CN110066322B

CN110066322B - 一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用

Info

Publication number: CN110066322B
Application number: CN201910271500.1A
Authority: CN
Inventors: 郑爱萍; 李平; 孙宏伟; 马丽; 邓其明; 王世全; 李双成; 朱军; 王玲霞; 刘怀年
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110066322A

Abstract

本发明公开了一种Bt蛋白Cyt2‑like及其基因和应用。该蛋白具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。

Description

一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Bt蛋白Cyt2-like及其编码基因和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽胞杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽胞形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs主要由cry和cyt基因编码，具有特异的杀虫活性，Cyt类杀虫晶体蛋白发现了3类，分别是Cyt1类、Cyt2类和Cyt3类，Cyt类蛋白中，第一等级蛋白共3类，其中最多的一类为Cyt2类，共25个蛋白，Cyt类蛋白分子量一般在27-30kDa。Bt具有高效专一、无毒、不污染环境等特点，被广泛作为微生物杀虫剂应用在农林、果蔬以及卫生等害虫防治，近年来Bt杀虫晶体蛋白编码基因已大量应用在转基因玉米、棉花、大豆等农作物中，取得了良好的防治效果。

自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类。最近研究表明，Cyt类蛋白可能成为控制害虫对Cyt类杀虫晶体蛋白产生抗性的一种新策略，因为它与广泛应用的Cry类蛋白相比,具有不同的蛋白结构和独特的作用机制。它除了具有杀虫特性以外,还具有在体外广泛溶细胞的能力。这些特性使它成为控制害虫对苏云金杆菌的Cry类毒素蛋白的抗性的一种最有潜力的毒蛋白。此外，Federici发现Cyt1Aa不但对棉花叶甲(Chrysomela scripa)有较高的毒性,而且可以抑制此叶甲对Cry3Aa的抗性达5000倍。

以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力Bt基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用，以提供一种新的Bt毒力蛋白资源。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种Bt蛋白Cyt2-like，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，Bt蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cyt2-like的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第24位的Gly替换为Ala，在第1122处插入Lys，在第1120处缺失Gly，而不影响其活性。因此，本发明的Bt蛋白Cyt2-like还包括SEQ IDNo.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cyt2-like同等活性的由Cyt2-like衍生得到的蛋白质。

编码权利要求上述Bt蛋白Cyt2-like的基因，该核苷酸序列如；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白质可以从Bt菌株CS72-2中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转Cyt2-like基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。

此外，还可以通过发酵本发明菌株CS72-2，得到含有Cyt2-like蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。

含有上述基因的重组表达载体。

含有上述表达载体的宿主细胞。

进一步地，宿主细胞为植物细胞。

含有上述Bt蛋白的杀虫剂。

上述Bt蛋白在提高植物抗虫性中的应用。

上述基因在培育转基因植物、制备杀虫剂或提高植物抗虫性中的应用。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的Cyt2-like基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。例如：利用密码子的简并性，将Cyt2-like基因设计具有玉米偏好密码子的基因序列，再将合成的Cyt2-like基因序列与载体pCAMBIA1300连接，通过农杆菌介导转入到玉米基因组中，从而得到具有抗虫活性的转基因玉米品种。

本发明的有益效果为：

本发明提供Cyt2-like蛋白是一种Bt蛋白，具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。在本发明的效果验证试验过程中，也没有发现害虫对该蛋白产生抗性的情况。因此，本发明的Bt蛋白Cyt2-like具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。

附图说明

图1显示的是克隆得到的Cyt2-like全长基因的凝胶电泳图；其中，泳道M为DNAmarker；泳道1为Cyt2-like基因；

图2显示的是重组质粒pET-Cyt2-like的酶切鉴定图谱；其中，泳道1酶切重组质粒pET28a+Cyt2-like；泳道2为pET28a线性化质粒(EcoRI)；泳道M为DNA marker；

图3显示的是Cyt2-like基因在E.coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE检测图；

其中，泳道M为蛋白marker(分子量从上到下：120、100、80、60、50、40、30、20、12KDa)；泳道1为含有载体pET-28a的E.coli BL21(DE3)未经IPTG诱导的表达蛋白；泳道2为含有载体pET-28a的E.coli BL21(DE3)未经IPTG诱导的表达蛋白；泳道3为含有重组质粒pET-Cyt2的E.coli BL21(DE3)未经IPTG诱导菌体裂解液；泳道4为含有重组质粒pET-Cyt2的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导菌体裂解液。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1 Cyt2-like基因的克隆

本发明从贵州省高原地区土壤中分离得到的苏云金芽胞杆菌新菌株CS72-2，分类命名为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis CS72-2)(该菌株的保藏号为：CCTCCNO：M 2018930；其保藏时间为：2018年12月27日；保藏地址为：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心)，通过对CS72-2的毒力测试表明，CS72-2对鳞翅目害虫等具有极高的毒力。

再根据Cyt2类基因保守序列设计一对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株中存在Cyt2类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到Cyt2-like基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长为1137bp，分析表明，GC含量为32％，编码379个氨基酸组成的蛋白。Cyt2-like蛋白的氨基酸组成如表1，其氨基酸序列见SEQ ID No.2。

表1 Cyt2-like蛋白的氨基酸组成

本例通过如下方法克隆得到Cyt2-like基因的全长序列。

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株CS72-2的总DNA作为扩增Cyt2-like基因的模板，设计的引物序列具体如下：

P1-F：5'-ATTTGAGTTTCTAAATTTGTAAA-3'；(SEQ ID No.3)

P2-R：5'-TTTACAAATTTAGAAACTCAAAT-3′；(SEQ ID No.4)

PCR反应体系如表2所示：

表2 PCR反应体系

反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸90s，34个循环；最后，72℃延伸7min。

然后扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为1137bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列一致。

实施例2 Cyt2-like蛋白的获得

测序得到Cyt2-like基因完整的开放阅读框，根据Cyt2-like基因开放阅读框两端序列，设计一对含有酶切位点的全长扩增引物PET-Cyt2F/PET-Cyt2R，以Bt菌株CS72-2的基因组DNA为模板，使用FastPfu高保真聚合酶进行PCR扩增，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-28a连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断大小符合预期目的片段后(图2)，再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)(购买于北京全式金生物技术有限公司)。

将重组质粒命名为pET-Cyt2，将阳性转化子于LB培养基中，在200r/min、37℃过夜培养，再将培养液按照1:100的比例转接到含有400mL LB培养液的1L三角瓶中，200r/min、37℃培养,当培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入0.6mmol/L IPTG进行诱导表达12h，离心培养液收集菌体，弃上清，加入30mL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)超声波破碎，用SDS-PAGE对表达蛋白进行检测。

SDS-PAGE分析表明基因的表达产物在菌体超声破碎后的溶液中(图3)，Cyt2-like分子量约为45kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。

实施例3蛋白杀虫活性测定

将实施例2获得的Cyt2-like蛋白对玉米螟和棉铃虫进行杀虫活性测定。

玉米螟的生测：将Cyt2-like蛋白配制成400，200，100，50，25，0.1μg/mL等6个不同的浓度梯度，将蛋白加入饲养玉米螟的饲料中混匀，E.coli.BL21(DE3)作为阴性对照，清水为空白对照，然后每处理投入20头2-3龄玉米螟，每处理3次重复，7d后统计结果。

棉铃虫的生测：将Cyt2-like蛋白配制成400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和0.1μg/mL 6个不同的浓度梯度，将蛋白加入饲养棉铃虫的饲料中混匀，采用E.coli.BL21(DE3)作为阴性对照，清水为空白对照，然后每处理投入20头棉铃虫，每处理3次重复，3d后统计结果。用SPSS 10.0软件计算LC₅₀，其测定结果见表3。

表3 Cyt2-like的杀虫活性

根据表3的生物活性测定结果可知，Cyt2-like表达产物对玉米螟和棉铃虫具有较好的杀虫活性，其中，Cyt2-like表达蛋白对亚洲玉米螟半致死浓度LC50为10.51μg/mL(95％置信区间:7.554-19.27μg/mL)；对棉铃虫的半致死浓度LC50为20.43μg/mL(95％置信区间:15.57-31.16μg/mL)。而阴性对照E.coli.BL21(DE3)和空白对照对玉米螟和棉铃虫均不具杀虫活性。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcatacac aaatggcttt ttcccaacag aactttaaag ttcatggggt taaatttttt 60

gatggactat taaacatcgt aaaactagaa aatgaaagaa aagagttacc atcttcagct 120

ttagctactt acatcttgct tcactttgaa tgcaatgata taggaatgct accacgtgaa 180

tttcaaataa tggatcttgc taagaaaagt gggattccct acacaacaat ttatacaggg 240

tttcaagttt gtttggagcg tagactcgta aaagaaacac ctgttggaaa tcgtactgta 300

tatgaaattg tagattatgc gttgtataac cacactactg cagaaactac aaagatgaca 360

ggcatatcgc tatcgtattt ccgtattcca tttcacctaa ttcaaacaac gataatgagt 420

agtctagtaa aggctcgtga taatagaggg attatattcc ttttagattt aatcaatact 480

ttttcaagaa aagtaggtat ggaacattat aaacataaaa ttgaggagtt tcagattaca 540

agaaagatgt cttccttaaa aaagagatta aatcgtaatg caaagaaagt aagacgctac 600

atagaaatta ttaaccccat cgtgcaattt actgcaatcg attctaaaga gaagaaatct 660

aatgaaacaa gaattacaag tgtaaggaaa caggtaaaac aaatcatcat tgagaagttc 720

aacgttgtat tttcttcaaa ctgcgtaatt gagaatgata aaaaagaatt acatagacca 780

gtagcgaagt gcagaaaaga agcggtgtct cgtttgaaac acatgggaca ggcgttacgt 840

aaaaaagata aagaaaatat aatgactgca tttagacaag aaattgttga tatcgcaatc 900

tatttaccga cgaaacaaaa acaaagtgaa ttattaattt acgcaatgac ttatgcatta 960

gatcaagttg aaagttgttt gaaagaacaa gaaatattct ctattccagc atttatgcgt 1020

atacagttta gagagtcctg gagaagtttt aaggaagaaa acttgtctac aggggaaaga 1080

cacgatgcaa tgataaatta tcataagaaa aatggtgttt atccggaatt tatttaa 1137

<210> 2

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His Thr Gln Met Ala Phe Ser Gln Gln Asn Phe Lys Val His Gly

1 5 10 15

Val Lys Phe Phe Asp Gly Leu Leu Asn Ile Val Lys Leu Glu Asn Glu

20 25 30

Glu Lys Glu Leu Pro Ser Ser Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Leu Leu His

35 40 45

Phe Glu Cys Asn Asp Ile Gly Met Leu Pro Arg Glu Phe Gln Ile Met

50 55 60

Asp Leu Ala Lys Lys Ser Gly Ile Pro Tyr Thr Thr Ile Tyr Thr Gly

65 70 75 80

Phe Gln Val Cys Leu Glu Arg Arg Leu Asp Lys Glu Thr Pro Val Gly

85 90 95

Asn Arg Thr Asp Tyr Glu Ile Val Asp Tyr Ala Leu Tyr Thr His Thr

100 105 110

Thr Ala Glu Thr Thr Lys Met Thr Gly Ile Ser Leu Ser Tyr Phe Arg

115 120 125

Ile Pro Phe His Leu Ile Gln Thr Thr Ile Met Ser Ser Leu Val Lys

130 135 140

Ala Arg Asp Asn Arg Gly Ile Ile Phe Leu Leu Asp Leu Ile Asn Thr

145 150 155 160

Phe Ser Arg Lys Val Gly Met Glu His Tyr Lys His Lys Ile Glu Glu

165 170 175

Phe Gln Ile Thr Arg Lys Met Ser Ser Leu Lys Lys Arg Leu Asn Arg

180 185 190

Asn Ala Lys Lys Val Arg Arg Tyr Ile Glu Ile Ile Asn Pro Ile Val

195 200 205

Gln Phe Thr Ala Ile Asp Ser Lys Glu Lys Lys Ser Asn Glu Thr Arg

210 215 220

Ile Thr Ser Val Arg Lys Gln Val Lys Gln Ile Ile Ile Glu Lys Phe

225 230 235 240

Asn Val Val Phe Ser Ser Asn Cys Val Ile Glu Asn Asp Lys Lys Glu

245 250 255

Leu His Arg Pro Val Ala Lys Cys Arg Lys Glu Ala Val Ser Arg Leu

260 265 270

Lys His Met Gly Gln Ala Leu Arg Lys Lys Asp Lys Glu Asn Ile Met

275 280 285

Thr Ala Phe Arg Gln Glu Ile Val Asp Ile Ala Ile Tyr Leu Pro Thr

290 295 300

Lys Gln Lys Gln Ser Glu Leu Leu Ile Tyr Ala Met Thr Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Asp Gln Val Glu Ser Cys Leu Lys Glu Gln Glu Ile Phe Ser Ile Pro

325 330 335

Ala Phe Met Arg Ile Gln Phe Arg Glu Ser Trp Arg Ser Phe Lys Glu

340 345 350

Glu Asn Leu Ser Thr Gly Glu Arg His Asp Ala Met Ile Asn Tyr His

355 360 365

Lys Lys Asn Gly Val Tyr Pro Glu Phe Ile

370 375

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atttgagttt ctaaatttgt aaa 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atttgagttt ctaaatttgt aaa 23

Claims

1.一种Bt蛋白Cyt2-like，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种含有权利要求1所述Bt蛋白的杀虫剂。

3.权利要求1所述Bt蛋白在提高植物抗虫性中的应用。