CN101362801A - 一种用于检测空肠弯曲菌特异性抗原的快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测空肠弯曲菌特异性抗原的快速检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被权利要求1所述单克隆抗体或PEB1多克隆抗体的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的与反应膜上不同抗原结合位点的PEB1单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中空肠弯曲菌的特异性抗原。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对空肠弯曲菌的感染诊断起到辅助作用。

Description

一种用于检测空肠弯曲菌特异性抗原的快速检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1基因工程抗原的制备及其单克隆抗体的研制，和含有该单克隆抗体的空肠弯曲菌胶体金快速检测试纸条及其应用。

技术背景

空肠弯曲菌病是由空肠弯曲菌(Cjejuni)引起的感染性疾病。空肠弯曲菌引起的肠炎是世界性疾病，在经济发达国家，是主要的食源性感染性疾病，空肠弯曲菌感染引起的腹泻在细菌性腹泻病中位居榜首。在发展中国家，腹泻病发病率较高，空肠弯曲菌引起的腹泻仅次于大肠杆菌和志贺菌。空肠弯曲菌的感染多为散发，较少有暴发，是夏秋季腹泻的主要病原，尤其学龄前儿童发病率较高，其传染源主要来自于污染的水和食物。最新研究证实空肠弯曲菌感染与格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome，GBS)相关。空肠弯曲菌病是典型的人畜共患疾病。

临床症状

空肠弯曲菌感染后，临床表现复杂多样。但主要症状为腹泻性肠炎。同时也有无症状携带和极少数因菌血症而引起的肠道外感染。

肠炎以轻、中型多见，多数可自愈。婴幼儿弯曲菌肠炎多不典型，表现为全身症状轻微，精神和外表若似无病；多数无发热和腹痛；仅有间断性轻度腹泻，间有血便，持续较久；若合并其他肠道致病菌感染，往往中毒症状较重、起病急。有中度发热或高热，大便多为脓血便，6个月以下、特别是新生儿发病率最高。临床难与菌痢等区别，应提高警惕。肠道外感染多见于老龄患者或免疫功能低下者。孕妇感染者常见上呼吸道症状、肺炎及菌血症。可引起早产、死胎或新生儿败血症及新生儿脑膜炎。空肠弯曲菌感染目前被广泛认为是GBS的前驱感染，GBS是目前空肠弯曲菌感染引起的主要致死因素。

临床诊断：

目前主要根据病史与流行特点相结合。常有不洁食物史、喝生水及旅游史，临床症状主要为发热、腹痛、腹泻、发热多为38℃左右，或无热；腹痛为脐周及全腹痉挛性疼痛，多伴里急后重；腹泻次数一般不多，且可间歇性血便。确诊主要依据实验室的病原分离培养或血清学检测结果。

·血清学检查

血清学检查通常作为空肠弯曲菌感染的流行病学调查。发病一周后，血清内可出现抗体，主要为1gM，可用间接血凝试验及间接免疫荧光试验，Western Blot等检测特异性抗体及抗体效价，正常人或带菌者血清效价可达1:2～1:8，急性期病人抗体效价可达1:8～1:32，恢复期可达1:80～1:320以上。由于血清抗体效价不高，须采取双份血清检测，以效价增高4倍作为诊断依据。空肠弯曲菌感染后血清中IgM，IgG，IgA水平升高。IgA在感染后血清及粪便中含量升高数周后迅速下降，对于临床诊断意义有限，但对于帮助确定空肠弯曲菌的感染与GBS及关节炎的关系却有重要意义。

·病原的分离培养

菌株的分离培养是空肠弯曲菌感染诊断的金标准。

·其它方法：目前已有多种基于免疫和基因的诊断产品应用于弯曲菌属的诊断。包括基于酶联免疫吸附原理和应用PCR的方法直接从粪便样品中检测病原的试剂盒。

大量研究表明空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1基因序列相对保守，在不同的血清型空肠弯曲菌中均有表达，是一种有效的保护性抗原。PEB1由peblA基因编码，peblA含有780bp，其中前26个氨基酸为信号肽，成熟蛋白分子量为25.5kD。因此属于各种空肠弯曲菌的共同抗原，可作为空肠弯曲菌的检测抗原，用于检测诊断。

发明内容

本发明的目的是利用各种空肠弯曲菌的共同抗原PEB1蛋白，研制特异性的单克隆抗体；并利用该抗原的单克隆抗体，研制一种可以快速，准确检验布氏杆菌的空肠弯曲菌胶体金快速检测试纸。

本发明的另一目的在于提供上述试纸条的制备方法。

为实现上述目的，本发明首先利用基因工程技术，克隆并高效表达空肠弯曲菌共同抗原PEB1蛋白，并通过免疫学技术对其免疫原性及特异性进行检定。然后，利用PEB1研制了空肠弯曲菌特异性的配对单克隆抗体。实验表明，通过基因工程抗原制备的单克隆抗体，其具有良好的特异性和灵敏度。

进而，本发明提供一种试纸条，其包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体或多克隆抗体的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的与反应膜上不同亚型的抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体。

其中，反应膜可为硝酸纤维膜，结合物释放垫可为玻璃纤维膜。

其中，二抗IgG为抗鼠IgG抗体。

本发明还提供一种制备上述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：

1)按照上述方法制备单克隆抗体，或制备多克隆抗体；

2)将步骤1)制备的单克隆抗体或多克隆抗体以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

3)用胶体金标记步骤1)制备的单克隆抗体，包被到结合物释放垫中，其中胶体金标记的单克隆抗体与步骤2)中包被在检测带中的单克隆抗体的抗原结合位点不同；

4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

本发明空肠弯曲菌抗原快速检测试纸(胶体金法)具有以下优点：

1)检测快速：10分钟出结果；

2)特异性：仅对空肠弯曲菌呈阳性，而对其他的致病菌如霍乱霍菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、痢疾等呈阴性结果；

3)敏感性：对空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1检出可达1ng的水平；

4)保存和运输方便，在室温下可保存18个月；

5)便于临床和家居使用，而且具有产业性。

附图说明

图1：A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面示意图。其中，1：吸水垫；2：硝酸纤维膜(T：空肠弯曲菌的单克隆抗体或抗空肠弯曲菌的多克隆抗体的条带；C：包被抗鼠IgG的质控条带)；3：含有胶体金标记空肠弯曲菌的单克隆抗体的玻璃纤维膜；4：金标抗体保护膜；5：反应支持物。

图2：检测结果示意图。其中，从左至右依次为：T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1基因工程抗原的制备

CJ基因组DNA的提取：

取空肠弯曲菌培养物1ml，离心收集细胞，然后悬浮于200ul TE液中，用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。

peblA基因的扩增

根据Genbank(编号：AL139076)报道的peblA完整CDS，去掉氨基端的信号肽设计一对引物，选择BamHI和XhoI作为酶切位点设计如下引物：

上游为5-GCGGATCCGCAGAAGGTAAACTTGAGTCTAT-3，

下游为5-CCGCTCGAGTTATAAACCCCATTTTTTCGCT-3。

PCR扩增peblA基因。扩增条件为94℃变性4min，然后94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸1min，最后1个循环结束后再以72℃延伸8min，共30个循环。所获PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用DNA Extraction Kit试剂盒回收纯化PCR产物。

质粒pET28a(+)-peblA的构建

将纯化的PCR产物和质粒pE128a(+)用BamHI和XhoI进行双酶切后。用DNA Extraction Kit试剂盒进行纯化，将酶切纯化的目的基因和质粒pET28a(+)按3:1(摩尔数)比例在22℃条件下连接2-4h；然后转化已制备的E coli J1V1109感受态细胞，用含卡那霉素30μg/ml LB平板筛选重组质粒。

重组质粒pET28a(+)-peblA的鉴定重组质粒用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，同时提取重组质粒进行测序鉴定。

重组质粒的诱导表达及表达水平的鉴定：

将重组质粒pET28a(+)-peblA转化E coli BL21(DE3)中，用含卡那霉素的LB培养基筛选表达菌并增菌。取过夜培养菌重新培养于37℃至A₆₀₀＝0.6时，用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养6h，分别于诱导后1□234、6h采集菌体。将菌体重悬于1×蛋白电泳上样bufer混匀后煮沸5min，用5％的浓缩胶和12％的分离胶进行SDS-PAGE电泳。以考马斯亮蓝R-250染液染色和脱色液充分脱色后观察蛋白条带。用凝胶图像分析系统分析其表达量。

重组蛋白表达形式分析及其纯化：

收集10ml诱导培养4h细菌菌体沉淀，加入1ml超声破碎液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaC1，pH8)重悬菌体，在冰浴中超声破碎细菌10min。于4℃12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。同时取超声碎菌后的上清液，用HIS-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌HIS标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78100赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。

rPEB1免疫原性的鉴定：

以兔抗CJ全菌抗体为一抗；HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，用Western bolt检测rPEB1的免疫反应性。结果表明，重组蛋白Peb1具有良好的免疫原性，其兔血清的ELISA效价达1：50000。实施例2：抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体的制备

(1)免疫小鼠

制备的基因工程抗原从-20低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠背部皮下注射(0.2ml/只)，间隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原0.15ml进行攻击。免疫效果用ELISA法进行检测。

(2)骨髓瘤细胞

SP2/0骨髓瘤细胞：将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10％小牛血清DMEM培养基中培养48-72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。

(3)细胞融合

制备好的SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴细胞分别配制成2×10⁷/ml和1×10⁸/ml。各取1ml室温下混合。用0.8ml，50％的PEG(分子量1500)作为融合剂；培养液用10％小牛血清DMEM。

(4)阳性孔的检测和筛选

ELISA法检测。包被空肠弯曲菌粗制抗原和PEB1蛋白抗原两种酶标板。对融合细胞的培养上清液进行检测，选择ELISA效价OD值大于1.0的阳性孔进行亚克隆。共检出阳性克隆16株，选择11株进行亚克隆操作。

(5)单抗细胞株的亚克隆：用有限稀释法对阳性克隆细胞株进行克隆化筛选。对筛选的的阳性克隆经过冻存、复苏、传代等过程，最终获得5株可稳定分泌特异性抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1的单克隆抗体细胞株。

(6)单克隆抗体细胞株检定

细胞株核型分析：对上述杂交瘤细胞染色体进行检测为106条；证明他们是SP2/0骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。

细胞株稳定性：对5株产生空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株经连续克隆化检测单克隆抗体阳性率100％，在体外传代5个月，并经反复冻存复苏均能达到保持稳定的分泌抗体。

实施例3：抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体的检定

(1)单抗腹水制备：

小鼠：SPF级小鼠，经检查无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。

细胞株扩大培养：取生产批细胞管1支复苏，加营养液扩大培养，1只生产细胞只用一次，不再冻存。

杂交瘤细胞株接种：制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。一周后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1-3×10⁶/0.2ml。

腹水采集：注射细胞株7-10天，或小鼠濒死前一次采集腹水，置-20℃保存。

(2)单克隆抗体的提纯：

采用硫酸铵沉淀法粗提，进而用HiTrap rProteinA柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。用HIS-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌HIS标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78100赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。

(3)抗体亲合力测定：采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED50的下降值，来间接反映其抗体亲合力的大小。选择其中亲和力较好的6株，进行亚型检定。

(4)亚型检定：采用免疫扩散法对细胞培养上清的单抗进行Ig亚类的检测。上述5株单克隆抗体的Ig亚类分别是：IIgG1有一株；IgG2a有两株；IgG2b有二株。

(5)抗原位点检定：用相加ELISA法对6株单抗的抗原结合位点进行检测。结果表明，这5株中有三种不同的抗原结合位点。

实施例4：空肠弯曲菌Peb1蛋白多克隆抗体制备

(1)动物免疫：

选择1-2kg的新西兰白兔，用空肠弯曲菌Peb1蛋白于背部皮下多点注射，免疫剂量为1mg/kg。共免疫4次。

(2)免疫效价检测：

包被空肠弯曲菌Peb1蛋白酶标板，每孔4μg。按间接ELISA法检测免疫血清的效价。血清效价达到1:20000以上，可采集血清。

(3)抗体提纯及检定：

采用常规辛酸法提纯。纯度用非变性PAGE电泳检定，显示蛋白一条带。活性采用ELISA检定，效价大于1:20000。

实施例5：空肠弯曲菌抗原检测试剂盒的研制

(1)胶体金-抗体结合物的制备：

经实验确定，以1A3作为金标抗体，其最佳结合pH值为8.0，蛋白配比为25μg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(0.5％BSA，pH8.0，0.01M Tris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。

(2)包被抗体于硝酸纤维膜：

将空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体(与胶体金标记的单克隆抗体的抗原结合位点不同)用0.01M PBS稀释成1.2±0.1mg/ml。将羊抗鼠IgG多克隆抗体用0.01M PBS稀释成2±0.1mg/ml。用喷膜机将二者以1μl/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。

把固定有抗体的硝酸纤维置37度烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。

(3)空肠弯曲菌抗原检测试剂盒组成

反应支持物为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被抗鼠IgG，空肠弯曲菌PEB1蛋白的单克隆抗体(步骤2)或抗空肠弯曲菌的多克隆抗体，0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的空肠弯曲菌PEB1蛋白的单克隆抗体玻璃纤维(步骤1)；金标抗体保护膜(样品垫)为2.7cm×0.4cm的滤纸纤维；即形成了空肠弯曲菌抗原快速检测试纸条(胶体金法)。

(4)空肠弯曲菌抗原检测试剂盒特异性及敏感度实验：

使用步骤3的检测试剂盒(检测带为单克隆抗体)进行实验

特异性实验：

空肠弯曲菌是一种人畜共患病，临床上主要引起人腹泻症状。因此其特异性实验设计以下阴性质控品：大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、正常粪便、血便。检测结果表明，本品与上述样品无交叉反应。

敏感度实验：

用生理盐水将空肠弯曲菌培成不同浓度表准品，检测结果表明，本品最低检出量为1×10⁶菌/ml。

实施例6检测方法(参见图2)

将待检粪便标本用裂解液处理后，取约100-150μl加入检测条的样品垫(实施例4试纸条“4”处)上，样品液沿膜向上爬行，10-15分钟判读结果。

结果：

如样本中含有空肠弯曲菌抗原，则与试纸条上胶体金标记的空肠弯曲菌的单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的空肠弯曲菌的单克隆抗体或抗空肠弯曲菌的多克隆抗体，形成红色线条，即在T处形成红色条带，即为阳性结果。

无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记空肠弯曲菌的单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

序列表

<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司

<120>一种用于检测空肠弯曲菌特异性抗原的快速检测试纸条

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

Claims (10)

1、抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的由PEB1基因工程抗原制备获得。

2、一种制备权利要求1所述单克隆抗体的方法，其包括步骤：将构建表达PEB1基因的表达载体，将所述表达载体转化宿主细胞，诱导表达PEB1蛋白，经纯化后作为免疫原制备单克隆抗体。

3、如权利要求2所述的方法，其还包括检测制备的单克隆抗体的抗原结合位点。

4、含有权利要求1所述单克隆抗体的检测试剂盒。

5、一种检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，其特征在于，所述反应膜具有包被权利要求1所述单克隆抗体或PEB1多克隆抗体的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的与反应膜上不同抗原结合位点的PEB1单克隆抗体。

6、如权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

7、如权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述的结合物释放垫为玻璃纤维膜。

8、如权利要求5～7任一项所述试纸条，其特征在于，所述的二抗IgG为抗鼠IgG。

9、一种制备权利要求5～8任一所述试纸条的方法，包括步骤：

1)按照权利要求2或3所述方法制备单克隆抗体，或制备多克隆抗体；

2)将步骤1)制备的单克隆抗体或多克隆抗体以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

3)用胶体金标记权利要求1制备的单克隆抗体，被包被到结合物释放垫中，其中胶体金标记的单克隆抗体与步骤2)中包被在检测带中的单克隆抗体的抗原结合位点不同；

4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

10、权利要求5～8任一项所述的试纸条在检测空肠弯曲菌中的应用。

Images