CN113933403A - 一种丙氨酰谷氨酰胺有关物质的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种测定丙氨酰谷氨酰胺或其制剂中的有关物质的方法，该方法采用HPLC进行检测；其中，色谱柱以十八烷基酰氨基键合硅胶为填充剂，以辛烷磺酸钠溶液‑乙腈(95︰5)为流动相。本发明方法能够有效分离丙氨酰谷氨酰胺的9种有关物质，专属性好，灵敏度高，能够实现准确定量测定丙氨酰谷氨酰胺或其制剂。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用高效液相色谱测定丙氨酰谷氨酰胺及其制剂中的有关物质的方法。
背景技术
丙氨酰谷氨酰胺，结构式如下所示：
是临床常用的氨基酸类药物，具有补充营养必须氨基酸、维持体内酸碱平衡、增强机体免疫力等功能。国内已有多家企业获批该原料药在上市制剂中使用，例如：赢创美诗简化股份公司、山东辰龙药业有限公司、武汉大安制药有限公司等。
杂质研究是药物质量评价的重要途径，丙氨酰谷氨酰胺在合成过程中有可能引入残留原料及其他有关物质，在储藏过程中还有可能产生降解产物，需要对其有关物质进行定量控制，以满足质量要求确保用药安全。
《中国药典》2015年版及USP43版均收载了丙氨酰谷氨酰胺的质量标准，采用HPLC法测定其有关物质，以氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱(即氨基柱)，以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(35︰65)为流动相，控制的杂质个数较少。
研究发现，当采用氨基色谱柱时，系统耐用性很差，流动相比例稍有变化，各有关物质色谱峰保留时间便会产生较大的变化。并且，氨基柱需要平衡很长时间，流动相更要保证较高浓度比例的有机溶剂(通常>50％)，色谱柱使用寿命较短。
因此，非常有必要开发一种新的测定丙氨酰谷氨酰胺及其制剂的有关物质的方法，以改善现有技术中存在的问题。
发明内容
针对现有技术检测丙氨酰谷氨酰胺及其制剂中有关物质存在的杂质分离效果差、个别杂质保留时间太长，保留时间漂移，色谱柱耐用性差等缺点，本申请提供了一种新的HPLC测定方法，通过对色谱柱和流动相的调整，能够准确有效地实现丙氨酰谷氨酰胺有关物质的测定。并且，色谱条件简单，耐用性好，可较好地控制丙氨酰谷氨酰胺的杂质及其降解产物的情况，在其质量控制方面具有重要意义。
根据丙氨酰谷氨酰胺原料药及其制剂的药典标准并结合其合成工艺，丙氨酰谷氨酰胺或其制剂中可能存在以下杂质，其杂质编号、名称及结构式如下表1所示。其中，杂质1、杂质3、杂质4、杂质6、杂质7、杂质10、SM1均收录在药典标准中。
表1丙氨酰谷氨酰胺有关物质
本申请所要解决的技术问题是提供一种测定丙氨酰谷氨酰胺及其制剂中的有关物质的方法，对上述表格中的杂质进行有效分离和定量测定。
本申请提供的测定方法为HPLC法，其色谱条件包括：色谱柱以十八烷基酰氨基键合硅胶为填充剂，流动相为辛烷磺酸钠溶液-乙腈体积比为95︰5的混合溶液。
在部分实施方案中，本申请提供的测定方法中，所述色谱柱为ACE Excel色谱柱。
在部分优选的实施方案中，所述色谱柱为ACE Excel 5 C18-Amide柱；更优选地，所述色谱柱为ACE Excel 5 C18-Amide 250mm×4.6mm。
本申请提供的测定方法中，还可以选择与ACE Excel 5 C18-Amide柱性能相似的色谱柱。
在部分实施方案中，本申请提供的测定方法中，所述辛烷磺酸钠溶液为辛烷磺酸钠的磷酸水溶液，辛烷磺酸钠的浓度为0.0034mol/L～0.0040mol/L。
在部分实施方案中，本申请提供的测定方法中，所述辛烷磺酸钠溶液的浓度为0.0037mol/L。
本申请提供的测定方法中，所述辛烷磺酸钠溶液可采用以下方法配制得到：取辛烷磺酸钠0.795g～0.935g，加水1000ml溶解，加磷酸0.5ml，混匀，即得。
在部分实施方案中，本申请提供的测定方法中，所述色谱条件还包括：检测波长为210nm，流速为每分钟0.8～1.1ml，柱温为23～30℃。
在部分优选的实施方案中，所述流速为每分钟1.0ml。
在部分优选的实施方案中，所述柱温为27℃。
本申请提供的测定方法中，色谱运行时间为45分钟。
在部分实施方案中，本申请提供的测定方法，包括以下步骤：采用HPLC进行检测；色谱条件包括：色谱柱以十八烷基酰氨基键合硅胶为填充剂，流动相为辛烷磺酸钠溶液-乙腈体积比为95︰5的混合溶液，检测波长为210nm，流速为每分钟0.8～1.1ml，柱温为23～30℃。
在部分优选的实施方案中，本申请提供的测定方法，色谱条件包括：色谱柱为ACEExcel 5 C18-Amide柱，流动相为0.0034mol/L～0.0040mol/L的辛烷磺酸钠溶液-乙腈体积比为95︰5的混合溶液，检测波长为210nm，流速为每分钟1.0ml，柱温为27℃。
本申请提供的测定方法中，所述丙氨酰谷氨酰胺的制剂选自丙氨酰谷氨酰胺注射液和注射用丙氨酰谷氨酰胺。
本申请提供了一种高效液相色谱测定丙氨酰谷氨酰胺及其制剂中的有关物质的方法，色谱条件简单，操作便捷，灵敏度高，耐用性好，可有效分离各杂质，快速准确地实现了丙氨酰谷氨酰胺有关物质的测定，保证了其质量可控。
本申请采用十八烷基酰氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱，对各有关物质均有较强的保留能力，可以耐受100％水相，耐用性好，色谱柱平均使用寿命长，应用范围更加广泛；
本申请采用辛烷磺酸钠溶液与乙腈的混合溶液作为流动相，能够将各有关物质完全分离，且系统运行时间仅45分钟，较现有技术大大缩短，有利于提高检测效率。
附图说明
图1对比例1中氨基柱初始使用的测定色谱图；
图2对比例1中氨基柱使用一段时间后色谱图；
图3采用Amide柱检测色谱图；
图4采用HILIC柱检测色谱图；
图5采用本申请的色谱条件进行系统适用性试验考察的色谱图；
图6采用十二烷基磺酸钠溶液-乙腈(95︰5)作为流动相缓冲盐检测色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
试验例1流动相中离子对试剂种类筛选
1)溶液配制：
稀释剂：水-乙腈(95︰5)(v/v)，用于供试品溶液配制；
辛烷磺酸钠溶液：取辛烷磺酸钠0.865g，加水1000ml溶解，加磷酸0.5ml，混匀，即得浓度为0.0037mol/L的辛烷磺酸钠溶液；
十二烷基磺酸钠溶液：取十二烷基磺酸钠0.865g，加水1000ml溶解，加磷酸0.5ml，混匀，即得浓度为0.0032mol/L的十二烷基磺酸钠溶液；
混合杂质贮备液：分别精密称取杂质1、杂质3、杂质4、杂质6、杂质8、杂质10、SM1、中间体1对照品各约10mg，分别置10ml量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密称取杂质7、杂质9对照品各约20mg，分别置5ml量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合杂质贮备液。
系统适用性溶液：取丙氨酰谷氨酰胺约80mg，精密称定，置20ml量瓶中，分别精密量取杂质1、杂质3、杂质4、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10、SM1、中间体1储备液各0.25ml，置同一20ml量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
2)色谱条件：
流动相1：辛烷磺酸钠溶液-乙腈＝95∶5(v/v)；
流动相2：十二烷基磺酸钠溶液-乙腈＝95∶5(v/v)；
色谱柱：以十八烷基酰氨基键合硅胶为填充剂(ACE Excel 5 C18-Amide 250mm×4.6mm)；
流速：1.0mL/min，检测波长：210nm，柱温：27℃；
精密量取上述的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，分别在流动相1及流动相2两种色谱条件下进行测定，考察离子对试剂对各杂质分离情况的影响。
3)试验结果
表2流动相缓冲盐种类考察
从上述试验可以看出，采用辛烷磺酸钠作为离子对试剂，配制流动相，在上述色谱条件下可以满足各杂质的分离要求。
试验例2流动相中缓冲盐浓度筛选
采用上述试验例1的色谱条件和系统适用性溶液，其中采用辛烷磺酸钠作为离子对试剂配制不同浓度的缓冲盐浓度作为流动相，考察各浓度流动相对杂质分离情况的影响。试验方案及结果如下表所示。
表3流动相缓冲盐浓度考察
在上述色谱条件下，主峰与其相邻杂质之间、杂质7与杂质9之间以及杂质8与杂质6之间的分离情况需要重点关注，其余杂质之间均能够实现有效分离，因此，对上述各成分之间的分离情况进行了统计。从上表试验结果可以看出，当辛烷磺酸钠浓度在0.0034mol/l～0.0040mol/l范围内时，主峰与其相邻杂质间最小分离度达到3.6，杂质8与杂质6之间的最小分离度不小于1.5，分离度均满足要求。
可见，采用辛烷磺酸钠作为离子对试剂配制流动相，显著提高了柱效、各杂质间的分离度和灵敏度，实现了各成分的完全分离。
试验例3系统适用性试验考察
采用上述试验例1的色谱条件和系统适用性溶液，其中采用0.0037mol/L的辛烷磺酸钠溶液-乙腈＝95∶5(v/v)作为本试验的流动相。
精密量取试验例1的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验数据及结果见下表，图谱见图5。
表4系统适用性测定结果
| 杂质编号 | 保留时间(min) | 分离度 |
| 杂质1 | 3.616 | / |
| 杂质4 | 4.032 | 2.9 |
| 杂质3 | 4.585 | 3.6 |
| 中间体1 | 7.297 | 12.9 |
| SM1 | 8.227 | 3.7 |
| 杂质7 | 11.052 | 9.8 |
| 杂质9 | 13.155 | 4.5 |
| 主峰 | 16.236 | 3.5 |
| 杂质10 | 19.610 | 3.7 |
| 杂质8 | 23.433 | 6.0 |
| 杂质6 | 24.746 | 1.8 |
由上表并结合色谱图可见，在本试验色谱条件下，测定丙氨酰谷氨酰胺及其10种杂质，各成分峰形良好，主成分与杂质之间以及各杂质相互之间的分离度均大于1.5，符合主峰与杂质间分离度大于1.5，杂质间分离度大于1.0的标准要求，分离效果好。
试验例4系统耐用性考察(柱温)
采用上述试验例1的色谱条件和系统适用性溶液，其中采用0.0037mol/L的辛烷磺酸钠溶液-乙腈＝95∶5(v/v)作为本试验的流动相，考察在不同色谱柱温条件下(23℃、25℃、27℃、30℃和35℃)，各杂质的分离情况。
精密量取试验例1的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验数据及结果见下表。
表5柱温考察
| 柱温 | 主峰与杂质间最小分离度 | 最小分离度(杂质6和杂质8分离度) |
| T＝23℃ | 3.6 | 1.7 |
| T＝25℃ | 3.6 | 1.5 |
| T＝27℃ | 3.6 | 1.3 |
| T＝30℃ | 3.5 | 1.1 |
| T＝35℃ | 3.6 | 0.3 |
从上述试验数据可知，柱温在23℃～30℃范围内时，主峰与其相邻杂质间的最小分离度大于1.5，较难分离的杂质6与杂质8之间的分离度大于1.0，能够实现有效分离，分离度满足要求。同时说明该色谱条件下，柱温在23℃～30℃范围内，耐用性良好。
试验例5系统耐用性考察(流速)
采用上述试验例1的色谱条件和供试品溶液，其中采用0.0037mol/L的辛烷磺酸钠溶液-乙腈＝95∶5(v/v)作为本试验的流动相，考察在不同流速条件下(0.8ml/min、0.9ml/min和1.0ml/min)，各杂质的分离情况。
精密量取试验例1的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验数据及结果见下表。
表6流速考察
| 流速 | 主峰与杂质间最小分离度 | 杂质间最小分离度(杂质6和杂质8分离度) |
| 0.8ml/min | 3.7 | 1.5 |
| 0.9ml/min | 3.7 | 1.4 |
| 1.0ml/min | 3.6 | 1.3 |
| 1.1ml/min | 3.6 | 1.4 |
从上表试验数据可以看出，在其它条件不变时，流速在0.8ml/min～1.1ml/min范围内，主峰与杂质间最小分离度大于1.5，较难分离的杂质6与杂质8之间的分离度大于1.0，分离度满足要求。因此，选择本测定方法的流速为0.8ml/min～1.1ml/min，流速耐用性良好。试验例6丙氨酰谷氨酰胺原料药检测
采用上述试验例1的色谱条件，其中采用0.0037mol/L的辛烷磺酸钠溶液-乙腈＝95∶5(v/v)作为本试验的流动相，检测丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质情况，试验数据见下表。
丙氨酰谷氨酰胺原料药来源：自制
供试品溶液制备：取丙氨酰谷氨酰胺原料药约100mg，置25ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定方法：精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算杂质含量。
表7测定结果
| 杂质编号 | 保留时间(min) | 峰面积％ | 分离度 |
| 杂质8 | 20.024 | 0.03 | 4.7 |
| 杂质6 | 20.671 | 0.04 | 1.3 |
试验结果显示，丙氨酰谷氨酰胺原料药中检出杂质8、杂质6，其他已知杂质均未检出。对比例1采用氨基柱测定
采用《中国药典》2015年版丙氨酰谷氨酰胺中有关物质的方法，以氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱(即氨基柱)，磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(35︰65)为流动相，检测波长为215nm，流速为每分钟0.7ml，柱温为30℃。精密量取上述试验例1的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，在该色谱条件下进行测定，记录色谱图，见图1。
上述氨基柱在正常使用频次条件下使用一个半月后，再次按照本试验条件进行重复试验，图谱见图2。
图1表明，采用《中国药典》2015年版有关物质方法，杂质3与杂质7重合，不能达到基线分离，干扰杂质检测；杂质6保留时间接近80分钟，出峰时间太晚，不利于检测效率；
由图2可知，该方法耐用性差，尤其是色谱柱耐用性差，在使用一段时间后，各有关物质色谱峰保留时间漂移，且杂质10与主峰未达到基线分离，干扰杂质检测。
对比例2采用Amide柱测定
采用三键键合的酰胺基色谱柱(Amide)(250mm×4.6mm，5μm)，以50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(调节pH＝4.5)︰乙腈＝(28︰72)为流动相，检测波长210nm，柱温35℃，流速为每分钟0.5ml。精密量取上述试验例1的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，在该色谱条件下进行测定，记录色谱图，见图3。
图3表明，采用上述色谱条件，检出9个已知杂质，杂质8与主峰重合无法分离，不能满足检测要求。
对比例3采用HILIC柱测定
采用Sepax亲水硅胶色谱柱(HILIC)(250mm×4.6mm，5μm)，以30mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(调节pH＝4.0)︰甲醇︰乙腈＝(25︰5︰70)为流动相，检测波长215nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取上述的系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，在该色谱条件下进行测定，记录色谱图，见图4。
图4表明，采用上述色谱条件，杂质和主峰保留时间过早，各杂质之间不能达到基线分离，干扰杂质检测。
Claims (9)
1.一种丙氨酰谷氨酰胺及其制剂中的有关物质的测定方法，其特征在于，采用HPLC进行检测，色谱条件包括：色谱柱以十八烷基酰氨基键合硅胶为填充剂，流动相为辛烷磺酸钠溶液-乙腈体积比为95︰5的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱为ACE Excel色谱柱。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱为ACE Excel 5C18-Amide250mm×4.6mm。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述辛烷磺酸钠溶液为辛烷磺酸钠的磷酸水溶液，辛烷磺酸钠的浓度为0.0034mol/L～0.0040mol/L。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，色谱条件还包括：检测波长为210nm，流速为每分钟0.8～1.1ml，柱温为23～30℃。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述流速为每分钟1.0ml。
7.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述柱温为27℃。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，色谱运行时间为45分钟。
9.根据权利要求1～8任一项所述的测定方法，其特征在于，所述丙氨酰谷氨酰胺的制剂选自丙氨酰谷氨酰胺注射液和注射用丙氨酰谷氨酰胺。
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