CN102532283A

CN102532283A - 空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用

Info

Publication number: CN102532283A
Application number: CN2011104274543A
Authority: CN
Inventors: 唐泰山; 祝长青; 蒋原; 张睿; 张常印; 薛峰; 栾军; 王凯民; 姜焱
Original assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: CN102532283B

Abstract

本发明公开了空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用。空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，编码所述含空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列为SEQ ID No.2。一种富集空肠弯曲菌的试剂盒，含有包被空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体的免疫磁珠。利用该免疫磁珠或试剂盒能从样品预增菌液中将空肠弯曲菌富集，极大地提高下一步分离培养或PCR检测的敏感性和检出率，具有特异性好，灵敏度高，简单，方便，快速，适合大规模样品检测的优点。

Description

空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，C.jejuni)大量存在于各种野生或家养动物的肠道内，污染水源或食物后可引起腹泻的暴发流行，被感染的动物常无明显的症状，并长期携带此菌。目前C.jejuni感染已成为全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。在发展中国家，它是儿童腹泻死亡的重要病原，也是旅行者腹泻的最常见原因，在美国和其他工业化国家，空肠弯曲杆菌感染引起的腹泻是沙门氏菌、志贺氏菌或大肠杆菌(O157:H7)引起的腹泻的2～7倍。该菌还可引起格林-巴利综合征和儿童急性迟缓性瘫痪。C.jejuni传统分离培养方法的取样量较少，划线培养后，一些杂菌快速摄取培养基中的有效营养成分，严重干扰C.jejuni的分离培养，造成传统分离方法的敏感性和检出率降低；酶联免疫吸附试验(ELESA)、核酸探针杂交、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)等方法敏感、特异、且检出率较高，但存在一定的非特异性反应，不能区分活菌和死亡细菌。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽及其特异性抗体。

本发明的另一目的是提供包被有该抗体的免疫磁珠。

本发明的又一目的是提供该免疫磁珠的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，是由人工分析空肠弯曲菌特异性表面蛋白的抗原表位，人工设计、改造、串联、表达后获得，其氨基酸序列为SEQID No.1，编码所述含空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

所述的含空肠弯曲菌特异性多抗原表位的人工多肽的特异性抗体。

由所述的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠。

一种利用所述的试剂盒富集检测空肠弯曲菌的方法，按如下步骤进行：

(1)样品的预增菌依据GB/T 4789.9进行，样品加入预增菌培养液后，在微需氧条件(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)下，以100rpm的振荡速度，36±1℃培养4h；必要时测定增菌液的pH值并调整至7.2±0.2，42±1℃继续培养24h-48h；也可用等效的方法进行预增菌；

(2)取所述预增菌液20-30mL，加入权利要求3所述的免疫磁珠50μL，37℃孵育1h；

(3)将其放于磁力架上，3min后弃去上清，加入30mL PBS缓慢重悬，磁力架吸下免疫磁珠后，弃去上清，如此重复洗涤3次；

(4)吸附后的免疫磁珠直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA用PCR或荧光PCR进行检测；为避免免疫磁珠上抗体影响菌落的生长状态，可以向吸附后的免疫磁珠中加入1mL 50mmol/L甘氨酸溶液(pH2.0)，间断振荡洗脱1h；将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA后用PCR或荧光PCR进行检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明选择空肠弯曲菌4个位于菌体表面的特异性蛋白各选取一个抗原性较强的表位，人工设计出一条空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽，并利用纯化的多肽作为抗原免疫新西兰兔，获得的空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体对空肠弯曲菌具有良好的特异性。与常规方法相比，本发明空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被的免疫磁珠可以从体积较大的样品预增菌液中将空肠弯曲菌富集，极大地提高下一步分离培养或PCR检测的敏感性；并且本发明空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被的免疫磁珠能够特异性地吸附样品预增菌液中空肠弯曲菌，可排除其它杂菌对下一步的分离培养或PCR检测的干扰，以提高空肠弯曲菌的检出率。由于磁珠包被有特异性抗体，富集效果及效率大大提高，磁珠与细菌结合是通过非共价键结合，不会影响空肠弯曲菌的生理和生化特性。

具体实施方式

实施例1空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的制备

1.空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽(也称空肠弯曲菌多表位抗原，或称C.jejuni多表位抗原重组蛋白，下同)的设计、合成与克隆

通过Epitope Conservancy Analysis软件预测空肠弯曲菌4个位于菌体表面的特异性蛋白(gi号分别为：6967637、6967894、6968218和6968454)的抗原表位，从每个蛋白各选取一个抗原性较强的表位，人工设计出一条多肽，其编码的氨基酸序列为：SEQ ID No.1，长度为53个氨基酸；结合原核表达载体E.coli密码子的简并性，设计的人工多肽核酸序列为：SEQ IDNo.2，长度为159bp，并在其上下游分别添加BamH I和Hind III酶切位点。经人工合成并克隆至pMD18-T载体，获得克隆质粒pMD18-T-CJMEA-A。

2.空肠弯曲菌多表位抗原的质粒构建

按照碱裂解法提取重组质粒pMD18-T-CJMEA-A，BamH I和Hind III双酶切后电泳，回收大小为171bp的特异性目的片段，与表达载体pET-32a(+)用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)按照说明书的条件进行连接，按照常规方法转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，筛选到阳性表达质粒pET-32a-CJMEA-A。对表达质粒pET-32a-CJMEA-A进行PCR扩增、BamH I和Hind III双酶切，电泳后在大小约为171bp处均出现特异性条带。对表达质粒pET-32a-CJMEA-A进行测序，确定其核苷酸序列无误。

3.空肠弯曲菌多表位抗原的表达及纯化

将含有表达质粒pET-32a-CJMEA-A的E.coli BL21(DE3)于LB培养基中培养至对数生长期(OD_600nm为0.6-0.8)，加入IPTG至浓度为1mM，37℃诱导6h后离心，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬，超声裂解后离心，上清用0.45μm微孔滤膜过滤后，用His Bind Purification Kit(Novagen公司)按照说明书的方法纯化。纯化的重组蛋白用SDS-PAGE电泳分析，观察到约27kD的特异性蛋白条带，大小与预计相似，说明纯化的C.jejuni多表位抗原重组蛋白纯度较好。

实施例2空肠弯曲菌多表位抗原的反应原性和免疫原性鉴定

1.免疫转印

将实施例1纯化的C.jejuni多表位抗原重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，凝胶用半干转印仪(Bio-Rad)电转印至PVNF膜(Osmonics公司)。将转印后的PVNF膜用5％脱脂奶粉溶液封闭，加入1∶200稀释的兔抗C.jejuni全菌阳性血清，37℃作用1.5h后洗膜；加入1∶10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG，37℃作用1h后洗膜；用3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色5min后，显示单一的特异性条带，大小与重组蛋白相似，说明制备的C.jejuni多表位抗原重组蛋白具有良好的反应原性。

2.兔免疫试验

将实施例1纯化的C.jejuni多表位抗原重组蛋白加入等量的弗氏完全佐剂(GIBCO公司)乳化，皮下多点注射成年新西兰兔，0.5mg/只，2周后加入等量弗氏不完全佐剂乳化抗原进行二免，第5周和第8周时分别进行三免和四免，方法同二免，第10周时采血收集血清(下文称抗血清)，用ELISA方法鉴定血清抗体和重组蛋白。结果显示制备的抗血清与重组蛋白反应效价大于1∶512000，与C.jejuni菌体反应效价为1∶3200，重组蛋白与抗C.jejuni全菌血清反应效价为1∶50，说明制备的抗血清与菌体具有良好的反应性。鉴定好的抗血清用C.jejuni多表位抗原重组蛋白偶联的凝胶做亲和层析，纯化后的抗体用紫外分光光度计测定蛋白浓度后分装，-20℃冻存备用。

ELISA反应程序为：灭活的C.jejuni菌体或C.jejuni多表位抗原重组蛋白用1mol/L的Tris-HCl(pH为7.5)稀释至10μg/mL，4℃包被过夜；1％BSA(质量浓度)4℃封闭过夜；预稀释好的抗血清或抗C.jejuni全菌血清、以及阴性对照血清倍比稀释，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用1.0h；HRP标记的羊抗兔二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗)1∶10000稀释，37℃作用1.0h；邻苯二胺(OPD)37℃避光显色15min；用2mol/L H₂SO₄终止显色，测定OD_490nm值，计算P/N值，以P/N≥2.5的血清最高稀释度作为血清效价。

3.重组蛋白抗血清特异性实验

将空肠弯曲杆菌ATCC 29428、霍乱弧菌ATCC 51394、副溶血型弧菌89001(中国药品生物制品检定所)、阪崎氏肠杆菌ATCC 29544、蜡样芽孢杆菌ATCC 63301、沙门氏菌ATCC14028、大肠埃希菌ATCC 25922、甲型溶血型链球菌CMCC 32205、痢疾志贺氏菌CMCC(B)51105、单增李斯特菌CMCC(B)54002、铜绿假单胞杆菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923灭活后调整菌体浓度至5×10⁵包被ELISA板，兔抗重组蛋白阳性血清(即空肠弯曲菌多表位抗原的特异性抗体)以1∶25稀释后再做倍比稀释，间接ELISA确定发现除空肠弯曲杆菌ATCC 29428(P/N为6.8)以外，其它菌的P/N均小于2.5，说明制备的抗血清(即空肠弯曲菌多表位抗原的特异性抗体)具有良好的特异性。

实施例3空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠的制备

1.取165μL磁珠悬浮液(含磁珠5mg)至离心管内，用磁力架将磁珠沉淀(以下简称磁力沉淀，其具体操作步骤是，将离心管放于磁力架上，待上层液体变澄清后弃掉上清，保留底部的磁珠，移开磁力架)；

2.加入1mL磁珠偶联缓冲液，重悬磁珠后，磁力沉淀；

3.先后加入75.7μL磁珠偶联缓冲液和74.3μL实施例2中制备的纯化空肠弯曲菌特异性抗体(含抗体100μg)混匀，再加入100μL处理液并混匀，置37℃摇床上孵育18h后，磁力沉淀；

4.加入1mL封闭液重悬磁珠，37℃摇床上孵育1小时后，磁力沉淀；

5.加入1mL储备液，涡旋振荡5-10s后，磁力沉淀；重复该操作一次；加入240μL储备液混匀(溶液总体积250μL)，于4℃冰箱保存。

磁珠偶联缓冲液：1mol/L的硼酸盐缓冲液，其pH为7.4；

处理液组成是：3mol/L的硫酸铵/1mol/L的硼酸盐缓冲液；

封闭液组成是：0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mLPBS中，其pH为7.4；

储备液组成是：0.1g BSA溶于100mL PBS中，其pH为7.4；

PBS：Na₂HPO₄ 2.9g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L，其pH为7.4；

实施例4

利用实施例3制备的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠富集检测空肠弯曲菌的具体步骤如下：

1.样品的预增菌依据GB/T 4789.9进行，样品加入预增菌培养液后，在微需氧条件(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)下，以100rpm的振荡速度，36±1℃培养4h。必要时测定增菌液的pH值并调整至7.2±0.2。42±1℃继续培养24h-48h；也可用等效的方法进行预增菌；

2.取所述预增菌液20-30mL，加入实施例3制备的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠50μL，37℃孵育1h；

3.将其放于磁力架上，3min后弃去上清，加入30mL PBS缓慢重悬，磁力架吸下免疫磁珠后，弃去上清，如此重复洗涤3次；

4.吸附后的免疫磁珠直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA用PCR或荧光PCR进行检测。为避免免疫磁珠上抗体影响菌落的生长状态，可以向吸附后的免疫磁珠中加入1mL 50mmol/L甘氨酸溶液(pH2.0)，间断振荡洗脱1h；将离心管放于磁力架上，待磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA后用PCR或荧光PCR进行检测。

实施例5

分别制备实施例2中11种非空肠弯曲菌菌液各25mL(菌液浓度为10⁵/mL)，添加空肠弯曲菌约10²个，按照实施例4中的操作步骤进行。吸附后的免疫磁珠或洗脱下的菌液直接铺显色平板后培养，可观察到大量目标菌落，荧光PCR鉴定均为空肠弯曲菌。同时将吸附后的免疫磁珠或洗脱下的菌液提取DNA，用荧光PCR鉴定，结果均阳性。

用从市场采集样品中随机抽取生鲜鸡肉、冻鸡、环境污水样品各40份。分别按照GB/T4789.9-2008和以上免疫磁珠富集法进行检测。发现用GB/T 4789.9-2008方法的检出率依次为23.75％、11.25％、6.25％，以上免疫磁珠富集法的检出率依次为27.50％，15.00％，7.50％，表明免疫磁珠富集法的检出率相比常规方法明显提高。

Claims

1.空肠弯曲菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，其特征在于编码所述人工多肽的核苷酸序列为SEQ ID No.2、氨基酸序列为SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述的空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体。

3.由权利要求2所述的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠。

4.一种富集空肠弯曲菌的试剂盒，其特征在于含有权利要求3所述的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠。

5.一种利用权利要求3所述的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠富集检测空肠弯曲菌的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)依据GB/T 4789.9进行样品的预增菌：将样品加入预增菌培养液后，在5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气的条件下，以100rpm的振荡速度，36±1℃培养4h；必要时测定增菌液的pH值并调整至7.2±0.2，42±1℃继续培养24h-48h；亦或者用等效的方法进行预增菌；

(2)取步骤(1)得到的预增菌液20-30mL，加入权利要求3所述的空肠弯曲菌特异性抗体包被的免疫磁珠50μL，37℃孵育1h；

(4)吸附后的免疫磁珠直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取吸附后的免疫磁珠上的DNA用PCR或荧光PCR进行检测；或者向吸附后的免疫磁珠中加入1mL 50mmol/L甘氨酸溶液，间断振荡洗脱1h，将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA后用PCR或荧光PCR进行检测。