CN111548423A

CN111548423A - 肺炎支原体融合抗原及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111548423A
Application number: CN202010498321.4A
Authority: CN
Inventors: 聂金梅; 何丽娟; 况承钰; 朱越谭; 胡志强; 陈巧红; 杨海林; 候宝凤
Original assignee: Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Current assignee: Zhuhai Livzon Diagnostics Inc
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111548423B

Abstract

本发明提供一种肺炎支原体融合抗原及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。所述肺炎支原体融合抗原为包含P1M抗原片段与P30A抗原片段的融合蛋白。本发明提供的肺炎支原体融合抗原，经免疫血清学检测技术验证，与现有的肺炎支原体抗原相比，其特异性更强、灵敏度更高，且易于培养纯化，更有利于工业化生产，节约成本。所述肺炎支原体融合抗原适用于MP抗体检测产品的制备，可以被加工为体外免疫诊断领域任何形式的产品，具备广阔的市场前景。

Description

肺炎支原体融合抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肺炎支原体融合抗原及其制备方法和应用。

背景技术

肺炎支原体(MP)是一种病原性支原体，是社区获得性肺炎的重要病原，其感染可引起原发性非典型肺炎，还可引起人类呼吸道感染性疾病如支气管炎、咽炎等，严重者可引发并发症累及神经系统、血液系统、心血管系统以及皮肤、肌肉、关节等。总之，由MP感染引起的呼吸道损伤及各种肺外并发症已引起广发关注。

MP感染常无特异性临床表现，及时确诊病因，避免病情恶化，做到早发现早治疗，已成为MP感染性疾病治疗的当务之急，因此，MP感染的早期诊断尤为重要。

肺炎支原体抗体分为IgG和IgM抗体两种，MP感染的潜伏期为2-3周，大约7-10天左右出现IgM抗体，20天左右出现IgG抗体。当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此，IgM抗体阳性可作为急性感染期的诊断指标。但如IgM抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测IgG抗体。此外，检测到MP特异性IgM并不能表明患者处于急性感染期，因为在感染后一年内，特异性IgM仍能持续升高。所以，在MP的血清学诊断方法中，需动态观察，检测IgM抗体和IgG抗体总抗体，才能较好地辅助MP的临床诊断。

在肺炎支原体感染的体外诊断中，最重要的是选用抗原性强、特异性好的抗原。MP全菌抗原的制备工艺要求严格、步骤复杂，常混有其它蛋白，价格昂贵，批次间产品质量不均一，且在生产使用过程中有感染人类的危险性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺炎支原体融合抗原、所述肺炎支原体融合抗原的制备方法、所述肺炎支原体融合抗原在制备肺炎支原体抗体检测产品中的应用、肺炎支原体抗体检测产品、编码所述肺炎支原体融合抗原的核酸分子以及与所述核酸分子相关的生物材料，所述肺炎支原体融合抗原具有特异性强、灵敏度高、易于培养纯化等优点。

为实现以上目的，本发明首先提供一种肺炎支原体融合抗原，所述肺炎支原体融合抗原为包含P1M抗原片段与P30A抗原片段的融合蛋白；

所述P1M抗原片段具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或者将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列；

所述P30A抗原片段具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。

本发明一些实施例中，所述P1M抗原片段位于所述融合蛋白的N端，所述P30A抗原片段位于所述融合蛋白的C端。

本发明一些实施例中，所述P1M抗原片段与所述P30A抗原片段通过短肽连接。

本发明一些实施例中，所述肺炎支原体融合抗原具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或者将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。

具体的，所述肺炎支原体融合抗原中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明还提供一种肺炎支原体融合抗原的制备方法，包括：构建包含编码所述肺炎支原体融合抗原的DNA序列的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中进行表达。

本发明一些实施例中，所述重组载体为重组质粒，所述宿主细胞为原核细胞(例如大肠杆菌)。

本发明一些实施例中，所述肺炎支原体融合抗原的制备方法具体包括如下步骤：

筛选出肺炎支原体P1抗原的抗原表位P1M(residues 1341-1518)和P30抗原的抗原表位P30A(residues 170-182)，并用短肽连接；

设计PCR引物HP-P1M/P30A-P1M-for、HP-P1M/P30A-P1M-rev，以本申请发明人实验室保存的重组质粒pET28a-P1F为模板，PCR扩增P1M核酸片段；以本申请发明人实验室保存的重组质粒pET28a-P30C为模板，设计PCR引物HP-P1M/P30A-P30A-for、HP-P1M/P30A-P30A-rev，PCR扩增P30A核酸片段，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到P1M核酸片段和P30A核酸片段；

以P1M核酸片段和P30A核酸片段作为模板和引物进行融合PCR；

以上述融合PCR产物为模板，以引物HP-P1M/P30A-P1M-for、HP-P1M/P30A-P30A-rev扩增融合抗原的全长基因P1M-P30A，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到融合抗原P1M-P30A的全长核酸产物。

采用无缝克隆技术，将上述全长核酸产物P1M-P30A连接至载体pET28a上，37℃，反应3h后，取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5a，涂布含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落接种至含有50μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基，37℃，250rpm培养过夜；取经菌液PCR验证和基因测序验证都正确的重组菌菌液4ml，按照质粒提取试剂盒的操作说明书提取重组质粒pET28a-P1M/P30A。

取重组质粒P1M-pET28a 200μg转入大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布于含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的LB平板，37℃，倒置培养14-16h；挑取平板上的单菌落，接种至4ml含有相同抗性的LB液体培养基，37℃，250rpm，培养14-16h；

按1％(v/v)的接种量，将上述菌液接种至含有相同抗性的LB液体培养基，37℃，250rpm，培养4h，再加入IPTG至终浓度为0.5-1.0mM；在25℃，250rpm条件下诱导目的蛋白表达。

采用Ni柱和离子柱纯化目的蛋白P1M/P30A，所述目的蛋白P1M/P30A即为肺炎支原体融合抗原。

本发明还提供一种上述肺炎支原体融合抗原在制备肺炎支原体抗体检测产品中的应用。

本发明一些实施例中，所述肺炎支原体抗体检测产品为支原体肺炎检测产品。

本发明一些实施例中，所述肺炎支原体抗体检测产品的形式为试剂盒。

可选的，所述肺炎支原体抗体检测产品的检测方法包括化学发光法、ELISA和胶体金快速检测法中的至少一种。

本发明还提供一种肺炎支原体抗体检测产品，包括上述肺炎支原体融合抗原。

本发明还提供一种编码上述肺炎支原体融合抗原的核酸分子。

本发明一些实施例中，所述核酸分子包括编码所述P1M抗原片段的DNA序列与编码所述P30A抗原片段的DNA序列；

所述编码所述P1M抗原片段的DNA序列为如SEQ ID NO.4所示的DNA序列或者与SEQID NO.4所示的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述编码所述P30A抗原片段的DNA序列为如SEQ ID NO.5所示的DNA序列或者与SEQ ID NO.5所示的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选的，所述核酸分子具有如SEQ ID NO.6所示的DNA序列或者与SEQ ID NO.6所示的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

具体的，所述核酸分子中，所述80％以上同源性还可以为85％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、98％以上同源性或99％以上同源性。

本发明还提供一种与上述核酸分子相关的生物材料，该生物材料为如下任一种：

(a)表达盒，含有上述核酸分子；

(b)重组载体，含有上述核酸分子或(a)中表达盒；

(c)重组细胞，含有上述核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体。

可以理解的是，所述表达盒指的是包含启动子和目的基因的一组DNA序列，所述表达盒能够在宿主细胞中表达所述目的基因。

可选的，所述重组细胞为重组真核细胞或重组原核细胞。

本发明一些实施例中，所述重组载体为重组质粒，所述重组细胞为重组原核细胞(例如大肠杆菌)。

本发明的有益效果：

本发明提供的肺炎支原体融合抗原，经免疫血清学检测技术验证，与现有的肺炎支原体抗原相比，其特异性更强、灵敏度更高，且易于培养纯化，更有利于工业化生产，节约成本。此外，所述肺炎支原体融合抗原适用于MP抗体检测产品的制备，可以被加工为体外免疫诊断领域任何形式的产品，具备广阔的市场前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。

图1为本发明实施例2中经过诱导表达后的发酵样品和经Ni柱纯化后的含有肺炎支原体融合抗原的样品的SDS-PAGE蛋白电泳图。其中，M：Marker；S：上清液；FT：穿透液；1～7分别为10mM、20mM、40mM、80mM、160mM、250mM和1M咪唑洗脱峰。

图2为本发明实施例2中经离子柱进一步纯化所得的肺炎支原体融合抗原的SDS-PAGE蛋白电泳图。其中，M：Marker；FT：穿透液；1～6分别为5％、10％、20％、30％、50％和100％Buffer(含1M NaCl)洗脱峰。

图3为本发明实施例2中经纯化、浓缩后得到的肺炎支原体融合抗原的SDS-PAGE蛋白电泳图。其中，5μg、10μg为蛋白上样量。

图4为本发明实施例1-2提供的融合抗原P1M/P30A以及本发明实施例3提供的六种不同肺炎支原体抗原的SDS-PAGE蛋白电泳图。其中，Mp：肺炎支原体全菌抗原；1：P1M；2：P1C/P30C；3：P1C；4：P1C/P30A；5：P1M/P30A；6：P1M/P30C；M：蛋白分子量标准品；5μg、2μg为蛋白上样量。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供的肺炎支原体融合抗原为P1蛋白中的P1M抗原片段(residues1341-1518)和P30蛋白中的P30A抗原片段(residues170-182)的融合蛋白(又称P1M/P30A抗原)，其中，所述P1M抗原片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述P30A抗原片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述肺炎支原体融合抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

WLVGQLPSTSDGNTSSTNNLAPNTNTGNDVVGVGRLSESNAAKMNDDVDGIVRTPLAELLDGEGQTADTGPQSVKFKSPDQIDFNRLFTHPVTDLFDPVTMLVYDQYIPLFIDIPASVNPKMVRLKVLSFDTNEQSLGLRLEFFKPDQDTQPNNNVQVNPNNGDFLPLLTASSQGPQT(SEQ ID NO.1)。

RTGFPPQPGMAPR(SEQ ID NO.2)。

WLVGQLPSTSDGNTSSTNNLAPNTNTGNDVVGVGRLSESNAAKMNDDVDGIVRTPLAELLDGEGQTAD TGPQSVKFKSPDQIDFNRLFTHPVTDLFDPVTMLVYDQYIPLFIDIPASVNPKMVRLKVLSFDTNEQSLGLRLEFF KPDQDTQPNNNVQVNPNNGDFLPLLTASSQGPQTLQRTGFPPQPGMAPR(SEQ ID NO.3)。

肺炎支原体采用独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子UGA在肺炎支原体中编码色氨酸，如果直接采用肺炎支原体的野生基因会造成翻译的中断，限制了抗原的制备。为了克服此困难，本发明采用大肠杆菌偏好性密码子反向翻译本发明的抗原氨基酸序列，获得由大肠杆菌偏好性密码子组成的重组抗原基因核酸分子。该核酸分子可以完整、准确地表达本发明的肺炎支原体融合抗原。核酸分子优选为SEQ ID NO.6所示的DNA序列。

TGGCTGGTTGGCCAGCTGCCGAGCACCAGCGATGGTAACACCAGCAGCACCAACAACCTGGCGCCGAA CACCAACACCGGCAACGACGTGGTTGGTGTGGGCCGTCTGAGCGAAAGCAACGCGGCGAAAATGAACGATGACGTG GACGGTATCGTTCGTACCCCGCTGGCGGAGCTGCTGGATGGCGAGGGTCAGACCGCGGACACCGGTCCGCAGAGCG TGAAGTTTAAAAGCCCGGATCAAATCGACTTCAACCGTCTGTTTACCCACCCGGTTACCGACCTGTTCGACCCGGT GACCATGCTGGTTTACGATCAGTATATTCCGCTGTTTATCGACATTCCGGCGAGCGTTAACCCGAAGATGGTGCGT CTGAAAGTTCTGAGCTTCGATACCAACGAGCAAAGCCTGGGTCTGCGTCTGGAGTTCTTCAAACCGGATCAAGACA CCCAGCCGAACAACAACGTGCAGGTTAACCCGAACAACGGTGACTTTCTGCCGCTGCTGACCGCGAGCAGCCAAGG TCCGCAGACCCTGCAGCGTACCGGTTTTCCGCCGCAGCCGGGTATGGCGCCGCGTTAA(SEQ ID NO.6)。

上述SEQ ID NO.6所示的DNA序列中，编码所述P1M抗原片段的DNA序列为：

TGGCTGGTTGGCCAGCTGCCGAGCACCAGCGATGGTAACACCAGCAGCACCAACAACCTGGCGCCGAACACCAACACCGGCAACGACGTGGTTGGTGTGGGCCGTCTGAGCGAAAGCAACGCGGCGAAAATGAACGATGACGTGGACGGTATCGTTCGTACCCCGCTGGCGGAGCTGCTGGATGGCGAGGGTCAGACCGCGGACACCGGTCCGCAGAGCGTGAAGTTTAAAAGCCCGGATCAAATCGACTTCAACCGTCTGTTTACCCACCCGGTTACCGACCTGTTCGACCCGGTGACCATGCTGGTTTACGATCAGTATATTCCGCTGTTTATCGACATTCCGGCGAGCGTTAACCCGAAGATGGTGCGTCTGAAAGTTCTGAGCTTCGATACCAACGAGCAAAGCCTGGGTCTGCGTCTGGAGTTCTTCAAACCGGATCAAGACACCCAGCCGAACAACAACGTGCAGGTTAACCCGAACAACGGTGACTTTCTGCCGCTGCTGACCGCGAGCAGCCAAGGTCCGCAGACC(SEQ ID NO.4)。

上述SEQ ID NO.6所示的DNA序列中，编码所述P30A抗原片段的DNA序列为：

CGTACCGGTTTTCCGCCGCAGCCGGGTATGGCGCCGCGT(SEQ ID NO.5)。

实施例1：编码P1M/P30A抗原的目的基因合成及重组载体构建

1、利用ProtScale等软件分析肺炎支原体(FH株)抗原P1和P30的全部氨基酸序列，筛选出包含抗原性的蛋白序列P1M：residues 1341-1518以及P30A：residues170-182，并用短肽连接。

设计PCR引物HP-P1M/P30A-P1M-for，序列为：

CATCACAGCAGCGGCTGGCTGGTTGGCCAG，

以及HP-P1M/P30A-P1M-rev，序列为：

CGGAAAACCGGTACGCTGCAGGGTCTGCGGACCTTG，以本实验室保存的重组质粒pET28a-P1F(P1抗原片段residues：1181-1525)为模板扩增P1M核酸片段；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，20s；72℃，25s；循环30次；

保温：72℃，4min。

以本实验室保存的重组质粒pET28a-P30C(P30抗原片段：residues 28-274)为模板，设计PCR引物HP-P1M/P30A-P30A-for，序列为：CAAGGTCCGCAGACCCTGCAGCGTACCGGTTTTCCG；

以及HP-P1M/P30A-P30A-rev，序列为：

GTCGACGGAGCTCGAATTCTTAACGCGGCGCCATAC；

扩增P30A核酸片段，PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，10s；72℃，20s；循环30次；

保温：72℃，4min。

上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到P1M核酸片段和P30A核酸片段；

2、以P1M核酸片段和P30A核酸片段同时作为模板和引物进行融合PCR；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，30s；72℃，45s；20个循环；

保温：72℃，4min。

3、以上述融合PCR产物为模板，以引物HP-P1M/P30A-P1M-for和HP-P1M/P30A-P30A-rev扩增融合抗原全长基因P1M-P30A，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到融合蛋白P1M-P30A全长核酸片段。PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，30s；72℃，45s；循环30次；

保温：72℃，4min。

4、采用无缝克隆技术，将上述融合基因产物P1M-P30A连接至载体pET28a上，37℃，反应3h后，无缝克隆反应条件：

5、取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，经菌液PCR验证和基因测序验证，挑选阳性转化子。

6、挑取阳性转化子接种至含有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基，37℃，250rpm培养过夜，按照质粒提取试剂盒的操作说明书提取重组质粒pET28a-P1M/P30A，经测序，重组质粒pET28a-P1M/P30A中插入的融合基因产物P1M-P30A的序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例2：肺炎支原体融合抗原(P1M/P30A抗原)的诱导表达和纯化

1、将实施例1中的重组载体P1M/p30A-pET28a转入大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，在含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的LB培养平板上培养，37℃，培养14-16h；筛选阳性重组菌，挑取单菌落接种到5ml含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的LB培养基中，过夜培养。

2、按1％(v/v)接种量将上述过夜培养的菌液接种至含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氯霉素的750ml LB培养基中，37℃，250rpm，培养至菌液OD₆₀₀为1.0-1.3，再用终浓度为0.5mM-1.0mM的IPTG于25℃，250rpm条件下诱导3-4h。

3、离心收集2得到的0.75L培养基培养收集的大肠杆菌E.coli Rosetta菌体，冰上加入60ml lysis buffer(20mM PBS+500mM NaCl，pH7.4)重悬固体，至肉眼不可见块状菌体。

4、超声破碎：按照超声功率400W，超声4s，停3s，循环200次的条件破碎细菌，直至菌液清亮透明为止。超声结束后，于4℃，12000rpm，离心30min(离心机提前预冷)分离上清与沉淀，上清使用0.22μm膜过滤；上清和沉淀分别留样20μl。

5、向步骤4分离的上清加入平衡好的1ml Ni resin，置于冰盒中摇床振荡孵育1h。

6、Ni柱准备：用Ni柱Buffer B(20mM PBS，1M imidazole，pH7.4)冲洗5CV，然后用Buffer A(20mM PBS，pH7.4)平衡柱子10CV。

7、上样：将过滤后上清液以2ml/min的流速进行Ni柱亲和层析，用干净的瓶子收集流穿液，命名为FT，并留样20μl。

8、清洗：待流穿液全部流完之后，使用lysis buffer(20mM PBS+500mM NaCl，pH7.4)冲洗柱子待基线平稳(约10CV)，流速不变。

9、洗脱：依次使用咪唑浓度分别为10mM，20mM，40mM，80mM，160mM，250mM，500mM和1M，收集洗脱液并留样20μl。

10、将上述步骤留样的样品，按照洗脱的先后顺序，分别向所有留样的EP管中加入5μl 5×loading buffer，按照洗脱的先后顺序进行SDS-PAGE(4％-20％梯度胶)，结果如图1所示(图1中箭头所指为目的蛋白)。

11、Q柱纯化：

Q柱准备：用Q柱高盐buffer冲洗10CV，然后用低盐buffer平衡10CV。

上样：将Ni柱纯化后的样品用Buffer A(20mM PBS，pH7.4)稀释至10ml，以1ml/min的流速Q柱层析，用干净的瓶子收集流穿液。

洗脱：以5％、10％、20％、30％、50％和100％的Buffer C(20mM PBS+1M NaCl，pH7.4)梯度洗脱，按峰分管收集洗脱液并留样20μl。

12、电泳：按洗脱顺序进行SDS-PAGE(4％-20％梯度胶)，结果如图2所示(图2中箭头所指为目的蛋白)。

13、浓缩，结果显示目的蛋白在5％Buffer C的洗脱峰中，纯度达标，浓缩测浓度。浓缩后抗原SDS-PAGE结果如图3所示。

实施例3：其它几种肺炎支原体抗原的制备

本实验室也制备了P1M抗原(P1抗原片段：residues 1341-1518)和P1C抗原(P1抗原片段：residues 1288-1518)。

本实验室还采用与实施例1和2相似的方法，制备了其它几种肺炎支原体融合抗原，包括P1M/P30C抗原、P1C/P30C抗原和P1C/P30A抗原。

1、P1M抗原制备：利用ProtScale等软件分析肺炎支原体(FH株)抗原P1的全部氨基酸序列，筛选出包含抗原性的蛋白序列P1M：residues 1341-1518，针对大肠杆菌密码子优化后，采用全基因合成法获得表达P1M抗原的重组质粒pET28a-P1M，转化大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)；诱导表达并纯化得到目的蛋白P1M。

2、P1C抗原制备：针对大肠杆菌密码子优化后，采用全基因合成法获得表达P1C抗原(P1抗原片段：residues 1288-1518)的重组质粒pET28a-P1C，转化大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)；诱导表达并纯化得到目的蛋白P1C。

3、P1M/P30C融合抗原制备：

3.1、设计PCR引物HP-P1M/P30C-P1M-for，序列为：

CATCACAGCAGCGGCTGGCTGGTTGGCCAG

和HP-P1M/P30C-P1M-rev，序列为：

CAGGATCAGGGTCGCCTGCAGGGTCTGCGGACCTTG

以本实验室保存的质粒pET28a-P1F为模板，用引物HP-P1M/P30C-P1M-for和HP-P1M/P30C-P1M-rev扩增得到P1M核酸片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化得到P1M核酸片段；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

3.2、设计PCR引物HP-P1M/P30C-P30C-for，序列为：

CAAGGTCCGCAGACCCTGCAGGCGACCCTGATCCTG

HP-P1M/P30C-P30C-rev，序列为：

GTCGACGGAGCTCGAATTCTTAACGCTTCGGCGGGAAG

以本实验室保存的质粒pET28a-P30C为模板，用引物HP-P1M/P30C-P30C-for和HP-P1M/P30C-P30C-rev扩增P30C核酸片段；PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，30s；72℃，20s；循环30次；

保温：72℃，4min。

上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化得到融合蛋白P1M/P30C的P1M核酸片段和P30C核酸片段；

3.3、以P1M核酸片段和P30C核酸片段同时作为模板和引物进行融合PCR；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，50s；72℃，45s；

循环20次；

保温：72℃，4min。

3.4、以上述融合PCR产物为模板，以引物HP-P1M/P30C-P1M-for、HP-P1M/P30C-P30C-rev扩增融合抗原全长基因P1M-P30C，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到融合蛋白的全长核酸产物P1M-P30C。PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，50s；72℃，45s；循环30次；

保温：72℃，4min。

3.5、采用无缝克隆技术，将上述融合基因产物P1M-P30A连接至载体pET28a上，37℃，反应3h后，取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布抗性LB平板，37℃倒置培养14-16h，无缝克隆反应条件：

3.6、取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，经菌液PCR验证和基因测序验证，挑选阳性转化子。

3.7、挑取阳性转化子接种至含有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基，37℃，250rpm培养14-16h，按照质粒提取试剂盒的操作说明书提取重组质粒pET28a-P1M/P30C；

3.8、融合抗原P1M/P30C的诱导表达和纯化方法与制备P1M/P30A抗原的方法相同，不再赘述。

4、P1C/P30C融合抗原制备：

4.1、设计PCR引物HP-P1C/P30C-P1C-for，序列为：

CATCACAGCAGCGGCCTGAAAACCACCACCCCG

和HP-P1C/P30C-P1C-rev，序列为：

CAGGATCAGGGTCGCCTGCAGCTGGTTAAACGGGCTG

以本实验室保存的质粒pET28a-P1F为模板，用引物HP-P1C/P30C-P1C-for和HP-P1C/P30C-P1C-rev扩增得到P1C核酸片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化得到P1C核酸片段；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

4.2、设计PCR引物HP-P1C/P30C-P30C-for，序列为：

CAGCCCGTTTAACCAGCTGCAGGCGACCCTGATCCTG

和HP-P1C/P30C-P30C-rev，序列为：

GTCGACGGAGCTCGAATTCTTAACGCTTCGGCGGGAAG

以本实验室保存的质粒pET28a-P30C为模板，用引物HP-P1C/P30C-P30C-for和HP-P1C/P30C-P30C-rev扩增P30C核酸片段；PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化得到融合蛋白P1C/P30C的P1C核酸片段和P30C核酸片段；

4.3、以P1C核酸片段和P30C核酸片段同时作为模板和引物进行融合PCR；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，50s；72℃，45s；循环20次；

保温：72℃，4min。

4.4、以上述融合PCR产物为模板，以引物HP-P1C/P30C-P1C-for、HP-P1M/P30C-P30C-rev扩增融合抗原全长基因P1C-P30C，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到融合蛋白的全长核酸产物P1C-P30C。PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

4.5、采用无缝克隆技术，将上述融合基因产物P1C-P30C连接至载体pET28a上，37℃，反应3h后，取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布抗性LB平板，37℃倒置培养14-16h，无缝克隆反应条件：

4.6、取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，经菌液PCR验证和基因测序验证，挑选阳性转化子。

4.7、挑取阳性转化子接种至含有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基，37℃，250rpm培养14-16h，按照质粒提取试剂盒的操作说明书提取重组质粒pET28a-P1C/P30C；

4.8、融合抗原P1C/P30C的诱导表达和纯化方法与制备P1M/P30A抗原的方法相同，不再赘述。

5、P1C/P30A融合抗原制备：

5.1、设计PCR引物HP-P1C/P30A-P1C-for，序列为：

CATCACAGCAGCGGCCTGAAAACCACCACCCCG

和HP-P1C/P30A-P1C-rev，序列为：

CGGAAAACCGGTACGCTGCAGCTGGTTAAACGGGCTG

以本实验室保存的质粒pET28a-P1F为模板，用引物HP-P1C/P30A-P1C-for和HP-P1C/P30A-rev扩增得到P1C核酸片段，PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

5.2、设计PCR引物HP-P1C/P30A-P30A-for，序列为：

CAGCCCGTTTAACCAGCTGCAGCGTACCGGTTTTCCG

HP-P1C/P30A-P30A-rev，序列为：

GTCGACGGAGCTCGAATTCTTAACGCGGCGCCATACCTG

以本实验室保存的质粒pET28a-P30C为模板，用引物HP-P1C/P30A-P30A-for和HP-P1C/P30A-P30A-rev扩增P30A核酸片段；PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收、纯化得到融合蛋白P1C/P30A的P1C核酸片段和P30A核酸片段；

5.3、以P1C核酸片段和P30A核酸片段同时作为模板和引物进行融合PCR；PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应条件为：

预变性：98℃，2min；

变形、退火、延伸：98℃，10s；60℃，30s；72℃，45s；循环20次；

保温：72℃，4min。

5.4、以上述融合PCR产物为模板，以引物HP-P1C/P30A-P1C-for、HP-P1C/P30A-P30A-rev扩增融合抗原全长基因P1C-P30A，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化得到融合蛋白的全长核酸产物P1C-P30A。PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

预变性：98℃，2min；

保温：72℃，4min。

5.5、采用无缝克隆技术，将上述融合基因产物P1C-P30A连接至载体pET28a上，37℃，反应3h后，取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布抗性LB平板，37℃倒置培养14-16h，无缝克隆反应条件：

5.6、取无缝克隆产物15μl转化大肠杆菌DH5α，涂布含有50μg/ml的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，经菌液PCR验证和基因测序验证，挑选阳性转化子。

5.7、挑取阳性转化子接种至含有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基，37℃，250rpm培养14-16h，按照质粒提取试剂盒的操作说明书提取重组质粒pET28a-P1C/P30A；

5.8、融合抗原P1C/P30A的诱导表达和纯化方法与制备P1M/P30A抗原的方法相同，不再赘述。

6、Mp全菌抗原为Meridian Life Science的商品化产品。

图4为本发明实施例1-2提供的融合抗原P1M/P30A以及本发明实施例3提供的六种不同肺炎支原体抗原的SDS-PAGE蛋白电泳图。

实施例4：七种不同肺炎支原体抗原特异性和灵敏度检测结果分析

基于抗原抗体特异性结合的原理，采用化学发光法检测肺炎支原体抗原与IgM抗体结合的反应性。分别测试本发明实施例1-2提供的融合抗原P1M/P30A以及其它六种肺炎支原体抗原(包括本发明实施例3提供的P1M抗原、P1M/P30C抗原、P1C抗原、P1C/P30C抗原、P1C/P30A抗原和Mp全菌抗原)的应用效果，对数据进行定性分析，并分别与对照样本(亚辉龙定值样本)的定性结果进行符合率分析。包括如下步骤：

1、包被磺化磁珠

1.1、所需试剂和仪器：

结合缓冲液：0.1M硼酸缓冲液pH 9.5

洗涤缓冲液：TBS-T(25mM Tris-HCl，pH 7.2，0.15M NaCl，0.05％吐温20)

催化剂溶液：3M硫酸铵/0.1M硼酸缓冲液，pH 9.5

封闭液：10％BSA/H₂O

磁珠储存液：25mM Tris-HCl(pH7.2)+0.5％BSA+1.0％明胶+0.9％Nacl+0.05％Proclin300

设备：磁力分离器，涡旋混合器，温控管旋转器

1.2、包被磁珠的操作流程

1)将磁珠Magnosphere TM MS160/Tosyl用涡旋混合器充分混悬，取1ml磁珠混悬液至2ml离心管中。

2)将离心管置于磁力分离器1min，然后小心吸去上清液。

3)加入900μl(＝Aμl)结合缓冲液，涡旋使磁珠重悬。

4)加入200μg(＝Bμl)抗体(200μl浓度为1mg/ml的抗体，涡旋使磁珠重悬。

5)加入550μl即(A+B)/2μl催化剂溶液，涡旋使磁珠重悬。

6)在37℃的温度下旋转磁珠18小时。

7)加入10μl封闭液，在37℃的温度下继续反应6h。

8)重复步骤2。

9)加入500μl洗涤缓冲液，涡旋使磁珠重悬。

10)重复步骤2，吸去上清液。

11)重复步骤9和10，共重复3次。

12)按比例加入抗原，每毫克磁珠包被30μg抗原，用磁珠储存液重悬磁珠(100mg/ml)，并保存在2-8℃，备用。

13)采用化学发光法检测肺炎支原体抗原的反应性，记录发光值，与对照样本(肺炎支原体IgM亚辉龙定值样本)的定性结果做符合率分析，统计分析实验数据。

14)数据统计分析结果

3.1 P1M/P30A抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析

阳性样本符合率为88％(95％CI：75.69％～95.47％)；

阴性样本符合率为96.08％(95％CI：86.54％～99.52％)；

总符合率为92.08％(95％CI：84.99％～96.52％)；

进行Kappa检验，K＝0.8414，95％可信区间为0.7363～0.9465，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果具有一致性，一致性较好。

3.2 P1M抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析：

阳性样本符合率为72.73％(95％CI：59.04％～83.86％)；

阴性样本符合率为86.96％(95％CI：73.74％～95.06％)；

总符合率为79.21％(95％CI：69.99％～86.64％)；

进行Kappa检验，K＝0.5874，95％可信区间为0.4328～0.7421，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果具有一定的一致性。

3.3 P1C抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析：

阳性样本符合率为76.00％(95％CI：61.83％～86.94％)；

阴性样本符合率为84.31％(95％CI：71.41％～92.98％)；

总符合率为80.20％(95％CI：71.09％～87.46％)；

进行Kappa检验，K＝0.6036，95％可信区间为0.4485～0.7587，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果有一定的一致性。

3.4 P1M/P30C抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析：

阳性样本符合率为70.00％(95％CI：55.39％～82.14％)；

阴性样本符合率为78.43％(95％CI：64.68％～88.71％)；

总符合率为74.26％(95％CI：64.60％～82.44％)；

进行Kappa检验，K＝0.4847，95％可信区间为0.3146～0.6548，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果有一定的一致性。

3.5 P1C/P30C抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析：

阳性样本符合率为74.00％(95％CI：59.65％～85.37％)；

阴性样本符合率为80.39％(95％CI：66.88％～90.18％)；

总符合率为77.23％(95％CI：67.82％～84.98％)；

进行Kappa检验，K＝0.5442，95％可信区间为0.3809～0.7076，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果有一定的一致性。

3.6 P1C/P30A抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析：

阳性样本符合率为76.92％(95％CI：63.16％～87.47％)；

阴性样本符合率为85.71％(95％CI：72.76％～94.06％)；

总符合率为81.19％(95％CI：72.19％～88.28％)；

进行Kappa检验，K＝0.6245，95％可信区间为0.4731～0.7759，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果有一定的一致性。

3.7 MP全菌抗原化学发光法测定结果与对照样本符合率分析

结果分析：

阳性样本符合率为86.00％(95％CI：73.26％～94.18％)；

阴性样本符合率为92.16％(95％CI：81.12％～97.82％)；

总符合率为89.11％(95％CI：81.35％～94.44％)；

进行Kappa检验，K＝0.7820，95％可信区间为0.6606～0.9034，P＜0.05。故拒绝H0，接受H1，认为两种测定方法检测结果有一致性，一致性较好。

综上以上数据分析，结果表明：与P1M抗原、P1M/P30C抗原、P1C抗原、P1C/P30C抗原和P1C/P30A抗原的应用性能相比，本发明提供的P1M/P30A融合抗原具有更高的特异性和灵敏度；MP全菌抗原检测结果与对照样本总符合率为89.11％，P1M/P30A融合抗原检测结果与对照样本总符合率为92.08％，P1M/P30A融合抗原的制备工艺与MP全菌抗原相比，更易于培养纯化，更有利于工业化生产，成本更低，适用于MP抗体检测产品的制备，可被加工成为体外免疫诊断领域的任何形式的产品，具备广阔的市场前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

序列表

<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司

<120> 肺炎支原体融合抗原及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 178

<212> PRT

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 1

Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser

1 5 10 15

Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly

20 25 30

Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp Asp Val

35 40 45

Asp Gly Ile Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly Glu Gly

50 55 60

Gln Thr Ala Asp Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys Ser Pro Asp

65 70 75 80

Gln Ile Asp Phe Asn Arg Leu Phe Thr His Pro Val Thr Asp Leu Phe

85 90 95

Asp Pro Val Thr Met Leu Val Tyr Asp Gln Tyr Ile Pro Leu Phe Ile

100 105 110

Asp Ile Pro Ala Ser Val Asn Pro Lys Met Val Arg Leu Lys Val Leu

115 120 125

Ser Phe Asp Thr Asn Glu Gln Ser Leu Gly Leu Arg Leu Glu Phe Phe

130 135 140

Lys Pro Asp Gln Asp Thr Gln Pro Asn Asn Asn Val Gln Val Asn Pro

145 150 155 160

Asn Asn Gly Asp Phe Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ser Ser Gln Gly Pro

165 170 175

Gln Thr

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 2

Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser

1 5 10 15

Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly

20 25 30

Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp Asp Val

35 40 45

Asp Gly Ile Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly Glu Gly

50 55 60

Gln Thr Ala Asp Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys Ser Pro Asp

65 70 75 80

Gln Ile Asp Phe Asn Arg Leu Phe Thr His Pro Val Thr Asp Leu Phe

85 90 95

Asp Pro Val Thr Met Leu Val Tyr Asp Gln Tyr Ile Pro Leu Phe Ile

100 105 110

Asp Ile Pro Ala Ser Val Asn Pro Lys Met Val Arg Leu Lys Val Leu

115 120 125

Ser Phe Asp Thr Asn Glu Gln Ser Leu Gly Leu Arg Leu Glu Phe Phe

130 135 140

Lys Pro Asp Gln Asp Thr Gln Pro Asn Asn Asn Val Gln Val Asn Pro

145 150 155 160

Asn Asn Gly Asp Phe Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ser Ser Gln Gly Pro

165 170 175

Gln Thr Leu Gln Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro

180 185 190

Arg

<210> 4

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggctggttg gccagctgcc gagcaccagc gatggtaaca ccagcagcac caacaacctg 60

gcgccgaaca ccaacaccgg caacgacgtg gttggtgtgg gccgtctgag cgaaagcaac 120

gcggcgaaaa tgaacgatga cgtggacggt atcgttcgta ccccgctggc ggagctgctg 180

gatggcgagg gtcagaccgc ggacaccggt ccgcagagcg tgaagtttaa aagcccggat 240

caaatcgact tcaaccgtct gtttacccac ccggttaccg acctgttcga cccggtgacc 300

atgctggttt acgatcagta tattccgctg tttatcgaca ttccggcgag cgttaacccg 360

aagatggtgc gtctgaaagt tctgagcttc gataccaacg agcaaagcct gggtctgcgt 420

ctggagttct tcaaaccgga tcaagacacc cagccgaaca acaacgtgca ggttaacccg 480

aacaacggtg actttctgcc gctgctgacc gcgagcagcc aaggtccgca gacc 534

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtaccggtt ttccgccgca gccgggtatg gcgccgcgt 39

<210> 6

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggctggttg gccagctgcc gagcaccagc gatggtaaca ccagcagcac caacaacctg 60

gcgccgaaca ccaacaccgg caacgacgtg gttggtgtgg gccgtctgag cgaaagcaac 120

gcggcgaaaa tgaacgatga cgtggacggt atcgttcgta ccccgctggc ggagctgctg 180

gatggcgagg gtcagaccgc ggacaccggt ccgcagagcg tgaagtttaa aagcccggat 240

caaatcgact tcaaccgtct gtttacccac ccggttaccg acctgttcga cccggtgacc 300

atgctggttt acgatcagta tattccgctg tttatcgaca ttccggcgag cgttaacccg 360

aagatggtgc gtctgaaagt tctgagcttc gataccaacg agcaaagcct gggtctgcgt 420

ctggagttct tcaaaccgga tcaagacacc cagccgaaca acaacgtgca ggttaacccg 480

aacaacggtg actttctgcc gctgctgacc gcgagcagcc aaggtccgca gaccctgcag 540

cgtaccggtt ttccgccgca gccgggtatg gcgccgcgtt aa 582

Claims

1.一种肺炎支原体融合抗原，其特征在于，所述肺炎支原体融合抗原为包含P1M抗原片段与P30A抗原片段的融合蛋白；

2.如权利要求1所述的肺炎支原体融合抗原，其特征在于，所述P1M抗原片段位于所述融合蛋白的N端，所述P30A抗原片段位于所述融合蛋白的C端。

3.如权利要求1所述的肺炎支原体融合抗原，其特征在于，所述P1M抗原片段与所述P30A抗原片段通过短肽连接。

4.如权利要求1所述的肺炎支原体融合抗原，其特征在于，所述肺炎支原体融合抗原具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或者将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的肺炎支原体融合抗原的制备方法，其特征在于，包括：构建包含编码所述肺炎支原体融合抗原的DNA序列的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中进行表达。

6.权利要求1-4中任一项所述的肺炎支原体融合抗原在制备肺炎支原体抗体检测产品中的应用。

7.一种肺炎支原体抗体检测产品，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项所述的肺炎支原体融合抗原。

8.一种编码如权利要求1-4中任一项所述的肺炎支原体融合抗原的核酸分子。

9.如权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码所述P1M抗原片段的DNA序列与编码所述P30A抗原片段的DNA序列；

所述编码所述P1M抗原片段的DNA序列为如SEQ ID NO.4所示的DNA序列或者与SEQ IDNO.4所示的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

所述编码所述P30A抗原片段的DNA序列为如SEQ ID NO.5所示的DNA序列或者与SEQ IDNO.5所示的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

10.与权利要求8-9中任一项所述的核酸分子相关的生物材料，该生物材料为如下任一种：

(a)表达盒，含有权利要求8-9中任一项所述的核酸分子；

(b)重组载体，含有权利要求8-9中任一项所述的核酸分子或(a)中表达盒；

(c)重组细胞，含有权利要求8-9中任一项所述的核酸分子、(a)中表达盒或(b)中重组载体。