CN115980336B - 一种白介素-2标准品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白介素‑2标准品及其制备方法，包括如下步骤：(1)白介素‑2样品的制备；(2)白介素‑2样品的纯化；(3)白介素‑2样品的稀释；(4)白介素‑2的表征；(5)白介素‑2标准品含量标准值的测定。本发明制备方法制得了高纯度标准品蛋白样品，并且保证了样品的活性。并采用氨基酸的同位素稀释质谱法对样品进行定值，保证量值结果的准确性。本发明所制得的人白介素‑2标准品可用于制药质量控制环节，保证药品性能评价的关键参数测量结果的准确性。

Description

一种白介素-2标准品及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质标准品技术领域，特别是涉及一种白介素-2标准品及其制备方法。

背景技术

人白介素-2(IL-2)是基因重组药物，是一种非糖基化蛋白，生物活性与天然IL-2相同，含有133个氨基酸残基，相对分子质量为15.5k，其药理作用在于增强免疫应答。人白介素-2可提高人体对病毒、细菌、真菌、原虫等感染的免疫应答，使细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、天然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。它还可以增加抗体和干扰素(IFN)等细胞因子的分泌，在机体免疫应答中具有非常重要的作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。1992年，人白介素-2在美国经FDA批准上市，批准的临床应用适应证为肾癌、血管肉瘤和黑色素瘤。制药工艺中，重组人白介素-2由大肠杆菌高效表达后，经发酵、分离和高度纯化后获得。

中国药品生物制品检定所在1993年研制出了重组人白细胞介素-2活性测定标准品，其唯一的特性量值为效价400IU/支，用于《药典》中重组人白介素-2的活性测定。但是，该标准品量值为活性单位，无溯源性。该标准品特性量参数单一，用途局限，无法胜任作为“量值标准”参与重组人白介素-2药物生产过程和质量控制。药物生产环节的质量控制，需要标准品的量值准确、具有溯源性，可在测量过程中用作标准品建立准确的标准曲线，实现蛋白质含量的绝对定量，同时也可以为蛋白表征新方法的开发提供评价标准；亦可用作系统适用性评价、方法建立、仪器验证、相关能力验证等。

另外，二硫键结构正确是生物学功能的前提和基础。IL-2分子含有3个半胱氨酸，分别位于氨基酸序列的58、105、125位，其中58位与105位半胱氨酸之间所形成的链内二硫键对于保持IL-2生物学活性起重要作用。第125位Cys游离，易形成二硫键错配或分子间二硫键。

因此，本领域亟需开发一种可应用于相关重组蛋白药物研发和生产过程的参数量值溯源性建立，并可用于校准和检定化学分析仪器，在判定方法的准确度及产品质量控制等方面起到量值溯源和传递作用的白介素-2标准品。

发明内容

本发明的目的是提供一种白介素-2标准品及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种白介素-2标准品的制备方法，包括以下步骤：

(1)白介素-2样品的制备：以大肠杆菌重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，进行裂解，收集上清和沉淀；

(2)白介素-2样品的纯化：采用分子筛和离子交换对样品进行纯化，得到白介素-2标准品候选物；

(3)白介素-2样品的稀释：将白介素-2标准品候选物用PBS溶解，稀释到浓度为0.01～0.1mg/g，得到稀释的白介素-2标准品侯选物溶液；

(4)白介素-2标准品的理化性质表征

(4a)采用蛋白纯化分析方法对白介素-2标准品侯选物的纯度进行表征；

(4b)采用质谱法对白介素-2标准品侯选物的分子量进行测定，测定结果与理论分子量相吻合；

(4c)对白介素-2标准品侯选物的蛋白质进行鉴定；

采用胰蛋白酶对白介素-2进行酶切，酶切后的肽段采用串联质谱法对蛋白酶切产生的肽段进行鉴定，然后通过BioPharma Finder软件进行分析，结果应当与蛋白的序列对应的蛋白质一致；

(4d)白介素-2二硫键分析；

采用胰蛋白酶对白介素-2进行酶切，酶切后的肽段采用串联质谱法对蛋白酶切产生的肽段进行鉴定，对二硫键进行分析；

(4e)采用毛细管等电聚焦电泳法对白介素-2的等电点测定，测得等电点应与理论值一致；

(5)基于氨基酸分析的高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定白介素-2的含量

用分析天平准确称量100mg稀释后白介素-2溶液于安踣瓶中，按质量比1∶1分别加入提前配制的标记的缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的混合标准溶液，准确称量，记录数据。混匀后，于离心浓缩仪，离心浓缩至干，取出加入800μL 6mol/L HCL，涡旋混合均匀后，通氮密封，于110℃烘箱中水解48h，通氮吹干，0.1％甲酸水溶液复溶，过0.22μm滤膜进行测定。

其中，步骤(2)中，采用蛋白纯化系统对白介素-2的原料进行纯化，分别采用分子筛和离子交换柱对样品进行纯化，在210nm吸光度监测出峰时间，收集出峰时间段内的溜分液。

其中，所述步骤(4a)中，白介素-2纯度分析方法为SDS-PAGE凝胶电泳法、反相高效液相色谱法和凝胶排阻高效液相色谱法。

其中，所述步骤(4b)中，白介素-2相对分子质量测定方法为：采用飞行时间串联质谱对完整蛋白的分子量进行检测，样品溶于0.1％甲酸水溶液，配置浓度为1.0mg/mL；

色谱柱为ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg；柱温80℃，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，流速0.3mL/min；

洗脱梯度：(0～1.00)min，15％B；(1.00～8.00)min，(15～80)％B；(11.50～15.00)min，15％B；进样量2μL；

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：(600～5000)Da，离子源温度：350℃，去簇电压(Declustering Potential，DP)275v，碰撞能(Collision energy，CE)10V。

其中，所述步骤(4c)中，白介素-2鉴定方法的前处理方式为：

(1)润洗：加入100uL 50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗；

(2)溶液置换：16000r离心10min，100μL浓度为1μg/uL的样品加入超滤管滤膜；

(3)变性：加入100μL 7M盐酸胍变性；

(4)还原：加入4μL 1M DTT置于42℃恒温1h；

(5)烷基化：加入10μL 1M IAA室温避光30min；

(6)离心，加入100μL 50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，至超滤膜溶液至干，重复三次；

(7)酶解：样品与胰蛋白酶质量比30:1，37℃烘箱恒温4h；

(8)倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1％。

其中，所述步骤(4d)中，鉴定方法的前处理方式为：

(1)润洗：加入100uL 50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗；

(2)溶液置换：16000g离心10min，100μL浓度为1μg/uL的样品加入超滤管滤膜；

(3)变性：加入100uL 7M盐酸胍变性；

(4)离心：加入100uL 50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，至超滤膜溶液至干，重复三次；

(5)酶解：样品与胰蛋白酶质量比30:1，37℃烘箱恒温4h；

(6)倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1％。

其中，所述步骤(5e)中，基于等电点(pI)差异分析的毛细管等电聚焦电泳方法测定白介素-2样品的等电点，所配检测器为紫外检测器，检测器波长为280nm，NCHO涂层毛细管50μm I.D.数据处理软件为32Karat^TM软件。

其中，所述步骤(5)中，选择苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸的同位素标记方法进行定值。采用以下公式计算合成的特征肽段的含量，

其中，

C_AA：白介素-2样品中Phe、Val、Pro的浓度(mg/g)；

P：氨基酸标物纯度；

m_标：样品中加入标记氨基酸的质量，mg；

R_样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记/标记；

I₁：低标氨基酸实际质量比，非标记/标记；

I₂：高标氨基酸实际质量比，非标记/标记；

R₁：低标氨基酸峰面积比，非标记/标记；

R₂：高标氨基酸峰面积比，非标记/标记；

M：平行样中白介素-2样品溶液的质量，g；

其中，

C_IL-2：白介素-2的浓度，mg/g；

M_IL-2：白介素-2的相对分子质量；

C_AA：计算出的白介素-2样品中Phe、Val、Pro的浓度，mg/g；

n：白介素-2样品中氨基酸个数；

M_AA：Phe、Val、Pro的相对分子质量；

白介素-2的浓度取Phe、Val、Pro计量出得IL-2的平均浓度。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

(1)本发明制备方法制得了高纯度白介素-2标准品，所得白介素-2标准品的纯度大于98％。

(2)本发明基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对缓冲液中白介素-2的质量浓度进行测定，作为标准品的标准值。以GBW0926L-缬氨酸纯度和GBW09235 L-苯丙氨酸纯度国家一级标准物质为量值溯源参考标准，并使用经检定/校准的称量等计量器具，确保标准品的量值溯源至SI基本单位千克(kg)和摩尔(mol)。

(3)二硫键的结构正确是生物学功能的前提，本发明采用高分辨质谱对二硫键进行了表征，保证了二硫键的正确连接方式。

(4)本发明所制得的人白介素-2标准品可用于制药质量控制环节，保证了药品性能评价的关键参数测量结果的准确性。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的白介素-2标准品及其制备方法作进一步说明。

附图说明

图1为白介素-2样品纯化后超高效液相色谱图；

图2为白介素-2酶解肽段高分辨质谱序列覆盖度图；

图3为白介素-2酶解肽段二硫键连接图；

图4-图5为白介素-2氨基酸同位素稀释质量谱定量LC-MS MRM图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本实施例中采用试剂为：

GBW09236缬氨酸纯度标准物质：纯度99.4％，U＝0.6％(k＝2)，中国计量科学研究院。

GBW09235 L-苯丙氨酸纯度标准物质：纯度99.8％，U＝0.4％(k＝2)，中国计量科学研究院。

GBW(E)100084脯氨酸纯度标准物质：纯度99.0％，U＝1.5％(k＝2)，中国计量科学研究院。

缬氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸同位素标记氨基酸为美国剑桥同位素实验室，纯度＞98％。

乙腈，德国Merck公司，色谱级。

三氟乙酸，美国Sigma-Aldirich，色谱纯；

胰蛋白酶，美国Promega；

二硫苏糖醇(DTT)美国inalco；

碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAM)美国Inalco公司；

仪器：

高效液相三重四杆质谱仪，AB SCIEX 5500

高效液相飞行时间质谱仪，AB Q-TOF X500B

电子天平：赛多利斯

高分辨质谱液相联用仪(纳升液相)：赛默飞Orbitrap Exploris240

超高效液相色谱仪，Waters BIO H-CLASS

高效液相色谱仪，Waters Alliance e2695

快速纯化液相色谱系统，通用电气系统Avant 25

一种白介素-2标准品的制备方法，具体为：

(1)白介素-2样品制备，以大肠杆菌重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，进行裂解，收集上清和沉淀。大肠杆菌氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADETATIVEFLNR WITFCQSIISTLT

(2)白介素-2样品的纯化，分别采用分子筛和离子交换柱对样品进行纯化，得到白介素-2标准品候选物。具体操作如下：

采用GEAvant 25蛋白纯化工作站，采用Sephadex G75凝胶柱，采用PBS洗脱，UV210nm监测流出信号，收集主峰。然后每次取1mL，上样至蛋白纯化系统，以为HiTrap Q，监测波长210nm，缓冲浓溶液为Tris-HCL，洗脱液为4M NaCL溶液，收集主峰。

(3)白介素-2样品的稀释，将白介素-2标准物候选物用PBS溶解，稀释到浓度为(0.01～0.1)mg/g，得到稀释的白介素-2标准品侯选物溶液。

(4)对白介素-2标准品的理化性质表征

(a)采用SDS-PAGE凝胶电泳法、反相高效液相色谱法和凝胶排阻高效液相色谱法，对标准品的纯度进行表征。

SDS-PAGE凝胶电泳法的操作步骤如下：取50μLIL-2溶液与等体积的1X电泳上样缓冲液混合，沸水浴5min，上样10μL，采用预制胶进行分离，电泳电压80v，电泳时间1h。电泳完成后，考马斯亮蓝进行染色，染色完成后，甲醇-乙酸溶液进行脱色成像。

反相高效液相色谱法操作步骤如下：

IL-2纯品溶于0.1％甲酸水溶液中，配置样品浓度为1mg/mL，经0.22μm滤膜过滤，经UPLC分析。

色谱柱为ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg。柱温40℃，流动相A：0.1％TFA水，流动相B：0.075％ TFA，71.4％乙腈，28.6％水，流速0.2mL/min，进样量2μL，检测器为DAD检测器，检测波长220nm，洗脱梯度：(0～50)min，(40～100)％B，(50～54)min，100％B，(60～65)min，40％B，面积归一化法计算纯度。

高效液相色谱-凝胶排阻色谱的操作步骤如下：

IL-2纯品溶于0.1％甲酸水溶液中，配置样品浓度为1mg/mL，经0.22μm滤膜过滤，经HPLC分析。

色谱条件：色谱柱为Xbridge BEH125 SEC 3.5μm 7.8×300mm色谱柱，柱温：室温，流动相：8gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，pH7.2。流速0.5mL/min，进样量2μL，检测器为DAD检测器，检测波长210nm，280nm。面积归一化法计算纯度。

白介素-2超高效液相色谱图如图1所示。

(b)采用质谱法对白介素-2标准品的分子量进行测定

采用飞行时间串联质谱对完整蛋白的分子量进行检测，液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg。柱温80℃，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，流速0.3mL/min。洗脱梯度：(0～1.00)min，15％B；(1.00～8.00)min，(15～80)％B；(11.50～15.00)min，15％B；进样量2μL。

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：(600～5000)Da，离子源温度：350℃，去簇电压(Declustering Potential，DP)275v，碰撞能(Collision energy，CE)10V。

样品飞行时间质谱测定分子量平均分子量为15415.78，与IL-2的理论分子量15415.82一致。

表1相对分子质量

(c)对白介素-2标准品的蛋白质进行鉴定；

采用高分辨质谱对样品进行鉴定，所用分析软件为BioPharma Finder，液相条件：预柱：Acclaim PepMapTM 100 75μm×2cm，nanoViper 2Pk C18，3μm，100A；色谱柱：AcclaimPepMapTM RSLC 50μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A。

柱温：室温，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈水溶液(80％乙腈)；

洗脱梯度：(0～3)min，3％B；(3～28)min，(3～30)％B；(28～86)min，(30～50)％B；(86～88)min，(50～99)％B；90min，99％B；流速300nL/min，进样量1μL。

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：(200～2000)Da，分辨率：15000，带点：1-6。

白介素-2酶解肽段高分辨质谱序列覆盖度图如图2所示。

(d)白介素-2二硫键分析；

采用高分辨质谱对样品进行鉴定，所用分析软件为BioPharma Finder，液相条件：预柱：Acclaim PepMapTM 100 75μm×2cm，nanoViper 2Pk C18，3μm，100A；色谱柱：AcclaimPepMapTM RSLC 50μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A。

柱温：室温，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈水溶液(80％乙腈)；

洗脱梯度：(0～3)min，3％B；(3～28)min，(3～30)％B；(28～86)min，(30～50)％B；(86～88)min，(50～99)％B；90min，99％B；流速300nL/min，进样量1μL。

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：(200～2000)Da，分辨率：15000，带点：1-6。

白介素-2酶解肽段二硫键连接图如图3所示。

(e)采用毛细管等电聚焦电泳法对白介素-2的等电点测定。

所配检测器为紫外检测器，检测器波长为280nm，NCHO涂层毛细管50μm I.D.数据处理软件为32Karat^TM软件。

表2样品等电点测定结果

(5)采用基于氨基酸分析的高效液相色谱-同位素稀释质谱法对测定白介素-2的含量

样品基于酸水解的氨基酸同位素稀释质谱的方法对样品检测含量检测，所选用定量氨基酸为苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸。

液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column，130A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg，柱温30℃，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，洗脱梯度：(0～10)min，(5～95)％B，(10～14)min，95％B，(14.10～16)min，5％B，流速0.2mL/min，进样量2μL。

质谱条件见表3氨基酸水解的质谱分析条件。

表3氨基酸水解的质谱分析条件

白介素-2氨基酸同位素稀释质量谱定量LC-MS MRM图如图4-5所示，定值结果如表4所示。

表4IL-2同位素稀释质谱法的定值结果

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种白介素-2标准品的制备方法，其特征在于：所述白介素-2标准品的纯度大于98%，标准品的量值溯源至SI基本单位千克和摩尔mol；

其制备方法具体包括以下步骤：

（1）白介素-2样品的制备：以大肠杆菌重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，进行裂解，收集上清和沉淀；所述大肠杆菌氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

（2）白介素-2样品的纯化：采用分子筛和离子交换对样品进行纯化，得到白介素-2标准品候选物，具体操作如下：采用GEAvant 25蛋白纯化工作站，采用Sephadex G75凝胶柱，采用PBS洗脱，UV210nm监测流出信号，收集主峰；然后每次取1mL，上样至蛋白纯化系统，层析柱为HiTrap Q，监测波长210nm，缓冲浓溶液为Tris-HCL，洗脱液为4M NaCL溶液，收集主峰；

（3）白介素-2样品的稀释：将白介素-2标准品候选物用PBS溶解，稀释到浓度为0.01～0.1mg/g，得到稀释的白介素-2标准品候选物溶液；

（4）白介素-2标准品的理化性质表征

（4a）采用蛋白纯化分析方法对白介素-2标准品候选物的纯度进行表征；白介素-2纯度分析方法为SDS-PAGE凝胶电泳法、反相高效液相色谱法和凝胶排阻高效液相色谱法；

SDS-PAGE凝胶电泳法的操作步骤如下：取50μLIL-2溶液与等体积的1X电泳上样缓冲液混合，沸水浴5min，上样10μL，采用预制胶进行分离，电泳电压80v，电泳时间1h；电泳完成后，考马斯亮蓝进行染色，染色完成后，甲醇-乙酸溶液进行脱色成像；

反相高效液相色谱法操作步骤如下：

IL-2纯品溶于0.1%甲酸水溶液中，配置样品浓度为1mg/mL，经0.22μm滤膜过滤，经UPLC分析；

色谱柱为ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg；柱温40℃，流动相A：0.1%TFA水，流动相B：0.075% TFA，71.4%乙腈，28.6%水，流速0.2mL/min，进样量2μL，检测器为DAD检测器，检测波长220nm，洗脱梯度：0～50min，40～100%B，50～54min，100%B，60～65min，40%B，面积归一化法计算纯度；

高效液相色谱-凝胶排阻色谱的操作步骤如下：

IL-2纯品溶于0.1%甲酸水溶液中，配置样品浓度为1mg/mL，经0.22μm滤膜过滤，经HPLC分析；

色谱条件：色谱柱为Xbridge BEH125 SEC 3.5μm 7.8×300mm色谱柱，柱温：室温，流动相：8gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，pH7.2；流速0.5mL/min，进样量2μL，检测器为DAD检测器，检测波长210nm，280nm；面积归一化法计算纯度；

（4b）采用质谱法对白介素-2标准品候选物的分子量进行测定，测定结果与理论分子量相吻合；白介素-2相对分子质量测定方法为：采用飞行时间串联质谱对完整蛋白的分子量进行检测，样品溶于0.1%甲酸水溶液，配置浓度为1.0mg/mL；

色谱柱为ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column，300A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg；柱温80℃，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.3mL/min；

洗脱梯度：0～1.00min，15%B；1.00～8.00min，15～80%B；11.50～15.00min，15%B；进样量2μL；

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：600～5000Da，离子源温度：350℃，去簇电压275v，碰撞能10V；

（4c）对白介素-2标准品候选物的蛋白质进行鉴定；

采用胰蛋白酶对白介素-2进行酶切，酶切后的肽段采用串联质谱法对蛋白酶切产生的肽段进行鉴定，然后通过BioPharma Finder软件进行分析，结果应当与蛋白的序列对应的蛋白质一致；其前处理方式为：

1）润洗：加入100uL 50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗；

2）溶液置换：16000r离心10min，100μL浓度为1μg/uL的样品加入超滤管滤膜；

3）变性：加入100μL 7M盐酸胍变性；

4）还原：加入4μL 1M DTT置于42℃恒温1h；

5）烷基化：加入10μL 1M IAA室温避光30min；

6）离心，加入100μL 50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，直至超滤膜上的溶液离心至干，重复三次；

7）酶解：样品与胰蛋白酶质量比30:1，37℃烘箱恒温4h；

8）倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1%；

鉴定所用分析软件为BioPharma Finder，液相条件：预柱：Acclaim PepMapTM 100 75μm×2cm，nanoViper 2Pk C18，3μm，100A；色谱柱：Acclaim PepMapTM RSLC 50μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A；

柱温：室温，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1% 甲酸乙腈水溶液，80%乙腈；

洗脱梯度：0～3min，3%B；3～28min，3～30%B；28～86min，30～50%B；86～88min， 50～99%B；90min，99%B；流速300nL/min，进样量1μL；

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：200～2000Da，分辨率：15000，带点：1-6；

（4d）白介素-2二硫键分析：采用高分辨质谱对二硫键进行表征，保证二硫键的正确连接方式；

采用胰蛋白酶对白介素-2进行酶切，酶切后的肽段采用串联质谱法对蛋白酶切产生的肽段进行鉴定，对二硫键进行分析；其前处理方式为：

1）润洗：加入100uL 50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗；

2）溶液置换：16000g离心10min，100μL浓度为1μg/uL的样品加入超滤管滤膜；

3）变性：加入100uL 7M盐酸胍变性；

4）离心：加入100uL 50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，直至超滤膜上的溶液离心至干，重复三次；

5）酶解：样品与胰蛋白酶质量比30:1，37℃烘箱恒温4h；

6）倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1%；

鉴定所用分析软件为BioPharma Finder，液相条件：预柱：Acclaim PepMapTM 100 75μm×2cm，nanoViper 2Pk C18，3μm，100A；色谱柱：Acclaim PepMapTM RSLC 50μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A；

柱温：室温，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1% 甲酸乙腈水溶液，80%乙腈；

洗脱梯度：0～3min，3%B；3～28min，3～30%B；28～86min，30～50%B； 86～88min，50～99%B；90min，99%B；流速300nL/min，进样量1μL；

质谱条件：正离子扫描，扫描范围：200～2000Da，分辨率：15000，带点：1-6；

（4e）采用毛细管等电聚焦电泳法对白介素-2的等电点测定，测得等电点应与理论值一致；基于等电点差异分析的毛细管等电聚焦电泳方法测定白介素-2样品的等电点，所配检测器为紫外检测器，检测器波长为280nm，NCHO涂层毛细管 50 μm I.D.数据处理软件为32Karat^TM软件；

（5）基于氨基酸分析的高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定白介素-2的含量

选择苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸的同位素标记方法进行定值；用分析天平准确称量100mg稀释后白介素-2溶液于安踣瓶中，按质量比1∶1分别加入提前配制的标记的缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的混合标准溶液，准确称量，记录数据；混匀后，于离心浓缩仪，离心浓缩至干，取出加入800μL 6mol/L HCL，涡旋混合均匀后，通氮密封，于110℃烘箱中水解48h，通氮吹干，0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22μm滤膜进行测定；

液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column，130A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg，柱温30℃，流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1% 甲酸乙腈，洗脱梯度：0～10min，5～95%B，10～14min，95%B，14.10～16min，5%B，流速0.2mL/min，进样量2μL；

氨基酸水解的质谱分析条件如下表所示：

ID Q₁ Q₃ DP，V CE，V Phe 166.1 120.1 50 19 Pro 116.1 70.0 50 23 Val 118.10 72.10 40 16 13C₉-Phe 175.1 128.1 50 19 13C₅-Pro 121.0 74.1 50 22 13C₅-Val 123.10 76.10 40 15

采用以下公式计算合成的特征肽段的含量，

，

其中，

C_AA：白介素-2样品中Phe、Val、Pro的浓度，mg/g；

P：氨基酸标物纯度；

m_标：样品中加入标记氨基酸的质量，mg；

R_样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记/标记；

I₁：低标氨基酸实际质量比，非标记/标记；

I₂：高标氨基酸实际质量比，非标记/标记；

R₁：低标氨基酸峰面积比，非标记/标记；

R₂：高标氨基酸峰面积比，非标记/标记；

M：平行样中白介素-2样品溶液的质量，g；

，

其中，

C_IL-2：白介素-2的浓度，mg/g；

M_IL-2：白介素-2的相对分子质量；

C_AA：计算出的白介素-2样品中Phe、Val、Pro的浓度，mg/g；

n：白介素-2样品中氨基酸个数；

M_AA：Phe、Val、Pro 的相对分子质量；

白介素-2的浓度取Phe、Val、Pro 计量出得IL-2的平均浓度。