ES2523749T3 - Antígenos proteicos destinados al serodiagnóstico de las infecciones por Staphylococcus aureus, en particular en prótesis osteo-articulares - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro para determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, que comprende la detección de anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende una secuencia SEC ID nº 40, en una muestra biológica del individuo.

Description

Antígenos proteicos destinados al serodiagnóstico de las infecciones por Staphylococcus aureus, en particular en prótesis osteo-articulares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico de las infecciones por estafilococos.

Antecedentes técnicos

Más de 10 millones de individuos en el mundo son portadores de prótesis osteo-articulares (cadera, rodilla, hombro) y este número aumenta regularmente debido al envejecimiento de la población y a los problemas de sobrepeso.

Las infecciones en prótesis articular (IPOA) son una de las principales complicaciones relacionadas con la colocación de una prótesis. Están asociadas a una morbilidad muy alta, ya que necesitan una o más reintervenciones, una larga antibioterapia, y provocan una desventaja funcional importante, frecuentemente prolongada. Las IPOA, en el 50 al 75% de los casos, están causadas por unas bacterias que pertenecen al género Staphylococcus. Una de las principales especies implicadas es S. aureus.

El diagnóstico de IPOA resulta de un haz de argumentos clínicos, paraclínicos y microbiológicos, que en ciertos casos no permiten alcanzar un diagnóstico seguro. El cultivo de extracciones sigue siendo la técnica de referencia que necesita un gesto invasivo y está sujeto a la contaminación bacteriana. Actualmente, no existe ninguna herramienta serológica para el diagnóstico y el seguimiento de IPOA.

En la técnica anterior, se describen numerosas secuencias peptídicas y nucleotídicas procedentes de S. aureus. Así, POCSFALVI et al. Proteomics. Junio de 2008; 8(12):2462-76 ha identificado, con la ayuda de un enfoque proteómico, 119 exoproteínas de S. aureus. El documento WO 02/094868 describe 5642 secuencias nucleicas o peptídicas procedentes de S. aureus en el diagnóstico de una infección por S. aureus en un individuo. B. CHRISTENSSON et al. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand B. octubre de 1983; 91(5):351-6 muestra que con respecto a unos individuos sanos, los pacientes que sufren de una infección por S. aureus tienen unos porcentajes mucho más elevados de anticuerpos dirigidos contra la toxina alfa-hemolisina procedente de S. aureus, que un grupo de pacientes que han desarrollado unas septicemias que no se deben a S. aureus, que tienen unos niveles de anticuerpos normales.

Resumen de la invención

El objetivo del estudio era identificar unos antígenos pertinentes para el serodiagnóstico de IPOA por S. aureus. Los inventores han procedido al análisis de la respuesta humoral anti-estafilocócica de pacientes que padecen IPOA por

s. aureus. El estudio se ha realizado mediante la técnica de inmunoproteoma a partir de las proteínas bacterianas segregadas en el medio extracelular. Se han estudiado en paralelo dos cepas de S. aureus resistente (SARM) y sensible (SASM) a la meticilina.

Así, los inventores han mostrado en particular que las proteínas de las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 6, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 18, SEC 10 nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 40, SEC ID nº 41, y SEC ID nº 42 son útiles para el diagnóstico serológico de las infecciones por estafilococos, en particular en el marco de las infecciones sobre prótesis osteo-articulares.

La presente solicitud describe por lo tanto un procedimiento in vitro para determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, que comprende la detección de anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre las SEC ID 10 nº 1, SEC ID nº 6, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 40, SEC ID nº 41 y SEC ID nº 42, en una muestra biológica del individuo.

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Tal como se entiende en la presente memoria, la expresión "bacteria del género Staphylococcus" se refiere a todas las especies o sub-especies comprendidas en este género. Se prefiere sin embargo que la bacteria del género Staphylococcus sea Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus warnerii o Staphylococcus hominis.

Tal como se entiende en la presente memoria, la expresión "infectado" o "infección" se refiere a individuos portadores de una bacteria del género Staphylococcus tal como se ha definido anteriormente. Los individuos infectados pueden presentan uno o varios sitios de multiplicación de las bacterias del género Staphylococcus.

Las infecciones por bacterias del género Staphylococcus pueden también ser la consecuencia de una intervención quirúrgica para la colocación de un material extraño. Así, tal como se entiende en la presente memoria, el individuo ha sufrido preferentemente una intervención quirúrgica y, en particular, ha sufrido la implantación de una prótesis, tal como una prótesis articular, en particular seleccionada de entre el grupo constituido por una prótesis de rodilla, una prótesis de cadera y una prótesis de hombro.

La infección diagnosticada en el marco de la presente invención, y para la cual se desea determinar si se debe a la presencia de una bacteria del género Staphylococcus, se puede seleccionar por ejemplo de entre:

-

una infección en prótesis (en particular articular);

-

una infección osteo-articular;

-

una infección post-operatoria (en particular durante la colocación de un material extraño, tal como una

prótesis);

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una miositis aguda;

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una otitis;

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una sinusitis;

-

una infección cutánea supurativa tal como un furúnculo, un ántrax, un panadizo, una foliculitis, una sicosis (por ejemplo en asociación con un tricofitón), una celulitis, una erisipela, un pénfigo neonatal, un impétigo (por

ejemplo en asociación con estreptococos) o una mastitis (en particular en la vaca);

-

una infección de vísceras tal como una neumonía (sobre todo como complicación de la gripe), una endocarditis (en particular en los pacientes portadores de prótesis cardiacas), una infección urinaria, una

flebitis, una enteritis o una meningitis;

-

una infección de los huesos (en particular la osteomielitis); y

-

una septicemia (en particular unos individuos inmunodeprimidos).

Tal como se entiende en la presente memoria, la expresión "muestra biológica" incluye al mismo tiempo la muestra tal como se ha extraído y la muestra que ha sido sometida a diversos tratamientos, en particular para hacerla apta para su utilización en los procedimientos y procedimientos según la invención. La "muestra biológica" según la invención puede ser de cualquier tipo susceptible de contener unos anticuerpos dirigidos contra una bacteria del género Staphylococcus, o contener unos antígenos procedentes de una bacteria del género Staphylococcus, pero se prefiere que la muestra biológica se seleccione de entre el grupo constituido por una muestra de sangre, por una muestra de suero, por una muestra de plasma, por una muestra de tejido linfoide asociado a una mucosa (MALT), por una muestra de líquido cefalorraquídeo, por una muestra de líquido articular, por una muestra de líquido pleural, por una muestra de saliva, y por una muestra de orina.

Como se entiende en la presente memoria, la expresión "determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus" comprende el planteamiento de un diagnóstico o el diagnóstico de una infección por una bacteria del género Staphylococcus tal como se ha definido anteriormente en el individuo. Comprende asimismo el seguimiento de individuos que han sufrido una intervención quirúrgica, en particular para implantar, limpiar o reemplazar una prótesis. Comprende además el seguimiento de una infección por una bacteria del género Staphylococcus, tal como se ha definido anteriormente, en particular en el marco de un tratamiento terapéutico que pretende luchar contra la infección.

En el marco de la presente solicitud, el "individuo" es preferentemente un ser humano. Sin embargo, también puede tratarse de otro mamífero, tal como por ejemplo el mono, el conejillo de indias, la cobaya, el conejo, la rata, el ratón, la vaca, el perro, el gato o el caballo.

Como se entiende en la presente memoria, las expresiones "proteína constituida por una secuencia" o "proteína representada por una secuencia" son sinónimas.

Por "ligando de captura", se entiende en la presente memoria un compuesto capaz de enlazarse, de manera preferentemente específica, al antígeno o al anticuerpo que se desea detectar en un individuo.

Por "ligando de detección" se entiende en la presente memoria un compuesto capaz de enlazarse, de manera preferentemente específica, al ligando de captura y/o al complejo formado entre el ligando de captura y el antígeno o el anticuerpo que se desea detectar y/o al antígeno o al anticuerpo que se desea detectar.

El término "específico" o "específicamente", cuando se refiere a la unión de un ligando con una primera diana, significa que el ligando se puede unir a la primera diana sin unirse por ello a una segunda diana que no se parece estructuralmente a la primera diana.

Como se entiende en la presente memoria, un "anticuerpo", cuando se trata de un ligando de captura o de un ligando de detección, puede pertenecer a cualquier especie, y es en particular un anticuerpo humano, de ratón, de rata, de cabra o de camélido. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico, es decir un anticuerpo constituido por unas partes que proceden de diferentes especies. Los anticuerpos quiméricos preferidos se denominan humanizados, en los que las partes constantes (en particular CH y CL) son de origen humano y las partes variables (VH y VL) o los CDR de las partes variables son de otra especie, el ratón por ejemplo. El anticuerpo puede ser producido mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia, por ejemplo por inmunización de un animal o mediante procedimientos recombinantes o quiméricos. Además, el término "anticuerpo" como se entiende en la presente memoria, comprende también los fragmentos de anticuerpos que comprenden por lo menos uno de los paratopos del anticuerpo, a saber en particular los fragmentos Fab, F(ab')2, y scFv. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, en particular un anticuerpo policlonal monoespecífico, o un anticuerpo monoclonal.

Los "aptámeros" son bien conocidos por el experto en la materia. Pueden ser de naturaleza nucleotídica, como se describe en particular por Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22 y Bock et al. (1992) Nature 355:564-6, o de naturaleza peptídica, como se describen, en particular, por Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78:426-30.

El procedimiento denominado de "phage display" (despliegue de fagos) es un procedimiento de selección de ligandos polipeptídicos expresados en la cápside de un bacteriófago y codificados por una secuencia nucleotídica insertada en el gen que codifica la cápside. Este procedimiento es bien conocido por el experto en la materia y está descrito en particular por Scott & Smith (1990) Science 249:386-390, y Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597. Preferentemente, el polipéptido obtenido por "phage display" es un polipéptido de tipo scFv (por "single-chain variable fragment"), como se describe en particular por Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455.

Polipéptidos

Los inventores han identificado varios antígenos nuevos útiles para el diagnóstico serológico de las infecciones por estafilococos, a saber unos antígenos de las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 6, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 31, SEC ID nº32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 40, SEC ID nº 41 SEC IDnº 42.

De este modo, se describen unos procedimientos, unas utilizaciones y unos kits basados en el empleo o la detección de los polipéptidos siguientes

-

una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, SEC ID nº 6, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 40,SEC ID nº 41y SEC ID nº 42 ; o

-

una proteína homóloga que comprende o que está constituida por una secuencia que comparte por lo menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad con una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, SEC ID nº 6, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36,SEC ID nº 37, SEC ID nº 40, SEC IDnº 41y SEC ID nº 42; o

-

una proteína que comprende o que está constituida por un fragmento de la proteína definida en (i) o en (ii), comprendiendo dicho fragmento por lo menos 10 aminoácidos consecutivos de dicha proteína definida en (i)

o en (ii);

con la condición de que la proteína definida en (ii) o que el fragmento definido en (iii) pueda ser unido mediante por lo menos un anticuerpo dirigido contra una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC ID nº 1, SEC ID nº 6, SEC ID nº 9, SEC ID nº 11, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37,SEC ID nº 40, SEC ID nº 41 y SEC ID nº 42.

Tal como se entiende en la presente memoria, la proteína homóloga definida anteriormente o el fragmento definido anteriormente, es tal que se pueda unir mediante por lo menos un anticuerpo dirigido contra una proteína

representada por una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42. En otras palabras, la proteína homóloga definida anteriormente o el fragmento definido anteriormente comprenden por lo menos uno de los epítopos de una proteína constituida por 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42. Por lo tanto, la proteína homóloga definida anteriormente o el fragmento definido anteriormente deberían preferentemente ser tales que procuren por lo menos el 70%, más preferentemente por lo menos el 80% y aún más preferentemente por lo menos el 90%, de la sensibilidad respectivamente procurada por una proteína que comprende o que está constituida por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42, medida en las mismas condiciones. Como se entiende en la presente memoria, el término "sensibilidad" se define como el porcentaje de individuos infectados por una bacteria del género Staphylococcus tal como se ha definido anteriormente, preferentemente por S. aureus, cuyas muestras biológicas, en particular unas muestras de suero, contienen unos anticuerpos dirigidos contra una proteína que comprende o que está constituida por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42.

Los polipéptidos tales como los definidos anteriormente pueden estar compuestos por los 20 aminoácidos naturales

o por aminoácidos a los que estos 20 aminoácidos codifican. Pueden estar compuestos también por aminoácidos modificados mediante procesos naturales, tales como el proceso de maduración post-traduccional o mediante procedimientos químicos, que son bien conocidos por el experto en la materia. El mismo tipo de modificación puede estar presente en varios sitios de la cadena polipeptídica, y en cualquier lugar en la cadena polipeptídica: en el esqueleto peptídico, en los grupos laterales o también en los extremos carboxi-o amino-terminales. Pueden ser ramificados tras una ubiquitinación o ser cíclicos con o sin ramificación. Este tipo de modificaciones puede ser el resultado de procesos de post-traducción naturales o sintéticos, que son bien conocidos por el experto en la materia.

Se entiende, por ejemplo, por modificaciones de un polipéptido, la acetilación, la acilación, la ADP-ribosilación, la amidación, la fijación covalente de flavina, la fijación covalente de hemo, la fijación covalente de un nucleótido o de un derivado nucleotídico, la fijación covalente de un lípido o de un derivado lipídico, la fijación covalente de un fosfatidilinositol, la reticulación covalente o no covalente, la ciclación, la formación de puente disulfuro, la desmetilacion, la formación de cisteína, la formación de piroglutamato, la formilación, la gamma-carboxilación, la glicosilación, la formación de anclaje al GPI, la hidroxilación, la yodación, la metilación, la miristoilación, la palmitoilación, la glipiación, la oxidación, el proceso proteolítico, la fosforilación, la prenilación, la racemización, la seneloilación, la sulfatación, la adición de aminoácidos, tal como la arginilación o la ubiquitinación (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, páginas 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION (OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)).

Por otra parte, cuando se obtienen por vía recombinante, los polipéptidos tales como se han definido anteriormente pueden comprender también unas secuencias útiles para la purificación de las proteínas (etiquetas de purificación), tales como unas etiquetas polihistidina, y eventualmente una secuencia que permite escindir estas etiquetas, por ejemplo unos sitios de cortes por proteasas.

Preferentemente, un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42, comprende 350, 400, 500, o 1000 aminoácidos como máximo.

En un modo de realización preferido, los polipéptidos están constituidos por una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42 fusionada a una etiqueta de purificación.

El porcentaje de identidad según la invención se puede calcular mediante numerosos procedimientos bien conocidos por el experto en la materia. Preferentemente, el porcentaje de identidad corresponde al número de aminoácidos idénticos obtenidos para una alineación emparejada óptima (es decir la alineación que maximiza el número de aminoácidos idénticos) de una secuencia de una proteína homóloga con las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42, en la totalidad de su longitud, dividido entre el número total de aminoácidos de la mayor de las dos secuencias alineadas. La alineación se puede realizar manualmente o con la ayuda de programas de ordenador tales como el programa EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453). El porcentaje de identidad se calcula preferentemente utilizando el programa EMBOSS::needle (global) con la matriz Blosum62 y los parámetros siguientes: "Gap Open" igual a 10,0, "Gap Extend" igual a 0,5. Preferentemente, el porcentaje de identidad según la invención es de por lo menos el 85%, más preferentemente de por lo menos el 90%, y aún más preferentemente de por lo menos el 95%.

Preferentemente, el "fragmento" según la invención comprende por lo menos 20 aminoácidos, más preferentemente por lo menos 30 aminoácidos, y aún más preferentemente por lo menos 40 aminoácidos. Preferentemente también, el "fragmento" según la invención comprende 100 aminoácidos como mucho, más preferentemente 80 aminoácidos como mucho, y aún más preferentemente 60 aminoácidos como mucho. El fragmento según la invención puede

corresponder, por ejemplo, a la forma madura de la proteína (es decir sin péptido señal). Este fragmento puede además ser fusionado a otras secuencias, tales como un péptido señal heterólogo y/o una etiqueta de purificación.

Procedimientos

5 Los pacientes infectados por Staphylococcus producen unos anticuerpos contra unos antígenos de Staphylococcus. De este modo, los antígenos identificados por los inventores pueden ser utilizados en el marco del serodiagnóstico de infecciones por estafilococos.

10 La presente solicitud describe un procedimiento in vitro para determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, preferentemente S. aureus, que comprende la detección de anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42, en una muestra biológica del individuo.

15 Así, se prevé un procedimiento para determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, preferentemente s. aureus, que comprende:

a) determinar si unos anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende o que está 20 constituida por una secuencia seleccionada de entre las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42 están presentes en la muestra biológica del individuo; y

b) deducir de ello si dicho individuo sufre una infección por una bacteria del género Staphylococcus.

25 Preferentemente, los anticuerpos detectados en las muestras biológicas según la invención son unas IgG.

Como aparecerá claramente para el experto en la materia, un "anticuerpo dirigido contra por lo menos una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42" se refiere a cualquier anticuerpo del individuo

30 capaz de reconocer una proteína constituida por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42, es decir un anticuerpo específico de esta proteína, pero que puede también reconocer cualquier polipéptido tal como se ha definido anteriormente, en particular la forma madura de esta proteína.

Tratándose de la detección de anticuerpos dirigidos contra una proteína que comprende o que está constituida por

35 las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42 en las muestras biológicas, ésta se puede realizar con la ayuda de los polipéptidos tales como se han definido anteriormente. Estos polipéptidos constituyen entonces unos ligandos de captura de los anticuerpos presentes en la muestra biológica del individuo.

Así, la etapa (a) de determinación de la presencia o de la ausencia de anticuerpos dirigidos contra por lo menos una

40 proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42 en la muestra biológica del individuo puede comprender las etapas de:

a1) poner la muestra biológica en contacto con por lo menos un polipéptido, tal como se ha definido 45 anteriormente; y

b2) detectar la presencia o la ausencia de anticuerpos unidos al polipéptidos, por ejemplo con la ayuda de un ligando de detección.

50 En un modo de realización preferido, la detección de la presencia o de la ausencia de anticuerpos unidos al polipéptido según la invención se realiza por ELISA.

Un modo de realización particular de la invención se refiere a un procedimiento en el que además se determinan unos anticuerpos dirigidos contra una proteína que comprende o que está constituida por la secuencia SEC ID nº 6

55 en una muestra biológica del individuo. Este anticuerpo se detecta únicamente en la cepa Mu50 (SARM) y no se detecta en la cepa SASM estudiada. De este modo, la determinación de que unos anticuerpos dirigidos contra una proteína que comprenden una secuencia SEC ID nº 6 están presentes en la muestra biológica del individuo indica que este individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, en particular S. aureus, que es resistente a la meticilina.

60 La presente solicitud describe también un procedimiento in vitro para determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, preferentemente S. aureus, que comprende la detección de una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia seleccionada de entre las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 y 42 (es decir la detección del antígeno como tal) en una muestra biológica

65 del individuo.

En este caso, la detección de antígenos de Staphylococcus se puede realizar con la ayuda de un ligando de captura dirigida, preferentemente de manera específica, contra una proteína representada por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 o 42. Este ligando de captura puede ser de cualquier tipo, pero se prefiere que sea un anticuerpo, un aptámero, o un péptido obtenido por "phage display" y en particular se prefiere que sea un anticuerpo.

Para determinar si unos anticuerpos o unos antígenos presentes en la muestra biológica se han fijado por un ligando de captura, se puede utilizar un ligando de detección, que puede ser específico bien de los anticuerpos o de los antígenos fijados, o bien de los ligandos de captura. El ligando de detección puede ser de cualquier tipo, pero se prefiere que sea un anticuerpo, un aptámero, o un péptido obtenido por "phage display" y en particular se prefiere que sea un anticuerpo. Así, el ligando de detección puede corresponder, por ejemplo, a un anticuerpo anti-IgG, que pretende detectar los anticuerpos del individuo unidos al polipéptido según la invención utilizado como ligando de captura.

Preferentemente, el ligando de detección está marcado. Como se entiende en la presente memoria, el término "marcado" se refiere al mismo tiempo a un marcado directo y a un marcado indirecto (por ejemplo a través de otro ligando en sí mismo marcado directamente). El marcado puede ser de tipo radioisotópico, enzimático o luminoso (por ejemplo con la ayuda de un cromóforo o de un fluoróforo).

Los procedimientos que utilizan unos ligandos de captura y unos ligandos de detección son bien conocidos por el experto en la materia y pueden ser aplicados según diferentes formatos bien conocidos, en fase sólida u homogénea, en una o dos etapas, con la ayuda de un procedimiento sándwich o por competición. Preferentemente, el ligando de captura está inmovilizado sobre una fase sólida, tal como las paredes de un pocillo de una placa de microtitulación o unas bolas paramagnéticas.

Kits

Se describe un kit para diagnosticar una infección por una bacteria del género Staphylococcus, preferentemente S. aureus, que comprende por lo menos uno o dos polipéptidos según la invención, tales como se han definido anteriormente.

Se describe asimismo un kit para diagnosticar una infección por una bacteria del género Staphylococcus, preferentemente S. aureus, que comprende por lo menos un ligando de captura dirigido, preferentemente de manera específica, contra una proteína representada por la SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 o 42. Este ligando de captura puede ser de cualquier tipo, pero se prefiere que sea un anticuerpo, un aptámero, o un péptido obtenido por "phage display", y en particular se prefiere que sea un anticuerpo.

Los kits pueden contener por ejemplo:

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un polipéptido según la invención y un ligando de detección que permiten la detección de anticuerpos unidos al polipéptido según la invención (por ejemplo un anticuerpo anti-IgG, preferentemente marcado); o

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un ligando de captura dirigido, preferentemente de manera específica, contra una proteína representada por SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41, o 42 y un ligando de detección que permite la detección de antígenos unidos al ligando de captura.

Estos kits pueden comprender también unos reactivos que permiten aplicar el procedimiento según la invención y/o unas instrucciones de utilización.

Utilizaciones

La presente solicitud se refiere a la utilización para el diagnóstico in vitro de una infección por una bacteria del género Staphylococcus, particularmente S. aureus:

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de un polipéptido según la invención definido anteriormente; o

-

de un ligando de captura dirigido, preferentemente de manera específica, contra una proteína representada por las SEC ID nº 1, 6, 9, 11, 18, 20, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 37, 40, 41 o 42.

Se describe también la utilización para determinar in vitro si un individuo sufre de una infección por una bacteria del género Staphylococcus, particularmente S. aureus, resistente a la meticilina:

i.

de una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia SEC ID nº 6; o

ii.

de una proteína homóloga que comprende o que está constituida por una secuencia que comparte por lo

menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad con una secuencia

SEC ID nº 6; o

iii. de una proteína que comprende o que está constituida por un fragmento de la proteína definida en (i) o en (ii), comprendiendo dicho fragmento por lo menos 10 aminoácidos consecutivos de dicha proteína definida en (i)

o en (ii); o

iv. de un ligando de captura dirigido, preferentemente de manera específica, contra una proteína representada

por SEC ID nº 6;

con la condición de que la proteína definida en (ii) o que el fragmento definido en (iii) pueda estar unida por lo menos por un anticuerpo dirigido contra una proteína que comprende o que está constituida por una secuencia SEC ID nº 6.

Todos los artículos, revistas, solicitudes de patentes, patentes y manuales mencionados en la presente memoria están incorporados a título de referencia en el texto de la presente solicitud.

A pesar de tener significados distintos, los términos "que comprende", "que contiene", "que tiene" y "que consiste en" se han utilizado de manera intercambiable en la descripción de la invención y pueden ser sustituidos uno por otro.

Por otra parte, la invención se explicará más con la ayuda de las figuras y de los ejemplos siguientes.

Descripción de las figuras

Figura 1: Principio del inmunoproteoma. PMF: Peptide Mass Fingerprinting, MS/MS: espectrometría de masas en tándem.

Figura 2: Análisis por inmunoproteoma de las proteínas segregadas por la cepa Mu50 (SARM) con 10 sueros de pacientes que padecen una infección en prótesis de SARM (2A Gel 2D coloreado con azul de Coomassie y 2B inmunotransferencia correspondiente).

Figura 3: Repartición y funciones de los antígenos identificados.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y procedimientos

1.1 Panel de pacientes

Se seleccionaron veinte pacientes (adultos de 28 a 84 años) que sufren IPA y admitidos entre 2004 y 2006 en el Hospital Raymond Poincaré (Garches) o en el Hospital de la Croix Saint-Simon (Paris) en base al criterio de por lo menos 3 extracciones positivas por cultivo de Staphylococcus aureus resistente o sensible a la meticilina.

1.2. Cepas, condiciones de cultivo y extracción proteica

Las cepas Mu50 (SARM) y 29213 (SASM) se cultivaron en 100 ml de medio TCS (Tryptic soy broth) a 37ºC y bajo agitación (200 rpm) durante 6 horas. El sobrenadante de cultivo se concentró y después se añadió el 10% de TCA (ácido tricloroacético) con el fin de precipitar las proteínas correspondientes a la fracción segregada del proteoma (fracción Sc).

1.3. Análisis inmunoproteómico (figuras 1 y 2)

Después del lavado con acetona glacial, las proteínas de la fracción Sc se solubilizaron en un tampón 2D (urea 7M, tiourea 2M, ASB-14 1%, Tris 40 mM). Se separa una cantidad de 500 µg de proteínas por electroforesis 2D en un intervalo pH 3 a 10. Un gel se colorea con azul de Coomassie (A), el otro se transfiere sobre una membrana de nitrocelulosa para la revelación de los antígenos en transferencia western con los sueros de cribado (B). Los diferentes antígenos indicados a nivel de la transferencia western (B) por un número se localizan de la misma manera a nivel del gel coloreado con azul de Coomassie (A). Las proteínas antigénicas se identificaron después por espectrometría de masas (PMF y/o MS/MS) en la cepa Mu50.

1.4. Serodiagnóstico de IPOA por ensayo ELISA

Las placas ELISA se dejan durante una noche a 4ºC en presencia de 0,5 µg de antígeno purificado en un "tampón salino fosfato" (PBS). Después de cuatro lavados por PBS que contiene polioxietileno de sorbitán (Tween) al 0,05%, las placas son saturadas durante una hora y media a 37ºC mediante PBS-Tween que contiene el 4% de albúmina de suero bovino (BSA) (250 µl por pocillo). Se realizan cuatro nuevos lavados y después se añaden 100 µl de cada suero "positivo" o control, a la dilución 1/100 en un tampón PBS-BSA al 4%, en cada pocillo. La placa se incuba después a 37ºC durante 30 minutos. Después de cuatro nuevos lavados, se añaden unos anticuerpos anti

inmunoglobulinas G humanas de cabra marcados con peroxidasa (por ejemplo 31415, Pierce) (simultánea y/o independientemente) en 30 minutos a 37ºC después de haber sido diluidos, según el protocolo del proveedor, en un tampón PBS-BSA al 4%. Se realizan cuatro nuevos lavados y después se añaden por pocillo 100 µl de sustrato tetrabencimidina (TMB) (por ejemplo HD979505, Pierce). Después de la incubación durante aproximadamente 15 5 minutos, se añaden en cada pocillo 100 µl de ácido sulfúrico. La absorbencia a 450 nm de cada pocillo se mide entonces tras 5 minutos. Se consideran como "positivos" en ELISA, los sueros identificados por su unión con los polipéptidos (antígenos) tales como se han definido según la invención. Los rendimientos de los ensayos ELISA que utilizan los polipéptidos identificados según la invención así como las combinaciones de polipéptidos según la invención se evaluaron por el procedimiento de análisis por función discriminante, análisis muy parecido al análisis

10 de varianza. Este procedimiento conocido por el experto en la materia permite determinar las variables que permiten determinar entre los dos grupos de pacientes o individuos control. El procedimiento consiste en determinar si los dos grupos difieren según la media de la variable y utilizar esta última para predecir el grupo.

Ejemplo 2: resultados

15 Entre el conjunto de las proteínas segregadas por la bacteria en el sobrenadante de cultivo, se pudieron identificar 41 proteínas antigénicas en las dos cepas estudiadas. Un antígeno (SEC ID nº 6) está segregado sólo por la cepa SARM estudiada (Mu50).

20 La secuencia de estos cuarenta y dos antígenos se presenta a continuación.

SEC ID nº 1 (S. aureus)

SEC ID nº 2 (S. aureus)

SEC ID nº 3 (S. aureus)

SEC ID nº 4 (S. aureus)

SEC ID nº 5 (S. aureus)

SEC ID nº 6 (S. aureus)

SEC ID nº 7 (S. aureus)

SEC ID nº 8 (S. aureus)

SEC ID nº 9 (S. aureus)

SEC ID nº 10 (S. aureus)

SEC ID nº 11 (S. aureus)

SEC ID nº 12 (S. aureus)

SEC ID nº 13 (S. aureus)

SEC ID nº 14 (S. aureus)

SEC ID nº 15 (S. aureus)

SEC ID nº 16 (S. aureus)

SEC ID nº 17 (S. aureus)

SEC ID nº 18 (S. aureus)

SEC ID nº 19 (S. aureus)

SEC ID nº 20 (S. aureus)

SEC ID nº 21 (S. aureus)

SEC ID nº 22 (S. aureus)

SEC ID nº 23 (S. aureus)

SEC ID nº 24 (S. aureus)

SEC ID nº 25 (S. aureus)

SEC ID nº 26 (S. aureus)

SEC ID nº 27 (S. aureus)

SEC ID nº 28 (S. aureus)

SEC ID nº 29 (S. aureus)

SEC ID nº 30 (S. aureus)

SEC ID nº 31 (S. aureus)

SEC ID nº 32 (S. aureus)

SEC ID nº 33 (S. aureus)

SEC ID nº 34 (S. aureus)

SEC ID nº 35 (S. aureus)

SEC ID nº 36 (S. aureus)

SEC ID nº 37 (S. aureus)

SEC ID nº 38 (S. aureus)

SEC ID nº 39 (S. aureus)

SEC ID nº 40 (S. aureus)

SEC ID nº 41 (S. aureus)

SEC ID nº 42 (S. aureus)

Se confirmó la secreción de 40 de los 42 antígenos por la presencia de secuencias características identificadas in

30 silico. De estos 40 antígenos, 9 proteínas (las de las secuencias SEC ID nº 6, 9, 18, 20, 29, 30, 33, 36 y 37) todavía no se habían detectado en el sobrenadante de cultivo de estafilococo (Royan et al. 2000. FEMS Immunol Med Microbiol. 29:315-21). Dos proteínas no poseen ninguna secuencia de secreción conocida.

Entre las 42 proteínas antigénicas identificadas durante nuestro estudio, 23 antígenos, tales como la α hemolisina, la

35 enterotoxina P o también los antígenos inmunodominantes IsaA o IsaB, ya se habían descrito en la bibliografía (véase la tabla 1 y la figura 3).

Tabla 1 -Caracterización de los antígenos identificados

Secreción * Antigenicidad: SEC ID nº Nombre de la proteína N°de gen (publicaciones) publicaciones

2 Autolisina SAV1052 Sí* (2, 9) 1,2 3 Lipasa 2 geh SAV320 Sí* (2, 9) 2 4 Estafilocoagulasa SAV0230 Sí* (2) 2 5 Inositol monofosfato deshidrogenasa SAV0390 Sí* (2, 9) 1,2 7 6 fosfogluconato deshidrogenasa SAV1511 Sí* (2) 2 8 Proteína A SAV0111 Sí* (2) 2,5

10 Proteína de unión al anión SAV0719 Sí* (2, 9) 2 12 Alcohol deshidrogenasa SAV0605 Sí* (2) 1 13 Precursor de cisteína proteasa SAV1047 Sí* (2, 9) 2 14 Componente C de hemolisina γ SAV2420 Sí* (9) 7 15 Cadena II de hemolisina γ SAV2419 Sí* (9) 7

Secreción * Antigenicidad: SEC ID nº Nombre de la proteína N°de gen (publicaciones) publicaciones

16 Cadena A de hemolisina α SAV1163 Sí* (2, 9) 4 17 precursor de 1 fosfatidil inositol fosfodiesterasa SAV0095 Sí* (2, 9) 2 19 Enterotoxina P SAV1948 Sí* (9) 6 21 V8 proteasa SAV1048 Sí* (2, 9) 3 22 Triosa fosfato isomerasa SAV0774 Sí* (2) 1,2 23 Antígeno immunodominante A SAV2569 Sí* (2, 9) 8, 12 27 Subunidad C de la alquil hidroperóxido reductasa SAV0381 Sí* (9) 1,2 33 Nucleasa microcócica SAV0815 11 34 Proteína de estrés alcanino 23 SAV2182 Sí* (2, 9) 2 35 Familia de proteínas de estrés universal SAV1710 Sí* (9) 1 38 Antígeno immunodominante B SAV2638 Sí* (9) 8 39 Precursor de estafilokinasa (f) SAV1944 Sí* (2) 2

Leyenda de la tabla 1: (f) identificación de un fragmento de la proteína, (*) cálculo del resultado extracelular por los programas PSORT2b (por ejemplo disponible en el sitio internet psort.org/psortb), Señal P (por ejemplo disponible en el sitio internet cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y/o Secretome P para la vía de secreción no clásica (por ejemplo

5 disponible en el sitio internet cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/), y después confirmación eventual en la bibliografía.

El presente estudio ha permitido identificar 19 nuevos antígenos, aún no identificados como tales (véase la tabla 2 y figura 3). Cinco de entre ellos están descritos como factores de virulencia. Los otros doce poseen unas funciones muy variadas y están implicados en el metabolismo de la bacteria, el transporte del metabolito o también en la

10 regulación de la expresión de genes. Finalmente, los dos últimos no se han estudiado nunca y no presentan ninguna homología que permita atribuirles una función.

Tabla 2 -caracterización de los antígenos identificados

SEC ID nº

Nombre de la proteína N°de gen Secreción * (publicaciones) Función o función putativa Similitud con las proteínas de función conocida, observaciones

1

Glicerofosfodiéster fosfodiestearasa SAV959 Sí* (9) Metabolismo fosfolipídico

6

Proteína hipotética SAV434 Sí* Desconocida Ninguna homología con las proteínas con las funciones descritas, antigénica en SARM únicamente

9

Proteína hipotética SAV2032 Sí* Adhesión Ser-Asp rich fibrinógeno/hueso proteína de unión a la sialoproteína. Similar a SdrH de S. aureus. MW2 : 105/415 => 25% (100% de homología sobre los 105 comunes)

11

Transportador de eflujo de azúcar SAV0673 Sí* (2, 9) Implicada en el transporte de los azúcares

18

Leucoccidina no caracterizadada (en Mu50) SAV2004 Sí* Trastorno de la respuesta inmunitaria lisis de los leucocitos (neutrófilos polinucleares) 100% de identidad con Luk F de S. aureus (cepa RF122)

20

Probable transglicosilasa SceD SAV2095 Sí* Implicada en la escisión del peptidoglicano

24

N-acetil-muramoilL-alanina-amidasa (f) SAV2307 Sí* (9) Catabolismo de la pared

SEC ID nº

Nombre de la proteína N°de gen Secreción * (publicaciones) Función o función putativa Similitud con las proteínas de función conocida, observaciones

25

Serina proteasa SpIC SAV1811 Sí* (9) Actividad proteásica («de tipo» tripsina)

26

Serina proteasa SpIF SAV1809 Sí* (9) Actividad proteásica («de tipo» tripsina)

28

Proteína hipotética SAV0372 Sí* (2, 9) Desconocida Lipoproteína de S. aureus (cepa MN8) 98%

29

Exotoxina 15 «de tipo» superantígeno de S. aureus SAV0433 Sí* Trastornos de la respuesta inmunitaria hiperestimulación de los linfocitos T

30

Exotoxina 6 «de tipo» superantígeno de S. aureus SAV0422 Sí*

31

Proteína hipotética SAV0171 Non Transducción de la señal Proteína doble espiral alfa-helicoidal Microcystis aeruginosa NIES-843: 44%

32

Proteína hipotética SAV0613 Sí* (9) Desconocida

36

Proteína hipotética SAV2205 Sí* Adhesión, trastorno de la respuesta inmunitaria Análogo del complejo mayor de histocompatibilidad (dominio MAP) Proteína de tipo proteína de adherencia extracelular de S. aureus (cepa MN8): 99%

37

Proteína hipotética SAV0814 Sí* Adhesión a las matrices del plasma Homeostasia Homólogo truncado del factor (segregado) de von Willebrand de S. aureus (cepa RF122):85% 147/499 (29%) sobre la totalidad del gen

40

Proteína hipotética SAV0981 Sí* (9) Adhesión, trastorno de la respuesta inmunitaria Análoga del complejo mayor de histocompatibilidad Proteína de adherencia extracelular Eap de S. aureus (cepa MN8):143/144 (99%)

41

Proteína hipotética SAV1942 Sí* (2) Adhesión, trastorno de la respuesta inmunitaria SCIN (Staphylococcal Complement Inhibitor) de S. aureus (cepa MRSA252) (69%) Proteína de unión al fibrinógeno de S. aureus (cepa MN8): 49%

42

Respuesta estafilocócica respiratoria A ssrA, (f) de S. aureus SAV1492 No Regulador transcripcional pleiotrópico (sistema Agr, proteína A, TSST-1)

Leyenda de la tabla 2: (f) identificación de un fragmento de la proteína, (*) cálculo del resultado extracelular por los programas PSORT2b (por ejemplo disponible en el sitio internet psort.org/psortb), Señal P (por ejemplo disponible en el sitio intenet cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y/o Secretome P para la vía de secreción no clásica (por ejemplo

5 disponible en el sitio internet cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/), y después confirmación eventual en la bibliografía.

Las prestaciones de varios antígenos nuevos identificados para el serodiagnóstico de IPOA a S. aureus se han estudiado mediante el ensayo de ELISA utilizando unos paneles de 18 sueros de pacientes infectados y de 79 sueros de donantes de sangre control (tabla 3).

10 Tabla 3: Ejemplos de resultados (ELISA) utilizando unos anti-IgG como anticuerpos secundarios

Polipéptidos ensayados

Proporción de sueros «positivos» entre los 18 sueros de pacientes infectados por S.aureus y diagnosticados por cultivo Proporción de sueros «negativos» entre 79 sueros control (donantes de sangre).

SEC ID nº 1

55,6% (10/18) 91,1% (72/79)

SEC ID nº 18

55,6% (10/18)

SEC ID nº 24

66,7% (12/18)

SEC ID nº 40

33,3% (6/18)

SEC ID nº 42

50% (9/18)

SEC ID nº 17

5,6% (1/18) 91,1% (72/79)

Se desprende de estos resultados que los polipéptidos de las secuencias SEC ID nº 18, SEC ID nº 40, SEC ID nº 24, 15 SEC ID nº 1 y SEC ID nº 42 permiten discriminar a los pacientes de los control, mientras que el polipéptido de la SEC ID Nº 17, a pesar de que ya se ha descrito como antigénico en la bibliografía, no lo permite.

En conclusión, este estudio ha permitido identificar 19 antígenos nuevos candidatos para el desarrollo de un ensayo de serodiagnóstico de IPOA.

20 La producción en forma recombinante y la purificación de estos antígenos están en curso. Los rendimientos diagnósticos (sensibilidad, especificidad) de los antígenos son evaluados en la perspectiva del desarrollo de un ensayo multiparamétrico de serodiagnóstico de IPOA. Se ha iniciado un estudio clínico multicéntrico francés que incluye 5 centros (Croix St Simon, Berck sur Mer, Lyon, Strasbourg, Garches-Amboise Paré [UTL], etc.) con el fin de

25 recoger sueros de pacientes que padecen IPOA. El gen que codifica el antígeno 6, únicamente detectado en la cepa Mu50 (SARM) y no detectado en la cepa SASM estudiada está secuenciado en varias cepas SARM y SASM. Se han llevado a cabo unos estudios con el fin de confirmar el interés de esta proteína para el diagnóstico de las infecciones por SARM frente a SASM.

30 Bibliografía

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40 3. Calander A. M., G. Dubin, J. Potempa, A. Tarkowski. 2008. Staphylococcus aureus infection triggers production of neutralizing, V8 protease-specific antibodies. FEMS Immunol Med Microbiol. 52:267-72.

4. Christensson B., S. A. Hedström, y G. Kronvall. 1983. Antibody response to alpha-and betahemolysin from Staphylococcus aureus in patients with staphylococcal infections and in normals. Acta Pathol Microbiol Immunol

45 Scand. 91:351-6. Graille M., E. A. Stura, A. L . Corper, B. J. Sutton, M. J. Taussig, J. B. Charbonnier, y G. J. Silverman. 2000. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for récognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci USA. 97:5399-404.

50 5. Gruber J., G. C. Wright. 1969. Ammonium sulfate coprecipitation antibody determination with purified staphylococcal enterotoxins. J Bacteriol. 99:18-24.

6. Kurek M., K. Pryjma, S. Bartkowski, y P. B. Heczko. 1977. Anti-staphylococcal gamma hemolysin antibodies in

rabbits with staphylococcal osteomyelitis. Med Microbiol Immunol. 163:61-5. 55

7. Lorenz U., K. Ohlsen, H. Karch, M. Hecker, A. Thiede, y J. Hacker. 2000. Human antibody response during sepsis

against targets expressed by methicillin resistant Staphylococcus aureus. FEMS Immunol Med Microbiol. 29:145-53.

8. Pocsfalvi G., G. Cacace, M. Cuccurullo, G. Serluca, A. Sorrentino, G. Schlosser, G. Blaiotta, y A. Malorni. 2008. Proteomic analysis of exoproteins expressed by enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains. Proteomics. 8:2462

5 76.

9. Royan S., L. Sharp, S. P. Nair, S. Crean, B. Henderson, S. Poole, G. L. Scott, y A. W. Evans. 2000. Identification of the secreted macromolecular immunogens of Staphylococcus aureus by analysis of serum. FEMS Immunol Med Microbiol. 29:315-21.

10. Verbrugh H. A. , R. D. Nelson, P. K. Peterson, B. J. Wilkinson, y R. L. Thompson. 1983. Serology of Staphylococcus aureus infections using multiple antigens and serial serum samples. J Infect Dis. 148:608.

11. Vytvytska O., E. Nagy, M. Blüggel, H. E. Meyer, R. Kurzbauer, L. A. Huber, y C. S. Klade. 2002. Identification of 15 vaccine candidate antigens of Staphylococcus aureus by serological proteome analysis. Proteomics. 2:580-90.

Listado de secuencias

<110> InGen Biosciences 20

<120> Antígenos proteicos destinados al serodiagnóstico de las infecciones por Staphylococcus aureus en particular en prótesis osteoarticulares

<130> BET 10P0776 25

<150> US 61/213452

<151> 2009-06-10

<160> 42 30

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 308 35 <212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

<210> 2

<211> 1248

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 2

<210> 3

<211> 691

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 3

<210> 4

<211> 658

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 4

5 <210> 5

<211> 488

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 5

5 <210> 6

<211> 495

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 6

5 <210> 7

<211> 468

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 7

5 <210> 8

<211> 450

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 8

<210> 9

<211> 415

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 9

<210> 10

<211> 646

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<210> 11

<211> 404

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 11

<210> 12

<211> 336

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 12

<210> 13

<211> 393

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 13

<210> 14

<211> 315

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 14

<210> 15

<211> 309

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 15

<210> 16

<211> 319

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 16

5 <210> 17

<211> 328

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 17

<210> 18

<211> 338

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 18

<210> 19

<211> 260

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 19

5 <210> 20

<211> 231

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 20

5 <210> 21

<211> 342

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 21

<210> 22

<211> 253

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 22

<210> 23

<211> 233

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 23

<210> 24

<211> 258

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 24

<210> 25

<211> 239

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 25

<210> 26

<211> 239

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 26

<210> 27

<211> 189

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 27

<210> 28

<211> 190

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 28

<210> 29

<211> 227

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 29

<210> 30

<211> 226

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 30

<210> 31

<211> 170

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 31

<210> 32

<211> 168

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 32

<210> 33

<211> 228

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 33

<210> 34

<211> 169

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 34

<210> 35

<211> 166

<212> PRT 15 <213> Staphylococcus aureus

<400> 35

<210> 36

<211> 141

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 36

<210> 37

<211> 173

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 37

<210> 38

<211> 175

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 38

<210> 39 15 <211> 163

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 39

5 <210> 40

<211> 144

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

10 <400> 40

<210> 41

<211> 116

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 41

<210> 42

<211> 241

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 42

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Procedimiento in vitro para determinar si un individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus, que comprende la detección de anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende una secuencia SEC ID nº 40, en una muestra biológica del individuo.

2. 2.

   Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

   a) determinar si unos anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende la secuencia SEC

   ID nº 40 están presentes en la muestra biológica del individuo; y

   b) deducir de ello si dicho individuo sufre una infección por una bacteria del género Staphylococcus.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la bacteria del género Staphylococcus es Staphylococcus aureus.

4. 4.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el individuo ha sufrido la implantación de una prótesis articular.

5. 5.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el individuo ha sufrido la implantación de una prótesis articular seleccionada de entre el grupo constituido por una prótesis de rodilla, una prótesis de cadera y una prótesis de hombro.

6. 6.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra biológica se selecciona de entre el grupo constituido por una muestra de sangre, por una muestra de suero, por una muestra de plasma, por una muestra de tejido linfoide asociado a una mucosa (MALT), una muestra de líquido cefalorraquídeo, una muestra de líquido articular, una muestra de líquido pleural, una muestra de saliva, y una muestra de orina.

7. 7.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la etapa (a) de determinación de la presencia o de la ausencia de anticuerpos dirigidos contra por lo menos una proteína que comprende la secuencia SEC ID nº 40 en la muestra biológica del individuo comprende las etapas de:

   a1) poner la muestra biológica en contacto con por lo menos:

   (i) una proteína que comprende la secuencia SEC ID nº 40; o

   (ii) una proteína que comprende una secuencia que comparte por lo menos el 80% de identidad con la secuencia SEC ID nº 40, o

   (iii) un fragmento de la proteína definida en (i) o en (ii), comprendiendo dicho fragmento por lo menos 10

   aminoácidos;

   con la condición de que la proteína definida en (ii) o que el fragmento definido en (iii) pueda ser enlazado por lo menos por un anticuerpo dirigido contra una proteína que comprende la secuencias SEC ID nº 40, y

   a2) detectar la presencia o la ausencia de anticuerpos enlazados a la proteína o al fragmento definido en la etapa a1).
8. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la etapa (a) comprende además la determinación de la presencia o de la ausencia de anticuerpos dirigidos contra una proteína que comprende una secuencia SEC ID nº 6, y en el que la determinación de que unos anticuerpos dirigidos contra una proteína que comprende una secuencia SEC ID nº 6 están presentes en la muestra biológica del individuo indica que el individuo está infectado por una bacteria del género Staphylococcus resistente a la meticilina.