき樹脂の球状蛋白質に対する排除限界は，好ましくは１．５×１０^３Ｄａを超えないものであり，より好ましくは６×１０^２Ｄａ〜１．５×１０^３Ｄａであり，更に好ましくは６．５×１０^２Ｄａ〜７．５×１０^２Ｄａであり，更により好ましくは約７×１０^２Ｄａである。市販のＳＥＰＨＡＤＥＸ^ＴＭＧ−１０（排除限界：７×１０^２Ｄａ），ＳＥＰＨＡＤＥＸ^ＴＭＧ−１５（排除限界：１．５×１０^３Ｄａ）等は，本発明において好適に使用できる。

本発明の方法で得られたアミノピリジン標識化糖鎖は，これを順相カラムクロマトグラフィーに付し，カラム通過後の溶液に，蛍光検出器で励起光を連続的に照射して，流出液から放射される蛍光の強度を測定することにより分析できる。このとき用いられる順相カラムクロマトグラフィーでカラムに充填されるべき担体は，分析対象の糖鎖の分子量に応じて適宜選択されるべきものであるが，アミノプロピル基を官能基として保持する担体が，この目的で好適に使用できる。

本発明において，糖蛋白質の糖鎖の還元末端をアミノピリジン標識する場合，糖蛋白質から糖鎖を予め切り出す必要がある。糖蛋白質からの糖鎖の切り出しは，酵素処理又は化学処理して行う。酵素処理は，Ｎ−グリコシダーゼ，グリコペプチダーゼＡ，Ｏ−グリコシダーゼ等を用いて行い，化学処理は，ヒドラジン分解等により行う。これらの処理により，糖蛋白質中のアスパラギン残基，セリン残基，スレオニン残基等に結合した糖鎖が切り出される。

本発明において，糖鎖が分析対象となる糖蛋白質は，特に限定はないが，好ましくはイズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体であり，特に，組換え体技術を用いて合成されたヒト等の哺乳動物の組換え糖蛋白質である。

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。

〔ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのグリコシダーゼ処理〕
組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈｌ２Ｓ）の精製品を，公知の手法を用いて準備した（米国特許公報５７９８２３９）。ｒｈｌ２Ｓ溶液にＮ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を加えて振り混ぜ，２〜８℃で３時間静置した。次いで反応液を９５℃で５分間加熱してグリコシダーゼを失活させてから減圧乾固した。

〔糖鎖のアミノピリジン処理〕
上記の減圧乾固させた糖鎖に，２０μＬの２−アミノピリジン溶液（１５０ｍｇの２−アミノピリジンを５０μＬの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，８０℃で１時間反応させた。次いで，２０μＬのボラン−ジメチルアミン錯体溶液（２０ｍｇのボラン−ジメチルアミン錯体を１００μＬの酢酸に溶解したもの）を加えて振り混ぜ，８０℃で１時間反応させた。次いで，１００μＬのトルエンを加えて振り混ぜた後，遠心して，糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去した。このトルエンによる抽出操作を，更に２回繰り返して行い，未反応の２−アミノピリジンを除去した。また，最後のトルエン抽出の際には，沈殿を残すようにして，可能な限りの溶液を除去した。ここで除去したトルエンを含む液は，有機溶媒廃棄用の容器に回収した。次いで，沈殿させた糖鎖を滅圧乾固させた後，５０μＬの水に溶解して糖鎖溶解液とし，これをゲルろ過カラムクロマトフィーに付して，アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマトフィーは，純水で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸ^ＴＭＧ−１０（カラム径５ｍｍ，カラム長１５０ｍｍ，ＧＥヘルスケア）に糖鎖溶解液を付し，次いで，室温で８ｍＬ／分の流速で０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液を通して，蛍光検出器（励起波長３２０ｎｍ，蛍光波長４００ｎｍ）で蛍光強度をモニターしながら行った。このとき得られたクロマトグラムを図１に示す。図１において，ピークＡがアミノピリジン標識化糖鎖に由来するピークである。分取したアミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を凍結乾燥した後，１ｍＬの水に溶かし，減圧乾固した。

〔順相クロマトグラフィーによるアミノピリジン標識された糖の分析〕
（１）装置
島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ（島津製作所）に順相クロマトグラフィー用カラム（Ａｓａｈｉｐａｋ^ＴＭＮＨ２Ｐ−５０４Ｅ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ），官能基：アミノプロピル基，昭和電工）をセットした。カラムオーブンでカラムを５０℃に加熱するとともに，カラムの流出口の下流に蛍光検出器を設置し，カラム通過後の溶液に，励起光として波長３２０ｎｍの紫外線を照射し，波長４００ｎｍの蛍光を検出するようにした。
（２）移動相の調製
移動相として，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（溶液Ａ）と，０．５ＭＮａＣｌを含有する０．１％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（溶液Ｂ）とを調製した。
（３）操作手順
上記の減圧乾固したアミノピリジン標識化糖鎖を溶液Ａに溶解し，試料溶液とした。還元糖分析システムのオートサンプラーに，溶液Ａと溶液Ｂをセットし，溶液Ａと溶液Ｂの体積比率が７０：３０である溶液でカラムを平衡化した後，試料溶液をカラムに負荷した。

カラムに試料溶液を負荷した後，溶液Ａと溶液Ｂの体積比率が７０：３０の移動相を，０．６ｍＬ／分の流速で２分間カラムに流した後，同一流速で７８分かけて，移動相における溶液Ｂの体積比率を９５％にまで直線的に高め，次いで２５分間溶液Ｂの体積比率を９５％として同一流速で流し，更に，３５分間溶液Ａと溶液Ｂの体積比率を７０：３０にして同一流速で流した。カラム通過後の溶液に，励起光（波長３２０ｎｍ）を連続的に照射して該流出液から放射される蛍光（波長４００ｎｍ）の強度を連続的に測定した。

〔分析結果の評価〕
順相クロマトグラフィーによる分析の結果，アミノピリジン標識化糖鎖がピークＡ〜Ｅとして検出された（図２）。ピークＥは，アミノピリジン標識されたマンノース６リン酸を含む糖鎖に由来するものであった。

本発明によれば，多量のトルエンを気化させることなく，遺伝子組換え技術を用いて製造した糖蛋白質の糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンで標識することができる。

Claims

還元末端が２−アミノピリジンで標識された糖鎖を得るための方法であって，
還元末端を有する糖鎖と２−アミノピリジンとを含む溶液を加熱して，該還元末端と該２−アミノピリジンとを反応させることによりイミンを形成させた後，該溶液にボラン−ジメチルアミン錯体を添加して加熱し，該イミンを還元させることにより，還元末端が２−アミノピリジンで標識された標識化糖鎖を含む反応液を得るステップと，
該反応液にトルエンを添加し，該標識化糖鎖を沈殿させるとともに，未反応の２−アミノピリジンをトルエンとともに除去するステップと，
該沈殿を水性溶媒に溶解させて得られた溶液を，ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して，該標識化糖鎖を含有する画分を回収するステップとを，
この順で含んでなるものである方法。
該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，１．５×１０^３Ｄａを超えないものである請求項１に記載の方法。
該ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて，カラムに充填される樹脂の排除限界が，６．５×１０^２〜７．５×１０^２Ｄａである請求項１に記載の方法。
該糖鎖が，糖蛋白質から切り出して得られるものである，請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
該糖蛋白質が，組換え糖蛋白質である，請求項４に記載の方法。
該糖蛋白質が，イズロン酸−２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター，血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，及び抗体からなる群から選択されるものである，請求項４又は５に記載の方法。