CN103275196A - 一种肺炎支原体重组抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种肺炎支原体重组抗原及其制备方法和应用。本发明所述肺炎支原体重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明运用一段氨基酸作为连接短肽，将MP特异性抗原P1蛋白抗原优势表位及P30抗原优势表位组成一个重组蛋白。该重组蛋白经试验验证，特异性、灵敏度均高于现有的MP抗原，可作为制备MP抗体检测产品的应用。

Description

一种肺炎支原体重组抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肺炎支原体重组抗原及其制备方法和应用。

背景技术

支原体肺炎是由肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）导致的急性呼吸道感染性肺炎，可引起流行，约占各类肺炎的10%，严重时可导致死亡。因此，研究一种有效的MP的诊断试剂盒尤为重要。

目前，MP的诊断方法有免疫荧光试验、间接血凝ELISA检测、补体结合试验、肺炎支原体的培养、聚合酶链式反应等，但是这些现有检测方法普遍需要到特定的场合利用特定的仪器来检测，不仅不够方便快捷而且时间较长，不利于根据相应的诊断结果对患者采取果断的保护和防范措施。

鉴于此，现有的检测产品中推出了一种免疫层析试纸的快捷检测产品，其以免疫胶体金技术为核心，能够快速的检测MP。现有的免疫层析试纸中所采用的MP抗原一般为MP黏附蛋白P1。编码P1蛋白的基因是当前MP的研究热点，基因全长为5146bp，编码1635个氨基酸。由于TGA密码子的原因，在大肠杆菌表达系统将P1基因分成了15个片段，其分别命名为RP1-RP15，现在所谓的P1蛋白多指的是RP14蛋白。但是，P1蛋白作为检测抗体的抗原灵敏度较差，尤其是用于检测早期由MP产生的IgM，由于IgM在人血清中含量较低，以P1蛋白为抗原进行检测极易出现假阴性的误判，而使患者错失治疗的黄金时期。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种肺炎支原体重组抗原及其制备方法和应用，使得所述肺炎支原体重组抗原灵敏度得到提高。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种肺炎支原体（MP）重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

不同于其他病原体，MP采用独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子UGA在MP中编码色氨酸，如果直接采用MP的野生基因能造成蛋白翻译的中断，限制了重组抗原的研制。

因此，本发明选择P1蛋白基因中具有优势抗原表位的部分基因以及P30蛋白基因中具有优势抗原表位的部分基因，通过特殊的连接肽基因序列组成一个编码MP重组抗原的基因序列，同时经过大肠杆菌的密码子优化，获得由大肠杆菌优势密码子组成的全新MP重组抗原基因，如SEQ ID NO:2所示，其能够高表达本发明所述MP重组抗原。

本发明所述MP重组抗原蛋白经Elisa试验验证，灵敏度高于现有的MP抗原，在将两者应用于免疫层析试纸中时，经Elisa试验验证为阳性结果且血清滴度较低的样本，现有MP抗原检测结果为阴性，而本发明仍然检测为阳性，更加验证了本发明所述MP重组抗原的特异性和灵敏度较高。

因此，本发明还提供所述肺炎支原体重组抗原在制备检测支原体肺炎产品中的应用。这些检测产品可以是本领域任何形式的产品、如试剂盒、试纸条等，除了本发明提供的关键的MP重组抗原，其他附加的检测试剂均为本领域常规选择，本领域技术人员能够轻易完成并实现。

此外，本发明还提供一种肺炎支原体重组抗原的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、以SEQ ID NO:2所示核苷酸序列为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

步骤2、将扩增产物BamHI及EcoRI双酶切连接至同样BamHI及EcoRI双酶切的pET-30a质粒中，得重组质粒；

步骤3、重组质粒转化至大肠杆菌中诱导表达、纯化、透析、浓缩即得SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肺炎支原体重组抗原。

其中，作为优选，步骤1所述PCR的扩增体系如下：

优选地，步骤1所述PCR的扩增条件如下：

预变性，94℃，5min；

变性、退火、延伸共30个循环，94℃，60s；58℃，60s；72℃，60s；

保温，72℃，6min。

优选地，步骤2所述扩增产物BamHI及EcoRI双酶切体系如下：

优选地，步骤2所述pET-30a质粒BamHI及EcoRI双酶切体系如下：

优选地，步骤2所述连接的体系如下：

作为优选，本发明步骤3具体为：

步骤3.1、将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21中，0.4mM-1.0mM的IPTG于37℃诱导2-4h；

步骤3.2、离心收集大肠杆菌BL-21菌体，用20mM-50mM、pH8.0的tris悬浮菌体，超声破碎，离心收集上清；

步骤3.3、Ni柱纯化上清，先用含有20mM咪唑的binding buffer溶液洗涤柱子，再用含有binding buffer溶液梯度洗脱MP重组抗原蛋白，所述binding buffer溶液为pH8.0、由20mM-50mM的tris和200-500mM的NaCl组成的溶液；

步骤3.4、将纯化后的MP重组抗原蛋白装入透析袋中，pH7.4-7.5的磷酸缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇20000浓缩MP重组抗原蛋白，所述pH7.4-7.5的磷酸缓冲液由19ml 0.2mol/L的NaH₂PO₄和81ml0.2mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O组成。

在步骤3.4中，所述pH7.4-7.5的磷酸缓冲液pH偏高或偏低，可通过改变NaH₂PO₄和Na2HPO₄·12H₂O的比例来加以调整。

除本发明提供的优选方案外，本领域技术人员可根据实际情况采用本领域其他相适应的PCR扩增方法、双酶切方法来完成所述MP重组抗原的制备，本发明所提供的优选方案与其他方案相比能够带来扩增效率、连接效率、转化效率、表达效率等方面的提高。

由以上技术方案可知，本发明运用一段氨基酸作为连接短肽，将MP特异性抗原P1蛋白抗原优势表位及P30抗原优势表位组成一个重组蛋白。该重组蛋白经试验验证，特异性、灵敏度均高于现有的MP抗原，可作为制备MP抗体检测产品的应用。

附图说明

图1所示为验证重组质粒中目的基因的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，1泳道为阴性对照、2、3、4、5泳道为阳性；

图2所示为验证诱导表达的重组抗原的聚丙酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式：

本发明公开了一种肺炎支原体重组抗原及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的基因序列、MP重组抗原已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明目的基因的扩增以及重组载体的构建

1、扩增目的条带

全基因合成SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，作为扩增模板。

设计引物PCR扩增，引物序列如下：

lan-MP-501：5′-GGATCCGATGACGACGATAAAG-3′（SEQ IDNO:3）

lan-MP-304：5′-GAATTCCTAGCGTTTCGGCGGAAAACCTG-3’（SEQ ID NO:4）

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

预变性，94℃，5min；

变性、退火、延伸共30个循环，94℃，60s；58℃，60s；72℃，60s；

保温，72℃，6min。

2、重组载体构建

将扩增的目的条带构建到pET-30a（购自于Novagen）原核表达载体中，运用限制性内切酶BamHI（购自于NEB）及EcoRI（购自于NEB）将目的基因插入到原核表达载体pET-30a中。

以pET-30a为载体，其BamHI及EcoRI双酶切反应体系（50μL，37℃酶切2h）如下：

扩增的目的条带的BamHI及EcoRI双酶切反应体系（50μL，37℃酶切2h）如下：

酶切后将酶切产物回收，连接体系（10μL）如下：

16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM110，在含有卡那霉素（100μg/mL）、IPTG和X-gal的LB选择平板上，经过蓝白斑筛选和酶切分析得重组质粒30a-P嵌2；以构建好的质粒为模板，用扩增基因片段引物验证了目的基因成功插入到目的载体中，验证结果见图1。

实施例2：本发明所述MP重组抗原的诱导表达、纯化、透析和浓缩

将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21中，0.4mM-1.0mM的IPTG于37℃诱导2-4h；

离心收集大肠杆菌BL-21菌体，用20mM-50mM、pH8.0的tris悬浮菌体，超声破碎，离心收集上清；

Ni柱纯化上清，先用含有20mM咪唑的binding buffer溶液洗涤柱子，再用binding buffer溶液梯度洗脱MP重组抗原蛋白，所述bindingbuffer溶液为pH8.0由20mM-50mM的tris和200-500mM的NaCl组成的溶液；将纯化后的蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果见图2，加上载体本身标签，约为50KD左右，与图中条带位置一致；

将纯化后的MP重组抗原蛋白装入透析袋中，pH7.4-7.5的磷酸缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇20000浓缩MP重组抗原蛋白，所述pH7.4-7.5的磷酸缓冲液由19ml0.2mol/L的NaH₂PO₄和81ml0.2mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O组成。

实施例3：本发明所述MP重组抗原和现有MP抗原（RP14蛋白）的Elisa鉴定

包被：用PBS（pH7.4）缓冲液将抗原稀释至蛋白质含量为10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗5次，每次2分钟（简称洗涤，下同）；

封闭：采用5%的牛血清白蛋白为封闭剂，每孔中加0.1mL，37℃温育2小时，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗5次；

加样：加稀释的阳性血清、阴性血清（1:100-1:400）0.1mL于上述已包被之反应孔中，置室温孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗5次；

加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（羊抗人HRP1:2000）0.1mL。室温孵育1小时，洗涤5次；

加底物液显色：TMB100uL，显色时间可视实际情况而定；

终止反应：加入2M硫酸0.05mL；

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”、“－”号表示；

测定OD值判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，空白对照应小于0.1，阳性的数值－阴性数值大于0.1，同时大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

判定结果见表1。

表1 Elisa试验OD值测定结果

由表1的数据可知，相同阳性血清样本，用本发明所述MP重组抗原检测的OD值明显高于采用现有的RP14蛋白检测的OD值，表明本发明的MP重组抗原的灵敏度更高。

在血清滴度较低的1：320时，RP14蛋白的OD值均较低，而本发明重组抗原OD值显著高于RP14蛋白，这种RP14蛋白用于免疫层析法（如胶体金法）时，对这样的血清很容易判定为假阴性，给予了错误的判断，而本发明灵敏度较高就不会容易出现错判。MP抗体检测，早期的IgM检测意义重大，IgM的在人体血清中含量相对较低，因此，现有的MP抗原已经无法保证诊断的准确性。

从特异性上看，所做的重组抗原阴性样本、阳性样本均能被本发明MP重组抗原筛查出来，特异性较好。

实施例4：免疫层析试纸检测

用本发明所述MP重组抗原制成免疫层析试纸，同时用RP14蛋白制成对照免疫层析试纸，分别采用表1中标号为5号、14号和15号的阳性血清样本同时检测，检测结果显示，对照免疫层析试纸检测结果均为阴性，本发明检测结果均为正确的阳性，可见在抗体含量较低的情况下，采用现有的MP抗原极易出现误判的问题。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肺炎支原体重组抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肺炎支原体重组抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述肺炎支原体重组抗原在制备检测支原体肺炎产品中的应用。

4.一种肺炎支原体重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、以SEQ ID NO:2所示核苷酸序列为模板，以SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示核苷酸序列为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

步骤2、将扩增产物BamHI及EcoRI双酶切连接至同样BamHI及EcoRI双酶切的pET-30a质粒中，得重组质粒；

步骤3、重组质粒转化至大肠杆菌中诱导表达、纯化、透析、浓缩即得SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肺炎支原体重组抗原。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤1所述PCR的扩增体系为：

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤1所述PCR的扩增条件为：

预变性，94℃，5min；

变性、退火、延伸共30个循环，94℃，60s；58℃，60s；72℃，60s；

保温，72℃，6min。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤2所述扩增产物BamHI及EcoRI双酶切体系为：

8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤2所述pET-30a质粒BamHI及EcoRI双酶切体系为：

9.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤2所述连接的体系为：

10.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤3为：

步骤3.1、将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21中，0.4mM-1.0mM的IPTG于37℃诱导2-4h；

步骤3.2、离心收集大肠杆菌BL-21菌体，用20mM-50mM、pH8.0的tris悬浮菌体，超声破碎，离心收集上清；

步骤3.3、Ni柱纯化上清，用含有20mM咪唑的binding buffer溶液洗涤柱子，再用binding buffer溶液梯度洗脱MP重组抗原蛋白，所述binding buffer溶液为pH8.0、由20mM-50mM的tris和200mM-500mM的NaCl组成的溶液；

步骤3.4、将纯化后的MP重组抗原蛋白装入透析袋中，pH7.4-7.5的磷酸缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇20000浓缩MP重组抗原蛋白，所述pH7.4-7.5的磷酸缓冲液由19ml 0.2mol/L的NaH₂PO₄和81ml 0.2mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O组成。

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