CN110208419B - 一种用于检测比伐卢定中杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测比伐卢定中杂质的方法，所述的检测方法包括使用高效液相色谱法检测比伐卢定样品中的杂质，特别是和主峰极性接近的杂质[D‑Phe¹²]‑比伐卢定(杂质I)、[L‑Phe¹]‑比伐卢定(杂质II)、[D‑Leu²⁰]‑比伐卢定(杂质III)、[Plus‑Gly⁵Gly⁶]‑比伐卢定(杂质IV)、[Des‑Gly⁵Gly⁶]‑比伐卢定(杂质V)能和主峰进行有效分离的方法。本方法中各杂质的检测限约0.15μg/ml，即可以检出比伐卢定中高于0.01％的杂质；本方法不仅能有效检出分离USP中披露的6个杂质，同时能够有效分离其它5个极性接近的潜在工艺杂质，实用性强，检测过程简单快捷。

Description

一种用于检测比伐卢定中杂质的方法

发明领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及用于一种用于检测比伐卢定中杂质的高效液相方法。

背景技术

比伐卢定(Bivalirudin)的有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，无论凝血酶处于血循环中还是与血栓结合，本品均可与其催化位点和阴离子结合位点)发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。其作用与肝素不同，它不依赖于抗凝血酶、肝素辅因子等。凝血酶是凝血反应中起核心作用的丝氨酸蛋白酶：它水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体；激活凝血因子；促进纤维蛋白交联形成稳定血栓的共价结构，凝血酶激活凝血因子；激活血小板，促进血小板聚集和颗粒释放。

比伐卢定为人工合成的二十肽，由20个氨基酸残基组成的线性肽，其中1位为D型Phe，其肽序结构为：

D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH化学结构式如下：

比伐卢定的合成目前基本上都是通过固相法和液相法合成制备得到，由于合成步骤较长，合成过程中产生的杂质种类比较多，这些杂质与主成分比伐卢定的化学结构极为相似，如果控制不好，有可能产生严重的毒副作用。

经文献检索，USP比伐卢定质量标准草案中披露了6个已知杂质，分别为H-[12-20]-比伐卢定(杂质VI)、H-[1-11]-比伐卢定(杂质VII)、[Des-Glu¹³]-比伐卢定(杂质VIII)、[Asp⁹]-比伐卢定(杂质IX)、[Plus Gly⁵]-比伐卢定(杂质X)和[Des Gly⁵]-比伐卢定(杂质XI)；采用方法1分析检测4种杂质，分别为杂质VI、杂质VII、杂质VIII和杂质IX；采用方法2分析检测2种杂质，分别为杂质X和杂质XI。USP比伐卢定质量标准草案采用2种分析方法对6种潜在的杂质进行分析检测，操作较为繁琐，检验工作量大。

由于比伐卢定C端为羧酸结构，采用固相合成法合成比伐卢定时C端的Leu残基容易发生消旋反应产生[D-Leu²⁰]-比伐卢定(杂质III)，另外，比伐卢定肽序中含有Phe和D-Phe残基，在合成过程中容易发生消旋反应产生杂质[D-Phe¹²]-比伐卢定(杂质I)和[L-Phe¹]-比伐卢定(杂质II)；比伐卢定肽序中含有-Gly⁵-Gly⁶-Gly⁷-Gly⁸-结构，在合成过程中除了产生[Plus Gly⁵]-比伐卢定(杂质X)和[Des Gly⁵]-比伐卢定(杂质XI)，还可能产生杂质[Plus Gly⁵Gly⁶]-比伐卢定(杂质IV)、[Des Gly⁵Gly⁶]-比伐卢定(杂质V)。这些潜在的杂质与比伐卢定主峰极性接近，分离效果不佳，因此有必要开发比伐卢定中杂质的检测方法，将这些潜在杂质有效分离，为后续的纯化制备中控提供有效支持，保证工艺杂质能有效去除，确保产品质量。

杂质的肽序结构

本发明开发了一种比伐卢定杂质检测方法，不仅在同一分析检测方法能将USP中披露的6种已知杂质进行有效分离，同时将合成工艺中可能引入的与主峰极性接近的消旋杂质/缺失杂质等杂质进行有效分离，为后续的纯化制备中控提供有效支持，保证工艺杂质能有效去除。

发明内容

本发明提供了一种用于检测比伐卢定中杂质的方法，能够对比伐卢定中可能存在的11种杂质进行有效的分离，并能够定量检测，为比伐卢定的质量研究提供支持。

本发明的目的在于提供一种用于检测比伐卢定中杂质的方法，包括以下步骤：

(1)流动相组成：

流动相A:由磷酸盐缓冲液组成；

流动相B:由乙腈和甲醇混合组成；

(2)样品的配制

供试品溶液的配制：称取比伐卢定样品，和(1)中流动相A混合配制成供试品溶液，待用；

系统适应性溶液的配制：分别称取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质VI、杂质VII、杂质VIII、杂质IX、杂质X、杂质XI对照品和比伐卢定对照品，和(1)中流动相A混合配制成供试品溶液，待用；

(3)分别吸取上述的供试品溶液和系统适应性溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，其色谱条件包括：

色谱柱：C18柱，4.6mm*250mm，5μm，或效能相当的色谱柱

检测波长：210nm

流速：0.6-1.2ml/min

柱温：25-50℃

采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，

其中，杂质I-XI的结构如下：

其中，流动相A的配置：称取5.99g磷酸二氢钠，加纯化水1000ml溶解，加入三乙胺5ml，并用醋酸调节pH至2.5～5.0，优选pH＝3.5。

其中，流动相B中乙腈跟甲醇的体积比为10:90～40:60，优选20:80。

其中，步骤2中，所述的比伐卢定供试品溶液浓度为1～3mg/ml，优选2mg/ml。

其中，步骤2中，所述的系统适应性溶液浓度，各杂质的浓度为1～3μg/ml，优选2μg/ml；比伐卢定的浓度为1～3mg/ml，优选2mg/ml。

其中，步骤3中，所述的柱温为25～50℃，优选35℃。

其中，步骤3中，所述的流速为0.6～1.2ml/min，优选1.0ml/min。

其中，步骤3中，线性梯度洗脱程序如下所示：

表1、

时间min	流动相A％	流动相B％
			0	62	38
20	60	40
			55	53	47
65	20	80
			66	62	38
75	62	38

优选的，本发明所述的检测方法，步骤如下：

1)配置流动相：

流动相A：称取5.99g磷酸二氢钠，加纯化水1000ml溶解，加入三乙胺5ml，采用乙酸调节pH至3.52；

流动相B：乙腈：甲醇＝20:80的混合溶液；

2)供试品溶液、系统适应性溶液的配制：

供试品溶液的配制：精密称取20mg比伐卢定样品至10ml容量瓶中，加入5ml流动相A混合溶解，继续流动相A稀释定容至刻度，配制成2mg/ml的比伐卢定样品溶液，待用；系统适应性溶液的配制：分别称取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质VI、杂质VII、杂质VIII、杂质IX、杂质X、杂质XI对照品各20μg至10ml容量瓶中，再称取20mg比伐卢定样品至同一容量瓶中，加入5ml流动相A混合溶解，继续流动相A稀释定容至刻度，配制成每1ml中含各个杂质分裂为0.2μg和比伐卢定2mg的溶液，作为系统适应性溶液，待用；

3)分别吸取上述的供试品溶液和系统适应性溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，

色谱条件包括：

色谱柱：C18柱，4.6mm*250mm，5μm，或效能相当的色谱柱

检测器：UV检测器

检测波长：210nm

流速：1.0ml/min

柱温：35℃

采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱程序如下：

表2

时间min	流动相A％	流动相B％
			0	62	38
20	60	40
			55	53	47
65	20	80
			66	62	38
75	62	38

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种用于检测比伐卢定中杂质的方法，采用不同于USP标准草案中的色谱条件，采用一种分析方法将USP草案中披露的6种潜在杂质有效分离，同时将合成工艺中可能引入的与主峰极性接近的消旋杂质/缺失杂质等杂质进行有效分离，并对比伐卢定样品中的杂质进行定量检测，实际检测效果良好。

本发明实用性强，在实际检测过程中，各个已知杂质的检测限度达0.15μg/ml，即可以检出比伐卢定中高于0.01％的杂质，以及能有效分离极性接近的杂质，实用性强，检测过程简单、快捷。

本发明所述的高效液相色谱法，其测定条件中所包含的范围内均为有效值，即：在各参数范围内取任意值后，也能准确检出样品中的这11种已知杂质，而且能将杂质与主峰有效的分离。在实际检测过程中，便于检测人员对参数的调整和避免人为误差对检测结果产生的影响，适宜推广使用，尤其是纯化制备中控工艺杂质去除情况。

附图说明

图1为比伐卢定系统适应性溶液的HPLC图谱

图2为比伐卢定样品的HPLC图谱

具体实施方式

以下结合具体实例将本发明的发明目的、技术方案和有益效果做出进一步详细的说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

以下以典型案例来列举说明本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

实施例1

选取批号为20180701批的比伐卢定样品，按照以下步骤进行检测：

1、配置流动相：

流动相A：称取5.99g磷酸二氢钠，加纯化水1000ml溶解，加入三乙胺5ml，采用乙酸调节pH至3.52；

流动相B:乙腈跟甲醇的体积比为20:80混合配置；

供试品溶液的配制：精密称取20mg比伐卢定样品至10ml容量瓶中，加入5ml流动相A混合溶解，继续流动相A稀释定容至刻度，配制成2mg/ml的比伐卢定样品溶液，待用；

系统适应性溶液的配制：分别称取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质VI、杂质VII、杂质VIII、杂质IX、杂质X、杂质XI对照品各20μg至10ml容量瓶中，再称取20mg比伐卢定样品至同一容量瓶中，加入5ml流动相A混合溶解，继续流动相A稀释定容至刻度，配制成每1ml中含各个杂质分裂为0.2μg和比伐卢定2mg的溶液，作为系统适应性溶液，待用；

3、分别吸取上述的供试品溶液和系统适应性溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图。

其色谱条件包括：

色谱柱：C18柱，4.6mm*250mm，5μm，或效能相当的色谱柱

检测器：UV检测器

检测波长：210nm

流速：1.0ml/min

柱温：35℃

采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱程序见表3：

表3：线性洗脱程序

时间min	流动相A％	流动相B％
			0	62	38
20	60	40
			55	53	47
65	20	80
			66	62	38
75	62	38

该方法能有效检出比伐卢定杂质，系统适应性溶液中的杂质能与主峰达到基线分离，比伐卢定系统适应性溶液中杂质的含量、相对保留时间、分离度见表4。该方法检测效果良好，操作简单实用性强，检测过程简单快捷。经检测可知，比伐卢定样品中只存在杂质VI(RRT＝0.48)、杂质X(RRT＝0.98)和杂质XI(RRT＝1.02)，其含量分别为0.13％、0.31％和0.32％，其它杂质均为检出。

表4：比伐卢定系统适用性溶液杂质汇总表

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流速参数不同，其他检测条件和实施例1一致。

本实施例中，流速为0.8ml/min

系统适应性溶液中的各杂质均能与主峰达到基线分离。经检测可知，比伐卢定样品中只存在杂质VI(RRT＝0.46)、杂质X(RRT＝0.97)和杂质XI(RRT＝1.04)，其含量分别为0.13％、0.34％和0.34％，其它杂质均为检出。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流速参数不同，其他检测条件和实施例1一致。

本实施例中，流速为1.2ml/min

系统适应性溶液中的各杂质均能与主峰达到基线分离。经检测可知，比伐卢定样品中只存在杂质VI(RRT＝0.47)、杂质X(RRT＝0.98)和杂质XI(RRT＝1.02)，其含量分别为0.13％、0.30％和0.31％，其它杂质均为检出。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中柱温参数不同，其他检测条件和实施例1一致。

本实施例中，柱温为30℃

系统适应性溶液中的杂质X和杂质XI与主峰未能达到基线分离，分离度分别为1.35和1.23，其它杂质均能与主峰达到基线分离。经检测可知，比伐卢定样品中只存在杂质VI(RRT＝0.48)、杂质X(RRT＝0.98)和杂质XI(RRT＝1.01)，其含量分别为0.13％、0.30％和0.29％，其它杂质均为检出。。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中柱温参数不同，其他检测条件和实施例1一致。

本实施例中，柱温为45℃

系统适应性溶液中的各杂质均能与主峰达到基线分离。经检测可知，比伐卢定样品中只存在杂质VI(RRT＝0.47)、杂质X(RRT＝0.98)和杂质XI(RRT＝1.03)，其含量分别为0.14％、0.31％和0.32％，其它杂质均为检出。

由以上结果可知：在比伐卢定杂质检测过程中，适当对色谱条件的各参数，如流速、柱温等进行调整后，均能对五个杂质基线分离，且其检测结果均有效、准确。

以上结合具体实施例和附图说明详细说明本发明，目的是使本发明的优势更加明确，而非限制本发明。本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些实施例以及使用方法，任何对本发明进行同等替换、组合、改良或修饰，均包含于本发明内。

试验例1、本发明与现有的检测方法进行比较

USP比伐卢定质量标准草案中披露了6个已知杂质，采用方法1分析检测4种杂质，分别为杂质VI、杂质VII、杂质VIII和杂质IX；采用方法2分析检测2种杂质，分别为杂质X和杂质XI。USP比伐卢定质量标准草案采用2种分析方法对6种潜在的杂质进行分析检测，操作较为繁琐，检验工作量大。

本发明提供了一种用于检测比伐卢定中杂质的方法，采用不同于USP标准草案中的色谱条件，采用一种分析方法将USP草案中披露的6种潜在杂质有效分离，同时将合成过程中可能引入的与主峰极性接近的5个消旋杂质/缺失杂质等杂质进行有效分离，并对比伐卢定样品中的杂质进行定量检测，实际检测效果良好。分析方法对比具体试验数据如表5所示。

表5：不同分析方法中比伐卢定潜在杂质的分离效果对比表

试验例2、本发明的检测方法筛选过程

1、流动相pH值对分离效果的影响

考察不同的流动相pH流速对各杂质的分离情况，主要与主峰较为接近的前杂[Plus Gly⁵]-比伐卢定(杂质X)和后杂[Des Gly⁵]-比伐卢定(杂质XI)的分离效果，具体的实验数据如表6所示。

表6：不同的流动相pH值对分离效果的影响

从表6中可以发现：流动相pH对杂质的效果有一定的影响，增大流速会影响主峰前后杂质的分离效果，本发明中选择的流动相A的pH值-3.5，能确保主峰前后杂质与主峰有效分离，满足检测要求。

2、流速对分离效果的影响

考察不同的流速对各杂质的分离情况，主要与主峰较为接近的前杂[Plus Gly⁵]-比伐卢定(杂质X)和后杂[Des Gly⁵]-比伐卢定(杂质XI)的分离效果，具体的实验数据如表7所示。

表7：不同的流速对分离效果的影响

从表7中可以发现：流速对杂质的效果有一定的影响，增大流速会影响主峰前后杂质的分离效果，本发明中选择的流速1.0ml/min，能确保主峰前后杂质与主峰有效分离，满足检测要求。

3、柱温对分离效果的影响

考察不同的柱温对各杂质的分离情况，主要与主峰较为接近的前杂[Plus Gly⁵]-比伐卢定(杂质X)和后杂[Des Gly⁵]-比伐卢定(杂质XI)的分离效果，具体的实验数据如表8所示。

表8：不同的柱温对分离效果的影响

从表8中可以发现：柱温对杂质的效果有一定的影响，增大流速会影响主峰前后杂质的分离效果，本发明中选择的35℃柱温，能确保主峰前后杂质与主峰有效分离，满足检测要求。

试验例3、本发明检测方法的有益效果

1、检测限

将已知浓度的杂质对照品溶液稀释到很低浓度进样，测出的信号与极限噪音比较(S/N≧3)，算出各杂质能被可靠检出的最低浓度。11个已知杂质的检测限数据具体如表9所示。

表9：比伐卢定已知杂质的检测限

从表9中可以发现：各个已知杂质的检测限度达0.15μg/ml以下，即本发明中的分析方法可以检出比伐卢定中高于0.01％的杂质。

2、重复性

重复性是通过配制同一批次的6分供试品溶液(加标：加0.5％限度浓度的杂质)，按照方法测定6分供试品溶液中各已知杂质的量，报告个杂质的RSD来证实分析方法具有良好精密度。重复性的实验数据具体如表10所示。

表10：检测方法重复性试验数据

样品编号	1#	2#	3#	4#	5#	6#	平均值	RSD/％
									杂质I	0.51	0.52	0.53	0.51	0.53	0.51	0.52	1.9
杂质II	0.53	0.51	0.52	0.52	0.51	0.53	0.52	1.7
									杂质III	0.50	0.54	0.52	0.51	0.53	0.52	0.52	2.7
杂质IV	0.58	0.56	0.57	0.55	0.56	0.58	0.57	2.1
									杂质V	0.55	0.58	0.54	0.56	0.56	0.55	0.56	2.5
杂质VI	0.62	0.60	0.63	0.64	0.63	0.62	0.62	2.2
									杂质VII	0.56	0.55	0.55	0.53	0.51	0.56	0.54	3.6
杂质VIII	0.64	0.67	0.69	0.67	0.65	0.68	0.67	2.8
									杂质IX	0.54	0.58	0.54	0.55	0.56	0.58	0.56	3.3
杂质X	0.68	0.69	0.71	0.68	0.72	0.72	0.70	2.7
									杂质XI	0.59	0.56	0.61	0.57	0.58	0.59	0.58	3.0

从表10中可以发现：本发明中比伐卢定的分析方法的重复性试验数据较好，RSD≤5％，满足检测要求。

3、中间精密度

中间精密度主要考察随机表动因素对精密度的影响，有2个不同的分析人员建立独立的分析系统，在不同日期、用不同仪器进行重复性试验。要求该精密度测定结果与重复性结果的12次测定结果基本一致。中间精密度的实验数据具体如表11所示。

表11：检测方法中间精密度试验数据

从表11中可以发现：本发明中比伐卢定的分析方法的中间精密度试验数据较好，RSD≤5％，满足检测要求。

Claims (10)

1.一种用于检测比伐卢定中杂质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)流动相组成：

流动相A的配置：称取5.99g磷酸二氢钠，加纯化水1000ml溶解，加入三乙胺5ml，并用醋酸调节pH至3.5，

流动相B中乙腈跟甲醇的体积比为20:80；

(2)样品的配制

供试品溶液的配制：称取比伐卢定样品，和(1)中流动相A混合配制成供试品溶液，待用；

系统适应性溶液的配制：分别称取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质VI、杂质VII、杂质VIII、杂质IX、杂质X、杂质XI对照品和比伐卢定对照品，和(1)中流动相A混合配制成供试品溶液，待用；

(3)分别吸取上述的供试品溶液和系统适应性溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，其色谱条件包括：

色谱柱：C18柱，4.6mm*250mm，5μm，

检测波长：210nm

流速：0.6-1.2ml/min

柱温：25-50℃

采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱：

梯度洗脱程序如下所示：

时间min 流动相A％ 流动相B％ 0 62 38 20 60 40 55 53 47 65 20 80 66 62 38 75 62 38

其中，杂质I-XI的结构如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的比伐卢定供试品溶液浓度为1～3mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的比伐卢定供试品溶液浓度为2mg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(2)所述的系统适应性溶液浓度，各杂质的浓度为1～3μg/ml；比伐卢定的浓度为1～3mg/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(2)所述的系统适应性溶液浓度，各杂质的浓度为2μg/ml；比伐卢定的浓度为2mg/ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(3)所述的柱温为25～50℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(3)所述的柱温为35℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(3)所述的流速为0.6～1.2ml/min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(3)所述的流速为1.0ml/min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1)配置流动相：

流动相A：称取5.99g磷酸二氢钠，加纯化水1000ml溶解，加入三乙胺5ml，采用乙酸调节pH至3.52；

流动相B：乙腈：甲醇＝20:80的混合溶液；

2)供试品溶液、系统适应性溶液的配制：

供试品溶液的配制：精密称取20mg比伐卢定样品至10ml容量瓶中，加入5ml流动相A混合溶解，继续流动相A稀释定容至刻度，配制成2mg/ml的比伐卢定样品溶液，待用；系统适应性溶液的配制：分别称取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质VI、杂质VII、杂质VIII、杂质IX、杂质X、杂质XI对照品各20μg至10ml容量瓶中，再称取20mg比伐卢定样品至同一容量瓶中，加入5ml流动相A混合溶解，继续流动相A稀释定容至刻度，配制成每1ml中含各个杂质分别为0.2μg和比伐卢定2mg的溶液，作为系统适应性溶液，待用；

3)分别吸取上述的供试品溶液和系统适应性溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，

色谱条件包括：

色谱柱：C18柱，4.6mm*250mm，5μm，

检测器：UV检测器

检测波长：210nm

流速：1.0ml/min

柱温：35℃

采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱程序如下：

时间min 流动相A％ 流动相B％ 0 62 38 20 60 40 55 53 47 65 20 80 66 62 38 75 62 38

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