CN112028975A - 2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法 - Google Patents

2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法。该蛋白的制备方法包括下列步骤：预测：预测该蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式较大量的表达该蛋白；纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤以及亲和的方法纯化该蛋白；复性：较纯的蛋白在具有二硫键氧化还原对的环境中，运用稀释法使得该蛋白复性；纯化：复性后的目标蛋白通过离子柱，分子筛等纯化手段进一步去除杂蛋白，得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。本发明提供的活性蛋白可与针对该表位的抗体结合，广泛用在化学发光以及胶体金等诊断试剂领域。

Description

2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及本发明涉及生物技术检测领域，具体而言，涉及一种2019新 型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒COVID-19感染的肺炎以发热、乏力、干咳等为主要表现， 少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在一 周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、 难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。迄今新型冠状病毒COVID-19还 没有针对性的特效药。一些个案报道的治疗药物仍需更多的临床实践证明效 果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。当务之急是尽 快研究有效的诊断试剂，早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。
新型冠状病毒COVID-19核酸检测有较高的特异性和灵敏度，但是该检测 方法对技术要求高，容易出现假阴性，标本需要特殊处理，要求具备PCR扩 增仪及凝胶电泳等专业的仪器设备，对新型冠状病毒的检测用时长，需专业 技术人员操作和判断检测结果，无法应用于社区、基层医院、机场、海关甚 至家庭等基层的早期初步筛查。
因此，亟需一种更早期、更准确、更快捷、更有效的检测新型冠状病毒 COVID-19的诊断试剂，进行早期鉴别诊断，这种快速诊断试剂面临巨大的需 求。
抗体检测快速诊断试剂的核心原料是抗原，上述2019新型冠状病毒刺突 蛋白受体结合结构域是很好的目标分子。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种2019新型冠状病毒 刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法及其应用。
本发明提供的技术方案如下：
根据本发明的第一个方面，提供了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白 受体结合结构域蛋白，该受体结合结构域蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
根据本发明的第二个方面，提供了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白 受体结合结构域蛋白的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，该制备方法包括下列步骤：
S1预测：预测所述的蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；
S2表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式表达所述的蛋白；
S3纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤和亲和的方法纯化所述的蛋白， 即获得目标蛋白；
S4复性：在具有二硫键氧化还原对的复性液中，运用稀释法进行所述 的目标蛋白复性；
S5纯化：复性后的所述的目标蛋白通过离子柱、分子筛进一步纯化， 去除杂蛋白，即得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域 蛋白。
进一步地，在步骤S3中，所述的杂蛋白洗涤包括二步洗涤：第一步： 使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠， pH 7.4，1％曲拉通的溶液洗涤；以及第二步：使用10毫摩尔/升的三(羟 甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH 7.4的溶液洗涤。
进一步地，所述的大肠杆菌包涵体表达包括大肠杆菌密码子优化的基 因合成、大肠杆菌转化和表达、大肠杆菌破菌和大肠杆菌包涵体获得。
进一步地，在步骤S4中，还包括将所述的大肠杆菌包涵体的溶解步 骤。
进一步地，所述的大肠杆菌包涵体的溶解步骤包括：将所述的大肠杆 菌包涵体溶解到10毫升6-8摩尔/升尿素，用电磁搅拌器搅拌溶解2小时，12000转/分钟离心去除沉淀，将收获的上清液用于复性。
进一步地，在步骤S4中，所述的二硫键氧化还原对为还原型谷胱甘 肽/氧化型谷胱甘肽。
进一步地，在步骤S4中，所述的复性液的成分是10毫摩尔/升的三(羟 甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH 7.4，5毫摩尔/升还 原型谷胱甘肽，0.5毫摩尔/升氧化型谷胱甘肽，300-400毫摩尔/升精氨酸。
进一步地，在步骤S4中，所述的复性过程包括：将所述的目标蛋白 以0.5毫升/分钟的速度滴入快速搅拌中的复性液中；放到4℃环境中复性 12小时。
进一步地，在步骤S5中，所述的目标蛋白的纯度大于等于90％。
根据本发明的第三个方面，提供了上述的2019新型冠状病毒刺突蛋 白受体结合结构域蛋白或上述的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺 突蛋白受体结合结构域蛋白应用于2019新型冠状病毒诊断试剂。
根据本发明的第四个方面，提供了一种2019新型冠状病毒抗原，该 抗原包含上述的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白或上述 的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。
根据本发明的第五个方面，提供了一种2019新型冠状病毒的检测试 剂盒，包括抗原试剂，该抗原试剂包含上述的2019新型冠状病毒刺突蛋 白受体结合结构域蛋白或上述的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺 突蛋白受体结合结构域蛋白。
本发明提供的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白，该 受体结合结构域蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其制备方法通过 以下技术方案得以实现：克隆2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区域 的基因序列；将合成的基因序列插入pET21a表达载体中，该序列是根据 大肠杆菌密码子的偏好性经过优化的，利用此表达载体转化BL21(DE3)， BL21(DE3)是一种工程化的细胞，用于体外大量表达目标蛋白，挑取单 克隆，培养细胞，经诱导表达目标蛋白，再通过破菌，包涵体洗涤，包涵 体复性，离子柱以及分子筛等柱纯化得到2019新型冠状病毒刺突蛋白受 体结合结构域蛋白。
本发明技术方案还提供了含2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结 构域蛋白的抗原，该蛋白是病毒编码的表面结构蛋白，通过与细胞表面的 受体结合侵入到细胞，是疫苗研发的靶点，同时也是免疫试剂抗体检测的 抗原，可以用作诊断试剂原料。本发明通过预测该蛋白的受体结合区域， 构建该蛋白的表达质粒，利用多个组氨酸标签纯化富集该蛋白，通过包涵 体复性的方法得到有特定功能结构域的蛋白，该活性蛋白可与针对该表位的抗体结合，广泛用在化学发光以及胶体金等诊断试剂领域。
2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白用在胶体金法新冠病毒 抗体检测试剂中，胶体金标记的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域 蛋白用在试剂条的金垫上，抗人的抗体划线用作T线，该方案实施的胶体金 检测试剂条具有特异性强，灵敏度高的特点。
本发明的有益效果是：本发明可以使得面临突入其来的疫情，快速获 得所需要的抗原，大概用一周的时间以较低成本制备出足量的抗原，用于 诊断试剂的研发生产。
附图说明
图1是本发明一典型实施例制备方法的流程图；
图2是本发明一典型实施例制备方法的流程图；
图3是SDS-PAGE分析2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白 的纯化；
图4.胶体金试纸条测试结果。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种2019新型冠状病毒刺突 蛋白受体结合结构域蛋白，该受体结合结构域蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
如图1所示，根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种2019新型冠 状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，该制备方法包括下列步骤：
S1预测：预测所述的蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；
S2表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式表达所述的蛋白；
S3纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤和亲和的方法纯化所述的蛋白，即 获得目标蛋白；
S4复性：在具有二硫键氧化还原对的复性液中，运用稀释法进行所述的 目标蛋白复性；
S5纯化：复性后的所述的目标蛋白通过离子柱、分子筛进一步纯化，去 除杂蛋白，即得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。
进一步地，在步骤S3中，所述的杂蛋白洗涤包括二步洗涤：第一步：使 用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH 7.4，1％曲拉通的溶液洗涤；以及第二步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基) 氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH 7.4的溶液洗涤。
如图2所示，根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种2019新型冠 状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法，该制备方法包括下列步骤：
首先预测2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区域，选定如氨基酸序列 表SEQID NO.1所示的序列，合成经过大肠杆菌密码子优化过的基因序列， 构建到表达载体pET21a；
用上述表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用抗生素筛选 成功转化的细胞；
挑取单克隆，介入几毫升培养基里，生长10小时，指标甘油菌以方便后 续培养；
较大量的细胞培养，直到光密度达到0.75左右，加入终浓度1毫摩尔/ 升诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖，诱导目标蛋白表达，37度培养4小时。
收集细胞，破碎，纯化目标蛋白，主要是包涵体洗涤，去除杂蛋白，两 步洗涤，包括10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的 氯化钠，pH 7.4，1％曲拉通的洗涤以及10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷 盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH 7.4的洗涤；
包涵体的溶解：采用8摩尔/升尿素，加入10毫摩尔/升二硫苏糖醇，以 便打开二硫键；
溶解的包涵体在复性液中复性：复性液先在4℃环境中预冷，复性的成 分是10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠， pH 7.4，5毫摩尔/升还原型谷胱甘肽，0.5毫摩尔/升氧化型谷胱甘肽， 300-400毫摩尔/升精氨酸，以0.5毫升/分钟的速度滴入快速搅拌中的复性 液中；放到4℃环境中复性12小时；
制备镍柱，用双蒸水和缓冲液分别洗涤和平衡柱子，将上述复性液离心 后，以1-2毫升/分钟的流速过柱子，用含20毫摩尔/升咪唑的缓冲液洗涤杂 蛋白，用250毫摩尔/升咪唑的缓冲液洗脱；
离子柱Q柱或者SP柱对于复性成功的蛋白的富集，包括下列步骤：离子 柱的实施是上述液体经透析后，过阴离子柱Q柱，然后用另外添加300毫摩 尔/升氯化钠的溶液洗脱；
分子筛对于目标蛋白的进一步纯化：上述洗脱后的溶液进一步浓缩，浓 缩到5毫克/毫升左右，上样1-2毫升经Superdex200 120毫升的柱子，1毫 升/分钟流速，收集吸收峰。
SDS-PAGE跑胶分析纯度和表达量，纯度达到90％以上，一升的表达量可 达到上百毫克。如图3所示是SDS-PAGE分析2019新型冠状病毒刺突蛋白受 体结合结构域蛋白的纯化。
根据本发明一典型实施方式，提供了含有2019新型冠状病毒刺突蛋白受 体结合结构域蛋白的金标抗原。如图4所示是胶体金试纸条测试结果。使用 该2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白制备的金标抗原在捕获 法胶体金试纸条试验中，阴性试验中无假阳，阳性试验IgM和IgG都能够检 测出来，显色清楚，表明该抗原具有良好的特异性和灵敏度。
本发明技术方案提供的抗原，含2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结 合结构域蛋白，该蛋白是病毒编码的表面结构蛋白，通过与细胞表面的受 体结合侵入到细胞，是疫苗研发的靶点，同时也是免疫试剂抗体检测的抗 原，可以用作诊断试剂原料。
根据本发明一典型实施方式，通过预测2019新型冠状病毒刺突蛋白受体 结合结构域蛋白的受体结合区域，构建该蛋白的表达质粒，利用多个组氨 酸标签纯化富集该蛋白，通过包涵体复性的方法得到有特定功能的受体结 合结构域蛋白，该活性蛋白可与针对该表位的抗体结合，应用在化学发光 以及胶体金等诊断试剂领域。
根据本发明一典型实施方式，提供了一种2019新型冠状病毒的检测试剂 盒，包括抗原试剂，该抗原试剂包含2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结 构域蛋白。2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白用在胶体金法新 冠病毒抗体检测试剂中，胶体金标记的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合 结构域蛋白用在试剂条的金垫上，抗人的抗体划线用作T线，该方案实施的 胶体金检测试剂条具有特异性强，灵敏度高的特点，是该抗原的一个典型应 用实施例。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可 以相互组合以得到新的实施例，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
序列表SEQ ID NO.1：
Figure BDA0002618205540000071

Claims (10)

1.一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括下列步骤：
S1预测：预测所述的蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；
S2表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式表达所述的蛋白；
S3纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤和亲和的方法纯化所述的蛋白，即获得目标蛋白；
S4复性：在具有二硫键氧化还原对的复性液中，运用稀释法进行所述的目标蛋白复性；
S5纯化：复性后的所述的目标蛋白通过离子柱、分子筛进一步纯化，去除杂蛋白，即得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述的杂蛋白洗涤包括二步洗涤：
第一步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4，1％曲拉通的溶液洗涤；以及
第二步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4的溶液洗涤。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌包涵体表达包括大肠杆菌密码子优化的基因合成、大肠杆菌转化和表达、大肠杆菌破菌和大肠杆菌包涵体获得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，还包括将所述的大肠杆菌包涵体的溶解步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌包涵体的溶解步骤包括：将所述的大肠杆菌包涵体溶解到10毫升6-8摩尔/升尿素，用电磁搅拌器搅拌溶解2小时，12000转/分钟离心去除沉淀，将收获的上清液用于复性。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述的二硫键氧化还原对为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。
7.根据权利要求1至6任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述的复性液的成分是10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4，5毫摩尔/升还原型谷胱甘肽，0.5毫摩尔/升氧化型谷胱甘肽，300-400毫摩尔/升精氨酸。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述的复性过程包括：将所述的目标蛋白以0.5毫升/分钟的速度滴入快速搅拌中的复性液中；放到4℃环境中复性12小时。
9.根据权利要求1-6任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，所述的目标蛋白的纯度大于等于90％。
10.如权利要求1至9任一项所述的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白应用于2019新型冠状病毒诊断试剂。
CN202010775413.2A 2020-08-05 2020-08-05 2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法 Pending CN112028975A (zh)

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