CN114578065A - 一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：重组质粒的制备；重组蛋白的表达；蛋白性能验证；蛋白纯化；蛋白纯度检测；蛋白定量。还包括同位素标记的完整蛋白的应用。本发明使用的13C标记的葡萄糖作为大肠杆菌扩大培养唯一的营养来源，表达的蛋白为13C标记的蛋白。这一蛋白能够用于血清中目标蛋白的绝对定量。由于目前目标蛋白的绝对定量使用到同位素稀释质谱法，需要考虑到目标蛋白的提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，而使用同位素标记的完整蛋白作为内标，这些影响因子会毫无差别的应用到两种蛋白，而这一优点也是相较于肽段定量、氨基酸定量优异的地方。

Description

一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于完整蛋白制备技术领域，具体涉及一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
蛋白质常被用作临床诊断标记物，其检测量值的大小往往标志着疾病的严重程度，常用的检测方法有酶联免疫吸附法、免疫发光法和免疫投射比浊法等。由于各厂家针对不同的目标物开发的方法和试剂不同，测量结果单位的不统一等问题，造成测量的偏差很大。
目前同位素稀释质谱法是蛋白质溯源到SI单位应用最广泛的方法，而同位素标记物作为内标是蛋白质溯源中关键一环。然而由于技术限制，目前蛋白质只能通过同位素标记的氨基酸和同位素标记的肽段进行溯源，同位素标记的氨基酸只适用于纯品蛋白，因为血清等复杂基质中的杂质蛋白也会水解成氨基酸，从而干扰蛋白质的定量。因此，同位素标记的肽段成为血清基质目标蛋白定量的首选，其中在样品处理过程中用到胰蛋白酶，它是将目标蛋白酶解为可以测量的肽段，但是这一过程又会引入酶切效率这一不可控因素，直接影响蛋白质的定量。
最直接的方法就是利用同位素标记的完整蛋白来对目标蛋白定量，因为酶切效率可以无差别地应用于两种蛋白，从而减少试验误差。但是由于技术等原因，市面上很少有同位素标记的完整蛋白，目前有Sigma公司研制的同位素标记的C反应蛋白，但是该样品浓度低，价格高，且是特定氨基酸上的碳氮被同位素标记的碳氮替代，存在酶切后特征肽段上没有同位素标记的碳氮的问题。
因此，同位素标记的内标蛋白的缺失是直接导致许多临床检测蛋白无法溯源的原因，这使得大量的蛋白质缺乏相关的标准物质。
本项目通过研制一种基于基因克隆的同位素标记蛋白质的生产、纯化方法，开发一种同位素标记的完整蛋白质的溯源方法，并将定值结果溯源至SI单位。从而为各大计量机构研发标准物质，以及企业试剂盒生产开发质控品提供技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用，该同位素标记的完整蛋白质与非标记的完整蛋白只存在碳元素价位的不同，非标记的蛋白质是常规碳源12C，而同位素标记的完整蛋白将所有的12C换成了13C。该同位素标记的完整蛋白可以用于对血清中蛋白质的定量，由于两者结构相同，试验带来的偏差能无差别的应用于两种蛋白，因此是一种高效、简便、可靠的检测方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1：重组质粒的制备：将目标基因插入到载体中，转染感受态，得到重组的含有目标基因的菌株；
S2：重组蛋白的表达：将上述重组的含有目标基因的菌株扩大培养，当培养到设定的OD值后加入IPTG诱导表达，收集菌株并裂解，收集上清和沉淀；
S3：蛋白性能验证：使用检测试剂盒检测同位素标记的完整蛋白的活性，接着用飞行时间高分辨串联质谱系统检测目标蛋白的分子量；
S4：蛋白质纯化：使用蛋白纯化仪对蛋白质纯度进行纯化；
S5：蛋白纯度检测：采用SDS-Page电泳法和液相色谱法进行蛋白质纯度验证；
S6：蛋白定量：使用同位素稀释质谱法对蛋白质进行定量分析，将蛋白质水解为氨基酸，选择三个氨基酸作为定量标记物，使用氨基酸标准物质对其进行定量分析，以三者平均值作为绝对定量的结果。
优选的是，在步骤S1中，具体操作为将表达目标蛋白的基因优化，插入到质粒pET30a中，将重组质粒pET30a-PCT转入表达菌种感受态细胞BL21，热激后涂布在含有卡那霉素的平板上，37℃过夜培养，其中平板中卡那霉素的浓度为50 μg/mL。
上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，具体操作为挑取单克隆菌株到2 mL含有抗生素的M9液体培养基中（用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖）进行第一次增菌，37℃过夜培养；次日，取0.2 mL第一次增菌液按照1:50接入到10 mL的M9培养基中（用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖）进行第二次增菌，37℃过夜培养；接着取第二次增菌液10 mL再以1：50扩大接入到500 mL的M9培养基中（用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖），37℃培养至OD600=0.6，加入0.8 mM的IPTG，25℃过夜诱导表达，8000 rpm、4℃离心5 min，收集菌体；加80 mL破碎液进行超声波裂解；裂解条件：温度冰浴、功率60 %、超声2 s、间隔2 s、时间40 min。12000rpm、4℃离心40 min，收集上清和沉淀。
上述任一方案中优选的是，在步骤S3中，所述蛋白活性检测具体方法为，将制备好的同位素标记的完整蛋白用1%的碳酸氢铵稀释到浓度约为50 ng/mL，取100 μL滴加到配套的试纸条上，等待15 min后，使用快速检测仪对其进行快速检测，并记录测得值。
上述任一方案中优选的是，在步骤S3中，所述目标蛋白完整分子量检测中，制备样品浓度为1 mg/mL，色谱柱为ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱；以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速0.2 mL/min，进样量2 uL。
上述任一方案中优选的是，在步骤S4中，所述标记蛋白的纯化，先根据重组蛋白上自带的His-tag标签与镍琼脂糖凝胶有很好的亲和力，使用镍柱对其进行纯化。再使用蛋白纯化仪对经镍柱纯化后的蛋白进行二次纯化，使用SEC（体积排阻色谱）柱根据蛋白质分子量的大小进行分离，并收集主峰；再使用离子交换柱依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离，对SEC柱纯化后的蛋白进行再次纯化。
上述任一方案中优选的是，在步骤S5中，所述SDS-Page电泳法的具体操作为在目标蛋白溶液中加入适量上样缓冲液混匀，90℃加热5 min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80 V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20 min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。
上述任一方案中优选的是，在步骤S5中，所述液相色谱法检测蛋白质的纯度的操作为以0.1%的甲酸水作为水相，以0.1%的甲酸已经作为有机相，用梯度洗脱的方式，使用全扫描模式找到相应最高的波长。
上述任一方案中优选的是，在步骤S6中，所述同位素稀释质谱法的操作为将100 μL的同位素标记的完整蛋白溶液分装到安瓿瓶中，加入等量的氨基酸标准物质，混匀后放离心浓缩仪中，50℃，浓缩1 h；加入500 μL，6 M的盐酸，充高纯氮气2 min后封口；样品在110℃水解48 h；打开盖子，通入高纯氮吹干；用200 μL 0.1%乙腈水溶液溶解，并用0.22 μm的滤膜过滤；质谱进样量为2 μL。
上述制备方法得到的完整蛋白在非标记蛋白定量分析中的应用，具体操作为：
（1）：在未知浓度的蛋白样品中加入已知浓度的同位素标记的完整蛋白；
（2）：加入尿素、DTT，于37 °C变性1 h，对蛋白质进行变性；
（3）：恢复常温后，加入IAM，避光反应1 h，用于保护氨基酸残基；
（4）：加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1 mol/L以下；
（5）：按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37 °C进行酶切反应；
（6）：加入甲酸终止反应；
（7）：已知同位素标记的完整蛋白浓度，根据公式计算未知非标记蛋白的浓度：
Figure 688310DEST_PATH_IMAGE001
Figure 176185DEST_PATH_IMAGE002
Figure 607167DEST_PATH_IMAGE003
Figure 970015DEST_PATH_IMAGE004
Figure 802842DEST_PATH_IMAGE005
式中：
Figure 960154DEST_PATH_IMAGE006
为同位素标记完整蛋白的浓度；
Figure 144010DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 44970DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 233768DEST_PATH_IMAGE009
为同位素标记完整蛋白酶切肽段的浓度；
Figure 827561DEST_PATH_IMAGE010
为非标记完整蛋白的浓 度；
Figure 967555DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 937785DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 479625DEST_PATH_IMAGE013
为非标记完整蛋白酶切肽段的浓度；
Figure 244319DEST_PATH_IMAGE014
为同位素 标记完整蛋白酶切肽段1的峰面积；
Figure 373074DEST_PATH_IMAGE015
为非标记完整蛋白酶切肽段的峰面积；
Figure 881416DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 543341DEST_PATH_IMAGE017
、
Figure 213357DEST_PATH_IMAGE018
为3组平行试验非标记完整蛋白的浓度。
本发明的技术效果和优点：本发明是使用M9作为基础培养基，对微生物进行扩大培养，微生物生长所需要的的碳源只来自葡萄糖，将葡萄糖替换成同位素标记的葡萄糖，葡萄糖上面6个12C全部换成13C，微生物的生长只能利用同位素标记的葡萄糖，因此微生物表达的蛋白质上所有的12C全部替换成13C。与目前市面上常用同位素标记的氨基酸取代非标记的氨基酸这一方法相比，该方法制备的同位素标记的完整蛋白能够满足所有的肽段的酶切和氨基酸的水解。由于同位素标记完整蛋白与非标记的蛋白只有碳元素价位的不同，因此，该方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，整个试验只需要考虑同位素标记完整蛋白定值结果的准确性。本发明使用蛋白纯化仪对蛋白质进行纯化，优化蛋白质纯化条件，使得距离很近的峰能够分开，从而提高蛋白质的纯度；
使用同位素稀释质谱法对同位素标记的完整蛋白进行定量，将其水解为氨基酸，用非标记氨基酸的国家一级有证标准物质（中国计量科学研究院研制）对其进行定值，数值可靠、可溯源至SI国际单位；
制备同位素标记的完整蛋白主要是用来对未知浓度的目标蛋白质进行定量分析，目前对蛋白质的绝对定量主要是用盐酸水解法，将蛋白质水解为氨基酸，再对氨基酸进行定量分析，最终得到蛋白质的浓度。但是该方法对蛋白质的纯度要求高，因为样品中的杂蛋白也会水解为氨基酸，从而影响蛋白质的定量结果。血清中蛋白质的定量往往使用酶切肽段的方式，先用磁珠抗体复合物将目标蛋白吸附出来，再进行酶切，对酶切后的肽段进行定量分析。这会引入蛋白质的吸附效率和酶切效率问题。本发明制备出的同位素标记的完整蛋白，则是对目标蛋白进行直接定量。将标记蛋白作为内标直接添加到目标蛋白中，可直接对样品进行酶切进质谱分析，由于试验误差能够无差别的应用于这两种蛋白，因此可以抵消；在未知浓度的目标蛋白中添加同位素标记的完整蛋白是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。
附图说明
图1为本发明同位素标记的完整PCT的沉淀和上清的SDS-page电泳图；
图2为本发明同位素标记的完整PCT的蛋白纯化仪SEC图；
图3为本发明同位素标记的完整PCT的蛋白纯化仪离子交换图；
图4为本发明同位素标记的完整PCT纯化后的SDS-page电泳图；
图5为本发明同位素标记的完整PCT纯化后的超高效液相色谱图；
图6为本发明同位素标记的完整PCT使用LC-MS定值的MRM图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
试剂：
快速质粒小提试剂盒购自天根；
限制性内切酶购自Takara；
卡那抗生素购自Solarbio；
PCR产物纯化试剂盒、IPTG、预染蛋白Marker、蛋白浓度定量试剂盒购自生工生物；
硫酸镁、硫酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钙购自国药集团；
乙腈、甲酸购自德国Merck公司产品；
超纯水由Millipore纯水系统纯化；
三氟乙酸、二硫苏糖醇（DTT）、乙酰胺(Iodoacetamide, IAM)、Tris、尿素（Urea）购自美国Sigma-Aldirich公司；
胰蛋白酶购自美国Promega公司；
磁珠购自Invitrogen公司；
13C标记葡萄糖、15N标记氯化铵购自美国剑桥CIL稳定性同位素公司；
基因合成公司为上海佑隆生物科技有限公司；
仪器：
超声波细胞破碎仪：JY 92-II型，宁波新芝生物科技股份有限公司；
恒温振荡培养箱：ZDP-250型，上海精宏实验设备有限公司；
高速冷冻离心机：TGL-20M型，长沙湘智离心机仪器有限公司；
基础电泳仪：Power Pac Basic型，美国BIO-RAV公司；
超高效液相色谱仪：BIO H-CLASS型，美国WATERS；
飞行时间高分辨串联质谱系统：X500B型，美国AB SCIEX公司；
液相色谱质谱联用仪：Qtrap5500超高效液相三重四级杆质谱联用系统，美国ABSCIEX公司；
移液器：德国Eppendorf Research公司；
天平：XSR205DU型，最小分度值0.01 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；
天平：XPE56型，最小分度值0.001 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；
快速纯化液相色谱系统：Avant 25型，美国通用电气系统；
荧光免疫定量分析仪：Getein1100型，中国基蛋生物科技股份有限公司。
一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）重组质粒的制备：
为了能在大肠杆菌表达体系中更高效的表达蛋白，根据大肠杆菌偏爱的密码子对PCT的基因做了优化并保证氨基酸序列不变，经过优化后得到如下序列：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKRDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN
（2）重组蛋白的表达：
将质粒pET30a-PCT转入表达菌种感受态细胞BL21，热激后涂布在含有对应抗生素的平板上，37℃培养16 h。挑取单克隆菌株到2 mL含有抗生素的M9液体培养基中（用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖）进行第一次增菌，37℃过夜培养；次日，取0.2 mL第一次增菌液按照1:50接入到10 mL的M9培养基中（用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖）进行第二次增菌，37℃过夜培养；接着取第二次增菌液10 mL再以1：50扩大接入到500 mL的M9培养基中（用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖），37℃培养至OD600=0.6，加入0.8 mM的IPTG，25℃过夜诱导表达，8000 rpm、4℃离心5 min，收集菌体。加80 mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率60 %、超声2 s、间隔2 s、时间40 min。12000 rpm、4℃离心40 min，收集上清和沉淀。
M9培养基（13C标记葡萄糖）配方为：6.75 g的磷酸氢二钠，3 g的磷酸二氢钾，0.5 g的氯化钠，1 g的氯化铵，0.241 g的硫酸镁，0.011 g的氯化钙，4 g的同位素标记的葡萄糖。其中葡萄糖过滤除菌，硫酸镁和氯化钙溶液分别高压灭菌，其余的混合配置成溶液高压灭菌，最终加灭菌后的蒸馏水至1 L。
PCT由116个氨基酸组成，加上6个组氨酸标签，所有的碳元素均被标记为13C同位素，分子量增加590，分子量大约为15 kDa左右，蛋白质的等电点为5.30。图1是PCT的SDS-PAGE电泳图，泳道1为沉淀，泳道2为上清，37℃大量诱导表达的蛋白主要以上清形式表达，条带大小符合理论值，初步判定表达的蛋白为所需蛋白。
（3）蛋白性能验证：
活性检测：将制备好的同位素标记的完整蛋白用1%的碳酸氢铵稀释100000倍，取100 μL滴加到配套的试纸条上，等待15 min后，使用荧光免疫定量分析仪对其进行快速检测，测得值如表1：
表1：荧光免疫定量分析仪的检测结果
Figure 593523DEST_PATH_IMAGE019
该样品的浓度为0.18 mg/mL，说明同位素标记的蛋白能与抗体结合，从而够满足临床检测需求。
分子量检测：用飞行时间高分辨串联质谱系统对同位素标记完整蛋白的分子量进行检测，同时对非标记的完整蛋白的分子量进行检测。制备样品浓度约为1 mg/mL；以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速 0.2 mL/min，进样量2 uL。色谱柱为：ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱，（2.1 mm×150 mm，1.7 µm）；流动相梯度如表2：
表2：飞行时间质谱流动相梯度表
Figure 374397DEST_PATH_IMAGE020
经质谱检测，PCT蛋白质的完整分子量为13789.22，13C标记的PCT的完整分子量为14362.08，分子量的差值为572.87，约为13C取代12C的后分子的增加量。
（4）蛋白质纯化：
先根据重组蛋白上自带的His-tag标签与镍琼脂糖凝胶有很好的亲和力，使用镍柱对其进行纯化。再使用蛋白纯化仪对经镍柱纯化后的蛋白进行二次纯化，使用SEC（体积排阻色谱）柱根据蛋白质分子量的大小进行分离，并收集主峰；再使用离子交换柱依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离，对SEC柱纯化后的蛋白进行再次纯化。
SEC柱型号为：Superdex 200 Increase 10/300 GL；检测波长：215 nm/254 nm/280 nm；流动相：PBS缓冲液，pH 7.4；流速：0.75 mL/min；进样量为100 µL。离子交换柱的型号为：HiTrap Q；检测波长为215 nm/254 nm/280 nm；结合缓冲液为1 M的Tris-HCL，洗脱缓冲液为4 M的NaCl；上样量为500 µL。如图2所示，收集最高峰的样品。
经SEC柱分离后，收集分子量大小合适的主峰，并再次用离子交换柱进行分离，收集分离峰，用PCT的荧光免疫定量分析仪进行检测，能够检测到数值的则为所需蛋白。如图3所示，收集峰1、峰2、峰3进行检测，峰2、峰3均能检测到PCT的数值，且分子量大小一致，说明两者是同一种蛋白。
（5）蛋白纯度检测：
SDS-Page电泳法：在目标蛋白溶液中加入适量上样缓冲液混匀，90℃加热5 min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80 V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20 min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。结果如图4所示，在Marker约为15KD处出现明显条带，该条带单一且亮度高，说明该样品纯度较高。
超高效液相色谱法：将同位素标记的完整PCT进液相，查看液相图中是否有杂峰。色谱柱为：ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱，（2.1 mm×150 mm，1.7 µm）；以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速 0.2 mL/min，进样量10 μL。结果如图5所示，在220nm紫外波长下游明显的峰，几乎无杂峰，说明样品纯度比较高。
（6）蛋白定量：
用同位素稀释质谱法，将同位素标记的PCT水解为同位素标记的氨基酸，选用3种氨基酸作为定值氨基酸进行定值。使用AB5500型三重四级杆质谱仪查找目标物母离子和子离子，质谱条件如下表3所示。色谱柱为：ACCQ-Tag Ultra C18，（2.1mm×100mm，1.7µm）；流动相为：以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速0.2 mL/min，进样量2 μL，流动相比例见下表4。MRM模式下的质谱图如图4所示。
将制备好的同位素标记的PCT分装并放-80℃冰箱保存，取其中5瓶进行定值，定值结果见表5，同时参照图6的LC-MS定值的MRM图。
表3 主要质谱参数
Figure 675451DEST_PATH_IMAGE021
表4 液质流动相比例
Figure 516368DEST_PATH_IMAGE022
表5 LC-MS对同位素标记的PCT的定值结果（ng/mL）
Figure 383830DEST_PATH_IMAGE023
一种用于定量的同位素标记的完整蛋白在非标记蛋白定量分析中的应用，
可应用到血清样品中去，由于添加了同位素标记的完整蛋白作为内标，因此，血清中的基质效应不影响定值结果，具体操作为：
在样品中加入同位素标记的PCT，共同经过酶切后进质谱，通过肽段的浓度推算出PCT的浓度，而肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示；选用3条肽段计算PCT的浓度，以3者平均值定值，如图6；
已知同位素标记的完整蛋白的浓度，计算未知非标记蛋白的浓度：
（7）：已知同位素标记的完整蛋白浓度，根据公式计算未知非标记蛋白的浓度：
Figure 233974DEST_PATH_IMAGE001
Figure 604913DEST_PATH_IMAGE002
Figure 882310DEST_PATH_IMAGE003
Figure 472954DEST_PATH_IMAGE004
Figure 861210DEST_PATH_IMAGE005
式中：
Figure 352234DEST_PATH_IMAGE006
为同位素标记完整蛋白的浓度；
Figure 534954DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 377008DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 568955DEST_PATH_IMAGE009
为同位素标记完整蛋白酶切肽段的浓度；
Figure 150371DEST_PATH_IMAGE010
为非标记完整蛋白的浓 度；
Figure 35150DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 98921DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 828980DEST_PATH_IMAGE013
为非标记完整蛋白酶切肽段的浓度；
Figure 29017DEST_PATH_IMAGE014
为同位素 标记完整蛋白酶切肽段1的峰面积；
Figure 819119DEST_PATH_IMAGE015
为非标记完整蛋白酶切肽段的峰面积；
Figure 871651DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 139821DEST_PATH_IMAGE017
、
Figure 459944DEST_PATH_IMAGE018
为3组平行试验非标记完整蛋白的浓度。综上所述：
本发明制备的同位素标记的完整蛋白，蛋白质上所有的12C全部替换成13C。通过国际通用的蛋白质的绝对定量法——同位素稀释质谱法对蛋白质进行绝对定量，前处理的两种方法：氨基酸水解法及胰蛋白酶酶切法，都能将同位素标记的完整蛋白水解或者酶切成同位素标记的氨基酸或同位素标记的酶切肽段。优势在于，由于同位素标记完整蛋白与非标记的蛋白只有碳元素价位的不同，因此，该方法无需考虑蛋白质提取率、酶切效率、仪器稳定性等因素，整个试验只需要考虑同位素标记完整蛋白定值结果的准确度。而本发明制备的同位素标记的完整蛋白的定值结果是用国家一级有证标准物质标定的，因此数值可靠、可溯源至SI国际单位。
此外，由于本发明制备了同位素标记的完整蛋白，因此在蛋白质定量过程中，可以使用已知浓度的同位素标记的完整蛋白对非标记的未知浓度的蛋白进行定量分析。与其他发明所用的使用氨基酸、肽段的标准品定量不同，本发明直接使用完整蛋白进行定量分析，使得量值的比较在同一水平上，更直接且引入的实验偏差能够无差别的应用于两种蛋白，从而消除实验偏差。因此，在目标蛋白中添加同位素标记的完整蛋白是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。
使用蛋白纯化仪对蛋白质进行纯化，优化蛋白质纯化条件，使得距离很近的峰能够分开，从而提高蛋白质的纯度。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：重组质粒的制备：将目标基因插入到载体中，转染感受态，得到重组的含有目标基因的菌株；
S2：重组蛋白的表达：将所述重组的含有目标基因的菌株扩大培养，当培养到设定的OD值后加入IPTG诱导表达，收集菌株并裂解，收集上清和沉淀；
S3：蛋白性能验证：使用检测试剂盒检测同位素标记的完整蛋白的活性，接着用飞行时间高分辨串联质谱系统检测目标蛋白的分子量；
S4：蛋白质纯化：使用蛋白纯化仪对蛋白质纯度进行纯化；
S5：蛋白纯度检测：采用SDS-Page电泳法和液相色谱法进行蛋白质纯度验证；
S6：蛋白定量：使用同位素稀释质谱法对蛋白质进行定量分析，将蛋白质水解为氨基酸，选择三种氨基酸作为定量标记物，使用氨基酸标准物质对其进行定量分析，以三者平均值作为绝对定量的结果。
2.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，具体操作为将表达目标蛋白的基因优化，插入到质粒pET30a中，将重组质粒pET30a-PCT转入表达菌种感受态细胞BL21，热激后涂布在含有卡那霉素的平板上，37℃过夜培养，其中，所述平板中卡那霉素的浓度为50 μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，具体操作为挑取单克隆菌株到2 mL含有抗生素的M9液体培养基中，用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖，进行第一次增菌，37℃过夜培养；次日，取0.2 mL第一次增菌液按照1:50接入到10 mL的M9培养基中，用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖，进行第二次增菌，37℃过夜培养；接着取第二次增菌液10 mL再以1：50扩大接入到500 mL的M9培养基中，用13C标记葡萄糖取代普通葡萄糖，37℃培养至OD600=0.6，加入0.8 mM的IPTG，25℃过夜诱导表达，8000 rpm、4℃离心5 min，收集菌体，加80 mL破碎液进行超声波裂解，裂解条件：温度冰浴、功率60 %、超声2 s、间隔2 s、时间40 min、12000 rpm、4℃离心40 min，收集上清和沉淀。
4.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述蛋白活性检测具体方法为，将制备好的同位素标记的完整蛋白用1%的碳酸氢铵稀释到浓度约为50 ng/mL，取100 μL滴加到配套的试纸条上，等待15 min后，使用快速检测仪对其进行快速检测，并记录测得值。
5.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述目标蛋白完整分子量检测中，制备样品浓度为1 mg/mL，色谱柱为ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱；以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速0.2 mL/min，进样量2 uL。
6.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述标记蛋白的纯化，先根据重组蛋白上自带的His-tag标签与镍琼脂糖凝胶有亲和力，使用镍柱对其进行纯化；再使用蛋白纯化仪对经镍柱纯化后的蛋白进行二次纯化，使用SEC柱根据蛋白质分子量的大小进行分离，并收集主峰；再使用离子交换柱依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离，对SEC柱纯化后的蛋白进行再次纯化。
7.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S5中，所述SDS-Page电泳法的具体操作为在目标蛋白溶液中加入适量上样缓冲液混匀，90℃加热5 min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80 V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20 min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。
8.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S5中，所述液相色谱法检测蛋白质的纯度的操作为以0.1%的甲酸水作为水相，以0.1%的甲酸乙腈作为有机相，用梯度洗脱的方式，使用全扫描模式找到相应最高的波长。
9.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S6中，所述同位素稀释质谱法的操作为将100 μL的同位素标记的完整蛋白溶液分装到安瓿瓶中，加入等量的氨基酸标准物质，混匀后放离心浓缩仪中，50℃，浓缩1 h；加入500 μL，6 M的盐酸，充高纯氮气2 min后封口；样品在110℃水解48 h；打开盖子，通入高纯氮吹干；用200 μL 0.1%乙腈水溶液溶解，并用0.22 μm的滤膜过滤；质谱进样量为2 μL。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的制备方法得到的完整蛋白在非标记蛋白定量分析中的应用，其特征在于：具体操作为：
（1）：在未知浓度的蛋白样品中加入已知浓度的同位素标记的完整蛋白；
（2）：加入尿素、DTT，于37 °C变性1 h，对蛋白质进行变性；
（3）：恢复常温后，加入IAM，避光反应1 h，用于保护氨基酸残基；
（4）：加入碳酸氢铵溶液稀释，使尿素浓度降至1 mol/L以下；
（5）：按比例加入设定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37 °C进行酶切反应；
（6）：加入甲酸终止反应；
（7）：已知同位素标记的完整蛋白浓度，根据公式计算未知非标记蛋白的浓度：
Figure 975054DEST_PATH_IMAGE001
Figure 257131DEST_PATH_IMAGE002
Figure 958371DEST_PATH_IMAGE003
Figure 198859DEST_PATH_IMAGE004
Figure 854225DEST_PATH_IMAGE005
式中：
Figure 939992DEST_PATH_IMAGE006
为同位素标记完整蛋白的浓度；
Figure 761318DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 907128DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 813905DEST_PATH_IMAGE009
为同位素标记完整蛋白酶切肽段的浓度；
Figure 437784DEST_PATH_IMAGE010
为非标记完整蛋白的浓 度；
Figure 612151DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 194442DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 322935DEST_PATH_IMAGE013
为非标记完整蛋白酶切肽段的浓度；
Figure 16085DEST_PATH_IMAGE014
为同位素 标记完整蛋白酶切肽段1的峰面积；
Figure 280844DEST_PATH_IMAGE015
为非标记完整蛋白酶切肽段的峰面积；
Figure 34036DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 145431DEST_PATH_IMAGE017
、
Figure 376692DEST_PATH_IMAGE018
为3组平行试验非标记完整蛋白的浓度。
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