CN101235085B - 抗西尼罗病毒膜蛋白e的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种抗西尼罗病毒的单克隆抗体及其应用。本发明的抗西尼罗病毒的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.2262的鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3分泌的。本发明抗西尼罗病毒的单克隆抗体的抗原决定簇是西尼罗病毒囊膜上的膜蛋白E的第三结构域。本发明单克隆抗体经间接酶联免疫法筛选，并用免疫印迹分析、流式细胞仪检测、表面等离子共振分析、间接免疫荧光等方法全面鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性，抗体经生物素标记后，建立了抗原捕获间接酶联免疫检测体系。本发明的抗西尼罗病毒的单克隆抗体可应用于西尼罗病毒抗原的多种检测方法中，也可应用于制备西尼罗病毒检测试剂盒。

Description

抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体及其应用。

背景技术

西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)感染可引起西尼罗热、西尼罗病毒性脑炎和脑膜炎，是一种人畜共患、自然疫源性、急性传染病。自1999年WNV在美国纽约爆发以来，该病毒已经迅速传播到世界多个国家和地区，成为严重威胁人类健康的病毒性疾病，引起了全球公共卫生界的关注。WNV可以感染多种蚊虫和鸟类，并通过蚊虫和鸟类的交替感染将病毒沿着鸟类迁徙的路径进行传播；蚊虫还可以通过叮咬被WNV感染的鸟类将WNV传染给多种哺乳动物，如人类、马、狗、猫和家禽如鸡、鹅等；该病毒还可以通过输血、器官移植、哺乳及胎盘垂直传播。截至目前全球已有两万多人感染WNV，发病率在20％以上，与以前的WNV感染相比，重症病例明显增加，死亡率上升为5-15％。

目前对WNV感染的治疗还没有特效药物，早期发现是控制WNV传播的主要措施。WNV已经在世界多个国家和地区发生多次的反复流行，虽然我国目前还没有WNV感染的报道，根据美国CDC发布的WNV在全球的地理分布图显示，我国西部的部分地区已经受到WNV入侵的威胁；而且，与我国毗邻的俄罗斯在1999年就爆发过WNV。由于WNV可以通过迁徙的鸟类进行远距离传播，同时也可能通过牲畜的进口贸易进入我国，且我国存在WNV流行的自然和社会因素，因此我国需尽快发展有效的WNV检测试剂和检测方法，及时建立WNV监测体系，防止WNV的传入和流行。

西尼罗病毒是虫媒病毒之一，属于黄病毒科黄病毒属，与日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)和登革热病毒(Dengue Virus，DEV)等属于同一个复合组，其病毒粒子表面有两个膜蛋白：M蛋白和E蛋白。其中E蛋白是主要的膜蛋白，与病毒和受体细胞的识别、结合和病毒的毒力有关。晶体结构分析表明E蛋白包含三个结构域：即结构域I、II和III，其中结构域III(EDIII)被认为是诱导病毒特异性抗体和中和抗体的主要抗原表位。由于黄病毒属成员的E蛋白上存在很多共同的抗原表位，所以在进行血清学检测时常常出现交叉反应，其抗体的中和活性也有一定的交叉性，使得血清检测反应的特异性大大降低；而JEV在我国多个地区发生过流行，因此，黄病毒属病毒感染的血清学检测具有很大的局限性，只能作为初筛的检测指标之一。

WNV抗原的检测可以通过细胞培养分离技术和噬斑滴定、传统的RT-PCR、实时荧光RT-PCR和免疫组织化学等方法进行。其中RT-PCR和实时荧光RT-PCR可以快速检测病毒抗原，但该方法成本昂贵，容易出现由于样品污染而呈假阳性结果；通过细胞培养技术分离病毒和检测样品中的病毒噬斑也可以检测病毒抗原，但该方法检测周期长，且需要专业的技术人员以及BSL-3生物安全试验室，因而在大范围检测中难以普及；而利用抗原捕获ELISA、间接免疫荧光、免疫组化等方法可以快速、灵敏地检测WNV抗原，适于在大规模的监测系统中应用。

抗原捕获ELISA、间接免疫荧光、免疫组化等检测方法的应用依赖于针对WNV抗原特异性的单克隆抗体的研制。国外学者利用灭活的WNV、DNA疫苗和WNV E蛋白的胞外区作为抗原免疫小鼠制备的单克隆抗体中，部分单抗与黄病毒科的其它成员有不同程度的交叉反应，但没有用复性的EDIII作为抗原制备单克隆抗体的报道。面对WNV可能入侵我国并进行传播的威胁，需要及时建立有效的WNV检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体。

本发明所提供的抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体是WNV-2F5′或WNV-4B3′。其中，WNV-2F5′是由保藏号为CGMCC No.2261的鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5分泌的，WNV-4B3′是由保藏号为CGMCC No.2262的鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3分泌的。

鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5已于2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2261。鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3已于2007年11月26日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2262。以上两种鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5和WNV-4B3也属于本发明的保护范围。

所述抗西尼罗病毒的单克隆抗体与抗原发生特异性结合的抗原决定簇位于西尼罗病毒膜蛋白E的第三结构域。

所述单克隆抗体通过间接酶联免疫反应、免疫印迹法、流式细胞仪检测技术、表面等离子共振、间接免疫荧光法对抗体和抗原反应的特异性和亲和力进行鉴定，结果表明：在间接酶联免疫反应中，0.002μg/ml的本发明的单克隆抗体WNV-2F5′或WNV-4B3′即能与抗原发生特异性的结合反应；WNV-2F5′和WNV-4B3′与重组WNVEDIII蛋白的亲和力常数分别为1.77+0.3nM和407+96nM；WNV-2F5′和WNV-4B3′与WNV感染细胞呈现强阳性荧光，其效价分别为5120和7680，二者与JEV感染的细胞均无交叉反应；抗原捕获酶联免疫检测法中，最低可以检测到10ng的重组EDIII蛋白和2.8 TCID₅₀/0.1ml的WNV病毒。

本发明所提供的抗西尼罗病毒的单克隆抗体可以应用于西尼罗病毒抗原的检测。在实际应用中，可在以下方法中使用本发明所提供的抗西尼罗病毒的单克隆抗体进行检测：间接免疫荧光检测法、抗原捕获酶联免疫检测法、免疫组织化学检测法或试纸条检测法。

其中，所述试纸条检测法即包括胶体金检测法或酶标检测法，还包括本领域技术人员所熟知的其它抗体标记检测法。

所述抗原捕获酶联免疫检测法中，可以WNV-2F5′为包被抗原，以WNV-4B3′为检测抗体检测待测样品。

本发明所提供的抗西尼罗病毒的单克隆抗体还可应用于制备西尼罗病毒检测试剂盒。含有所述抗西尼罗病毒的单克隆抗体的试剂盒也属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为WNV-2F5′与变性抗原的免疫印迹反应

图2为用流式细胞仪检测WNV-2F5′和WNV-4B3′与非变性抗原蛋白的结合能力

图3为纯化的WNV-4B3′与固定在CM5芯片上的重组EDIII蛋白的结合动力学曲线

图4为纯化的WNV-2F5′与固定在CM5芯片上的重组EDIII蛋白的结合动力学曲线

图5为用间接免疫荧光反应检测WNV-2F5′和WNV-4B3′与感染BHK21细胞的西尼罗病毒抗原的结合

图6为抗原捕获ELISA检测细胞培养上清中WNV的敏感性测定

图7为抗原捕获ELISA检测重组蛋白EDIII抗原的敏感性测定

具体实施方式

以下实施例中所涉及的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明中涉及西尼罗病毒活病毒的操作均在中国军事医学科学院微生物流行病研究所的BSL-3实验室完成。

实施例1、单克隆抗体WNV-2F5′或WNV-4B3′的获得

能分泌单克隆抗体WNV-2F5′或WNV-4B3′的鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5或WNV-4B3是发明人按照以下方法制备的：1)利用大肠杆菌表达系统体外表达西尼罗病毒膜蛋白E的第三结构域蛋白，经纯化获得重组的EDIII蛋白，该重组蛋白经重折叠后使蛋白复性；2)用该重组蛋白为抗原免疫小鼠，制备融合的杂交瘤细胞，经有限稀释法获得能分泌抗西尼罗病毒的单克隆抗体的细胞。

具体的实验方法和实验结果如下：

一、WNV膜蛋白EDIII的重组表达和复性

1、原核表达载体pET-EDIII的构建

为了在大肠杆菌表达系统中表达WNV EDIII重组蛋白，人工合成了编码EDIH蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表中序列1。用Nde I和Xho I(TaKaRa Inc.)双酶切合成的核苷酸片段，酶切体系如下：PCR产物15.0μl，10×H buffer 4μl，灭菌水17μl，NdeI和XhoI酶各2μl。37℃酶切8h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段后，与经同样酶切的载体pET-21a(+)(Novagen公司产品)大片段连接，连接体系为：PCR产物10μl，pET-21a(+)载体大片段6μl，10×连接酶缓冲液2μl，T4 DNA连接酶2μl。16℃连接12h后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将上述大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，培养12小时后挑取单克隆，提取质粒酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的含有5.4kb的载体片段和0.5kb的WNVEDIII的编码基因片段的重组质粒命名为pET-EDIII。对pET-EDIII进行测序鉴定，结果表明在重组质粒pET-EDIII的NdeI和Xho I酶切位点间插入片段的核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第11-418位核苷酸。该序列编码WNV EDIII蛋白。

2、重组WNV EDIII蛋白的表达和纯化

将质粒pET-EDIII转化入原核表达宿主菌BL21(DE3)中，37℃诱导表达后，重组蛋白以包涵体的形式表达。菌液在4℃条件下5000rpm/min离心10min后收集菌体，用20倍体积的PBS溶液重悬菌体，再次离心，离心条件同上；再用10倍体积的PBS溶液重悬菌体，经100次超声破碎菌体(超声4s，间隔10s)，然后于4℃15000rpm/min离心15min，收集沉淀即得到以包涵体形式表达的重组蛋白。将得到的重组蛋白用洗涤缓冲液(0.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl pH 8.0，100mMNaCl，0.1％叠氮化钠，10mM EDTA，2mM二硫苏糖醇(DTT))洗涤沉淀，再用重悬缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，2mM DTT)洗涤一次，然后将沉淀溶于盐酸胍缓冲液中(6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，10mMEDTA，10mM DTT)。SDS-PAGE检测重组WNV EDIII蛋白的纯度在95％以上。

蛋白复性条件如下：将20mg重组蛋白溶解于300ml复性液中(200mM Tris-HClpH 8.0，1M L-精氨酸，10mM EDTA，0.1mm苯甲磺酰氟化物(PMSF)，5mm还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽)，4℃搅拌复性，每24小时添加一次重组蛋白，每次20mg，共添加三次。复性后的重组蛋白经浓缩后用分子筛上样缓冲液(50mM Tris-HClpH 8.0，150mM NaCl)透析，用Superdex 75 HR分子筛层析柱(Amersham)纯化目的蛋白并浓缩。纯化后的目的蛋白经质谱鉴定，分子量为12488.0kDa，与WNV EDIII蛋白的理论计算值(12488.6 kDa)相符。

二、WNV EDIII单克隆抗体的制备和纯化

取Balb/c小鼠6只，将50μl实施例1纯化的重组WNV EDIII蛋白(100μg重组WNV EDIII蛋白溶解于50μl无菌的PBS溶液中)与等体积的弗式完全佐剂(Sigma-Aldrich公司，目录号为F5881)均匀混合后，皮下多点注射免疫小鼠。2周后加强免疫一次，三天后取血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的体积比进行融合，通过HAT筛选培养基选择培养，用有限稀释法获得杂交瘤细胞，用实施例1纯化的重组WNV EDIII为包被抗原，经间接ELISA检测，获得2株高效分泌WNV EDIII抗体的单克隆细胞株，分别命名为鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5或鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3，其ELISA效价大于10⁷。取杂交瘤细胞按照(1-5)×10⁶个/小鼠的量注入小鼠腹腔制备腹水单抗，经高速离心去除脂肪，用等体积1M Tris-HCl(pH 8.0)稀释后，Protein G亲和层析柱(Pharmacia Inc.)纯化抗体，鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5分泌的抗体命名为WNV-2F5′，鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3分泌的抗体命名为WNV-4B3′。

鼠源杂交瘤细胞株WNV-2F5已于2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2261。鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3已于2007年11月26日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2262。

用SBA Clonotyping System/AP kit(Southern Biotechnology Associates，Inc.)试剂盒进行抗体亚型分析表明：WNV-2F5和WNV-4B3的重链均为IgG1，轻链都为κ亚型。

实施例2、间接酶联免疫反应检测纯化抗体与包被抗原EDIII的结合

用实施例1纯化的重组WNV EDIII蛋白(将1μg的重组EDIII蛋白溶于5ml pH9.6的碳酸盐缓冲液中)包被酶标板，20ng/孔，4℃过夜，用相同浓度的牛血清白蛋白(BSA)包被，为阴性对照。用含3％BSA的PBS溶液于37℃封闭1小时，用PBST溶液(含0.05％(体积百分含量)Tween 20的PBS)洗涤4次，分别加入梯度稀释的、浓度为0.002-200μg/ml的纯化抗体，100μl/孔，37℃孵育1小时。用PBST洗涤4次后，加入HRP标记的抗鼠的二抗(1∶2000稀释，Santa Cruz，Inc.)，100μl/孔，37℃孵育40分钟。用PBST洗涤4次后，加入TMB(四甲基联苯胺)和过氧化氢的混合物(1∶1体积比混合)进行显色，37℃孵育15分钟，然后加入0.1MH₂SO₄，终止反应。最后用酶标仪检测OD_450nm处的光吸收值，以OD_590nm的光吸收值为参考值，以消除背景造成的光吸收。实验组的OD_450nm/对照组的OD_450nm＞2.1的孔判别为阳性。

实验结果见表1，每个浓度设三次重复，表中数据为三次重复的平均值。结果表明，0.002μg/ml的WNV-4B3′或WNV-2F5′与包被的EDIII仍能发生特异性的结合反应，其光吸收值大于对照的2.1倍，说明上述两种单抗与抗原的结合力很强。

表1纯化抗体WNV-4B3′或WNV-2F5′在间接ELISA反应中的光吸收值

注：^a酶标板上包被的抗原。

实施例3、免疫印迹法检测抗体与变性抗原的特异性反应

1、构建WNV的E蛋白表达载体pcDNA-WNV E

为了在真核细胞中表达WNV E重组蛋白，设计和合成如下引物：P1：GGGGTACCACCATGTTCAACTGCCTTGG(序列2)，P2：CCGCTCGAGCGCATGCACGTTCAC(序列3)。

利用-80℃保存的WNV病毒(Bird 5810株，军事医学科学院微生物流行病研究所，参考文献为Davis CT，Li L，May FJ，Bueno R Jr，Dennett JA，Bala AA，GuzmanH，Quiroga-Elizondo D，Tesh RB，Barrett AD.Genetic stasis of dominant West Nilevirus genotype，Houston，Texas.Emerg Infect Dis.2007，13(4)：601-4.)，通过提取病毒RNA(QIAmp Viral RNA Mini Kit，CAT.No.52904)，再逆转录(TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0，Code No.DRRO19A)获得病毒cDNA，采用如下PCR体系(25μl)扩增WNV E的编码基因片段：10×PCR Buffer 2.5μl；灭菌水14.5μl；10mM dNTPs2μl；TaKaRa pfu Taq酶1μl；10μM的引物P1和P2各1μl；病毒cDNA模板3μl。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸3min，共30个循环；最后72℃延伸10min。将目的片段切胶纯化后，用Kpn I和Xho I(TaKaRa Inc.)双酶切纯化后的目的片段，酶切体系如下：PCR产物15.0μl，10×L buffer 4μl，灭菌水17μl，Kpn I和Xho I酶各2μl。37℃酶切8h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段后，与用同样酶切的载体pcDNA4.1(Novagen公司产品)大片段连接，连接体系为：PCR产物10μl，pcDNA4.1载体大片段6μl，10×连接酶缓冲液2μl，T4 DNA连接酶2μl。16℃连接12h后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将上述大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，培养12小时后挑取单克隆，提取质粒酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的含有5.1kb的载体片段和1.5kb的WNV E的编码基因片段的重组质粒命名为pcDNA-WNV E。对pcDNA-WNV E进行测序鉴定，结果表明在重组质粒pcDNA-WNV E的Kpn I和Xho I酶切位点间插入片段的核苷酸序列为GenBank Accession Number：EF205436的自5′末端第502-2004位脱氧核糖核苷酸序列。

2、构建JEV的E蛋白表达载体pcDNA-JEV E

为了在真核细胞中表达JEV E重组蛋白，设计和合成如下引物：P3：GGGGTACCACCATGGGATTTAATTG(序列4)，P4：CCTCTCGAGGGAGCCGAAGTCCCAGG(序列5)。

利用-80℃保存的JEV病毒(Beijing-1株，军事医学科学院微生物流行病研究所，参考文献为Hashimoto H，Nomoto A，Watanabe K，Mori T，Takezawa T，Aizawa C，Takegami T，Hiramatsu K.Molecular cloning and complete nucleotide sequence of thegenome of Japanese encephalitis virus Beijing-1 strain.Virus Genes.1988，1(3)：305-17.)，通过提取病毒RNA(QIAmp Viral RNA Mini Kit，CAT.No.52904)、再逆转录(TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，Code No.DRRO19A)获得病毒cDNA，采用如下PCR体系(25μl)扩增JEV E的编码基因片段：10×PCR Buffer2.5μl；灭菌水14.5μl；10mM dNTPs 2μl；TaKaRa pfu Taq酶1μl；10μM的引物P3和P4各1μl；病毒eDNA模板3μl。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3min，共30个循环；最后72℃延伸10min。将目的片段切胶纯化后，用Kpn I和Xho I(TaKaRa Inc.)双酶切纯化后的目的片段，酶切体系如下：PCR产物15.0μl，10×L buffer 4μl，灭菌水17μl，KpnI和XhoI酶各2μl。37℃酶切8h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段后，与用同样酶切的载体pcDNA4.1(Novagen公司产品)大片段连接，连接体系为：PCR产物10μl，pcDNA4.1载体大片段6μl，10×连接酶缓冲液2μl，T4 DNA连接酶2μl。16℃连接12h后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将上述大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，培养12小时后挑取单克隆，提取质粒酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的含有5.1kb的载体片段和1.5kb的JEV E的编码基因片段的重组质粒命名为pcDNA-JEV E。对pcDNA-JEV E进行测序鉴定，结果表明在重组质粒pcDNA-JEV E的Kpn I和Xho I酶切位点间插入片段的核苷酸序列为GenBank Accession Number：L48961序列的自5′末端第978-2477位脱氧核糖核苷酸序列。

3、免疫印迹法检测抗体与变性抗原的特异性反应

分别将pcDNA-WNV E和pcDNA-JEV E用脂质体转染法转染293T细胞，使WNV E蛋白和JEV E蛋白分别表达在293T细胞膜上，裂解细胞后用浓度为10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离WNV E蛋白(55kDa)和JEV E蛋白(55kDa)；用灭活的WNV(Bird5810株，军事医学科学院微生物流行病学研究所)和灭活的JEV(Beijing-1株，军事医学科学院微生物流行病学研究所)作为对照，用浓度为10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离病毒蛋白。

用电转法将凝胶上的蛋白分别转移到硝酸纤维素膜上，用含有5％脱脂奶粉的TBS溶液室温封闭1小时，然后分别加入纯化的WNV-2F5′和WNV-4B3′单抗各10ml(纯化的WNV-2F5′和WNV-4B3′单抗分别稀释于TBS中，使其终浓度为1μg/ml)，或加入10ml抗His的抗体(1∶5000)(Medical and Biological laboratories Co.，LTD.Code No.PM032)作为JEV E蛋白检测的阳性对照，室温孵育2小时以上，用TBST(含0.05％Tween 20的TBS)洗涤3次，每次5分钟。加入羊抗鼠的二抗(1∶5000稀释于TBS中，Santa Cruz，Inc.)，室温孵育1小时，再洗涤3次。加入发光检测底物混合液SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate solution(PierceBiotechnology，Inc.)检测目的蛋白。具体检测结果如图1所示。其中1为未转染的293T细胞作为阴性对照；2为表达WNV E蛋白的293T细胞；3为表达JEV E蛋白的293T细胞；4为灭活的WNV总蛋白；5为灭活的JEV总蛋白；6为未感染病毒的BHK21细胞培养上清作为阴性对照；7为表达JEV E蛋白的293T细胞，作为JEV E蛋白表达的阳性对照；8为未转染的293T细胞作为阴性对照；M为25-175 kDa的蛋白质分子量标准。1-6用WNV-2F5′抗体检测，7-8用抗His抗体检测。

结果表明，WNV-2F5′可以与表达在293T细胞膜上的WNV E蛋白以及灭活的WNV蛋白发生特异性结合，而与表达在293T细胞膜上的JEV E蛋白以及灭活的JEV蛋白不发生交叉结合反应，JEV E蛋白的表达用His抗体证实，因此，WNV-2F5′可以特异地识别WNV变性抗原。同样的实验证明WNV-4B3′可以与表达在293T细胞膜上的WNV E蛋白以及灭活的WNV蛋白发生特异性结合，而与表达在293T细胞膜上的JEV E蛋白以及灭活的JEV蛋白不发生交叉结合反应，因此，WNV-4B3′可以特异地识别WNV变性抗原。

实施例4、流式细胞仪检测抗体与非变性抗原结合的能力

将pcDNA-WNV E表达载体(具体构建方法同实施例4)用脂质体转染法转染293T细胞，使WNV E蛋白表达在293T细胞膜上。消化细胞并随机分为四组，重悬于PBS溶液中后分别加入正常小鼠的血清、抗Myc的单克隆抗体(Santa Cruz，Inc.)、WNV-2F5′和WNV-4B3′，使其终浓度为10μg/ml，4℃孵育1小时，用PBS溶液洗涤3次，加入FITC标记的抗鼠的二抗(1∶1000稀释，Santa Cruz，Inc.)，4℃孵育1小时，用PBS溶液洗涤3次，用流式细胞仪检测带有荧光的细胞所占的比例，实验设三次重复，每次收集3×10⁴个细胞。具体的检测结果如图2所示。其中，横坐标为细胞的荧光强度，纵坐标为细胞数。图2中，A、B和C中阴影部分的图谱表示表达WNV E蛋白的细胞经正常小鼠的血清染色后的图谱，为阴性对照。A的白色图谱表示用抗Myc的单克隆抗体染色的细胞，与阴性对照相同，没有荧光细胞；B的白色图谱表示用WNV-4B3′染色的细胞，荧光阳性细胞所占比例为23％；C的白色图谱表示用WNV-2F5染色的细胞，荧光阳性细胞所占比例为70％。

结果表明，正常小鼠的血清、抗Myc的单克隆抗体与细胞孵育后没有检测到荧光细胞，而与WNV-2F5′和WNV-4B3′孵育的细胞中荧光细胞所占的比率分别为69.6+8.9％和21.6+5.7％(三次实验的平均值+标准差)。上述结果说明WNV-2F5′和WNV-4B3′可以特异地识别非变性的WNV E蛋白。

实施例5、用表面等离子共振检测抗体与抗原结合的亲和力

表面等离子共振分析是用Biacore3000(Biacore Inc.)进行的。具体步骤如下：

首先将实施例1纯化的WNV EDIII蛋白固定在CM5芯片(Biacore Inc.)上，然后将浓度梯度为0.4-400nM的纯化抗体(240μl)WNV-4B3′和WNV-2F5′分别注入芯片，分析在恒温25℃进行，使用的缓冲液是HBS-EP缓冲液(10mM HEPES[pH 7.4]，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％surfactant P20)，流速为30μl/min。抗体结合时间为8分钟，解离时间为10分钟。芯片表面的再生使用的是50mM NaOH，结合曲线如图3和图4所示。图3为纯化的WNV-4B3′与固定在CM5芯片上的重组WNV EDIII蛋白的结合动力学曲线，图中8条曲线的抗体浓度由上到下分别为400、200、100、50、25、10、0.4、0nM，不同浓度的曲线组成图示的动力学曲线。图4为纯化的WNV-2F5′与固定在CM5芯片上的重组WNV EDIII蛋白的结合动力学曲线。图中7条曲线的抗体浓度由上到下分别为400、200、100、50、25、10、0.4nM。其分析过程同图3。图3和图4中的横坐标是解离时间，单位是秒；纵坐标是芯片表面的结合响应强度，单位是RU(即Response unit)。

结合动力学常数的计算是利用BIAevaluation software version 3.2(Biacore，Inc.)软件进行的。亲和力常数K_D＝k_off/k_on，，为三次实验的平均值。结果表明，WNV-2F5′和WNV-4B3′与重组WNV EDIII蛋白的亲和力常数分别为1.77+0.3nM和407+96nM(平均值+标准误差)。

实施例6、间接免疫荧光法检测抗体与被感染细胞中的病毒抗原的结合能力

将BHK21细胞培养于铺有飞片的12孔板中，使细胞附着在飞片上，24小时后用WNV(Bird 5810株，军事医学科学院微生物流行病学研究所，参考文献同上)和JEV(Beijing-1株，军事医学科学院微生物流行病学研究所，参考文献同上)分别感染上述BHK21细胞。感染3天后取出飞片，分别加入经10倍稀释后再2倍梯度稀释的WNV-2F5′和WNV-4B3′腹水单抗，室温孵育2小时，用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次，加入FITC标记的抗鼠的二抗(1∶1000稀释)，室温孵育1小时后再用PBST洗涤3次，用伊文思蓝染色后，用荧光显微镜在200倍放大倍数下观察，以未感染病毒的细胞作为阴性对照。呈现阳性荧光反应的最大稀释倍数为抗体的效价。结果如图5所示。图5中，左图为WNV-2F5′和JEV感染细胞的结合情况；中间的图为WNV-2F5′和WNV感染细胞的结合情况，右图为WNV-4B3′和WNV感染细胞的结合情况。结果表明，WNV-2F5′和WNV-4B3′与WNV感染细胞呈现强阳性荧光，其效价分别为5120和7680，二者与JEV感染的细胞均无交叉反应。

实施例7、抗原捕获ELISA体系的建立及其检测抗原的灵敏度

经过反复实验，建立的高灵敏度抗原捕获ELISA体系如下：

1)将实施例1纯化的WNV-2F5′单抗用50mM的碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释为10μg/ml，加入到酶标板中，每孔100μl(即1μg/孔)，4℃包被过夜，作为捕获抗体；

2)弃掉包被液，加入含有5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20)封闭液，300μ1/孔，37℃封闭4小时；

3)用PBST洗涤3次，每次5分钟；

4)将实施例1纯化的重组EDIII蛋白用含1％脱脂奶粉的PBST稀释成0.8、0.2、0.1、0.05、0.025μg/ml的稀释液，用含1％脱脂奶粉的PBST作为阴性对照；用含1％脱脂奶粉的PBST将WNV(Bird 5810株)病毒(军事医学科学院微生物流行病学研究所保存)培养上清(其效价为2.81×10³TCID₅₀/ml)分别进行10、20、40、80、100、160倍稀释，以100μl/孔的量分别加入到上述包被有WNV-2F5′的酶标板中，每个梯度设3个复孔，37℃孵育3小时后用PBST洗涤4次；

5)将实施例1纯化的单抗WNV-4B3′用长臂活化生物素(中杉金桥生物技术有限公司)标记后，用含1％脱脂奶粉的PBST稀释为20μg/ml，以100μl/孔(即2μg/孔)的量加入到步骤4)的酶标板中，37℃孵育1小时后用PBST洗涤4次；

6)将HRP标记的链霉亲和素(中杉金桥生物技术有限公司)用含1％脱脂奶粉的PBST稀释(1∶2000)，以100μl/孔的量加入到步骤5)的酶标板中，37℃呼育30分钟后用PBST洗涤4次；

7)将H₂O₂和TMB等体积混合后，以100μl/孔的量加入到步骤6)的酶标板中，37℃孵育15分钟后加入0.1M H₂SO₄(100μl/孔)终止反应，然后在酶标仪上检测450nm处的光吸收值，用595nm处的光吸收值为参考波长以消除背景吸收值，分别用未感染病毒的细胞培养上清液和含1％脱脂奶粉的PBST作为阴性对照。

检测结果如图6和图7所示。实验组的OD_450nm/对照组的OD_450nm＞2.1的孔判别为阳性。结果表明，该体系最低可以检测到2.8 TCID₅₀/0.1ml的WNV病毒和10ng/0.1ml的重组EDIII蛋白。上述结果说明该抗原捕获ELISA体系可以灵敏地检测WNV抗原。

序列表

<160>5

<210>1

<211>427

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggaattccat atgcagttga agggaacaac ctatggcgtc tgttcaaagg ctttcaagtt     60

tcttgggact cccgcagaca caggtcacgg cactgtggtg ttggaattgc agtacactgg    120

cacggatgga ccttgcaaag ttcctatctc gtcagtggct tcattgaacg acctaacgcc    180

agtgggcaga ttggtcactg tcaacccttt tgtttcagtg gccacggcca acgctaaggt    240

cctgattgaa ttggaaccac cctttggaga ctcatacata gtggtgggca gaggagaaca    300

acagatcaat caccattggc acaagtctgg aagcagcatt ggcaaagcct ttacaaccac    360

cctcaaagga gcgcagagac tagccgctct aggagacaca gcttgggact ttggatcact    420

cgagcgg                                                              427

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggggtaccac catgttcaac tgccttgg                                        28

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccgctcgagc gcatgcacgt tcac     24

<210>4

<21>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggggtaccac catgggattt aattg    25

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cctctcgagg gagccgaagt cccagg    26

Claims (4)

1.一种抗西尼罗病毒膜蛋白E的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.2262的鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3所分泌的。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备西尼罗病毒检测试剂盒中的应用。

3.含有权利要求1所述的单克隆抗体的检测西尼罗病毒的试剂盒。

4.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CGMCC No.2262的鼠源杂交瘤细胞株WNV-4B3。

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