CN110412142A

CN110412142A - 一种检测a40926含量及有关物质的方法

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Publication number: CN110412142A
Application number: CN201910331936.5A
Authority: CN
Inventors: 张贵民; 刘志钰; 李旭娇
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2019-11-05

Abstract

本发明属于分析技术领域，具体提供了一种检测A40926含量及有关物质的方法，其采用以辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为磷酸二氢铵‑乙腈溶液。采用本发明方法既可以准确的检测出A40926中主成分B₀的含量，也可以将A40926中有关物质进行准确分离检测。为A40926生产过程中的质量控制提供了简便有效的检测方法。该高效液相分析方法具有灵敏度好、准确度高，数据重现性强以及耐用性好的优点。

Description

一种检测A40926含量及有关物质的方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种检测A40926含量及有关物质的方法。

背景技术

达巴万星是以A40926为前体的一种新型半合成糖肽类抗生素。达巴万星对革兰氏阳性菌具有很好的抗菌活性，其作用机制同万古霉素和替考拉宁相同。主要用于治疗由革兰氏阳性菌引起的复杂性皮肤、软组织感染。由于达巴万星具有更强的体内抗菌活性以及更长的半衰期，所以是目前最理想的第二代糖肽类抗生素。2014年5月23日美国食品和药物管理局(FDA)已批准达巴万星上市。

目前，达巴万星的前体A40926主要是通过微生物发酵来进行生产的，发酵液通过后期碱处理及纯化步骤得到的A40926为多组份混合物，其主要有关物质包括A₀、A₁、B₀、B₁、IB₀以及PA、PB等多种组分，其中B₀组分为A40926的主要的有效组分，是合成达巴万星的关键中间体。

A40926在纯化及存放过程中往往会存在不同有关物质间的相互转化及多种杂质的产生；这些有关物质及杂质的存在状况会严重影响A40926产品的质量控制和用药安全，因此，创建一种可以同时检测A40926含量及有关物质的检测方法非常必要。到目前为止，关于A40926的分离或检测方法的文献报道极少。

恩里科·塞尔瓦，鲁西诺·加斯塔尔多，格拉茨亚·布里塔，安吉洛·伯费，贝思·P·格尔德斯蒂英《生产抗生素a40926复合物及其纯因子PA、PB、A、B及B₀的方法》，中使用的HPLC检测方法A₀和A₁，B₀和B₁检出均为一个峰，计算B0含量时只是按常规的B因子的90％进行计算，计算结果不准确。

检测条件如下：

色谱柱：Ultraasphere ODS，5μm,4.6*250mm

流动相A：2.5g/L磷酸二氢钠溶液与乙腈体积配比为90:10，pH＝6.0；

流动相B：2.5g/L磷酸二氢钠溶液与乙腈体积配比为30:70，pH＝6.0；

流速：1.8ml/min；

检测波长：254nm；

洗脱：洗脱液B在洗脱A中占5％～60％的线性梯度，洗脱40分钟。

用以上文献检测方法，A40926供试品中的组份A₀和A₁，B₀和B₁均没有分开，其检出均为一个峰，统称为因子A和因子B。此文献方法，不能用于A₀、A₁、B₁、B₂、IB₀等有关物质的检测，在用于B₀的含量测定时，计算结果也不准确。

别一、郭明、袁建栋《一种生产达巴万星前体A40926的方法》中提到的检测方法仅可以用于检测A40926的浓度，不能用于A40926色谱纯度及有关物质的测定。原文如下：

检测条件如下：

色谱柱规格：C₁₈柱，4.6mm×250mm×5μm，波长:210nm，柱温:40℃；

流速：1mL/min，采用梯度洗脱；

流动相A:0.02M磷酸二氢钾水溶液(W/V):乙腈＝75:25(V/V)；

流动相B:0.02M磷酸二氢钾水溶液(W/V):乙腈＝62:38(V/V)；

此方法对于在B₀前期很多性质相近的杂质峰无法分离开，各种组分分离度低，且由于方法洗脱强度较低，一些极性比B₀小的有关物质无法洗脱，所以不能准确对A40926生产过程中B₀纯度及有关物质进行检测。如果长时间使用容易导致损坏色谱柱，连续进样时会影响数据分析的准确度与灵敏度。此方法梯度变化幅度较大，主成分及有关物质的洗脱前无平衡时间，致使数据检测的重现性较差，无法完全按保留时间进行定位。

为保证A40926的质量可控，确保其产品的有效性和安全性，本发明人建立一种专属性强、准确度高、重现性好、简便实用的检验方法。本方法既能定量关键中间体A40926-B₀，又能准确的检测出A40926的有关物质和工艺降解杂质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过高效液相色谱测定A40926中B₀及其有关物质的方法。该方法一方面能检测A40926-B₀(即A40926中主成分B₀)含量，另一方面，通过优选柱填料还能准确检测生产过程中产生的有关物质和工艺杂质，从而保证A40926的质量控制，确保了A40926产品的有效性和安全性。

本发明所述液相色谱条件如下：

色谱柱：以辛烷基或十八烷基键合硅胶为填料，色谱柱规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5μm。C₈和C₁₈色谱柱在检测B₀含量时可以相互替换，要对样品的主峰色谱纯度及有关物质进行检测时应选C₈色谱柱。

流动相：流动相采用的是磷酸盐溶液与乙腈的混合液；

优选地，流动相采用磷酸二氢铵溶液或磷酸二氢钠溶液与乙腈的混合液，磷酸二氢铵或磷酸二氢钠的浓度为0.02～0.03mol/L。

流动相A：磷酸盐溶液与乙腈体积配比为95:5，pH：5.5～6.0。

流动相B：磷酸盐溶液与乙腈体积配比为(35～45):(55～65)，pH：5.5～6.0。当配比(40～45):(55～60)时分离度稍优于(35～39):(61～65)，均能实现含量和有关物质测定。

流动相A、B可以按照现有技术的洗脱梯度进行洗脱以达到测定含量的目的。优选地，按照如下梯度洗脱程序进行洗脱：前期洗脱分离和后期洗脱平衡，前期洗脱分离程序为：0分钟时流动相B体积比为30％-35％，35-50分钟内流动相B体积比增加达到80％-90％，该洗脱程序可以测定含量和有关物质；优选的，所述前期洗脱分离程序中可以有几段时间维持流动相A和B浓度不变。

所述的后期洗脱平衡程序为：流动相B体积比由80％-90％较快速地降低至30％-35％；优选的，后期洗脱平衡可以有几段时间维持流动相A和B浓度不变。

在一个实施方案中，梯度为35分钟内流动相B体积比由30％增加到了80％，35～40分钟为等度洗脱，后期在40分钟时流动相B体积比开始由80％降低，至41分钟时降低到30％；具体梯度洗脱程序可以如下：

在一个实施方案中，梯度为50分钟内流动相B体积比由30％增加到了80％，50～54分钟为等度洗脱，后期在54分钟时流动相B体积比开始由80％降低，至55分钟时降低到30％；具体梯度洗脱程序可以如下：

在一个实施方案中，梯度为40分钟时流动相B体积比由35％增加到了90％，40～47分钟为等度洗脱，后期在47分钟时流动相B体积比开始由90％降低，至48分钟时降低到35％；具体梯度洗脱程序可以如下：

检测波长：270～285nm，进一步优选为280nm。

所述波长还可以是238nm，采用238nm时，分离效果与280nm接近。

柱温：40～55℃。

流速为0.9mL/min～1.2mL/min。

本发明的优势在于：①专属性强，首先能够提供A40926主成分B0含量的检测方法，其次通过优选C₈色谱柱填料可以对A40926的有关物质中的单一组分进行检测，各有关物质间不存在相互干扰，生产过程所用的空白溶剂对主成分及有关物质的检测也无干扰；②灵敏度高，本发明中A40926主成分B₀最低检测限为检测限浓度为1.387μg/mL，定量限为3.842μg/mL；③实用性强，此方法可以用于A40926有关物质及B₀含量检测的批量处理，保证了检测结果良好的重现性；④耐用性好，色谱条件中流速、柱温、波长等参数在本发明的范围内波动，不会对检测结果产生显著影响。

总之，本发明测定A40926有关物质及B₀含量的方法，A40926的B₀主峰及杂质峰分离度良好，理论塔板数高；基线噪音较小，拥有较好的专属性、灵敏度、准确度及耐用性等优点。

附图说明

图1：纯水溶剂的高效液相色谱图；

图2：60％乙醇溶剂的高效液相色谱图；

图3：A40926-B₀对照品溶液(购于加拿大MOLCAN CORPORATION)的高效液相色谱图；

图4：A40926-B₀对照品溶液(本公司生产制备)的高效液相色谱图；

图5：A40926粗品溶液主成分B₀含量测定的高效液相色谱图；

图6：A40926粗品溶液中有关物质测定的高效液相色谱图；

图7：A40926-B₀含量测定的线性与范围工作曲线；

图8：A40926主成分B₀定量限的高效液相色谱图；

图9：A40926主成分B₀检测限的高效液相色谱图。

图10：供试品在实施例9条件下的高效液相色谱图

具体实施方式

以下实施例对本发明加以详细说明，但本发明不限于这些实施例。

精密称定A40926粗品25.00mg，置于25ml容量瓶中，加纯水溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称定A40926-B₀对照品20.00mg，置于25ml容量瓶中，加纯水溶解并定容至刻度，摇匀，作为实施例1-10的A40926-B₀对照溶液；以溶解样品的溶剂纯水作为空白对照。实施例1-10所用A40926-B₀对照品原料为本公司按照现有技术方法自行制备得到的对照品；也可以购买自市售。

实施例1

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:45℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

流动相A：0.024mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为95:5，pH＝5.5～6.0；

流动相B：0.024mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为45:55，pH＝5.5～6.0；

洗脱梯度如下：

溶液配制：

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、理论塔板数及分离度，检测结果见表1。

表1

根据表1可以看出，A40926-B₀对照品及粗品主峰的保留时间平均值为24.499min，峰高平均值为238.98mAU，主峰分离度平均值为2.80，峰形良好，峰纯度良好，理论塔板数平均值为24917，且各杂质峰分离度均大于1.5，符合标准。本发明可以有效的检测A40926粗品的有关物质及B₀含量，本批A40926的B₀含量检测结果为73.0％，主峰色谱纯度检测结果为81.2％。

实施例2

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:40℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

流动相A：0.02mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为95:5，pH＝5.5～6.0；

流动相B：0.02mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为45:55，pH＝5.5～6.0；

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、主峰面积、理论塔板数及分离度，检测结果见表2。

表2

由上表可见，样品主峰峰高相应值为226.12mAU，主峰保留时间较实施例1中的检测条件推迟约1.1min，理论塔板数为23895，分离度2.55，仅主峰前保留时间为22.56min、22.73min的两个小杂质峰的分离度1.06，其他杂质峰分离度大于1.5。应用本实施例中的色谱条件测得本批A40926的B₀含量结果为73.1％，主峰色谱纯度检测结果为81.0％。与实施例1中检测结果相近。本实施例符合方法验证的要求，可用于样品检测。

实施例3

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:55℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

流动相A：0.03mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为95:5，pH＝5.5～6.0；

流动相B：0.03mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为45:55，pH＝5.5～6.0；

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、主峰面积、理论塔板数及分离度，检测结果见表3。

表3

由上表可见。样品主峰峰高相应值为237.4mAU，主峰保留时间较实施例1中的检测条件提前1.9min，理论塔板数为24928，与实施例1中分离的各项性能基本相同，在本色谱条件测得本批A40926的B₀含量结果为73.0％，主峰色谱纯度检测结果为81.0％，与实施例1中检测结果一致。

实施例4

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:270nm；

柱温:40℃；

流速:0.9mL/min；

流动相：

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、主峰面积、理论塔板数及分离度，检测结果见表4。

表4

由上表可见，主峰保留时间推迟约2.95min，理论塔板数为23236，分离度2.48，主峰响应值为216.38mAU。本实施例中各项检测性能，符合检测标准，应用本实施例中的色谱条件测得本批A40926的B₀含量结果为73.2％，主峰色谱纯度检测结果为81.3％，与实施例1中检测结果相近，仅灵敏度略低。

实施例5

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:285nm；

柱温:55℃；

流速:1.2mL/min；

流动相：

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、主峰面积、理论塔板数及分离度，检测结果见表5。

表5

由上表可见，主峰保留时间提前约3.7min，理论塔板数为22194，分离度2.33，主峰响应值为218.6mAU。应用本实施例中的色谱条件测得本批A40926粗品的B₀含量结果为73.2％，主峰色谱纯度检测结果为81.4％，与实施例1中检测结果相近。主峰前的两个杂质峰分离度1.17，其他杂质峰分离度均大于1.5。

实施例6

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:45℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

流动相A：0.024mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为80:20，pH＝5.5～6.0；

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、主峰面积、理论塔板数及分离度。

检测发现，将流动相A的配比设为0.024mol/L磷酸二氢铵溶液与乙腈的体积比为80:20时，主峰保留时间提前为9.770min，且主峰B₀与其前面的一杂质峰及主峰后面的组分B₁、B₂峰均未分离，导致主峰的峰纯度下降，面积不准确，无论样品的含量还是色谱纯度均不能被有效检测。因此流动相配比对分离效果至关重要。

实施例7

色谱条件

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:45℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

流动相A：0.03mol/L磷酸二氢钠溶液与乙腈体积配比为95:5，pH＝5.5～6.0；

流动相B：0.03mol/L磷酸二氢钠溶液与乙腈体积配比为45:55，pH＝5.5～6.0；

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

检测发现，在本色谱条件下，主峰保留时间及分离效果与实施例1中基本相同，对照品及供试品检测的色谱纯度及含量测定的结果完全一致。所以，流动相中添加磷酸二氢铵或磷酸二氢钠均能对样品中的各组分起到很好的分离效果。经验证其他相似性质的磷酸盐也可以起到较好的分离效果，但以磷酸二氢铵或磷酸二氢钠为最优。

实施例8

色谱柱:C₁₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:45℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

洗脱梯度如下：

溶液配制如实施例1中所述；

精密量取空白溶液、供试品溶液、A40926-B₀对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算其保留时间、峰高、主峰面积、理论塔板数及分离度，检测结果见表6。

表6

由检测结果可见，将色谱柱更换为同等规格的C₁₈色谱柱时，主峰出峰时间提前了约6min，主峰的分离度为1.93，主峰与前后杂质峰能较好分离，但组分A₁和B₀间由于出峰间隔较短，其中间的3-4个杂质峰完全没有被分离，而是堆合为一个不规则的色谱峰，无法准确对杂质进行分离和积分。本色谱条件下检测出的同一批的供试品B₀含量为73.1％，与实施例1一致。分离效果优于CN201510221758.2即别一、郭明、袁建栋《一种生产达巴万星前体A40926的方法》。因此，C₁₈色谱柱也能够解决检测含量的问题，但要对样品的主峰色谱纯度及有关物质进行检测时优选C₈色谱柱。

实施例9

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:45℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

洗脱梯度如下：

检测发现，在此检测条件下，组分A₀与A₁和B₀与B₁的分离度较差,前期检出峰无法分离,且使用该梯度检出的峰的个数明显偏少。所以,该梯度下的检测条件无法满足样品有关物质检测的要求，如图10。

该分离效果优于如下梯度：

但该分离效果显著低于本发明。

实施例10

色谱柱:C₈，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；

检测波长:280nm；

柱温:45℃；

流速:1.0mL/min；

流动相：

洗脱梯度如下：

检测发现，在此检测条件下，组分A₀与A₁和B₀与B₁的分离效果与实施例5接近。

将本实施例的流动相修改为：流动相A：2.5g/L磷酸二氢钠溶液与乙腈体积配比为90:10，pH＝6.0；流动相B：2.5g/L磷酸二氢钠溶液与乙腈体积配比为30:70，pH＝6.0；其他条件不变，检测结果与图10接近，无法满足样品有关物质检测的要求。

经过大量实验验证了本发明色谱条件中流速、柱温、波长等参数在本发明的范围内波动，不会对检测结果产生显著影响；而采用本发明流动相进行梯度洗脱分离效果与实施例1-5接近。

验证实施例1

主成分B₀含量检测的专属性实验。

1.取新鲜制备的纯水，用0.22μm滤膜过滤后作为样品的空白对照-1。

2.取样品提取过程所用溶剂60％乙醇，用0.22μm滤膜过滤后作为样品的空白对照-2。

3.称取购买自加拿大MOLCAN实验室的A40926-B₀的对照品10mg至10mL容量瓶，加水溶解并定容，作为对照品溶液-1。

4.称取本公司制备的A40926-B₀的对照品10mg至10mL容量瓶，加水溶解并定容，作为对照品溶液-2；所述A40926-B₀对照品是本公司采用现有技术方法制备的；也可以是市售品。

5.称取本公司生产的A40926粗品(与实施例1-10是同一批粗品)10mg至10mL容量瓶，加水溶解并定容；作为供试品溶液。

取上述配制溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，按照实施例1中所述条件进行检测，记录色谱图，检测图谱见图1-6，并考察分离度。实施例1检测结果见表7-1。

表7-1实施例1A40926专属性试验结果

	B<sub>0</sub>保留时间(min)	理论塔板数	分离度
				空白溶液-1	-----	-----	-----
空白溶液-2	-----	-----	-----
				对照品溶液-1	25.026	18368	2.81
对照品溶液-2	25.012	16473	5.43
				供试品溶液	25.201	17746	2.80
RSD％	0.297	-----	-----

表7-2别一、郭明、袁建栋《一种生产达巴万星前体A40926的方法》

由上表可见，别一、郭明、袁建栋《一种生产达巴万星前体A40926的方法》中所使用的液相检测方法平均保留时间约22.51min，保留时间的RSD值为0.459％，平均理论塔板数为16818，分离度平均值为1.64，仅能符合检测含量的要求。本专利方法检测的对照品溶液与供试品溶液的保留时间分别为25.026min、25.012min、25.201min，保留时间的RSD值为0.297％，两种方法对B₀组分保留时间定位准确，均可用于主成分B₀的含量测定；本专利方法中供试品溶液中主峰与相邻杂质的分离度为2.80，高于文献方法，分离度良好；且生产过程中使用的溶剂对本产品主成分及杂质的测定无干扰。可见本液相检测方法分离度及专属性良好。

验证实施例2

重复性实验。

2.1称取同一批A40926粗品五份于5个10mL容量瓶，加水溶解并定容，制成约1mg/mL的供试品溶液；

2.2将2.1中所制样品取20μL，注入高效液相色谱仪，按照实施例1中所述条件进行检测，计算主峰面积及纯度。检测结果见下表8。

表8重复性试验结果

由上表可见，本样品的色谱纯度的平均值为81.141％，且5次含量测量值的RSD为0.266％，B₀纯度的RSD为0.098％，符合方法验证的要求(≤2％)。所以可以鉴定为本批A40926粗品合格，符合B₀％≥70％的要求，含量为73.4％。可见本液相检测方法用于A40926-B₀含量及色谱纯度检测重复性良好。

按照别一、郭明、袁建栋《一种生产达巴万星前体A40926的方法》的检测方法检测本发明粗品,,主峰B₀与后面杂峰不能从基线分离，且在2.57min与2.75min，13.33min与13.72min，25.34min与25.73min等多处杂峰无法单独分开，不能用于主成分色谱纯度的测定。且文献方法在后期色谱柱平衡阶段31.59min，33.11min仍有杂质出现，若执行批量样品检测时，前期样品中难洗脱杂质会对后期样品的主峰分离机及实际面积造成干扰，影响含量检测的准确度。

验证实施例3

测定主成分B₀含量的线性实验。

精密称定A40926-B₀对照品(是本公司制备的，也可以是市售品)25(24.97)mg，置25mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL各置10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。参照实施例1色谱条件，分别取各线性溶液20μL进样分析，计算峰面积与浓度的线性关系，检测结果见表9。工作曲线见图7。

表9 A40926-B₀含量测定线性与范围试验结果

结果表明：本发明涉及的检测方法用于检测主成分B₀定量时，在0.0250mg/mL～0.9988mg/mL的浓度范围内线性关系良好，相关系数r＝0.9999。

验证实施例4

精密度实验。

配制浓度约为1mg/mL的A40926粗品溶液，其他条件参照实施例1进行检测，重复进样6针，记录各有关物质的色谱纯度。检测结果见表10。

表10精密度实验

样品名称	A<sub>0</sub>(％)	A<sub>1</sub>(％)	IB<sub>0</sub>(％)	B<sub>0</sub>(％)	B<sub>1</sub>(％)
						A-1	0.442	1.941	1.110	81.058	2.814
A-2	0.44	1.935	1.136	81.504	2.859
						A-3	0.447	1.968	1.128	81.214	2.878
A-4	0.436	1.962	1.142	81.224	2.892
						A-5	0.436	1.963	1.123	81.133	2.861
A-6	0.442	1.951	1.126	81.145	2.875
						AV	0.441	1.953	1.128	81.213	2.863
SD	0.004	0.012	0.010	0.155	0.025
						RSD(％)	0.867	0.619	0.895	0.191	0.859

由上表可见连续进样后，六次检测的各有关物质的含量(HPLC％)RSD值均＜1％，可见，本液相检测方法用于A40926有关物质的检测，精密度及重现性良好，使用批量的连续进样，样品间不存在相互影响。

而按照别一、郭明、袁建栋《一种生产达巴万星前体A40926的方法》文中所述方法，对样品中多种杂质均无法分离开，所以该文献中方法不能用于A40926有关物质的检测。

验证实施例5

检测限及定量限实验。

取实施例1相同的A40926-B₀对照品溶液，用纯水逐步稀释，其他条件参照实施例1，以信噪比S/N≥10为定量限，见附图8。以信噪比S/N≈3为检测限，HPLC图谱见附图9。检测结果见表11。

表11 A40926-B0定量限和检测限

由上表可见,本液相分析方法检测A40926主成分B₀的定量限的浓度为3.842μg/mL，定量限为76.840ng；检测限浓度为1.387μg/mL，检测限为27.740ng。

验证实施例6

耐用性实验。

6.1将检测柱温设置为40℃，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

6.2将检测柱温设置为55℃，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

6.3将流速设置为0.9mL/min，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

6.4将流速设置为1.2mL/min，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

6.5将检测波长设置为270nm，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

6.6将检测波长设置为285nm，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

6.7将检测波长设置为238nm，其他色谱条件如实施例1所述，检测结果见表12。

使用与验证实施例1对照品溶液-2相同的对照品。

表12 A40926检测方法的耐用性试验结果

由上表可见，改变流速、柱温、波长以及更换色谱柱等各条件下检测的结果RSD值均在2.0％以内，所以，色谱条件中流速、柱温、波长等参数在本发明的范围内波动，不会对检测结果产生显著影响，证明本检测方法耐用性好。

综上所述，本发明中所使用的液相检测方法，可以很好的实现A40926中B₀的含量测定，优选色谱柱填料后还可实现有关物质的检测。本检测方法对主峰B₀及有关物质的分离度高，专属性强，重现性好。可以更准确有效的控制A40926产品的质量，且本方法耐用性良好，操作简便,适于工业化应用。

Claims

1.一种检测A40926的方法，其特征在于，采用以辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为磷酸盐溶液和乙腈不同体积配比的A、B两种流动相，进行梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸二氢铵或磷酸二氢钠；磷酸盐溶液的浓度为0.02～0.03mol/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流动相A为磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为95:5，pH值为5.5～6.0。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流动相B为磷酸二氢铵溶液与乙腈体积配比为35～45:55～65，pH值为5.5～6.0。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，梯度洗脱时，流动相A、B按照如下梯度洗脱程序进行洗脱：设置前期洗脱分离和后期洗脱平衡，前期洗脱分离程序为：0分钟时流动相B体积比为30％～35％，35～50分钟内流动相B体积比增加达到80％-90％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度洗脱时柱温40～55℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度洗脱时流速为0.9～1.2mL/min；梯度洗脱时检测波长270nm～285nm；检测波长还可以是238nm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5μm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的色谱柱填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶。