CN111087453A

CN111087453A - 一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法

Info

Publication number: CN111087453A
Application number: CN201911425395.9A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 郭晓
Original assignee: Nanjing Fuxiao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Fuxiao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-05-01

Abstract

本发明公开了一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法，肺炎衣原体重组抗原的制备方的具体步骤如下：肺炎衣原体重组抗原序列的选取：肺炎衣原体重组抗原的原核表达；肺炎衣原体重组抗原的纯化与复性和肺炎衣原体重组抗原的验证，开发血清学检测方法的前提是制备有效的CP抗原，CP天然抗原的制备工艺繁琐、成本高及制备人员存在感染的风险，免疫原性强且特异性好的重组抗原作为天然抗原的替代品，不但降低了生产成本，而且为研制检测肺炎衣原体抗体IgG和IgM检测试剂盒打下了基础，本发明方法操作简单，成本低，且CP抗原的特异性强，稳定性好，可以大批量生产，适于推广应用。

Description

一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种医用药品，具体是一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法。

背景技术

肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia,CP)是一种全球比较常见的社区获得性肺炎的主要病原之一，幼儿和老年人是易感人群，四季均可发病，主要经由飞沫传染。临床上主要以呼吸道症状，咽痛、声嘶、流涕等，也可表现发烧、咳嗽。CP感染通常是轻度的、自限性的疾病，由于其症状不典型，故常常被忽略或是漏诊。研究表明，CP感染与一些慢性疾病有关，例如，哮喘、中耳炎、结节性红斑、动脉粥样硬化及心内膜炎、冠心病等，CP感染还会导致脑血管和中枢神经系统受损，严重者会危及生命，引起广泛关注。

现阶段CP的检测方法主要有：细胞的分离培养、血清学检测、分子生物学方法和联合检测。

上述检测方法存在的问题有：

第一，CP是一种专性胞内寄生菌，分离培养周期长、成本高；

第二，PCR检测衣原体DNA，其特异性和敏感性高，但是对实验室环境有特殊要求，实验室需要配备高端设备和高级技术人员，而且PCR的假阳性率难以控制，一般实验室难以开展；

第三，血清学的检测方法由于其通量高、成本低、特异性强和灵敏度高等优点，广泛的应用于临床检测和流行病学调查。肺炎衣原体血清学检测主要检测IgG和IgM两种抗体，CP感染初期(1-16d)产生的抗体以CPIgM为主，在感染后期和恢复期(21d后)以CPIgG为主。因此，IgM抗体阳性可作为早期感染的诊断指标。如果检测CPIgM抗体呈现阴性，也不能判定非肺炎衣原体感染，需要再进行CPIgG抗体的检测。但是，开发血清学检测方法的前提是制备有效的CP抗原。实操中，CP天然抗原的制备工艺繁琐、成本高及制备人员存在感染的风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法，以解决现阶段检测速度慢、准确性低、工艺繁琐、成本高及制备人员存在感染的风险等等实操问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法，肺炎衣原体重组抗原的制备方的具体步骤如下：

步骤一，肺炎衣原体重组抗原序列的选取，将重组质粒的表达菌株冻存备用；

步骤二，肺炎衣原体重组抗原的原核表达，Buffer A的配制：经SDS-PAGE电泳鉴定后，沉淀用Buffer A洗杂3次，溶解后进行Ni-NTA纯化；

步骤三，肺炎衣原体重组抗原的纯化与复性，平衡液的配制，将目的蛋白透析至缓冲液中；

步骤四，肺炎衣原体重组抗原的验证，对纯化后的CP重组蛋白进行Western Blot试验，抗体使用肺炎衣原体IgM和IgG抗体分别进行检测。

进一步，步骤一中化学合成目的基因片段后，CP重组抗原的核苷酸序列用上下游引物进行PCR扩增，胶回收，BamHI和HindШ双酶切。

进一步，步骤三中缓冲液收集透析样品，用超滤浓缩管浓缩，收集浓缩样，得到CP重组抗原。

本发明另一方面提供一种上述肺炎衣原体重组抗原的应用方法，具体应用步骤如下：

步骤一，用包被缓冲液将CP蛋白稀释至2μg/mL，加入到酶标板孔中；此时可以用铝箔袋真空包装保存；

步骤二，将待检样本用样本稀释液按1:100稀释并混匀；

步骤三，每孔加入100μL的稀释样品，并在预留的校准品孔中加入CP-IgM校准品溶液各100μL；

步骤四，用制备的ELISA对30例CP确诊的病人进行检测IgM，检测程序和结果判断严格按照提供的使用方法进行；

步骤五，测定OD₄₅₀值判定：空白对照OD₄₅₀小于0.1，阳性的数值－阴性数值大于0.1，同时大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即判定为阳性；

构建肺炎衣原体重组抗原的基因表达序列，并送生工合成，核酸序列见SEQ IDNO.1，以合成基因序列为模板，经PCR扩增，胶回收和酶切(BamHI和HindШ)后，连接至表达载体pET28a中，得到重组表达质粒pET28a-CP，得到重组质粒的表达菌株，对重组质粒的表达菌株进行诱导表达和纯化。

进一步，步骤三中CP-IgM校准品溶液用酶标仪测定其OD450值。

进一步，步骤四中IgM使用胶体金方法检测。

进一步，步骤四中根据序列设计上下游引物，在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindШ酶切位点并加入8×His标签。

进一步，步骤一中包被缓冲液为pH 9.6的0.1mol/L碳酸盐缓冲液。

进一步，步骤一中采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化。获得具有抗原优势表位的肺炎衣原体重组抗原。

本发明的有益效果体现在：

1，本发明提供的一种肺炎衣原体重组抗原的制备及应用，操作简单，成本低，且CP抗原的特异性强，稳定性好，可以大批量生产，适于推广应用。

2，本发明提供的一种肺炎衣原体重组抗原的制备及应用，开发血清学检测方法的前提是制备有效的CP抗原，CP天然抗原的制备工艺繁琐，成本高及制备人员存在感染的风险，免疫原性强且特异性好的重组抗原作为天然抗原的替代品，不但降低了生产成本，而且为研制检测肺炎衣原体抗体IgG和IgM检测试剂盒打下了基础。

附图说明

图1为一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法的pET28a-CP核酸电泳图示意图。

图2为一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法中western blot验证CP重组抗原2A(CP-IgM)示意图。

图3为一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法中western blot验证CP重组抗原2B(CP-IgM)的结构示意图。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为对本发明技术方案的限制。

实施例1

请参阅图1所示，一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法，具体步骤如下：(1)肺炎衣原体重组抗原序列的选取：综合比较CP现有文献报道的抗原靶点，并结合生物信息学分析，最终确定incA，incB和opmA最具有免疫原性的氨基酸区段为：incA的第220位氨基酸-第490位氨基酸，incB基因的第98位氨基酸-第175位氨基酸序列，ompA基因的第25位氨基酸-第192位氨基酸，通过连接肽GSGSGS串联起来，串联顺序从N端到C端依次为incA片段-GSGSGS-incB片段-GSGSGS-ompA片段，最终的核酸序列通过化学合成的方法获得。

CP重组抗原的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列见SEQ ID NO.2，化学合成目的基因片段后，CP重组抗原的核苷酸序列用上下游引物,

引物序列SEQ ID NO.3,

CP-F：5'-CGCGGATCCATGCAGGGCATTATGACCGTT-3'

CP-R：5'-CCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGATGGTGATGATGATGGCGCGCATGAATTTTAA-3'进行PCR扩增，胶回收，BamHI和HindШ双酶切，CP重组抗原的核苷酸序列连接到用BamHI和HindШ酶切之后的表达载体pET-28a中，CP重组抗原的核苷酸序列提取重组质粒pET-28a-CP，经PCR和测序验证正确，得到用于表达CP重组抗原的重组质粒，CP重组抗原的核苷酸序列将重组质粒pET-28a-CP转化至表达菌BL21(DE3)感受态细胞内，得到重组质粒的表达菌株冻存备用；

(2)肺炎衣原体重组抗原的原核表达，Buffer A的配制：20mM Tris-HCl，1mMEDTA，50mM NaCl，0.01％Triton X-100，pH8.0。

取10mL新鲜的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的500mL LB培养基中，培养基中温度为37℃，180rpm/min培养至菌体浓度为OD600＝0.6-1.0时间为3h；菌体浓度为OD600＝0.6-1.0加入终浓度为1mM IPTG诱导4h后，培养基中温度为4℃，12,000rpm/min离心10min收集菌体；获得的菌体每100mg用5mL裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0，1mM EDTA，100mMNaCl)重悬，冰浴超声破碎(200W，超声10s停5s，超声60min，每超声20min将菌液摇匀一次)；培养基中温度为4℃，12,000rpm/min离心20min，冰浴超声破碎分离上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分CP重组蛋白为表达；沉淀用Buffer A洗杂3次，培养基中温度为4℃，12,000rpm/min离心10min，沉淀用8M尿素(pH8.0 PBS)溶解，溶解后进行Ni-NTA纯化。

(3)肺炎衣原体重组抗原的纯化与复性，平衡液的配制：20mM Tris-HCl(pH7.9)，0.5mM NaCl，10mmol/L咪唑，8M尿素，pH 8.0；洗脱液的配制：20mM Tris-HCl(pH7.9)，0.5mMNaCl，150mmol/L咪唑，8M尿素，pH 8.0；

使用ATKA purifier 10/UPC层析仪，安装Ni-NTA亲和柱后，先用10倍柱体积的超纯水洗去乙醇；再用10倍柱体积的平衡液清洗平衡；将待上柱样品上柱结合；上样结束后用10倍柱体积的平衡液清洗柱子。

使用洗脱液进行洗脱，收集出现洗脱峰的EP管，测定蛋白浓度，-80℃保存；将上述纯化蛋白用平衡液稀释至0.5mg/mL，再依次用含有4M，3M，2M，1M，0.5M，0M尿素的复性缓冲液(20mM PBS，2mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，5％甘油，1mM EDTA，pH 8.0)于4℃进行透析，每隔12h换液一次，最终将目的蛋白透析至缓冲液(20mM PBS，1mM EDTA，pH8.0)中，收集透析样品，用超滤浓缩管浓缩，收集浓缩样，即为CP重组抗原，测定蛋白浓度，-80℃保存。

(4)肺炎衣原体重组抗原的验证，对纯化后的CP重组蛋白进行Western Blot试验，抗体使用肺炎衣原体IgM和IgG抗体分别进行检测。

实施例2

请参阅图2、3所示，一种肺炎衣原体重组抗原的应用方法，其具体步骤如下：

(1)用包被缓冲液(pH 9.6的0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将CP蛋白稀释至2μg/mL，加入到酶标板孔中，100μL/孔，37℃孵育2h；甩掉包被液后，拍干，使用PBST洗涤3次，3min/次；每孔加入200μL的封闭液(含终浓度为2％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液)，37℃孵育2h；甩掉包被液后，拍干，使用PBST洗涤3次，3min/次；此时可以用铝箔袋真空包装保存；

(2)将待检样本用样本稀释液按1:100稀释并混匀；

(3)每孔加入100μL的稀释样品，并在预留的校准品孔中加入CP-IgM校准品溶液各100μL，封闭酶标板孔后，在37℃孵育2h；PBST洗涤5次，3min/次；每孔加入羊抗人IgM-HRP100μL，封闭酶标板孔后，在37℃孵育1h；PBST洗涤5次，3min/次；每孔加入100μL的TMB显色液，在37℃避光显色10min；加入1M硫酸终止液，50μL/孔；用酶标仪测定其OD₄₅₀值；

(4)用制备的ELISA试剂盒对30例CP确诊的病人进行检测IgM(胶体金方法检测)，检测程序和结果判断严格按照实施例2提供的使用方法进行；检测结果如表1；

表1重组CP抗原检测临床样本IgM

由表1数据可知，相同的阳性样本，本实验室建立的间接ELISA检测方法的灵敏度高。可用于CP检测试剂盒的开发。

(5)测定OD₄₅₀值判定：空白对照OD₄₅₀小于0.1，阳性的数值－阴性数值大于0.1，同时大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即判定为阳性；

构建肺炎衣原体重组抗原的基因表达序列，并送生工合成，核酸序列见NO.1，根据序列设计上下游引物，在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindШ酶切位点并加入8×His标签，以合成基因序列为模板，经PCR扩增，胶回收和酶切(BamHI和HindШ)后，连接至表达载体pET28a中，得到重组表达质粒pET28a-CP，将PCR正确的重组质粒pET-28a-CP转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，得到重组质粒的表达菌株，经过测序验证正确后，对重组质粒的表达菌株进行诱导表达和纯化，采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化，获得具有抗原优势表位的肺炎衣原体重组抗原。

CP抗原的研究主要是外膜表面蛋白(MOMP)、蛋白酶样活性因子(CPAF)、质粒编码蛋白(PGP3)和包涵体膜蛋白(INC)等，都具有一定的免疫原性。本研究选择已知免疫原性强的蛋白：incA、incB和ompA进行DNAstar表位分析，最终选择incA的第220位氨基酸-第490位氨基酸，incB基因的第98位氨基酸-第175位氨基酸序列，ompA基因的第25位氨基酸-第192位氨基酸，作为重组抗原的序列，每个片段用连接肽GSGSGS连接，使其在宿主细胞内成功表达且不影响各自的免疫原性，同时对拼接后的核酸序列进行密码子优化，使其高效表达。

综上，本申请提供了特异性和灵敏性高的重组CP抗原，同时为研制快捷、高通量、准确的检测CP-IgM，CP-IgG抗体试剂盒打下基础。检测时，操作简单、成本低，且CP抗原的特异性强、稳定性好，可以大批量生产，适于推广应用。

以上仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京拂晓生物科技有限公司

<120> 一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1593

<212> DNA

<213> 1

<400> SEQUENCE NO.1

atgcagggca ttatgaccgt tcgcagcgaa gaaggcgaaa aagaaattag ccgcctgcag 60

gatctgatta gcctgcagca gcagaccgtt caggatctgc gcagccgcat tgatgatgaa 120

cagaaacgct gctggaccgc gctgcagcgc attaaccaga gccagaaaga tattcagcgc 180

gcgcatgatc gcgaagcgag ccagcgcgcg tgcgaaggca ccgaaatgga ttgcgcggaa 240

cgccagcagc tggaaaaaga tctgcgccgc cagctgaaaa gcatgcagga atggattgaa 300

atgcgcggca ccattcatca gcaggaaaaa gcgtggcgca aacagaacgc gaaactggaa 360

cgcctgcagg aagatctgcg cctgaccggc attgcgtttg atgaacagag cctgttttat 420

cgcgaatata aagaaaaata tctgagccag aaactggata tgcagaaaat tctgcaggaa 480

gttaacgcgg aaaaaagcga aaaagcgtgc ctggaaagcc tggttcatga ttatgaaaaa 540

cagctggaac agaaagatgc gaacctgaaa aaagcggcgg cggtttggga agaagaactg 600

ggcaaacagc agcaggaaga ttatgaacag acccaggaaa ttcgccgcct gagcaccttt 660

attctggaat atcaggatag cctgcgcgaa gcggaaaaag ttgaaaaaga ttttcaggaa 720

ctgcagcagc gctatagccg cctgcaggaa gaaaaacagg ttaaagaaaa aattctggaa 780

gaaagcatga accattttgc ggatctgttt gaaaaaggca gcggcagcgg cagcaaagtt 840

ctggcggttg ttctgaccat tattgcgctg attgcgattg cggttctgat tgcgtgcatt 900

attgcggcgt gcggcggctt tccgctgctg ctgagcgcgc tgaacctgta taccattggc 960

gcgtgcgtta gcctgccgat tattgcgagc accagcgttg cgctgatttg cctgtgcacc 1020

tttgttgcga acagcctgat taaaccggtt attaccgttc gcaccacccg cggcagcggc 1080

agcggcagcc cgaactatgg ctgggaagat agctgcaaca cctgccatca tacccgccgc 1140

aaaaaaccga gcagctttgg ctttgttccg ctgtataccg aagaagattt taacccgaac 1200

tttacctttg gcgaatatga tagcaaagaa gaaaaacagt ataaaagcag ccaggttgcg 1260

gcgtttcgca acattacctt tgcgaccgat agctatacca ttaaaggcga agaaaacctg 1320

gcgattctga ccaacctggt tcattatatg aaaaaaaacc cgaaagcgac cctgtatatt 1380

gaaggccata ccgatgaacg cggcgcggcg agctataacc tggcgctggg cgcgcgccgc 1440

gcgaacgcga ttaaagaaca tctgcgcaaa cagggcatta gcgcggatcg cctgagcacc 1500

attagctatg gcaaagaaca tccgctgaac agcggccata acgaactggc gtggcagcag 1560

aaccgccgca ccgaatttaa aattcatgcg cgc 1593

<110> 南京拂晓生物科技有限公司

<120> 一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法及其应用方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> 2

<400> SEQUENCE NO.2

Met Gln Gly Ile Met Thr Val Arg Ser Glu Glu Gly Glu Lys Glu Ile

1 5 10 15

Ser Arg Leu Gln Asp Leu Ile Ser Leu Gln Gln Gln Thr Val Gln Asp

20 25 30

Leu Arg Ser Arg Ile Asp Asp Glu Gln Lys Arg Cys Trp Thr Ala Leu

35 40 45

Gln Arg Ile Asn Gln Ser Gln Lys Asp Ile Gln Arg Ala His Asp Arg

50 55 60

Glu Ala Ser Gln Arg Ala Cys Glu Gly Thr Glu Met Asp Cys Ala Glu

65 70 75 80

Arg Gln Gln Leu Glu Lys Asp Leu Arg Arg Gln Leu Lys Ser Met Gln

85 90 95

Glu Trp Ile Glu Met Arg Gly Thr Ile His Gln Gln Glu Lys Ala Trp

100 105 110

Arg Lys Gln Asn Ala Lys Leu Glu Arg Leu Gln Glu Asp Leu Arg Leu

115 120 125

Thr Gly Ile Ala Phe Asp Glu Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Glu Tyr Lys

130 135 140

Glu Lys Tyr Leu Ser Gln Lys Leu Asp Met Gln Lys Ile Leu Gln Glu

145 150 155 160

Val Asn Ala Glu Lys Ser Glu Lys Ala Cys Leu Glu Ser Leu Val His

165 170 175

Asp Tyr Glu Lys Gln Leu Glu Gln Lys Asp Ala Asn Leu Lys Lys Ala

180 185 190

Ala Ala Val Trp Glu Glu Glu Leu Gly Lys Gln Gln Gln Glu Asp Tyr

195 200 205

Glu Gln Thr Gln Glu Ile Arg Arg Leu Ser Thr Phe Ile Leu Glu Tyr

210 215 220

Gln Asp Ser Leu Arg Glu Ala Glu Lys Val Glu Lys Asp Phe Gln Glu

225 230 235 240

Leu Gln Gln Arg Tyr Ser Arg Leu Gln Glu Glu Lys Gln Val Lys Glu

245 250 255

Lys Ile Leu Glu Glu Ser Met Asn His Phe Ala Asp Leu Phe Glu Lys

260 265 270

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Val Leu Ala Val Val Leu Thr Ile Ile

275 280 285

Ala Leu Ile Ala Ile Ala Val Leu Ile Ala Cys Ile Ile Ala Ala Cys

290 295 300

Gly Gly Phe Pro Leu Leu Leu Ser Ala Leu Asn Leu Tyr Thr Ile Gly

305 310 315 320

Ala Cys Val Ser Leu Pro Ile Ile Ala Ser Thr Ser Val Ala Leu Ile

325 330 335

Cys Leu Cys Thr Phe Val Ala Asn Ser Leu Ile Lys Pro Val Ile Thr

340 345 350

Val Arg Thr Thr Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Gly Trp

355 360 365

Glu Asp Ser Cys Asn Thr Cys His His Thr Arg Arg Lys Lys Pro Ser

370 375 380

Ser Phe Gly Phe Val Pro Leu Tyr Thr Glu Glu Asp Phe Asn Pro Asn

385 390 395 400

Phe Thr Phe Gly Glu Tyr Asp Ser Lys Glu Glu Lys Gln Tyr Lys Ser

405 410 415

Ser Gln Val Ala Ala Phe Arg Asn Ile Thr Phe Ala Thr Asp Ser Tyr

420 425 430

Thr Ile Lys Gly Glu Glu Asn Leu Ala Ile Leu Thr Asn Leu Val His

435 440 445

Tyr Met Lys Lys Asn Pro Lys Ala Thr Leu Tyr Ile Glu Gly His Thr

450 455 460

Asp Glu Arg Gly Ala Ala Ser Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Ala Arg Arg

465 470 475 480

Ala Asn Ala Ile Lys Glu His Leu Arg Lys Gln Gly Ile Ser Ala Asp

485 490 495

Arg Leu Ser Thr Ile Ser Tyr Gly Lys Glu His Pro Leu Asn Ser Gly

500 505 510

His Asn Glu Leu Ala Trp Gln Gln Asn Arg Arg Thr Glu Phe Lys Ile

515 520 525

His Ala Arg

530

Claims

1.一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法，其特征在于，制备方的具体步骤如下：

2.根据权利要求1的一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤一中化学合成目的基因片段后，CP重组抗原的核苷酸序列用上下游引物进行PCR扩增，胶回收，BamHI和HindШ双酶切。

3.根据权利要求1的一种肺炎衣原体重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤三中缓冲液收集透析样品，用超滤浓缩管浓缩，收集浓缩样，得到CP重组抗原。

4.一种如权利要求1-3任一项的肺炎衣原体重组抗原的应用方法，其特征在于，具体应用方法如下：

步骤二，将待检样本用样本稀释液按1:100稀释并混匀；

构建肺炎衣原体重组抗原的基因表达序列，并送生工合成，核酸序列见SEQ ID NO.1，以合成基因序列为模板，经PCR扩增，胶回收和酶切后，连接至表达载体pET28a中，得到重组表达质粒pET28a-CP，得到重组质粒的表达菌株，对重组质粒的表达菌株进行诱导表达和纯化。

5.根据权利要求4的应用方法，其特征在于，步骤三中CP-IgM校准品溶液用酶标仪测定其OD₄₅₀值。

6.根据权利要求4的应用方法，其特征在于，步骤四中IgM使用胶体金方法检测。

7.根据权利要求4的应用方法，其特征在于，步骤四中根据序列设计上下游引物，在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindШ酶切位点并加入8×His标签。

8.根据权利要求4的应用方法，其特征在于，步骤一中包被缓冲液为pH 9.6的0.1mol/L碳酸盐缓冲液。

9.根据权利要求4的应用方法，其特征在于，步骤一中采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化。