CN102286437B - 一种检测空肠弯曲菌抗体的特异抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测空肠弯曲菌的特异抗原，为空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶AhpC(Alkyl Hydroperoxide Reductase，AhpC)重组蛋白抗原，该抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的特异抗原可用于定量、定性检测血清中空肠弯曲菌特异抗体的各种检测试剂及试剂盒的制备。本发明还提供了以该抗原作包被原的ELISA检测试剂盒，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，可用于临床检测血清中空肠弯曲菌的抗体。

Description

一种检测空肠弯曲菌抗体的特异抗原及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种检测空肠弯曲菌抗体的特异诊断蛋白抗原，具体地，是空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶(AlkylHydroperoxide Reductase，AhpC)蛋白抗原及其应用。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原之一。空肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症(Guillain-BarreSyndrome，GBS)，给人类带来严重的疾病负担。空肠弯曲菌感染后导致GBS的机理是由于病原与外周神经细胞上的神经节苷脂有共同的抗原成分，感染后产生特异抗体的错误识别造成神经的损伤。空肠弯曲菌感染后血清特异抗体的检测是确定空肠弯曲菌的前期感染以及进行GBS的病因分析的主要手段。目前由于这种特异检测抗原的缺乏，造成空肠弯曲菌感染后抗体检测试剂以及检测方法的缺乏。

研究发现空肠弯曲菌不同菌型菌株感染产生的抗体的种类及其类神经节苷脂靶点的种类不同，从而导致神经病变的损伤不同。我国导致GBS的空肠弯曲菌菌株的菌型主要为HS：41和HS：19，腹泻患者感染菌株的血清型主要为HS：37，HS：6，7等。迄今，国际上只有一种的检测空肠弯曲菌抗体商业ELISA试剂盒，其为德国生产，但该试剂盒对于我国菌株感染的检测灵敏度较低。目前还没有针对我国菌株感染特异抗体检测的相关特异性诊断抗原。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种空肠弯曲菌AhpC蛋白抗原；

本发明的第二个目的在于提供编码上述AhpC蛋白的基因；

本发明的第三个目的在于提供上述AhpC蛋白的用途，以弥补目前针对我国空肠弯曲菌感染特异抗体检测没有相关特异性抗原的空白。

为实现上述目的，本发明首先对空肠弯曲菌菌株NCTC11168的ahpC基因DNA序列进行自主测序，用BLASTn与Vector NTI Suite 6.0软件对NCBI公布的测序菌种ahpC基因的DNA序列进行比对，结果发现，不同菌株的ahpC基因皆为597bp，菌株间DNA序列没有明显的缺失及插入，不同菌株共有12个碱基存在差异，一致性为98％，证明ahpC基因在空肠弯曲菌菌种内具有高度的保守性。其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的AhpC的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第30位的天冬酰胺N替换为甘氨酸G，或是将第35位的甘氨酸G缺失，或是在第54位增加丙氨酸A，均不影响其生物活性。因此，本发明AhpC还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与AhpC同等活性的由AhpC衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码上述蛋白的核苷酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明ahpC基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码AhpC的核苷酸序列。

ahpC基因的DNA序列经NCBI的Blast数据库的比对，发现仅与幽门螺杆菌有部分交叉。本发明将6株幽门螺杆菌的基因ahpC的碱基序列，其中有4株菌有542个碱基，2株菌有597个碱基，进行6株已知序列的幽门螺杆菌ahpC基因与空肠弯曲菌ahpC基因序列进行比对，一致性仅为62％，而与大肠杆菌O157，弗氏埃希氏杆菌，肠炎菌株，弗氏志贺菌，鲍氏志贺(氏)菌等其它肠道细菌相比，DNA一致性为45.1％。说明ahpC基因的DNA序列与其它病原相比具有特异性。

本发明提供了一种重组表达载体，含有以空肠弯曲菌AhpC蛋白编码基因为目的基因的表达盒。

本发明的重组表达载体为PGEX-ahpC。

本发明的空肠弯曲菌AhpC蛋白具有弯曲菌相关毒力因子的特征，且具有良好的抗原性，特异性，可用于检测空肠弯曲菌特异抗体。

针对AhpC蛋白的上述特点，本发明还提供了一种空肠弯曲菌抗体的检测方法。

本发明所述的空肠弯曲菌抗体的检测方法，是以AhpC重组蛋白为抗原，以间接ELISA方法检待测样本中的空肠弯曲菌特异抗体。

为了使上述方法操作更简便，本发明还提供了一种空肠弯曲菌抗体检测酶联免疫吸附试剂盒。

本发明的空肠弯曲菌抗体酶联免疫吸附试剂盒，以上述的AhpC重组蛋白为包被抗原。

该试剂盒还含有酶结合物工作液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液。酶结合物工作液可以用辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌A蛋白，简称SPA，阳性对照可以用兔免疫C.jejuni标准阳性血清，阴性对照可以用兔标准阴性血清。

本发明的AhpC蛋白为非全菌抗原，与空肠弯曲菌免疫血清、空肠弯曲菌标准阳性血清反应，不与幽门螺杆菌、大肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、霍乱弧菌等肠道细菌的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，特异性强。以AhpC蛋白为抗原，以ELISA方法可以检测空肠弯曲菌抗体，该方法操作简便，检测快速，成本低，可用于我国空肠弯曲菌感染特异抗体的检测。

附图说明

图1.为PCR扩增ahpC基因结果的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1：DNA marker，泳道2，3，4：ahpC的PCR扩增产物，大小597bp。

图2.为重组质粒PGEX-ahpC的双酶切鉴定结果图，其中1DNAmarker；2重组质粒PGEX-ahpC双酶切结果；3重组质粒PGEX-ahpC。

图3.为SDS-PAGE电泳图，其中1.蛋白marker；2.宿主菌BL21的诱导；3.转化体PGEX-BL21诱导后；4.转化体BL21-AhpC未诱导；5.转化体BL21-AhpC沉淀；6.转化体BL21-AhpC上清；7.AhpC纯化蛋白。

图4.为AhpC蛋白免疫印迹分析图，其中泳道1.蛋白maker；2.菌株ICDCCJ07001全菌蛋白；3.GBS散发株免疫前的兔血清；4.GBS散发菌株免疫兔血清；5.GBS爆发株ICDCCJ07001免疫前兔血清；6.GBS爆发株ICDCCJ07001免疫后兔血清；7.NCTC11168免疫前兔血清；8.NCTC11168免疫后兔血清；9.结核杆菌免疫兔血清；10.蛋白maker；11.空表达载体PGEX-4T-1散发株免疫后的兔血清。

图5.为AhpC抗原对空肠弯曲菌免疫前和免疫后血清抗体检测结果图，其中纵坐标为检测结果的OD值，横坐标为1-11份稀释了的血清，其稀释度分别从1∶100至1∶102400。

图6.为AhpC抗原对空肠弯曲菌和其他病原免疫血清抗体的ELISA检测结果图，纵坐标为ELISA检测空肠弯曲菌及其它病原免疫血清的OD值，横坐标为1-11份稀释了的血清(从1～11，稀释度分别为1∶100至1∶102400)，几种免疫血清分别为空肠弯曲菌免疫前血清，空肠弯曲菌免疫后血清，幽门螺杆菌免疫血清，小肠耶尔森氏菌08免疫血清，小肠耶尔森氏菌09免疫血清，大肠O：157免疫血清和霍乱弧菌免疫血清。

图7.为AhpC抗原包被ELISA试剂盒对患者血清的检测结果图，其中36份阳性血清，51份阴性血清。

图8.为三种试剂盒检测空肠弯曲菌的结果图，三种试剂盒分别为AhpC抗原包被ELISA，空肠弯曲菌全菌蛋白抗原包被ELISA和商品化试剂盒virion\serion。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 空肠弯曲菌AhpC蛋白的制备

1、AhpC编码基因的克隆

1.1材料

空肠弯曲菌菌株NCTC11168来自美国国家典型菌种保藏中心(ATCC)，购自北京中原公司；质粒PGEX-4T-1购自GE Healthcare公司；La Taq酶，限制性内切酶BamH I和Xho I，T4DNA连接酶，Pmd18-TVector，protein marker，均购自大连TaKaRa公司；大肠杆菌E.coliDH5a，菌株E.coli BL21(DE3)，Taq DNA聚合酶，dNTP，DNA marker，细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA电泳琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；GST标签的快速亲和层析柱购自GE Healthcare公司；辣根过氧化物酶标记SPA(北京博奥森生物技术公司)；兔免疫血清(本研究制备)；其他试剂均为国产分析纯。引物合成由上海生工生物技术有限公司北京合成部完成，DNA测序由天一辉远公司完成，飞行质谱鉴定由本实验室ABI4700MALDI-TOF-TOF完成。

1.2PCR扩增和产物回收

(1)PCR25μL扩增体系：10×PCR buffer 2.5μl；dNTP 2μl；LA taq酶0.5μl；模板DNA 1μl；上下游引物各0.5μl，ahpC上游引物：5′-BamHI-CGCGGATCCATGATAGTTACTAAAAAAGCTTTAGATTT-3′；下游引物：5′-XhoI-CCGCTCGAGTTAAAGTTTAGCTTCGTTTTTGC-3′；ddH₂O 18μl。PCR循环条件：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃90s，35个循环；72℃5min；PCR产物于4℃保存。

(2)PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果，见图1。PCR扩增产物大小597bp，与预期的ahpC基因大小一致。用普通琼脂糖凝胶试剂盒回收PCR扩增产物。

1.3目的基因连接T载体

10μl连接体系：PMD18-T载体1μl，PCR产物3μl，连接液5μl，双蒸水1μl，于16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a。取5μl连接产物转化到50μl的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀后放置于冰上30min。42℃热激90s，立刻放于冰上90s。加入500μl的LB培养基，混匀，37℃，220rpm摇菌45～60min，取出200μl菌液均匀涂在含有抗性的平板上，37℃培养过夜。取出过夜培养平板，随机挑取几个单克隆；在新的抗性平板上轻轻划一下以便保存，其余加到PCR体系中；反应条件同1.2项。结果显示扩增出预期的目的条带。(4)测序：将阳性克隆子24h摇菌1ml，送天一辉远公司测序，测序结果说明成功克隆出ahpC基因。

2、空肠弯曲菌AhpC蛋白的表达

以上述提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，回收目的片段，与克隆载体连接。以含有第一次PCR扩增片段的重组载体为模板，用含有BamHI和XhoI酶切位点引物进行PCR扩增，PCR产物经BamHI和XhoI酶切，与同样酶切的PGEX-4T-1表达载体进行连接获得重组表达载体PGEX-ahpC。该重组表达载体PGEX-ahpC的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1长597bp，编码序列表中SEQ IDNo.2所示的蛋白。重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下表达蛋白AhpC。

分别取AhpC蛋白表达菌液的上清、沉淀各5μl进行SDS-PAGE实验(12％的分离胶，5％的浓缩胶)，80V电泳半小时，待蛋白进入分离胶，调整电压120V电泳2小时。用考马斯亮蓝R250染色1-2h后，脱色观察，见图3。

结果表明，在诱导温度为37℃，诱导剂IPTG终浓度为0.5mmol/L时，AhpC蛋白大量表达，并在诱导4小时时表达量最大，AhpC重组蛋白大小为48kD(含载体PGEX-4T-1蛋白分子量26KD)，与理论值相当。

实施例2 空肠弯曲菌AhpC蛋白的质谱鉴定、纯化和Western-Blot分析

1、空肠弯曲菌AhpC蛋白的质谱鉴定

用25mM NH₄HCO₃(pH 8.0)每孔加入100μl，室温下置于摇床上300rpm，洗胶20min；吸去上清，加入50μl含30％乙腈的0.1MNH₄HCO₃置于摇床上100rpm，摇动脱色，中间换液一次，至看不到颜色为止。去液后，加入100μl 25mM NH₄HCO₃摇动(100rpm)20min，洗胶。-80℃预冻约1小时。取出，放于真空干燥机内低温冻干约1小时。每管加入20μl/ml的Trypsin(胰酶)8μl于干燥的胶上，胶块立即吸液涨大，等完全涨大后，置于4℃冰箱30min，加入10μl25mM NH₄HCO₃，然后用封口膜封紧，37℃16h。离心后将反应液吸出，加到PCR反应管中，然后加入50％乙腈(CAN)/5％三氟乙酸(TFA)40μl到胶上，轻微震荡萃取时间60min(40rpm)，把萃取液吸出加到前面的PCR管中，共萃取两次。萃取液和反应液预冻抽干。

AhpC蛋白质谱鉴定结果为所表达蛋白条带为空肠弯曲菌的烷基过氧化氢还原酶(AhpC)蛋白，其分子量约为22KD，其鉴定结果的可信度为100％。

2、AhpC蛋白的纯化

将含有阳性克隆子的细菌培养液收集到500ml离心管中，7000rpm，离心40分钟。细菌转入50毫升离心管，10000rpm，15分钟，PBS(pH7.4)洗3遍。将菌体悬于60毫升PBS，冰浴中进行超声破碎，60W，20分钟，超声5秒，停顿10秒。10000rpm离心20分钟，上清用0.45μm滤膜过滤。

利用AKTA(PURIFIER100)蛋白纯化仪进行纯化。A、B泵用超纯水泵洗。A、B泵分别用20mM PBS(pH7.3)和50mM的L-谷胱甘肽(pH 8.0)进行泵洗。设定纯化程序，用两步法5毫升的GSTrap亲和纯化柱进行纯化，即先用8％L-谷胱甘肽去除非特异蛋白，100％L-谷胱甘肽完全洗脱。

SDS-PAGE电泳检查蛋白纯化结果良好，纯化后AhpC蛋白的浓度为0.185μg/μl。

3、AhpC蛋白抗原性的免疫印迹(Western-Blot)分析

纯化后的AhpC蛋白作为抗原，一抗用3组6种血清(上述中国感染菌株代表免疫血清)，分别为：格林-巴利综合症散发相关空肠弯曲菌菌株免疫血清；格林-巴利综合症爆发相关空肠弯曲菌菌株免疫血清；NCTC11168免疫血清，一抗的浓度1∶50；二抗用HRP-SPA，浓度1∶10000。纯化后的Ahpc蛋白的浓度为0.185μl/μl，上样量1.2μl，空表达载体的蛋白分子量大小26KD。结果表明：AhpC蛋白只与空肠弯曲菌免疫血清发生反应，而与空表达载体以及其它免疫血清没有反应，见图4，说明AhpC蛋白具有免疫原性。

实施例3 空肠弯曲菌抗体间接ELISA诊断试剂盒的制备

空肠弯曲菌抗体ELISA诊断试剂盒包含抗体检测板、酶结合工作物、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、10×浓缩洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。

抗体检测板的制备：用pH7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液作为包被稀释液，将实施例1制备的蛋白AhpC稀释为10μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，使每孔所含的蛋白为1μg，用封口膜封闭后37℃孵育2h，再4℃包被过夜；pH7.4的磷酸盐缓冲液为KCl(26.7mM)，KH₂PO₄(14.7mM)，Na₂HPO₄(80.9mM)，NaCl(1.37M)溶液；甩干，按300μL/孔1％脱脂奶粉封闭(PBS配制)，4℃温箱中过夜，洗涤，甩干；PBS为KCl(26.7mM)，KH₂PO₄(14.7mM)，Na₂HPO₄(80.9mM)，NaCl(1.37M)的混合液，pH7.2～7.5；再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，将酶标板真空无菌、干燥包装。

酶结合物工作液的制备：辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG。以含0.1％(质量百分含量，下同)小牛血清白蛋白(BSA)，0.05％吐温-20，0.01％硫柳汞钠，pH7.4的磷酸盐缓冲液按1∶200～5000稀释冻存的辣根过氧化物酶标记的抗体作为酶结合物工作液。

样品稀释液、洗涤液、终止液的配制：样品稀释液为含0.05％酪蛋白(casein)的磷酸盐缓冲液(1.99g KCl(26.7mM)，2.00g KH₂PO₄(14.7mM)，11.48g Na₂HPO₄(80.9mM)，80.06g NaCl(1.37M)定容至1000mL pH7.4)；10×浓缩洗涤液为含0.05％吐温-20的0.1M的磷酸盐缓冲液(1.99g KCl(26.7mM)，2.00g KH₂PO₄(14.7mM)，11.48gNa₂HPO₄(80.9mM)，80.06g NaCl(1.37M)定容至1000mL，再加5mLTween-20，pH7.4)；显色液A为0.1mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.05％过氧化氢的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液，即取22.2mL浓硫酸缓慢加入177.8mL去离子水中制备获得。

显色液的制备：称取100mg四甲基联苯胺(TMB)，用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，定容至1000mL，配制显色液A；称取35.8gNa₂HPO₄·12H₂O，21g一水柠檬酸，6.4mL 0.75％的过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调pH值到4.5～5.0，配制显色液B。

阴、阳性对照的制备：阴性血清为未感染C.jejuni的健康新西兰大白兔血清；阳性血清为用4×10⁹个C.jejuni菌连续免疫健康新西兰大白兔4次，每次间隔10天，取免疫前后血清效价相差10⁵的大白兔血清，为阳性血清。

诊断试剂盒具体检测程序为：(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)将待检血清用样品稀释液作1∶500稀释，按100μL/孔加入反应板中，同时设阳性对照(C.jejuni标准阳性血清)、阴性对照(C.jejuni标准阴性血清)和空白对照(只加100μL样品稀释液)37℃反应1小时；(3)将酶标板应用美国BioTek Elx808洗板机洗板6次；(4)每孔加入100μL酶结合物工作液(空白不加)，37℃温箱中放置30min；(5)将酶标板应用美国BioTek Elx808洗板机洗板6次；(6)依次加入底物显色液A、B各50μL，室温下避光反应15min；(7)每孔加入50μL终止液，混合均匀，于酶标仪中双波长(第一波长450nm，第二波长630nm)下读取其OD值。

检测样本的判定标准为：血清抗体检测结果的定性判定标准：阴性血清判断：样本OD值≥2.5倍阴性标准的OD值：阴性血清判断：样本OD值≤2倍阴性标准的OD值，可疑阳性血清判断：样本OD值≥2倍阴性标准的OD值≤2.5倍阴性标准的OD值，对于可疑阳性的判断，重复实验，如果结果仍为可疑阳性值则判断为阴性。

实施例4 空肠弯曲菌抗体间接ELISA诊断试剂盒的应用

用建立好的方法对空肠弯曲菌免疫血清抗体进行检测，结果如下。

1、AhpC蛋白抗原包被ELISA检测空肠弯曲菌免疫血清抗体

用建立的方法对本实验室自行获得的空肠弯曲菌免疫兔血清进行抗空肠弯曲菌抗体检测，检测步骤如下：(1)对空肠弯曲菌免疫前及免疫后血清利用PBS缓冲液(同上)进行倍比稀释，稀释度分别为1∶100，1∶200，1∶400～1∶102400，共11个稀释度。(2)按100μL/孔加入上述方法制备的ELISA反应板中，37℃反应1小时。(3)将酶标板应用美国BioTek Elx808洗板机洗板6次；(4)每孔加入100μL酶结合物工作液(空白不加)，37℃温箱中放置30min；(5)将酶标板应用美国BioTek Elx808洗板机洗板6次；(6)依次加入底物显色液A、B各50μL，室温下避光反应15min；(7)每孔加入50μL终止液，混合均匀，于酶标仪中双波长(第一波长450nm，第二波长630nm)下读取其OD值。空肠弯曲菌免疫前后血清ELISA检测结果的OD值见下表1及附图5。

表1 AhpC抗原包被ELISA板对空肠弯曲菌免疫血清抗体检测结果

结果显示利用AhpC重组蛋白做抗原，在相同的稀释度下，空肠弯曲菌免疫血清不但具有针对AhpC蛋白的特异抗体(western-blot结果)，同时其抗体效价的比例在1∶102400时效价的比值为(0.604/0.001)64倍，说明AhpC蛋白抗原具有检测针对空肠弯曲菌感染特异性抗体的较高的灵敏度和特异度。

2、AhpC蛋白抗原包被ELISA检测对阳性、阴性血清及其它病原免疫血清抗体检测的灵敏度、特异度评价

利用上述方法获得的AhpC重组蛋白抗原包被ELISA检测板，检测空肠弯曲菌抗体阳性血清(免疫后血清)及阴性血清(免疫前血清)以及其它病原免疫血清，包括幽门螺杆菌免疫血清、小肠结叶尔森氏菌免疫血清、大肠杆菌0157：H7免疫血清、霍乱弧菌免疫血清。血清稀释度分别为1∶100～1∶102400，具体实验步骤按照上述方法进行。结果如图6所示：AhpC作为抗原与肠道其它感染血清抗体没有交叉反应。AhpC蛋白作为抗原检测空肠弯曲菌的抗体具有较高特异度及灵敏度，表2为对不同血清检测结果的OD值。

表2 AhpC抗原包被ELISA板对不同血清抗体检测OD值结果

3、AhpC蛋白抗原包被ELISA检测空肠弯曲菌抗体特异度分析

应用AhpC蛋白抗原包被ELISA检测试剂盒对36份临床空肠弯曲菌感染并产生格林-巴利综合征的阳性血清，51份健康体检并经分离培养确定的阴性血清，按照上述方案进行检测，检测结果如图7所示。按照检测结果判断标准，36份阳性血清检测结果皆为阳性，51份阴性血清的检测结果皆为阴性。AhpC重组蛋白抗原检测患者血清的灵敏度为100％，特异度为100％。

实施例5 空肠弯曲菌全菌可溶性蛋白的制备

将空肠弯曲菌用预冷的低盐PBS洗4次，按终浓度7M、2M、4％、1％、1％分别加入尿素、硫脲、CHAPS、IPG Buffer(pH 3-10)、DTT以及蛋白酶抑制剂1片、125μg的RNase A和50单位的DNase，不断吹打使全部溶解后定容至5ml。冰浴中超声5分钟(SONICS VC 750，大探头，最大功率的25％，脉冲2秒，停2秒)，使细胞彻底破碎。然后将溶液室温放置1小时，充分溶解蛋白质，40000g离心1小时去掉不溶物，收集上清，即为菌体蛋白溶液。

实施例6 AhpC重组蛋白抗原、空肠弯曲菌全菌可溶性蛋白抗原包被ELISA与商业试剂盒检测空肠弯曲菌结果的比较

目前检测空肠弯曲菌感染后抗体的商业试剂盒仅有1种，为德国空肠弯曲杆菌维润赛润(SERION ELISA classic)ELISA检测试剂盒。分别应用AhpC重组蛋白抗原、空肠弯曲菌菌株NCTC11168全菌蛋白抗原包被ELISA以及virion\serion空肠弯曲菌抗体检测试剂盒对12份临床阳性标本血清，17份人群阴性血清进行抗体检测。三种试剂盒的检测结果见表3、图8。

表3 三种抗原ELISA检测血清抗体结果

结果发现，商品化试剂盒对于中国感染者血清中抗体检测的灵敏度与AhpC蛋白抗原以及空肠弯曲菌的全菌可溶性蛋白相比较低。应用空肠弯曲菌全菌蛋白作为抗原，可以提高检测空肠弯曲菌的灵敏度，但利用全菌蛋白作为抗原在抗原制备的过程中需要培养大量病原，涉及生物安全，需要在生物安全二级以上实验室，并且需要有经验的操作者完成，同时空肠弯曲菌体外培养需要特异的微需氧气体环境以及营养丰富的特异培养基，增加了生产的成本。

通过三种试剂盒检测结果的比较发现，本发明AhpC蛋白抗原包被的ELISA试剂盒灵敏度、特异性最优，且操作安全简单，成本低、无污染，值得推广使用。

Claims (4)

1.空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶AhpC蛋白在制备检测空肠弯曲菌抗体试剂盒中的应用，所述AhpC蛋白氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.以AhpC蛋白为包被抗原的空肠弯曲菌酶联免疫吸附试剂盒，所述AhpC蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的空肠弯曲菌酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于还含有酶结合物工作液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液。

4.如权利要求3所述的空肠弯曲菌酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述酶结合物工作液为HRP标记SPA，所述阳性对照为兔免疫空肠弯曲菌标准阳性血清，所述阴性对照为兔标准阴性血清。

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