CN111233987A - 一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,通过1)合成、克隆Cry基因;2)制备包含质粒表达载体的工程菌;3)原核表达;4)包涵体蛋白的变性、纯化及复性,在原核表达过程中,使用以葡萄糖为唯一碳源的培养基,使Cry蛋白中含有稳定同位素13C标记,获得稳定同位素13C标记的Cry蛋白,其具有较强的杀虫活性,纯度达到99%,适用于采用稳定同位素质谱技术分析Cry蛋白的环境行为和生态效益,为评价转Cry基因植物和释放的Cry蛋白的环境安全和生态学效应提供物质基础和技术支持。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法。
背景技术
2019年全球转基因作物的种植面积到2亿公顷,转Cry基因作物是居耐除草剂转基因作物之后的第二大类转基因作物。目前Cry基因已经成为转基因植物育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因,Cry基因己被成功导入水稻、烟草、玉米和棉花等多种植物,获得一大批具良好抗虫性状的转基因植物品种和种质资源。
Cry蛋白是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在芽孢形成初期表达产生的原毒素(Protoxin)被蛋白酶水解生成的具有高度特异性杀虫活性的晶体蛋白(Crystalline Protein)。
其中,Cry1A是一个对鳞翅目害虫有高活性的杀虫蛋白家族,目前已知的Cry1A类基因有10个模式种类,112个杀虫基因,其中Cry1Ab/1Ac应用最为广泛。转Cry1Ab/1Ac基因抗虫水稻“华恢1号”于2009年8月17日获得了农业转基因生物安全证书,2014年12月11安全证书获得续签。
随着转Bt基因作物种植面积的迅速增加,其潜在的环境安全性问题引起广泛关注。转Bt基因作物的根、茎、叶中均可表达Cry蛋白,转Cry基因作物会通过根系分泌、花粉飘落和秸秆还田等方式向环境中释放Cry蛋白,然而,这些Cry蛋白的代谢转化过程尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,制备出由稳定同位素13C标记的Cry蛋白,其具有较强的杀虫活性,纯度达到99%,适用于采用稳定同位素质谱技术分析Cry蛋白的环境行为和生态效益,为转Cry基因植物的环境安全评价提供参考和依据。
为了达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,包括以下步骤:
1)合成、克隆Cry基因
合成Cry基因,将其连接至克隆载体,得到重组质粒,转化至大肠杆菌进行培养,挑取菌落摇菌培养并提取重组质粒DNA,对其进行Cry基因定性PCR检测;
2)制备包含质粒表达载体的工程菌
对重组质粒和表达载体pET28a分别进行双酶切,连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物,得到质粒表达载体pET28a-Cry,热激转化至大肠杆菌,挑取转化子进行液体培养,提取质粒,经双酶切鉴定连接正确后转化到感受态细胞,得到包含质粒表达载体的工程菌;
3)原核表达
将包含质粒表达载体的工程菌接种到以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中,培养菌体至OD6000.6-0.8,添加IPTG进行诱导培养,收集全菌菌液进行SDS-PAGE分析,确认蛋白表达正确;其中,作为碳源的葡萄糖中,添加了13C标记葡萄糖;
4)变性、纯化及复性
超声处理细胞菌液,离心,得沉淀即包涵体,再进行变性溶解,离心、收集变性液上清得到变性包涵体,用镍柱对变性包涵体进行纯化,得到变性的13C标记Cry蛋白,再进行复性,获得稳定同位素13C标记的Cry蛋白。
优选地,步骤3)中,作为碳源的葡萄糖中,13C标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt%。
又,步骤2)中连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物时,表达载体酶切片段与重组质粒酶切片段的摩尔数比为1:3-5。
优选地,步骤1)的PCR检测方法中,退火温度为55-58℃。
又,步骤1)中所述的Cry基因为Cry1Ab基因或Cry1Ac基因。
进一步,步骤2)中,双酶切时使用的内切酶为NcoI和XhoI。
又进一步,步骤2)中双酶切的反应体系为:重组质粒或表达载体10μL,NcoI 1-2μL,XhoI 1-2μL,10×buffer 2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
优选地,步骤3)中的诱导条件为:IPTG的用量为0.2-0.4mM,诱导培养时间4-6h。
又,步骤3)的M9培养基中Na2HPO4·7H2O 12-13g/L,KH2PO43.0-4.0g/L,NaCl 0.5-0.6g/L,NH4Cl 0.6-1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.4-0.5g/L,CaCl2·6H2O 0.02-0.03g/L,葡萄糖0.04-0.08g/L。
又,步骤4)中,变性溶解时,利用浓度为8M的尿素变性液对得到的包涵体进行溶解,包涵体:尿素=1:3-5,质量比。
采用稳定同位素质谱技术可以示踪和定量分析Cry蛋白在土壤环境中代谢转化过程,同时有效规避土壤中原有Cry蛋白的影响,本发明在原核表达过程中,使用葡萄糖为唯一碳源,在作为唯一碳源的葡萄糖中,添加了13C标记的葡萄糖,其中13C标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt%,获得13C标记的Cry蛋白,若13C标记葡萄糖占比过高,得到的13C标记的Cry蛋白的δ13C值会超过稳定同位素比质谱仪测量上限,若13C标记葡萄糖占比过低,不仅配制含有13C标记葡萄糖的葡萄糖混合物难度增加,且会造成标记量少,δ13C值过低,在示踪时难以检测。
本发明中,进行Cry基因的PCR检测时,退火温度设为55-58℃,目的基因能够进行特异性扩增,若退火温度过低,会造成PCR非特异性扩增;若退火温度过高,目的基因无法扩增。
本发明在双酶切时,在Cry1Ab/Ac基因中引入NcoI和XhoI的酶切位点,Cry1Ab/Ac基因可以完整表达,限定两种内切酶的用量NcoI 1-2μL,XhoI1-2μL,可以充分的对目的片段进行双酶切。
本发明在进行连接酶反应时候,控制pET28a表达载体酶切片段与pUC57-Cry1Ab/Ac重组质粒的摩尔数比为1:3-5的反应比例,连接效果最好,可以形成更多的质粒表达载体pET28a-Cry。
本发明采用尿素变性溶解Cry包涵体时,利用8M尿素的变性液溶解包涵体时,控制粗制包涵体:尿素=1:3-5,质量比,反应效果最佳,在此控制下尿素可以重复变性溶解包涵体,低于这个比例,包涵体无法溶解,高于这个比例,尿素就会剩余,对后续的纯化不利;在变性后采用一步纯化的Ni柱纯化方法,去除了杂质蛋白后,有助于后续的透析复性试验,得到了纯度较高、总量较高的蛋白,制备的Cry蛋白量可为12.6mg/L M9培养基。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明在原核表达过程中,使用葡萄糖为唯一碳源,使Cry蛋白中含有稳定同位素13C标记,获得的13C标记Cry杀虫蛋白纯度均达到99%,检出率高,其活性未到不良影响,适于对外源Cry蛋白在土壤中的代谢进一步进行研究,为评价转Cry基因植物和释放的Cry蛋白的环境安全和生态学效应提供物质基础和技术支持。
本发明在制备13C标记的Cry蛋白时,成功对原核表达的包涵体进行一步Ni柱纯化和复性,得到了纯度较高、总量较高的蛋白,每升培养基中获得的Cry蛋白量可达12.6mg,具有生物活性,制备的13C标记的Cry蛋白具有较强的杀虫活性,其半致死量LC50为5.44μg蛋白/g饲料。
附图说明
图1为本发明实施例1中纯化后的Cry蛋白SDS-PAGE分析结果。
图2为本发明实施例1中纯化后的Cry蛋白的Western blot检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、制备稳定同位素13C标记Cry1Ab/Ac蛋白,步骤如下:
在NCBI数据库中检索转Bt基因水稻“华恢1号”Cry1Ab/Ac基因序(EU816953.1),去除终止密码子序列,分别在5’和3’端引入了NcoI和XhoI的酶切位点。
利用两步法合成Cry1Ab/Ac基因,连接到载体pUC57得到克隆载体pUC57-Cry1Ab/Ac,转化大肠杆菌JM109,LB培养基中过夜培养,挑取菌落摇菌培养并提取质粒,进行Cry1Ab/Ac基因的PCR检测。
PCR反应体系为:10×PCR buffer 3μL,2mmol/L dNTP 3μL,正、反向引物Cry1Ab/Ac-F/R(10μmol/L)各2μL,5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL,模板DNA 1-2μL,加蒸馏水补充至30μL。
其中,Cry1Ab/Ac基因扩增引物序列如表1所示:
表1 Cry1Ab/Ac基因扩增引物序列
使用内切酶NcoI和XhoI对重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac和表达载体pET28a进行双酶切,采用T4连接酶连接表达载体与重组质粒的回收产物,22℃连接过夜,得到质粒表达载体pET28a-Cry1Ab/Ac,将其热激转化至大肠杆菌JM109,待平板上长出转化子之后,挑取转化子液体培养,提取质粒,通过NcoI和XhoI双酶切鉴定,然后将重组质粒转到BL21(DE3)感受态细胞中,得到BL21(DE3)/pET28a-Cry1Ab/Ac工程菌。
挑取单克隆,将工程菌接种于13C标记葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中,37℃培养至菌体OD600为0.6-0.8,加入IPTG至终浓度为0.2mM,于37℃诱导培养4h,收集全菌菌液进行SDS-PAGE(8%分离胶)分析。
其中,M9培养基中:Na2HPO4·7H2O 12.8g/L,KH2PO4 3.0g/L,NaCl0.5g/L,NH4Cl0.6-1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.492g/L,CaCl2·6H2O 0.02191g/L,葡萄糖总量0.04-0.08g/L。
收集菌液,用1×PBS重悬,超声处理细胞重悬液,离心得到沉淀(沉淀即为包涵体),采用清洗缓冲液清洗包涵体去除杂质,利用8M尿素变性液将洗涤后包涵体溶解于变性液中,离心收集变性液上清,采用镍柱纯化目的蛋白。
采用梯度透析法对变性的13C标记Cry1Ab/Ac蛋白进行复性,纯化后包涵体用含4M尿素的透析缓冲液稀释Cry1Ab/Ac蛋白,从4M、2M、1M、0.5M依次降低透析液中尿素浓度,每个浓度均于4℃透析,4-6h换新鲜透析液,高速离心去除沉淀,最后用1×PBS(PH7.2)4℃透析过夜,获得稳定同位素13C标记的Cry1Ab/Ac杀虫蛋白,制备的Cry蛋白量为12.6mg/L M9培养基。
本实施例中,Cry1Ab/Ac基因的PCR检测方法的反应程序为:94℃预变性,5min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸min,35个循环;72℃延伸7min。
本实施例中,重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac和表达载体pET28a分别进行双酶切的反应体系为:质粒pET28a 10μL,NcoI 1μL,XhoI 1μL,10×buffer2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h;
重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac 10μL,NcoI 1μL,XhoI 1μL,10×buffer 2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
本实施例中,重组质粒与表达载体的连接反应条件为:表达载体pET28a酶切片段与重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac酶切片段的摩尔数比为1:5,其中T4连接酶1μL,10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5μL,无菌水补充至25μL,16℃连接过夜。
本实施例中,稳定同位素13C标记的葡萄糖占葡萄糖总量的5wt%。
本实施例中,13C标记Cry1Ab/Ac蛋白的原核表达的诱导条件为:施加0.2mM IPTG,37℃诱导培养时间4h。
本实施例中,利用8M尿素的变性液溶解包涵体的质量比为包涵体:尿素=1:4。
2.对制备的13C标记Cry1Ab/Ac蛋白作进一步检测分析
2.1Western blot分析
对获得的13C标记的Cry1Ab/Ac蛋白进行SDS-PAGE分析,在相对分子量66.2kD左右呈单一蛋白条带(参见图1),说明获得了具有较高纯度的Cry1Ab/Ac蛋白。
用凝胶图像分析仪的灰度扫描测得纯化后的13C标记的蛋白条带所占的比例均达到99%,Western blotting实验进一步证实获得的纯化蛋白是Cry1Ab/Ac蛋白(参见图2)。
2.2测定杀虫活性
将原核表达的13C标记Cry蛋白按梯度分别掺入二化螟常规饲料,使各组饲料中蛋白含量分别为1μg/g、5μg/g、10μg/g、15μg/g、20μg/g、25μg/g。
每个梯度设置三个重复,每个重复接二化螟初孵幼虫20头,置于玻璃试管中,加塞,以常规饲料接虫作为对照,27±1℃培养,试管顶端用黑布遮光,使试管整体只有底部向光,4天后检查幼虫的死亡率,结果见表2。
表2 Cry1Ab/Ac蛋白杀虫试验分析
剂量/(μg/g) | 重复次数 | 接虫数 | 平均死亡数 |
1(<sup>13</sup>C标记的Cry蛋白) | 3 | 20 | 3.2 |
5(<sup>13</sup>C标记的Cry蛋白) | 3 | 20 | 7.5 |
10(<sup>13</sup>C标记的Cry蛋白) | 3 | 20 | 12.2 |
15(<sup>13</sup>C标记的Cry蛋白) | 3 | 20 | 15.5 |
20(<sup>13</sup>C标记的Cry蛋白) | 3 | 20 | 19.5 |
25(<sup>13</sup>C标记的Cry蛋白) | 3 | 20 | 20.0 |
根据杀虫试验结果,通过SPSS 16.0计算13C标记的Cry蛋白的半致死浓度(LC50)为5.44μg/g。
实施例2
本实施例中,除特别说明外,其余步骤与实施例1相同。
本实施例中,Cry1Ab/Ac基因的PCR检测的反应程序为:94℃预变性,5min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸min,35个循环;72℃延伸7min。
本实施例中,重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac和表达载体pET28a分别进行双酶切的反应体系为:质粒pET28a 10μL,NcoI 2μL,XhoI 2μL,10×buffer2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac10μL,NcoI 2μL,XhoI 2μL,10×buffer 2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
本实施例中,重组质粒与表达载体的连接反应条件为:表达载体pET28a酶切片段与重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac酶切片段的摩尔数比为1:4,其中T4连接酶1μL,10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5μL,无菌水补充至25μL,16℃连接过夜。
本实施例中,稳定同位素13C标记的葡萄糖占葡萄糖总量的1%。
本实施例中,13C标记Cry1Ab/Ac蛋白的原核表达的诱导条件为:施加0.4mM IPTG,37℃诱导培养时间4h。
本实施例中,利用8M尿素的变性液溶解包涵体的质量例为包涵体:尿素=1:5。
利用本实施例制备的13C标记的Cry1Ab/Ac蛋白SDS-PAGE结果与图1一致;Westernblot分析结果与图2一致,半致死浓度(LC50)为5.62μg/g,说明采用本发明方法制备的13C标记的Cry1Ab/Ac蛋白纯度较高。
实施例3
本实施例中,除特别说明外,其余步骤与实施例1相同。
本实施例中,Cry1Ab/Ac基因的PCR检测方法的反应程序为:94℃预变性,5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸min,35个循环;72℃延伸7min。
本实施例中,重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac和表达载体pET28a分别进行双酶切的反应体系为:
质粒pET28a10μL,NcoI 1μL,XhoI 2μL,10×buffer 2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac10μL,NcoI 1μL,XhoI 2μL,10×buffer 2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
本实施例中,重组质粒与表达载体的连接反应条件为:表达载体pET28a酶切片段与重组质粒pUC57-Cry1Ab/Ac酶切片段的摩尔数比为1:3,其中T4连接酶1μL,10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5μL,无菌水补充至25μL,16℃连接过夜。
本实施例中,稳定同位素13C标记的葡萄糖占葡萄糖总量的10wt%。
本实施例中,13C标记Cry1Ab/Ac蛋白的原核表达的诱导条件为:施加0.2mM IPTG,37℃诱导培养时间4h。
本实施例中,利用8M尿素的变性液溶解包涵体的质量比为包涵体:尿素=1:3。
利用本实施例制备的13C标记的Cry1Ab/Ac蛋白SDS-PAGE结果与图1一致;Westernblot分析结果与图2一致,半致死浓度(LC50)为5.47μg/g,说明采用本发明方法制备的13C标记的Cry蛋白纯度较高。
Claims (10)
1.一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,包括以下步骤:
1)合成、克隆Cry基因
合成Cry基因,将其连接至克隆载体,得到重组质粒,转化至大肠杆菌进行培养,挑取菌落摇菌培养并提取重组质粒DNA,对其进行Cry基因定性PCR检测;
2)制备包含质粒表达载体的工程菌
对重组质粒和表达载体pET28a分别进行双酶切,连接表达载体和重组质粒的酶切回收产物,得到质粒表达载体pET28a-Cry,热激转化至大肠杆菌,挑取转化子进行液体培养,提取质粒,经双酶切鉴定连接正确后转化到感受态细胞,得到包含质粒表达载体的工程菌;
3)原核表达
将包含质粒表达载体的工程菌接种到以葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中,培养菌体至OD600 0.6-0.8,添加IPTG进行诱导培养,收集全菌菌液进行SDS-PAGE分析,确认蛋白表达正确;其中,作为碳源的葡萄糖中,添加了13C标记葡萄糖;
4)变性、纯化及复性
超声处理细胞菌液,离心,得沉淀即包涵体,再进行变性溶解,离心、收集变性液上清得到变性包涵体,用镍柱对变性包涵体进行纯化,得到变性的13C标记Cry蛋白,再进行复性,获得稳定同位素13C标记的Cry蛋白。
2.根据权利要求1所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤3)中,作为碳源的葡萄糖中,13C标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt%。
3.根据权利要求1或2所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤2)中连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物时,表达载体酶切片段与重组质粒酶切片段的摩尔数比为1:3-5。
4.根据权利要求1或2所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤1)的PCR检测方法中,退火温度为55-58℃。
5.根据权利要求1所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述的Cry基因为Cry1Ab基因或Cry1Ac基因。
6.根据权利要求5所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤2)中,双酶切时使用的内切酶为NcoI和XhoI。
7.根据权利要求6所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤2)中进行双酶切的反应体系为:重组质粒或表达载体10μL,NcoI 1-2μL,XhoI 1-2μL,10×buffer 2μL,无菌水补充至20μL,37℃酶切3h。
8.根据权利要求1所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤3)中的诱导条件为:IPTG的用量为0.2-0.4mM,诱导培养时间4-6h。
9.根据权利要求1所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤3)的M9培养基中:Na2HPO4·7H2O 12-13g/L,KH2PO43.0-4.0g/L,NaCl 0.5-0.6g/L,NH4Cl 0.6-1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.4-0.5g/L,CaCl2·6H2O 0.02-0.03g/L,葡萄糖0.04-0.08g/L。
10.根据权利要求1所述稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法,其特征在于,步骤4)中,变性溶解时,利用浓度为8M的尿素变性液对得到的沉淀进行溶解,包涵体:尿素=1:3-5,质量比。
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