CN110118847B - 确定多位点peg修饰蛋白质修饰位点的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种多位点修饰修饰位点分析技术，实现了对4个及以上修饰位点的PEG化蛋白修饰位点定位，避免了对无法测准分子量的PEG修饰肽段的直接测定，而选择对PEG修饰肽段特异性回收并再次酶切后对不含被修饰位点的肽段进行精准的分子量测定，与理论肽段对比后得出准确的PEG修饰位点。本方法实现了对平均修饰度较高高的修饰位点较多的蛋白的修饰位点测定，对PEG修饰肽段具有特异性，简化检测步骤，减少工作量，操作方便，易于实施，重现率高。

Description

确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法
技术领域
本发明属于蛋白质修饰后结构分析方法，特别的涉及蛋白质修饰位点分析方法。
背景技术
蛋白质类药物主要包括多肽、酶、细胞因子、激素、抗体等一些具有特殊功能的蛋白质，随着生物技术的发展，人们可以通过发酵工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程等途径获得所需的蛋白质。但经过大量的临床研究发现，未经任何修饰的药物在体内具有半衰期短、稳定性差、易被体内酶降解、免疫原性强等一系列缺陷。为此，人们尝试通过多种途径对蛋白类药物进行修饰改造以适应临床应用。
其中聚乙二醇(PEG)是重复化学结构乙二醇的多聚物，PEG分子中存在大量乙氧基能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能够改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性。PEG是经FDA批准的极为少数的可作为体内注射药用的聚合物之一。蛋白类药物经过聚乙二醇修饰，可延长体内半衰期，减少给药次数，增大药物的分子量，肾小球清除减少；降低蛋白酶的酶解作用；与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物；屏蔽药物的抗原位点，降低免疫原性；增加药物的稳定性和溶解性。1991年，第一种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG腺苷脱氨酶(Pagedemase)获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症，目前已有许多PEG修饰蛋白药物应用于临床(见表1)，同时还有更多正处于临床研究阶段。
2000年以后上市的PEG修饰药物如下(参考“药渡”和《PEGylation ofBiologics》)：
表1于2000年以后上市的常见PEG修饰药物
Figure BDA0002062443830000011
Figure BDA0002062443830000021
尽管聚乙二醇修饰蛋白质具有较多的优点，如延长半衰期、减弱蛋白的免疫原性，在临床上取得了更好的疗效和较大的商业价值，但聚乙二醇修饰技术本身存在的不足也不容忽视，如多位点修饰和异位修饰等，会造成修饰产物不均一，不同修饰率与修饰位点的修饰产物又具有不同的理化特性、药理活性和安全性，因此会影响到聚乙二醇化蛋白的质控与安全有效性。
为了确证聚乙二醇修饰药物的安全性和有效性，有必要对其修饰后结构，包含修饰位点与修饰度、修饰率等进行严格的质量控制，特别是要对修饰位点进行确证，以确保结构的一致性和修饰后结构的均一性。
目前国内外大多采用质量肽图的方法确定修饰位点。已上市的多数PEG修饰产品只有一个修饰位点，采用质量肽图的方法比较容易确定其修饰位点。而国内长春金赛生产的多位点修饰的PEG-rhGH有5个修饰位点。中检院通常采用两种方法分析PEG-rhGH的修饰位点，一是液相肽图法，该法详述了建立适宜的反相液相肽图分离方法，通过比较修饰前后的肽图，来推断PEG的修饰位点；二是离子交换分离修饰位点不同的蛋白质的方法，该法是经过离子交换分离各异构体后分别进行酶切肽图分析，将该图片与未修饰的rhGH的肽图比较，PEG肽图中缺失肽段中赖氨酸即为PEG修饰位点，或进一步分离、收集位点异构体肽图中的PEG修饰肽段，通过N端测序，确定修饰位点。该方法仅满足于修饰率低，且修饰位点分布均一的产物，但对修饰率更高，修饰位点分布更广的修饰物则无法确定修饰位点。
中国专利CN 102507824B，聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法公开了复合干扰素86位点变胱氨酸突变体聚乙二醇单修饰产物修饰位点分析方法，其中第一次酶解产物分离采用TSK-GEL G3000SWxl，“保留时间对比法”确定“连接聚乙二醇部分的酶解片段的出峰位置”后进行N端测序和第二次酶解及N端测序，通过与理论酶解序列进行比对确定修饰位置；另该专利公开了PEG-IIFNm1的修饰位点方法，该方法是第一次和第二次酶解后采用Waters Symmetry 300C18反相色谱柱进行分离，收集PEG相关肽段。该专利还公开了PEG-G-CSF和血管内皮生长因子聚乙二醇单修饰产物的修饰位点分析方法等。
由于聚乙二醇的聚合链长度不确定性，质谱较难读出PEG修饰肽段的准确的分子量信息，只能通过与理论酶解序列的肽图进行一一对比的方式寻找缺失的肽段，从而进行大致的判断修饰肽段，准确度不高，且工作量非常大。
发明内容
为了提高修饰位点判断的准确度，缓解由于聚乙二醇的不均一性导致的位点判断难度大、工作量大的问题，本发明提供了一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法。本发明所涉及的修饰个数包含4个至20个，修饰位点可以为N端修饰、巯基修饰、赖氨酸修饰等。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
(S1)对修饰蛋白质样品进行第一次酶切；
(S2)对酶切样品进行分析，确定修饰相关肽段；
(S3)对修饰相关肽段进行回收和浓缩；
(S4)对回收肽段进行检测，确定修饰位点，或进行二次酶切；第二次酶切使用至少一种与第一次酶切不同的工具酶；
(S5)对S4步骤中二次酶切产物进行测定，识别因修饰导致的二次酶切过程中产生的特异性肽段及肽图中因修饰而缺失的肽段，推断确定修饰位点。
其中所述修饰位点主要为Lys氨基修饰位点和Cys修饰位点。
本发明中，步骤(S1)是根据理论修饰位点选取合适的酶对待检测样品进行第一次酶切，这些酶可以为胰蛋白酶(Trypsin)、Glu-C、赖氨酸内肽酶(Lys-C、Lys-N)、谷氨酸内肽酶(V8)、Arg-C、天冬氨酸酶(ASP-N)、胃蛋白酶、糜蛋白酶等，需要注意的是：①选择的酶应包含较多理论酶切位点；②酶切的比例为1:20～1：500；酶切pH应为5.0-11.5之间，酶切时间应为2～24h，使其完全酶切。
本发明中，步骤(S2)对酶解样品的检测方法包括液相色谱(LC)检测方法、紫外检测(UV)、质谱检测(MS)、蒸发光检测器(ELSD)、示差折光检测器(RI)等。优选紫外检测器和蒸发光检测器。LC的方法可选用反相高效液相色谱(RP-HPLC)、SEC-HPLC、SAX-HPLC、SCX-HPLC中的一种或几种，优选RP-HPLC、SEC-HPLC。LC分离的反相色谱柱可选择C18，C4等。
本发明中，步骤(S3)中所述对修饰肽段进行回收所采用的方法选用固定化的层析法，固化手段包括凝胶和磁珠等，层析可选择反相层析、分子筛层析等，优选为PEG抗体亲和层析，用PEG抗体IgM特异性的回收PEG肽段。
第一步是纯化单克隆细胞培养液中的IgM抗体，第二步是抗PEG-IgM单克隆抗体预处理，第三步是抗PEG-IgM抗体偶联琼脂糖填料，第四步就是上样第一次酶解后的样品，对PEG肽段进行洗脱，收集洗脱液为特异性的PEG肽段。
对回收肽段进行浓缩所采用的方法为冷冻干燥或超滤。
本发明中，步骤(S4)二次酶切所使用的工具酶包括但不限于Trypsin、Lys-C、Glu-C、ASP-N、胃蛋白酶、CPB、Kex2等，其特点在于①选择的酶应与一次酶切的酶不同；②可以选择一种酶或多种酶；③酶切的比例为1:20～1：500，酶切pH应为5.0-11.5之间，酶切时间应为2～24h，应使其完全酶切。
本发明中，步骤(S5)中对所述二次酶切产物的测定，可选用LC-MS方法，其中LC可以为反相(RP)、分子筛排阻(SEC)、离子交换(IEC)、亲和层析、疏水层析；优选分子筛排阻(SEC)、离子交换(IEC)、反相层析(RP)；最优选反相层析(RP)；检测所使用的多种检测器包括但不限于紫外检测器(UV)、示差折光指数检测器(RI)、蒸发光散射检测器(ELSD)、质谱检测器(MS)，优选紫外检测器(UV)和质谱检测器(MS)，优选紫外和MS检测器。
本方法通过第一次酶切未修饰和修饰样品，经分析比较后初步确定修饰肽段。由于PEG的不均一性，修饰肽段在质谱上分子量信息不能被准确读取，但从质谱信号可以初步确定是否被修饰；另外采用蒸发光检测器比较未修饰和修饰蛋白的肽图，也可以发现被修饰肽段因PEG的原因，吸收值特别高；通过以上两个方法均能初步确定修饰肽段，且由于PEG的疏水性，修饰肽段在色谱图中的保留时间均滞后。
第二步则是回收这部分待确认位点的修饰肽段。收集PEG相关肽段，进一步浓缩后进行回收肽段确认。
第三步则是采用与一次酶切不同的一种酶或多种酶对回收的肽段进行二次酶切。当使用多种酶时是将样品分成若干份用不同的酶分别进行二次酶切，酶切后进行LC-MS分析，计算新出现肽段的分子量，通过理论序列比对该肽段及所述第一次酶切中的大肽段，从而确定修饰位点。
其中对PEG化蛋白修饰位点分析的方法主要是采用蛋白酶酶解后进行高效液相分析，但由于聚乙二醇的不均一性，质谱较难读出其准确的分子量信息，但质谱对不含PEG的肽段具有高度的特异性，能得出每个肽段准确的分子量信息，根据该准确的分子量信息判断其属于哪个未修饰酶切理论肽段的哪部分片段，再根据该片段的序列进一步判断修饰位点。
鉴于此，本发明公开的一种多位点修饰修饰位点分析技术，实现了对4个及以上修饰位点的PEG化蛋白修饰位点定位，避免了对无法测准分子量的PEG修饰肽段的直接测定，而选择对PEG修饰肽段特异性回收并再次酶切后对不含被修饰位点的肽段进行精准的分子量测定，与理论肽段对比后得出准确的PEG修饰位点。本方法实现了对平均修饰度较高高的修饰位点较多的蛋白的修饰位点测定，对PEG修饰肽段具有特异性，简化检测步骤，减少工作量，操作方便，易于实施，重现率高。
附图说明
图1为本发明的实验流程图。
图2为PEG修饰蛋白质第一次酶切肽段的质谱分析图。
图3为抗PEG抗体亲和层析后回收的PEG肽段的色谱图。
图4为PEG肽段第二次酶切后收集肽段的色谱图。
具体实施方式
以下是本发明的非限定实施例，将有利于本领域的普通技术人员进一步理解本发明。
本研究主要参考发明内容所述多酶切确定修饰位点分析的原理，采用两次以上酶切的方法，即第一次酶切确定修饰肽段，对修饰肽段进行回收与浓缩、对修饰肽段进行二次酶切后进行LC-MS分析确定修饰位点。具体实验方法建立如下：
由于多位点修饰蛋白质样品较少，因此本实验只选取了尿酸酶蛋白(重庆派金生物科技有限公司)经5kD聚乙二醇(日本NOF)饱和修饰后得到的聚乙二醇化尿酸酶作为待检测蛋白质。尿酸酶蛋白分子量340kD，主要修饰方式为5kDPEG定点修在Lys残基上。该蛋白含27个Lys，可修饰于任意位点上。由于期望实现修饰质量的可控，因此对修饰度及修饰位点均要进行质控。对于如此多且复杂的修饰位点进行分析，采用以下步骤进行位点确证(各步骤顺序及关系见图1)：
S1.第一次酶切的方法建立和检测：
取一定浓度的未修饰蛋白(尿酸酶)和修饰蛋白(聚乙二醇化尿酸酶)，分别用酶切缓冲液(25mmTris-Hcl，10％乙腈，pH9.0)调整蛋白浓度为1mg/ml，按1:50加入Lys-C酶(重庆派金生物科技有限公司)，在37度水浴中反应18h。
S2.对第一次酶切样品进行分析
采用RP-HPLC，在LC-MS上进样100ul，记录色谱图，比较未修饰蛋白和修饰蛋白在质量肽图中的差异(酶切样品的质谱图见图2)。
S3.修饰肽段的抗PEG抗体亲和层析
对修饰肽段采用抗PEG抗体(重庆派金生物科技有限公司)的亲和层析(酶切后回收肽段的色谱图见图3)。其中F3、F4、F5、F6分别表示色谱图中的第三、第四、第五、第六峰。亲和层析回收的肽段与回收前肽图进行比较，确定为回收的PEG肽段。
S4.修饰肽段二次酶切
取修饰肽段，分别选择胰蛋白酶(Sigma，货号P6181)和V8酶(上海雅心生物技术有限公司，序列级)酶切，用酶切缓冲液(100mmol/LTris-hcl，pH8.5)溶解后按蛋白质：酶(100：1)的比例在37度中反应15h。
S5.进行LC-MS分析。
此步骤使用的设备分别为Thermo Ultimate 3000和MSQ Plus。所得到的色谱图见图4。
计算新增的肽段极其相对应的分子量，确定修饰位点。
(1)尿酸酶序列及Lys-C酶切后理论肽段：
尿酸酶序列
TYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATTVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL
Lys-C酶切后理论肽段：
Figure BDA0002062443830000061
Figure BDA0002062443830000071
Figure BDA0002062443830000081
由上表可知Lys-C于易被PEG修饰的K位点处将样品切开，如果某位点被PEG修饰，则在第一次酶切过程中，受PEG影响，该位点处不会被切开，而会随同其前后肽段一起被特异性收集，再被第二次酶切。
(2)第二次酶切新出现肽段
二次酶切后层析并进行质谱检测，通过分子量判断识别出的肽段序列，并与理论肽段进行对比分析，判断识别到的肽段序列属于哪个理论肽段的一部分。
F4回收肽段分析1(V8酶酶切)
Figure BDA0002062443830000082
F4回收肽段2(胰酶切)
Figure BDA0002062443830000083
(3)结果分析：
(1)检测到“VLHIQR”，为T5的前部分肽段，不含K
检测到T5的前部分不含K肽段，说明：
①检测到T5的前部分肽段，说明T4或T5被修饰；由于二次酶切针对的是特异性收集的PEG修饰肽段，在此样品中发现T5的部分肽段，说明其临近位点被修饰，即T4或者T5的K位点被PEG修饰。
②由于检测到的肽段为T5的前部分肽段，即该肽段序列从T5的前端开始，说明在第一次酶切过程中T4与T5已经断开，因此说明T4末端的K位点未被修饰。
③由于T4未被修饰，因此被修饰的为T5末端的K位点。
(2)检测到T14后部分含K肽段
检测到T14的含K肽段，说明：
①由于肽段含K，可知T14未被修饰；
②由于肽段含K，说明第一次酶切中T14与T15已经被切开；
③由于肽段为T14的一部分，说明T14因临近肽段被修饰而与其临近肽段在第一次酶切中未断开，从而在层析收集过程中被收集，而T14与T15在第一次酶切中断开，所以推断T14与T13在第一次酶切中并未断开，而这只能是因为T13被修饰而导致的。
由此得出结论：
二次酶切后检测到T14后部分含K肽段→T13被修饰，T14未被修饰。
(3)检测到T15前部分不含K肽段
与上述分析(1)中原理相同，可得出结论：
二次酶切后检测到T15前部分不含K肽段→T15被修饰，T14未被修饰。
(4)检测到T17后部分含K肽段
与上述分析(2)中原理相同，可得出结论：
检测到T17后部分含K肽段→T16被修饰，T17未被修饰。
(5)检测到T25后部分含K肽段→T24被修饰，T25未被修饰。
说明：由于经过多次重复实验，得出的结论相同，因此本文只提供了其中一次实验的相关谱图。
结论：如检测到的肽段序列含K，则说明该肽段序列所对应的第一次酶切理论肽段序列未被修饰，其前一段理论肽段序列的K位点处被修饰；如检测到的肽段序列不含K，并且不含K肽段序列从该理论序列前端开始，则说明该肽段序列所对应的第一次酶切理论肽段序列被修饰，前一段理论肽段序列的K位点未被修饰。
由于二次酶切后所检测识别的新肽段序列是未被修饰的肽段，因此通过质谱可以精确测定其分子量，从而推断出其对应的肽段序列，使得根据此质谱检测数据和上述结论推断而出的修饰位点结果也是精确的，实现了对于多位点修饰蛋白质各修饰位点的确定。并且本测定分析方法步骤少、原理简单、可操作性和重复性强、结果精准，便于大范围推广。

Claims (4)

1.一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.对未修饰的尿酸酶蛋白和经5KD PEG多位点PEG修饰的尿酸酶蛋白采用Lys-C酶进行第一次酶切，得到理论肽段序列，并根据理论肽段序列分析未修饰和修饰尿酸酶蛋白的质量肽差异，初步得到被修饰的肽段；
S2.回收并确认S1的得到的被修饰的肽段；
S3.对S3的被修饰的肽段采用胰蛋白酶和V8酶进行第二次酶切得到新增的肽段；
S4.计算新增肽段的分子量，并进一步判断确定修饰位点；
判断的方法为根据第一次酶切的酶切特性，明确易被酶切的位点为K，若新增肽段序列含K，则说明该肽段序列对应的理论肽段序列未被修饰，其前一段理论肽段序列的位点K处被修饰；反之，若不含K，并且为对应理论肽段序列的前端，则说明该肽段序列对应的理论肽段序列被修饰，前一段理论肽段序列的K位点未被修饰。
2.根据权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法，其特征在于，所述第二次酶切得到新增的肽段是未被PEG修饰的肽段。
3.根据权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法，其特征在于：所述多位点PEG修饰尿酸酶蛋白有5个修饰位点，所述修饰位点包括Lys氨基修饰位点和Cys氨基修饰位点。
4.根据权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法，其特征在于：S1，采用RP-HPLC和LC-MS分析未修饰和修饰蛋白的质量肽差异；S2，采用亲和层析回收肽段；S4,采用LC-MS计算新增肽段的分子量。
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