CN108918749B - 一种蛇毒纤溶酶的反相hplc检测方法 - Google Patents

一种蛇毒纤溶酶的反相hplc检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蛇毒纤溶酶的反相HPLC检测方法。所述检测方法的检测条件为：(1)反相柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；(2)流动相A为：0.1％的三氟乙酸的5％乙腈溶液；(3)流动相B为：0.08％的三氟乙酸的80％乙腈溶液。本发明通过建立专属性强及重现性、稳定性、及精密度良好的含量测定方法，能够有效控制纤溶酶的质量，使纤溶酶质量达到稳定、可控、高效及安全。

Description

一种蛇毒纤溶酶的反相HPLC检测方法
技术领域
本发明属于生化与生物医药领域，具体涉及蛇毒纤溶酶纯度的反相HPLC检测方法。
背景技术
蛇毒中存在着能直接溶解纤维蛋白的酶类，以其作用快速高效，不良反应小的优势成为目前临床使用的潜在的强力溶栓剂。纤溶酶原液生产工艺包括离子交换层析、亲和层析、凝胶层析。原液质量受蛇毒质量和纯化工艺控制水平的影响，然而多数企业工艺条件粗放，缺乏有效的中间过程控制，导致收率低，纯度和比活低于国家标准，工艺稳定性差。
目前关于蛋白药物的质量标准中，针对蛋白质纯度的测量方法多为凝胶色谱法。采用凝胶色谱测定蛇毒纤溶酶的方法通常采用下述条件：1)凝胶色谱柱，其规格为SK20007.8*300mm，5μm；2)以0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH值为6.8)为流动相，检测波长为280nm，理论板数按纤溶酶峰计算应不低于3000；3)取待测样品用流动相稀释成每1mL中含1mg蛋白的溶液作为供试品溶液，取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按照面积归一化法计算，供试品中主峰相对百分含量不得低于90.0％。本申请人根据比活性推算目前市售每支纤溶酶制剂中主成分的含量均小于测定结果，说明样品中有类似活性的物质存在，厂家的样品纯度不够。由此可见，蛇毒类凝血酶样蛋白(TLE)类药物的现行质量标准体系不够完善，项目设置不够全面，难以有效控制产品质量。
目前，虽然也有采用常规反相色谱对蛋白质检测的相关报道，但其对于所检测的蛋白质的分子量有要求，一般上限在10KD左右，分子量过大易堵塞柱子，而且检测效果也存在精确度低、重现性差、专属性不强及回收率低等缺陷。
有鉴于此，本发明特提出一种新的针对蛇毒纤溶酶的反相HPLC检测方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种反相HPLC(RP-HPLC)色谱分析检测蛇毒纤溶酶纯度的方法，其可作为现有凝胶色谱法检测的补充，为进一步提高纤溶酶的质量标准提供了有价值的参考；还可有效促进生产工艺的改进；除此之外，也为类凝血酶类化合物的反相色谱方法提供参考。
本发明所述的反相HPLC(RP-HPLC)色谱分析检测蛇毒纤溶酶纯度的方法，其检测条件为：
(1)反相柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体尺寸为：5μm，4.6mm×250mm；
(2)流动相A为：0.1％的三氟乙酸的5％乙腈溶液；
(3)流动相B为：0.08％的三氟乙酸的80％乙腈溶液。
下面对本发明作进一步详细说明。
所述的蛇毒纤溶酶属于大分子蛋白质，其分子量为24KDa～34KDa，来源于长白山白眉蝮蛇。
所述方法中，为了保证分离效果，所述反相柱的孔径为300埃，优选地，其长度为250mm；例如选自规格为Waters Peptide BEH，4.6mm×250mm，300埃，5μm的C18柱。
所述方法中，检测波长为280nm。
所述方法中，滤膜的孔径为0.45μm。
所述方法中，流速为0.8ml/min～1.0ml/min；洗脱时间为35min；洗脱温度为35℃～45℃，优选40℃。
所述方法中，洗脱程序如下：
Figure BDA0001733702230000031
在本发明所述检测方法中，主峰保留时间为12.5±0.5min，主峰峰纯度匹配值为998，则显示为单组分。
采用本发明所述的检测方法时，用流动相稀释样品，每1mL中含1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液；取供试品溶液(如20μL)注入液相色谱仪，记录色谱图，按照面积归一化法计算，供试品中主峰相对百分含量不得低于95.0％。
本发明所取得的有益效果如下：
(1)本发明所述的检测方法检出限低，能用于单瓶样品的检测(单瓶样品主药含量较低)，对于纤溶酶及其制剂在工艺控制过程中对样品的跟踪检测以及考察每支样品的含量及其杂蛋白分析非常有利。
(2)本发明的广泛目的在于，为与纤溶酶同类型的降纤酶、蕲蛇酶等溶栓药的质量标准提高和工艺的控制提供参考。目前国内临床使用的与纤溶酶同类型的溶栓药主要有降纤酶、蕲蛇酶和巴曲酶，他们的主要作用机制大致相同，对比三者的质量标准与纤溶酶的质量标准基本一致。
(3)本发明所述的蛇毒纤溶酶所采用的反相色谱法基于蛋白药物的疏水性不同实现的分离，与利用分子筛原理实现分离的SDS-PAGE凝胶电泳及凝胶色谱相互补充，提高了纤溶酶的质量标准。
毫无疑问，对纤溶酶进行质量标准研究，建立更全面的分析测试方法，制定高技术水平的控制纤溶酶质量的检测指标和分析方法，使之更加科学化、规范化，增强竞争力，具有重大的实际意义和学术价值。本发明通过建立专属性强及重现性、稳定性、及精密度良好的含量测定方法，能够有效控制纤溶酶的质量，使纤溶酶质量达到稳定、可控、高效及安全。
附图说明
图1为蛇毒纤溶酶的色谱峰紫外吸收光谱图。
图2为蛇毒纤溶酶的质量控制的HPLC检测色谱图。
图3为利用二极管阵列检测器(DAD)对蛇毒纤溶酶纯度检查的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种针对蛇毒纤溶酶的反相HPLC色谱分析检测方法，具体步骤如下：
1.【波长测定】：
取待测样品蛇毒纤溶酶，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。以同批水作为空白对照。
分别取空白对照及供试品溶液各200μL注入比色皿中，将比色皿置于紫外分光光度计中，在190nm～400nm波长范围内扫描测定，仪器自动绘制吸光度与波长的关系图，即得本品的紫外吸收光谱。
2.【含量测定】：
取待测样品，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。
取供试品溶液20μL注入液相色谱仪进行检测，检测条件如下：
C18反相分析柱：由孔径为300埃，粒径为5μm的反相硅胶C18颗粒作为固定相填充剂制备得到；
流动相A：0.1％的三氟乙酸的5％乙腈溶液；
流动相B：0.08％的三氟乙酸的80％乙腈溶液；
流速：0.8ml/min；
洗脱程序：
表1
时间 A相 B相 洗脱方式
0～5 52％ 48％ 等度洗脱
5～30 52％～32％ 48％～68％ 线性洗脱
30～30.1 32％～52％ 68％～48％ 线性洗脱
30.1～35 52％ 48％ 等度洗脱
洗脱时间：35min；
检测波长：280nm；
洗脱温度：40℃；
记录色谱图，按面积归一化法计算，供试品中主峰的相对峰面积比不得小于95.0％。如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不超过5.0％。
理论板数按纤溶酶计算不得低于3000。
3.【峰纯度测定】：
取待测样品，用纯水稀释成每1ml中含有1mg蛋白的溶液，作为供试品溶液。
按流动相系统，在高效液相色谱仪上用二极管阵列检测DAD检测器进行峰纯度检测，蛇毒纤溶酶的HPLC色谱峰匹配度大于980，其色谱峰紫外吸收光谱图、三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。
结果：
从图1可以看出，蛇毒纤溶酶的紫外光谱分别在214nm和280nm处有较大吸收峰。214nm为肽键的电子跃迁所产生的紫外特征吸收波长，280nm为含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸产生的紫外特征吸收波长。确定含有上述氨基酸的蛋白质生物大分子的检测波长为280nm。
从图2可以看出，保留时间在12分钟左右为主成分蛇毒纤溶酶，主成分含量小于95.0％。需后续进行工艺的改进，满足质量标准的要求。
表2
Figure BDA0001733702230000061
从图3可以看出，蛇毒纤溶酶的二极管阵列DAD峰纯度检查HPLC色谱图为单一的峰，表明其对应的为纯物质。
表3
Figure BDA0001733702230000062
对比验证试验：
本发明所述反相色谱法检测为多组分图谱，检出3个明显的杂质，主峰相对峰面积比仅为72.42％，而相同的供试品采用凝胶色谱法，主峰相对峰面积比为100.0％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种蛇毒纤溶酶的反相HPLC检测方法，其特征在于，其检测条件为：
(1)反相柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
(2)流动相A为：0.1％的三氟乙酸的5％乙腈溶液；
(3)流动相B为：0.08％的三氟乙酸的80％乙腈溶液；
所述方法中，洗脱程序为：
Figure FDA0002383100410000011
所述方法中，检测波长为280nm；洗脱温度为35-45℃。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的蛇毒纤溶酶为大分子蛋白质，其分子量为24KDa～34KDa。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法中，所述反相柱的孔径为300埃。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述方法中，所述反相柱的长度为250mm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法中，滤膜的孔径为0.45μm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法中，流速为0.8-1.0ml/min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在检测过程中，主峰保留时间为12.5±0.5min，主峰峰纯度匹配值为998，显示为单组分。
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