CN102317449B - 包括经修饰的e2蛋白质的重组猪瘟病毒（csfv）和用于生成所述重组csfv 的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组猪瘟病毒(CSFV)。优选的重组CSFV包含位于E2蛋白质内“TAVSPTTLR”结构域中的至少一个氨基酸的缺失。本发明进一步涉及包含所述重组CSFV的疫苗、用于生成重组CSFV的方法和重组CSFV的用途。

Description

包括经修饰的E2蛋白质的重组猪瘟病毒(CSFV)和用于生成所述重组CSFV 的方法

本发明涉及动物疾病。更具体而言，本发明涉及包括经修饰的E2蛋白质的重组猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)。本发明进一步涉及包括所述重组CSFV的疫苗，其可以区分受感染动物与接种疫苗的动物，本发明还涉及用于生成所述重组CSFV的方法。 

猪瘟病毒(CSFV)是有包膜的正链RNA病毒，其连同牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和边缘病病毒(BDV)，构成黄病毒科的瘟病毒属(Pringle，1998.Arch Virol 143：203-10)。CSFV在家养猪群中的引入可以导致巨大的经济损失(Terpstra和de Smit.2000.Vet Microbiol 77：3-15)。用通过在兔和细胞培养物中的反复传代减毒的CSFV病毒(所谓的“中国”或“C”株)进行疫苗接种，导致针对强毒CSFV的快速和漫长的免疫力。C株病毒在全世界成功使用，并且通常被称为已生产的最有效的兽医学疫苗。然而，这种疫苗无法进行受感染和接种疫苗动物之间的血清学区分(DIVA)。这是一个较大缺点，因为无法检测出接种疫苗群体中的CSF受感染动物可以造成严重的贸易限制。 

本领域中CSF的诊断可以通过ELISAs执行，所述ELISAs检测针对结构糖蛋白E^rns或E2的抗体。现已开发了当结合合适的ELISA时可以满足DIVA标准的几种候选疫苗，从亚单位疫苗(Hulst等人，1993.J Virol 67：5435-42)到活减毒病毒(van Gennip等人，2000.Vaccine 19：447-59；van Zijl等人，1991.J Virol 65：2761-2765)和基于复制子的疫苗(van Gennip等人，2002.Vaccine 20：1544-56；Widjojoatmodjo等人，2000.J Virol 74：2973-2980)不等。 

针对CSF的商购可得的DIVA疫苗基于杆状病毒产生的E2，这伴随检测针对E^rns的抗体的血清学测试(Van Aarle，2003.Dev Biol  Stand Basel 114：193-200)。尽管这种疫苗提供了针对CSF的保护，但就免疫起始和持续时间而言，它不如C株疫苗有效(van Oirschot，2003.Vet Microbiol 96：367-84)。更重要的是，伴随这种疫苗的E^rnsELISAs也检测瘟病毒属的其他成员(即BVDV和BDV)。因此，在这些病毒散布的地区不推荐它们的使用(2003/265/EC；SANCO/10809/2003)。 

此外，先前发现E^rnsELISAs的灵敏度不足以诊断个体动物，因此应仅在具有足够大的动物数目的兽群基础上使用(Blome等人，2006.Rev Sci Tech 25：1025-38；Floegel-Niesmann，2003.Dev Biol(114：185-91)。这解释了为何一般而言在伴随DIVA疫苗中E2ELISAs极大地优于E^rnsELISAs。 

E2蛋白质包含2个主要抗原结构域，即B/C结构域和A结构域(van Rijn等人，1993.J Gen Virol 74：2053-60；Wensvoort，1989.J Gen Virol 70：2865-76)。定位于CSFV多聚蛋白质的氨基酸766-866之间的结构域A分成亚结构域A1、A2和A3(Wensvoort，1989.J Gen Virol 70：2865-76)。尽管A1结构域是关于中和抗体的占优势靶的事实，但它在进化自始至终是保守的。事实上，它的序列保守性和免疫显性已致使其成为E2ELISAs中的占优势靶。 

尽管CSF的暴发目前受检疫管制和可疑兽群的屠宰加以控制，但迫切需要更人道和更经济的干预策略的实现，以控制未来的CSF暴发。因此，迫切需要结合可靠和CSFV特异性ELISA的DIVA疫苗。 

本发明提供了重组猪瘟病毒(CSFV)，其包括在E2蛋白质的“TAVSPTTLR”结构域中的至少一个氨基酸的缺失，所述结构域对应于亲本CSFV多聚蛋白质的位置829-837。 

多聚蛋白质意指约4000个氨基酸的假定多聚蛋白质，其在病毒RNA翻译后形成。所述多聚蛋白质进行加工，以形成最终的切割产物N^pro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。 

CSFV E2蛋白质包含最近鉴定的表位，其包括氨基酸序列TAVSPTTLR(CSFV多聚蛋白质的残基829-837；使用用于氨基酸的 单字母代码(Lin等人，2000.J Virol 74：11619-25)。这个表位共享A1结构域的所有特有特征，即免疫显性、进化上保守、对于CSFV特异性的和作为中和抗体的靶。在来自瘟病毒不同株的E2蛋白质中在TAVSPTTLR结构域周围的序列比较指出，序列TAVSPTTLR在CSFV株中是强烈保守的，而在BVDV和BDV株中是高度可变的(Lin等人，2000.J Virol 74：11619-25)。 

识别TAVSPTTLR结构域的、在E2特异性ELISAs中使用的抗体(特别是单克隆抗体)与瘟病毒属的其他成员不交叉反应，并且因此可以在这些其他病毒散布的区域中使用。所述抗体将不识别根据本发明的重组CSFV(其在E2蛋白质的所述结构域中含有缺失)。 

因此，所述重组病毒使得能够区分由重组病毒感染的动物与由野生型CSFV感染的动物和未感染和/或未接种疫苗的动物。此外，所述重组病毒的使用将允许使用基于肽的诊断测试来区分这些动物。 

本发明提供了重组猪瘟病毒(CSFV)，其包括在CSFV的“TAVSPTTLR”结构域或其等价物中的至少一个氨基酸的缺失。等价结构域是在E2区内的结构域，其中一个氨基酸被另一个氨基酸(例如属于相同组的氨基酸)置换，即由另一个芳香族氨基酸替换芳香族氨基酸，或由另一个脂肪族氨基酸替换脂肪族氨基酸。 

所述亲本基因组优选包括衍生自CSFV株(优选天然存在或重组减毒的CSFV株)的基本上完全的病毒基因组。术语亲本基因组包括核酸分子，例如RNA分子和/或其cDNA拷贝。 

如说明书中使用的，术语“至少一个氨基酸的缺失”意指至少一个氨基酸的去除。术语“缺失”不涵盖除去至少一个氨基酸，随后在相同位置上插上另外至少一个氨基酸。因此，如本文使用的，术语“缺失”不涵盖氨基酸由另一个氨基酸的置换。 

所述重组cDNA分子优选包括基本上完全的重组猪瘟病毒(CSFV)基因组，由此所述基因组编码这样的E2蛋白质，其在对应于CSFV多聚蛋白质的第829-837位的保守“TAVSPTTLR”结构域中包含至少一个氨基酸的缺失。术语“基本上完全的”意指通过所述基因 组生成的病毒能够感染合适细胞或细胞系，并且可以在所述合适细胞或细胞系中繁殖。“基本上完全的”病毒基因组优选是可复制基因组。更优选的是传染性、可复制和可包装的病毒基因组。进一步优选的是重组猪瘟病毒(CSFV)包括“基本上完全的”病毒基因组，优选可复制基因组，或更优选传染性、可复制和可包装的病毒基因组。 

在一个优选实施方案中，根据本发明的重组CSFV的TAVSPTTLR结构域中至少一个氨基酸的缺失包括所述“TAVSPTTLR”结构域的中心脯氨酸的缺失。

脯氨酸在20种常见氨基酸中是独特的，其具有在主链氮原子上环化的侧链。这限制了所述脯氨酸以及脯氨酸前一个残基的构象。此外，脯氨酸可以充当构象‘开关’，允许蛋白质的部分采取不同构象。因此，在TAVSPTTLR结构域中的中心脯氨酸的改变不仅改变一级结构，还改变免疫原性TAVSPTTLR结构域的构象。包括TAVSPTTLR结构域的中心脯氨酸的缺失的E2蛋白质将不受识别E2蛋白质内的所述结构域的抗体识别。 

在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的重组CSFV的经改变的E2蛋白质包括来自所述TAVSPTTLR结构域的至少2个氨基酸的缺失。2个氨基酸的缺失分别包括来自E2的TAVSPTTLR结构域的TA、AV、VS、SP、PT、TT、TL和LR的缺失。2个氨基酸的最优选缺失是在TAVSPTTLR结构域中第833-834位上的PT缺失。 

在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的重组CSFV的经改变的E2蛋白质包括来自所述TAVSPTTLR结构域的至少3个氨基酸的缺失，例如3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸或9个氨基酸的缺失。进一步优选的E2蛋白质包括氨基酸序列VSP、SPT、AVSP或SPTTL的缺失。 

本发明进一步提供了根据本发明的重组CSFV，其包括亲本CSFV基因组的至少一个进一步改变。与亲本病毒比较，在所述保守TAVSPTPLR结构域中包含缺失的病毒在感染细胞方面效率更低，和/或在受感染细胞中较不有效地复制，导致与亲本病毒比较更低的滴 度。由在保守TAVSPTTLR结构域中包含缺失的病毒感染的细胞的继续传代导致的援救的病毒在细胞中更有效感染和/或复制，其滴度与亲本病毒的滴度相当。经援救的病毒已在亲本基因组中引入一个或多个进一步改变，其补偿在保守TAVSPTTLR结构域中具有缺失的病毒的适合性丧失。 

在一个实施方案中，所述至少一个进一步改变是改变病毒的基因组，但不导致氨基酸改变的沉默突变。所述沉默突变存在于病毒基因组的非编码部分，或病毒基因组的编码部分中，例如在编码N^pro、C、E^rns、E1和/或E2的病毒基因组的部分中，和/或在编码非结构蛋白质的部分中。沉默突变可以在这些病毒的生成过程中的某些点上促进经改变的病毒的适合性恢复。不受理论束缚，沉默突变例如导致病毒基因组改善的稳定性和/或改善的复制，因为所述沉默突变改变病毒基因组核酸的构象。此外，所述沉默突变可以导致改善的密码子使用。优选的沉默突变是E^RNS基因中位置1549上的U至C改变。 

在一个进一步的实施方案中，所述至少一个进一步改变在编码E1蛋白质的区域中，已知其与E2蛋白质装配成二硫键合的异二聚体。因此，E2的保守TAVSPTTLR结构域中的缺失至少部分由E1蛋白质中至少一个氨基酸的改变补偿。在一个进一步的实施方案中，所述至少一个进一步改变在编码N^pro、C、E^rns或E2蛋白质的区域中。所述至少一个进一步改变优选包括在选自编码N^pro、C、E^rns、E1和/或E2的区域之中的不同区域内或在编码N^pro、C、E^rns、E1和/或E2蛋白质的一个区域内的至少2个改变。所述至少2个进一步改变优选包括至少一个沉默突变。优选的沉默突变由在E^RNS基因中在位置1549上的U至C改变提供。 

在一个优选实施方案中，所述至少一个进一步改变导致在E2蛋白质中另外N-连接糖基化位点的引入。在E2蛋白质中在另外位置上的N-连接糖基化位点直接地或借助于其作为用于碳水化合物部分的锚定位点的功能明显补偿由TAVSPTTLR表位中的所述缺失造成的适合性丧失。在一个优选实施方案中，所述N-连接糖基化位点通过氨 基酸位置772-778的LFDGTN结构域的改变，例如在位置774上的D至N改变引入。备选地或另外地，N-连接糖基化位点通过在E2蛋白质中在位置830上的A至N改变引入。 

所述进一步改变优选改变在位置1547-1549上的密码子，其编码E^rns蛋白质内的V392；在位置2273-2275上的密码子，其编码E1蛋白质内的E634；在位置2693-2695上的密码子，其编码E2蛋白质内的D774；和/或在位置2864-2866上的密码子，其编码E2蛋白质内的V831。在所示位置上的所述密码子改变包括沉默突变，或包括所编码氨基酸的改变。优选的至少一个进一步改变包括在位置831上的缬氨酸(V)由甘氨酸(G)的置换。 

在另一个优选实施方案中，亲本基因组的所述至少一个进一步改变导致在位置789上的S至F置换和/或在位置445上的A至T置换。在位置789上的丝氨酸和在位置445上的丙氨酸存在于所有C株病毒和相关兔化CSFV株中，而在位置789上的苯丙氨酸和在位置445上的苏氨酸在强毒CSFV株中是保守的。尽管C株病毒的历史并未得到充分证明，但明确的是该病毒通过在兔中传代数百次而得到减毒，其在位置789上的S和在位置445上的A可能是有利的。在位置789上的S至F改变和在位置445上的A至T改变对于包括在TAVSPTTLR表位中的缺失的病毒繁殖可能是有利的，而它在包括TAVSPTTLR表位的病毒中接近于中性。 

在再一个进一步优选的实施方案中，本发明提供了包括在位置833上的P缺失和沉默改变的重组CSFV。优选的沉默改变是在E^RNS基因中在位置1549上的U至C改变。进一步优选的重组CSFV包括在位置833上的P缺失和在位置789上的S至F改变，和/或在位置445上的A至T改变；在位置833上的P缺失、在位置774上的D至N改变、在位置831上的V至G置换和在位置834上的T缺失，加上或不加上在位置1549上的U至C改变。最优选的重组CSFV包括分别在E2蛋白质的“TAVSPTTLR”结构域的位置833和834上的脯氨酸和苏氨酸缺失、在位置1549上的U至C改变、在位置634上的 谷氨酸(E)由天冬氨酸(D)的置换、在E2蛋白质中在位置774上的天冬氨酸(D)由天冬酰胺(N)的置换、和在位置831上的缬氨酸(V)由甘氨酸(G)的置换。 

在一个进一步的实施方案中，本发明提供了重组猪瘟病毒(CSFV)，其包括在亲本CSFV多聚蛋白质的E2中从位置829到837的“TAVSPTTLR”结构域中的至少一个氨基酸的改变，由此所述改变包括在TAVSPTTLR结构域中的中心脯氨酸至天冬酰胺的置换。发现所述置换使E2特异性单克隆抗体与经改变的E2蛋白质的结合降到最低或甚至抑制所述结合。 

除改变一级氨基酸序列外，所述天冬酰胺的引入导致包括糖基化共有序列[N-x-S/T]的N-连接糖基化位点的引入，其中x指示除P或D外的任何氨基酸(Kornfeld和Kornfeld，1985.Annu Rev Biochem 54：631-64)。病毒蛋白质的N糖基化已牵涉免疫原性，由此N-连接糖基化的引入可以限制针对病毒蛋白质的细胞和抗体应答。所述置换因此可以用于生成能区分由野生型病毒感染的动物与由所述重组病毒感染的动物的重组病毒。 

在一个实施方案中，包括在TAVSPTTLR结构域中的中心脯氨酸至天冬酰胺的置换的重组CSFV，在基因组中包括至少一个进一步改变。优选的至少一个进一步改变导致在N^pro、C、E^rns、E1和/或E2中，和/或在编码非结构蛋白质的部分中的另外N糖基化位点。优选的另外N糖基化存在于E2内，例如E2蛋白质的TAVSPTTLR结构域内或LFDGTNP表位内。 

进一步优选的至少一个进一步改变是存在于病毒基因组的非编码部分中或病毒基因组的编码部分中的沉默突变，例如在编码N^pro、C、E^rns、E1和/或E2的病毒基因组的部分中，或在编码非结构蛋白质的部分中。优选的沉默突变由在E^RNS基因中在位置1549上的U至C改变提供。 

再进一步优选的至少一个进一步改变包括在N^pro、C、E^rns、E1和/或E2中和/或在编码非结构蛋白质的部分中的至少一个氨基酸的改 变。所述至少一个进一步改变优选选自沉默改变，例如在E^RNS基因中在位置1549上的U至C改变、在位置789上的S至F改变、在位置445上的A至T改变、在位置774上的D至N改变、在位置831上的V至G改变和/或在位置834上的T缺失。更加优选所述至少一个进一步改变包括至少2个进一步改变，选自沉默突变、另外的N糖基化位点和/或氨基酸改变，加上在TAVSPTTLR结构域中的中心脯氨酸至天冬酰胺的置换。所述至少2个进一步改变存在于相同蛋白质或选自N^pro、C、E^rns、E1、E2和非结构蛋白质的不同蛋白质中。优选所述至少2个进一步改变存在于相同蛋白质或选自N^pro、C、E^rns、E1和E2的不同蛋白质中。 

在再一个进一步的实施方案中，本发明提供了重组猪瘟病毒(CSFV)，其包括在由亲本CSFV基因组编码的E2中从位置829到837的“TAVSPTTLR”结构域中的至少一个氨基酸的添加。所述插入添加使E2特异性单克隆抗体与该经改变的E2蛋白质的结合降到最低或甚至抑制所述结合。在“TAVSPTTLR”结构域中的至少一个氨基酸的插入与在N^pro、C、E^rns、E1、E2和非结构蛋白质中选自沉默突变、另外的N糖基化位点和/或氨基酸改变的至少一个进一步改变或其组合优选组合。所述至少一个进一步改变优选选自沉默改变，例如在E^RNS基因中在位置1549上的U至C改变、在位置789上的S至F改变、在位置445上的A至T改变、在位置774上的D至N改变和/或在位置831上的V至G改变。 

根据本发明的重组CSFV的亲本基因组优选是减毒CSFV株的基因组。 

减毒CSFV株可以通过下述生成：编码具有RNA酶活性的蛋白质的E^rns基因的突变(Mayer等人，2003.Virus Res.98：105-16)；来自CSFV强毒株的N^pro缺失(Mayer等人2004.Vaccine 22：317-328；组合E^RNS和E2中的突变(van Gen nip等人2004.J.Virol，78：3812-3823)；E1基因的突变(Risatti等人，2005.Virology 343：116-127)：和E2基因的突变(Risatti等人，2007.Virology 364：371-82)。 

优选的减毒CSFV株包括在3′末端非编码区中的插入。例如，在3′非编码区中的12个核苷酸的插入导致CSFV的减毒(Wang等人，2008.Virology 374：390-8)。所述插入优选包括由5′-CUUUUUUCUUUU组成的12个核苷酸的序列。 

最优选的亲本基因组是C(中国)株的基因组。作为亲本基因组更加优选的是Cedipest C株的基因组，这是适合于猪肾细胞系SK6的悬浮培养的C株病毒(Terpstra等人，1990.Dtsch Tierarztl Wochenschr.97：77-9)。由400-600TCID50的Cedipest株接种的猪在疫苗接种后7天和在6个月时用超过100猪LD50的CSFV强毒株的攻击后受到完全保护。因此，本发明还提供了包括重组猪瘟病毒(CSFV)基因组的拷贝的cDNA分子，其编码在E2中从位置829到837的经改变的“TAVSPTTLR”结构域。所述cDNA分子优选包括根据本发明的基本上完全的重组亲本CSFV病毒基因组，由此所述亲本基因组衍生自C(中国)株、或更优选衍生自Cedipest株。优选的cDNA分子包括编码E2蛋白质的重组CSFV基因组的拷贝，所述E2蛋白质包括在“TAVSPTTLR”结构域中的至少一个氨基酸的缺失。本发明还提供了特异性识别所述经改变的“TAVSPTTLR”结构域的抗体，优选单克隆抗体。本发明进一步涉及编码蛋白质的构建体，所述蛋白质包括所述经改变的“TAVSPTTLR”结构域。本发明进一步涉及包括所述经改变的“TAVSPTTLR”结构域的蛋白质、和包括所述经改变的“TAVSPTTLR”结构域的肽，还涉及所述蛋白质或肽在免疫测定法例如ELISA中的用途。 

在一个进一步的方面，本发明提供了包括根据本发明的重组CSFV的活CSF疫苗。 

包括根据本发明的重组CSFV的疫苗或免疫活性组合物组合了由活减毒病毒诱导的保护的快速诱导和长度与区分接种疫苗的动物和由野生型病毒感染的动物的可能性，这种区分是由于E2的保守TAVSPTTLK结构域(这是E2蛋白质的重要的免疫显性表位)中的差异，例如缺失所致。 

已开发了导致循环病毒水平的显著减少和临床病例的伴随减少的几种疫苗。例如，已开发了基于包膜糖蛋白E2的针对CSFV的亚单位疫苗。这种亚单位疫苗允许在针对E^RNS的抗体检测的基础上区分接种疫苗的和受感染的猪(Van Aarle，2003.Dev Biol Stand(Basel)114：193-200)。然而，就免疫力的起始和持续时间而言，该疫苗次于C株疫苗。更重要的是，伴随这种疫苗的E^rnsELISAs也检测瘟病毒属的其他成员(即BVDV和BDV)。因此，在这些病毒散布的地区不推荐它们的使用(2003/265/EC；SANCO/10809/2003)。 

进一步的疫苗由所谓的病毒复制子颗粒(VRP)提供。VRP颗粒包含突变型基因组RNA，其能够复制且表达所编码的病毒蛋白质，但不包含颗粒形成所需的完全信息，这是由于编码病毒结构蛋白质的至少一种基因中的缺失所致。这些病毒颗粒是不可传播的，并且因此满足关于安全疫苗的要求之一。然而，具有E2基因的部分或全部缺失的VRP仅诱导针对用高度强毒CSFV的致命攻击的部分保护(Maurer等人，2005.Vaccine 23：3318-28)。 

本发明进一步提供了保护动物免于CSF的方法，其包括给所述动物施用有效量的根据本发明的疫苗。 

有效量定义为在它被施用的个体中将诱导免疫应答的所述疫苗的量，导致在个体中针对所述疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。针对疫苗的所述分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答针对用强毒CSFV株的攻击也是有效的。 

所述有效量优选经口或口鼻或肌内施用。包括根据本发明的重组CSFV的抗猪瘟的免疫原性组合物优选连同药学上可接受的载体一起施用。 

保护动物不受CSF的进一步方法包括提供有效量的根据本发明的疫苗作为诱饵疫苗，特别是保护野生动物例如野猪。 

有效疫苗通过预防病毒复制和/或减少病毒传播来减少或阻止临床体征。术语DIVA(区分受感染动物与接种疫苗的动物)用于疫苗及其配对诊断测试(其基于野生型病毒的突变体)，与鉴别诊断测试 结合。这个系统使得敏感动物群体的大量疫苗接种成为可能，而不会影响恢复期动物的血清学鉴定。 

本发明另外提供了区分由CSFV感染的动物与非感染的动物或由根据本发明的CSF疫苗接种疫苗的动物的方法，其包括在血清学测试中分析动物的血清。优选所述CSFV疫苗包括根据本发明的TAVSPTTLR结构域的改变，更优选包括E2蛋白质中的至少一个进一步改变，例如来自氨基酸位置772-778的LFDGTNP结构域中的改变。 

所述血清学测试优选包括识别包括完整TAVSPTTLR结构域的E2蛋白质的一种或多种抗体(例如单克隆抗体)，和识别由CSFV编码的进一步表位，例如在E2蛋白质内的进一步表位例如LFDGTNP表位的一种或多种抗体(例如单克隆抗体)。 

在一个优选实施方案中，所述抗体酶联免疫吸附测定法(ELISAs)允许诊断活猪中的CSF。优选的ELISAs是夹心型ELISAs。优选的ELISA是基于E2的竞争ELISA，例如Ceditest 2.0ELISA。通过使动物的血清与突变型E2蛋白质预温育，可以耗尽所述血清中针对所述经改变的TAVSPTTLR结构域和经改变的LFDGTNP结构域的抗体，所述突变型E2蛋白质包括与经改变的LFDGTNP结构域组合或不组合的经改变的TAVSPTTLR结构域。 

最优选的ELISA是基于肽的ELISA，其中肽与微孔测定板交联。所述交联优选通过锚定蛋白质例如多聚-L-赖氨酸执行。当与采用被动包被肽的ELISAs比较时，采用交联肽的ELISAs一般而言更灵敏。该技术执行相对简单，不需要组织培养设施，适合于自动化且可以在半天内提供结果。可以使用一方面明确区分CSFV的野外和疫苗株，另一方面区分CSFV和其他瘟病毒的单克隆和/或多克隆抗体，可以用于阻断非特异性交叉反应性。 

所述基于肽的ELISA优选是液相肽ELISA(lp-ELISA)。在用于检测诊断CSFV的抗体的所述lp-ELISA中，使测试血清与经修饰的CSFV肽和异源对照肽例如BVDV肽的混合物一起温育。所述经修 饰的CSFV肽优选是生物素化的，而对照肽不是生物素化的。CSFV特异性抗体将与所述CSFV肽结合，并且通过所述修饰进行捕获，例如通过与生物素化的CSFV肽的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合。可以检测与经修饰的CSFV肽复合的抗体，例如通过抗猪过氧化物酶缀合物和与合适底物的后续温育检测复合的猪抗体。 

用于区分由野外CSFV感染或由本发明的重组病毒接种疫苗的动物的备选测试由荧光抗体测试(FAT)和逆转录酶、随后例如通过聚合酶链反应进行cDNA扩增，和扩增DNA的序列分析所提供。FAT用于在从猪中分离的扁桃体、脾、肾、淋巴结或远侧回肠的冷冻切片中检测CSFV抗原，所述猪怀疑被CSFV感染或用根据本发明的疫苗接种疫苗。在备选测试中，从例如动物的扁桃体中分离CSFV，所述动物感染野外CSFV或怀疑由野外CSFV感染，并且与PK-15细胞一起温育。随后使用抗体在PK-15细胞中检测复制病毒，所述抗体区分野外病毒和根据本发明的重组病毒。 

进一步优选的血清学测试包括竞争ELISA，以测定所述血清是否包括抑制针对包括完整TAVSPTTLR结构域的E2蛋白质的抗体的结合，或所述血清是否包括抑制针对包括经改变的TAVSPTTLR结构域的E2蛋白质的抗体的结合。 

再进一步优选的血清学测试包括一种或多种抗体，优选单克隆抗体，其特异性识别包括根据本发明的经改变的TAVSPTTLR结构域的E2蛋白质。在一个更加优选的实施方案中，所述血清学测试包括一种或多种抗体，例如单克隆抗体，其特异性识别包括根据本发明的经改变的TAVSPTTLR结构域和所述E2蛋白质的进一步改变的免疫原性结构域的E2蛋白质。所述标记疫苗需要在动物的疫苗接种后区别性抗体的可靠诱导和检测(灵敏和特异性)。所述区别性抗体的存在通过所述血清学测试进行检测，所述血清学测试优选选自荧光抗体病毒中和测试、中和过氧化物酶连接的测定法和抗体ELISA。 

本发明进一步提供了用于分离可以在标记疫苗中使用的传染性重组病毒的方法，所述标记疫苗允许区分受感染动物与接种疫苗的动物， 所述方法包括选择由所述病毒编码的蛋白质的免疫显性结构域，其在至少90％的病毒、优选至少95％的病毒、更优选至少99％的病毒中是保守的；在编码所述免疫显性结构域的所述病毒的基因组区域中引入改变，优选缺失，以便生成起始病毒；使该经改变的基因组与合适细胞或细胞系接触；传代合适细胞或细胞系，以允许病毒繁殖；和从所述合适细胞或细胞系中分离传染性病毒，其在基因组中包括补偿起始病毒的适合性丧失的一个或多个进一步改变。 

蛋白质的保守、免疫显性结构域中的所述改变允许生成抗体例如单克隆和多克隆抗体，其可区别表达野生型免疫显性结构域的病毒与表达经改变的免疫显性结构域的病毒。因此，本发明还提供了特异性识别所述经改变的、保守的免疫显性结构域的抗体，优选单克隆抗体。 

本发明进一步涉及编码包含所述经改变的、保守的免疫显性结构域的蛋白质的构建体。本发明进一步涉及包含所述经改变的、保守的免疫显性结构域的蛋白质，和包含所述经改变的、保守的免疫显性结构域的肽。 

包括在保守的免疫显性结构域中的改变的疫苗另外在接种疫苗的个体中不诱导识别未改变的免疫显性结构域的抗体的生成。针对识别所述未改变的、保守的免疫显性结构域的诊断测试允许区别由表达野生型免疫显性结构域的病毒感染的动物与接种疫苗的动物。 

保守的免疫显性结构域的所述改变可以导致这样的病毒，其与野生型病毒比较，在感染细胞中较不有效，和/或在受感染细胞中较不有效地复制。受感染细胞或细胞系的传代使得能够引入援救病毒的一个或多个第二位点的基因组改变。与经改变的病毒比较，所述经援救的病毒在细胞中更有效感染和/或复制，或具有对抗与保守的免疫显性结构域的改变关联的其它缺点。经援救的病毒因此包括在亲本基因组中的一个或多个进一步改变，其补偿由保守的免疫显性结构域中的改变引入的适合度丧失。根据本发明的方法的进一步优点是在亲本基因组中的所述另外一个或多个进一步改变将阻碍包括亲本免疫显性结构域的回复体病毒的生成。 

在根据本发明的优选方法中，基因组区域中的所述改变导致至少一个氨基酸的缺失。至少一个氨基酸例如1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸或超过3个氨基酸的缺失，将进一步阻碍包括亲本免疫显性结构域的回复体病毒的生成。 

在根据本发明的进一步优选的方法中，至少一个氨基酸的缺失与亲本病毒的基因组中的至少一个进一步改变组合。在至少一个氨基酸的所述缺失对于病毒在所述细胞或细胞系中的复制有害的事件中，所述至少一个进一步改变允许起始病毒的受感染细胞或细胞系的传代。所述至少一个进一步改变的引入使起始病毒的适合度恢复至一定程度，允许起始病毒在所述细胞或细胞系中复制。 

在一个优选实施方案中，所述病毒选自负链RNA病毒，例如狂犬病病毒和新城疫病毒，和正链RNA病毒例如黄病毒科，优选瘟病毒例如牛病毒性腹泻病毒、边缘病病毒和CSFV。用于本发明的方法的最优选病毒是CSFV。 

本发明进一步提供了可通过本发明的方法获得的传染性重组病毒，优选CSFV。 

本发明还提供了可通过本发明的方法获得的传染性重组病毒(优选CSFV)的用途，例如在用于疫苗接种一种或多种动物的疫苗中的用途，以保护所述动物不受由强毒野外病毒的感染。 

所述疫苗的使用允许区分受感染动物与未感染动物或接种疫苗的动物。 

有效标记疫苗的主要优点是它可以在接种疫苗的猪群中检测受感染猪，并且因此提供了监控CSFV在猪群中的传播或再引入的可能性。因此，它使得能够以一定可信度基于实验室测试结果表明接种疫苗的猪群不含CSF。 

后者可以导致用于活猪或猪产品出口的管制期的缩短。贸易的快速恢复的经济优点是显而易见的，并且因此与任何标记疫苗的使用紧密相关。 

图例 

图1。在E2中的引入和适应性突变。 

^a所研究重组病毒的位置772-791和823-842的氨基酸的比较。 

^b引入的氨基酸置换以粗体指示，适应性突变以粗斜体指示。 

^cTAVSPTTLR和LFDGTNP表位是加框的。 

^d++；病毒被援救并且生长与vFlc34(野生型)相当，+；与vFlc34比较具有受损生长的病毒， ；病毒在数次传代后从培养基中丧失，-；未检测到病毒，nd；未测定。 

^e新近引入的AAU密码子之一在该病毒的繁殖过程中缺失。 

图2。vFlc34(野生型C株)、C株糖基化突变vFlc-N1和vFlc-N2、以及C株缺失突变体vFlc-ΔP和vFlc-ΔPTa1的体外生长特征。SK6.T7单层被感染，用包含甲基纤维素的生长培养基覆盖，并且在37℃温育4天。单层用4％低聚甲醛进行固定，并且用过氧化物酶缀合的mAbWB103进行免疫染色。 

图3。(A)病毒vFlc34(◇)、vFlc-N1(□)、vFlc-N2(○)的多级生长曲线，和(B)vFlc34(◇)、vFlc-ΔP(x)和vFlc-ΔPTa1(Δ)的多级生长曲线。SK6.T7细胞用0.1的感染复数进行感染。 

图4。包含未感染(模拟)，或分别由vFlc34、vFlc-N1或vFlc-N2感染的SK6.T7细胞裂解物，以及在用PNGase F处理后的相同样品的变性PAGE凝胶的蛋白质印迹。蛋白质通过mAb C2和过氧化物酶缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白作为二抗进行检测。指示了寡聚物(O)、单体(M)和PNGase F处理的单体(M^＊)的位置。分子量标准蛋白质的位置在左侧指示。 

图5。分别通过Ceditest 2.0E2ELISA(▲)和CHEKIT E^rnsELISA(□)分析由vFlc-34(A)、vFlc-N1(B)或vFlc-ΔP(C)诱导的E2和E^RNS抗体应答。指示的值是具有标准差的平均值(n＝4)。 

图6A-E。左图：分别通过Ceditest 2.0E2ELISA(▲)和CHEKITE^RNS ELISA(□)分析由vFlc34(Rabbits 1.1(A)和1.2(B))或vFlc-ΔPTa1(Rabbits 2.1(C)、2.2(D)和2.3(E))诱导的E2和E^RNS抗体应答。右图：通过PEPSCAN分析在第36天获得的兔抗血 清。显示了用162种肽(x轴)的兔抗血清的反应性。在x轴上的数目对应于该肽N末端在CSFV多肽中的位置。y轴描述了ODccd值。 

图6F-G。来自针对具有TAVSPTTLR表位的vFlc34(F)或vFlc-ΔPTa1(G)产生的兔抗血清的抗体的反应性比较。在x轴上的数目对应于该肽N末端在CSFV多肽中的位置。y轴描述了ODccd值。 

图7。CSFV C株E2蛋白质的胞外结构域的推测抗原性结构(由Van Rijn等人，1994.J Virol 68：3934-42改动而来)。指示了抗原性结构域B/C和A。在文本中提及的PNGSs位置由箭头指示。在这些突变体中，所示氨基酸由Asn残基置换。真正的N联聚糖用实线描绘，新近引入的(推定的)N联聚糖以虚线描绘。在E2中预测共定位于天然E2结构中的位置是加阴影的。B细胞表位⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷和 ⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸以粗体指出。 

图8。用vFlc34(A；猪编号3166-3170)、vFlc-ΔPTa1(B；猪编号3171-3175)接种疫苗的猪或仅用培养基接种的猪(C；猪编号3176-3178)的体温(实心符号)和临床得分(CS；空心符号)。猪在第28天时用强毒Brescia株进行攻击。发热定义为体温超过40℃(虚线)。 

图9。从用致死剂量的高度强毒Brescia株攻击的猪中获得的外周血中的外周血白细胞(A)和血小板(B)计数。在攻击前28天时，猪仅用培养基进行接种，或用vFlc34(猪编号3166-3170)或vFlc-ΔPTa1(猪编号3171-3175)进行疫苗接种一次。 

图10。在用vFlc34或vFlc-ΔPTa1接种疫苗且随后用强毒Brescia株攻击的猪中诱导的抗体应答的分析。PrioCHECK CSFV Ab 2.0E2ELISA(A)和Chekit ERNS ELISA(B)用于分析抗体应答。提供超过40％或50％阻断的血清分别被视为在E2ELISA和ERNS ELISA中对于CSFV抗体是阳性的。猪在第0天时用vFlc34(猪编号3166-3170；间断线)或vFlc-ΔPTa1(猪编号3171-3175；实线)进行疫苗接种，并且在第28天时进行攻击(箭头)。 

实施例

实施例1 

材料与方法 

病毒和细胞。组成性表达T7RNA聚合酶(van Gennip等人，1999.J Virol Methods 78：117-28)的猪肾细胞(SK6.T7)在K1000培养基中生长，所述K1000培养基补充有谷氨酰胺(0.3mg/ml，Gibco)、5％胎牛血清以及抗生素青霉素(100U/ml，Gibco)、链霉素(100U/ml，Gibco)、两性霉素B(2.5μg/ml，Gibco)，并且在合适时补充有10mM L-组氨醇二盐酸盐(Sigma)。除非另有说明，否则通过将病毒在SK6.T7细胞上传代3-4次、随后为受感染单层的2个连续冻/融循环来产生病毒原种。执行后者以使C株病毒的释放达到最大，该病毒是强细胞结合的。病毒原种以log 10稀释度在SK6.T7上滴定，并且测定为TCID50/ml。 

C株突变体的构建。包含在T7启动子控制下的“Cedipest”CSFV C株的DNA拷贝的质粒pPRK-flc34用作模板，以通过定点诱变引入突变。发现命名为pPRKflc-133(Moormann等人，1996.J Virol70：763-70)的先前公开的C株病毒DNA拷贝缺乏在基因第3组′末端上的-10位置上的半胱氨酸。在pPRK-flc34中，这个错误得到纠正。引物在表1中描述。正向引物的名称对应于构建的重组病毒的名称。引物RV-r用作每次构建的反向引物。PCR扩增使用Expand High-Fidelity PCR系统(Roche)执行。根据制造商(Promega)的说明书，将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体内，并且使用ABI PRISM 310遗传测序仪(Applied Biosystems)进行测序。PCR产物通过用ApaLI消化从pGEM-T质粒中释放，并且用于替换质粒pPRc129的相应基因组片段，所述质粒pPRc129是包含编码C株病毒的5′一半的cDNA的pOK12衍生质粒。pPRc129质粒随后用NotI和SalI进行消化，并且所得到的片段用于替换质粒pPRK-flc34的相应区段，得到质粒pFlc-N1、pFlc-N2、pFlc-N3、pFlc-N4、pFlc-N5、pFlc-ΔP、pFlc-ΔPT、pFlc-ΔSP、pFlc-ΔSPT、pFlc-ΔVSP、pFlc-ΔAVSP和pFlc-ΔSPTTL。 

C株突变体的病毒产生。包含全长cDNA克隆的质粒用XbaI进行线性化，并且转染到SK6.T7细胞内，如先前所述(van Gennip等人，1999.J Virol Methods 78：117-28)。在转染后4天，使用mAbWB103通过免疫过氧化物酶单层测定法(IPMA)测定病毒蛋白质的表达，所述mAb WB103针对CSFV非结构蛋白质NS3(Edwards等人，1991.Vet Microbiol 29：101-8)。来自另一个孔的细胞用胰蛋白酶进行处理，转移至25-cm2组织培养瓶，并且生长3-4天。需要时，使细胞反复传代以支持病毒生长。使单层冻融，离心以去除细胞碎片，并且随后贮存于-70℃。通过感染新鲜的SK6.T7细胞随后在4天后收获，澄清的裂解物用于制备疫苗候选物的种子批。病毒的生长始终在SK6.T7细胞上执行。尽管此处描述的病毒也在SK6细胞上正常复制，但当使用SK6.T7细胞时，产率可更准确地再现。 

为了研究经援救的病毒的生长动力学，以0.1的感染复数感染在25-cm²组织培养瓶中的亚汇合单层。在感染后24、48、72、96、120、144和168小时后，测定细胞裂解物中的病毒滴度。使材料冻融2次，通过在4℃以2,500xg离心进行澄清，并且贮存于-70℃。在SK6.T7细胞上测定病毒滴度(log TCID50/ml)。对经援救的病毒的E2基因测序。在合适时，还测序编码衣壳(C)、E^RNS和E1蛋白质(即结构蛋白质)的基因。为此，使用High Pure Total RNA分离试剂盒(Roche)分离病毒RNA，并且用于使用Superscript First-Strand Synthesis系统(Invitrogen)和基因特异性引物的cDNA合成。cDNA如上所述进行测序。 

蛋白质印迹。受感染SK6.T7细胞的裂解物由在25-cm²组织培养瓶中生长的汇合单层进行制备。为此，使细胞在包含1％Nonidet P40(BDH)和蛋白酶抑制剂混合物(Complete，Roche)的0，5mi磷酸盐缓冲盐水(PBS)中裂解。通过在10,000xg、4℃离心4分钟去除细胞碎片。蛋白质在12％聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE system，Invitrogen)中分离，并且随后转移至硝酸纤维素纸(Protran，Schleicher和Schuell)。在用包含0，05％Tween-20和1％Protifar(Nutricia)的 PBS阻断后，使印迹与C株特异性mAb C2一起温育，所述mAb C2针对E2的B/C结构域(Bognar和Meszaros，1963.Acta Vet Acad Sci Hung 13：429-438)，并且随后与过氧化物酶缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(DAKO)一起温育。使用Storm 860分子显像仪(GE Healthcare)，用增强型化学发光系统(ECL Plus，GE Healthcare)检测过氧化物酶活性。 

免疫过氧化物酶单层测定法(IPMA)。用D-PBS(Gibco)洗涤单层，风干，并且在-20℃冷冻。单层用低聚甲醛(在PBS中的4％w/v)固定15分钟，并且随后用PBS洗涤。过氧化物酶缀合的A结构域特异性mAbs b2、b3、b4、b7(Wensvoort等人，1989.J Gen Virol70：2865-76)、c1、c4、c8、c11(Bognar和Meszaros，1963.Acta Vet Acad Sci Hung 13：429-438)和在Ceditest 2.0ELISA中使用的命名为mAb 18.4的mAb，在包含0.05％Tween-80(PBS-T)和5％马血清的PBS中使用。在37℃温育1小时后，平板用PBS-T洗涤3次，这之后使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma)作为底物检测过氧化物酶的活性。 

兔的接种。约2kg的新西兰白兔以2-4只动物的组饲养。每天监控体温，从接种前3天开始直到接种后5天。兔的正常体温从38.5到40.1℃不等。因此，发热定义为体温超过40.1℃。兔经由边缘耳静脉用包含10³TCID50病毒的200μl生长培养基进行接种。每7天收集血清。在接种后4天收集待用于病毒分离的EDTA血液。 

病毒分离。如所述的(Terpstra和Wensvoort，1988.Vet Microbiol16：123-8)，通过氯化铵沉淀(0，83％NH₄Cl)从EDTA血样中浓缩外周血白细胞(PBLs)。使PBLs重悬浮于PBS中，并且冷冻于-70℃。第二天，使亚汇合的SK6.T7细胞单层与冻融的PBLs的悬浮液一起温育1小时，这之后由新鲜生长培养基替换悬浮液，随后为4天温育期。为了产生足够的病毒用于序列分析，使经援救的病毒在SK6.T7细胞上传代数次。 

PEPSCAN分析。如先前所述(Geysen等人，1984.Proc Natl Acad  Sci U S A 81：3998-4002)，在信用卡形式的miniPEPSCAN卡中合成衍生自CSFV株Brescia E2蛋白质的重叠15氨基酸长的肽的完全集，跨越CSFV多聚蛋白质的氨基酸690-851。来自血清的抗体与每种肽的结合在基于针的ELISA中进行测试，如由Slootstra等人描述的(Slootstra等人，1996.Mol Divers 1：87-96)。 

结果 

具有新近引入的潜在N-连接糖基化位点(PNGSs)的C株突变体的产生和表征。通过pPRK-flc34的遗传修饰构建编码在TAVSPTTLR表位中具有新近引入的N-连接糖基化位点的突变型C株病毒的全长cDNA构建体(图1)，所述pPRK-flc34是在T7启动子控制下的“Cedipest”C株的cDNA克隆。关于N-连接糖基化的最低限度需求是氨基酸序列天冬酰胺(Asn)-X-苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)的存在，其中X可以是除Pro或天冬氨酸(Asp)外的任何氨基酸(Kornfeld和Kornfeld，1985.Annu Rev Biochem 54：631-64)。突变体病毒vFlc-N1包含单个新近引入的PNGS，而突变体vFlc-N2、vFlc-N3、vFlc-N4和vFlc-N5包含多个(图1)。在vFlc-N5病毒中，TAVSPTTLR表位的中Pro残基(Pro⁸³³)由2个Asn(N)残基置换，导致2个重叠的PNGSs(即NNTT)。 

为了产生重组病毒，将线性化的质粒转染到组成性表达T7RNA聚合酶的SK6.T7细胞内。转染后4天，在所有情况下，传染性病毒在培养基中的存在通过新鲜SK6.T7细胞的感染加以证实。然而，注意到在病毒适合度方面的大差异。尽管vFlc-N1的传染灶略微小于vFlc34(图2)，但多级生长曲线显示这2种病毒的适合度无显著差异(图3A)。病毒vFlc-N2是明确更减毒的，获得小得多的病灶和更少的最终滴度(分别为图2和3A)。来自用pFlc-N3或pFlc-N4转染的细胞上清液的病毒可以传代一次或两次，但最终丧失。为了通过突变给病毒提供增加其适合度的机会，使包含这些病毒的细胞反复传代。然而，不幸的是，阳性染色细胞的数目在这些传代过程中未增加，暗示未引入适合度补偿突变。 

有利地，由pFlc-N5(图1)产生的病毒可以在转染细胞的仅少数传代后得到援救，最终获得10⁴TCID50/ml的滴度。测序这种病毒的E2基因，并且发现其是未改变的。为了以更大量产生vFlc-N5，该病毒用于感染新鲜的SK6.T7细胞。尽管这事实上导致类似于通常由vFlc34获得的滴度(数据未显示)，但共有区测序证实病毒已丧失了2个新近引入的Ash残基之一，并且因此实质上等同于vFlc-N1。这个发现暗示在TAVSPTTLR表位中的第二个Ash残基在感染过程的某些阶段对于病毒是有害的。因此，仅病毒vFlc-N1和vFlc-N2被视为适合于进一步研究。 

为了适合于作为DIVA疫苗，疫苗候选物在体内必须无法诱导A结构域特异性抗体。然而，为了获得在目前候选物中引入的修饰是否影响A结构域的抗原性结构的第一个想法，我们测定重组病毒是否可以在IPMAs中由我们的A结构域特异性mAbs中的任何一个识别。所使用的A结构域特异性mAbs针对CSFV株Brescia(即mAbs b2、b3、b4、b7)或C株(即c1、c4、c8和c11)产生。此外，在这些实验中还包括在Ceditest 2.0ELISA中使用的、命名为mAb 18.4的mAb。因为我们的抗体中有一些仅弱染色野生型C株，所以通过对传染灶染色研究抗体识别突变型C株病毒的能力(所述传染灶通过在甲基纤维素覆盖层下生长病毒产生)。虽然野生型C株的传染灶被所使用的所有抗体明确染色，但这些实验证实Pro⁸³³→Ash置换足以阻止mAb在体外对A结构域的识别(数据未显示)。 

尽管其在病毒粒子表面上的暴露和它是中和抗体的占优势靶的事实，但A结构域的TAVSPTTLR表位在整个进化过程中是保守的。这暗示包含这个确切序列的病毒具有优于病毒群体内在这个区域中包含氨基酸置换的变体的选择优势。尽管我们成功回收了在这个表位中具有一个(即vFlc-N1)或两个(即vFlc-N2)新近引入的PNGSs的病毒，但研究这些突变体在组织培养中生长后的进化具有明显关联性。为此，vFlc-N1在体外传代30次。为了研究病毒的表型稳定性，受感染单层用命名为WB103、针对非结构蛋白质NS3的抗体进行免疫染 色，并且一式两份的单层用A结构域特异性抗体b3和b4的混合物进行染色，以测定是否存在表型回复体(即其A结构域可以用这些抗体染色的病毒)。在仅3次传代后，用vFlc-N1感染的细胞的极小百分比由b3/b4混合物染色，明确显示出现了表型反转。群体生物学的一般竞争排斥原理表明，当2种生物共存于其中资源有限的环境中时，一种生物将最终生长超过另一种(Gause，1934.Science 79：16-17)。考虑到这点，我们希望通过病毒的反复传代测定表型回复体是否将生长超过vFlc-N1。令人惊讶地，表型回复体的量保持在极低水平，在大多数实验中由被b3/b4mAb混合物染色的仅少数细胞代表。因此，看起来表型回复体病毒被连续产生，但在病毒群体中始终作为少数变体维持着。因为这个发现暗示相对于vFlc-N1而言表型回复体的适合度较低，我们考虑回复体病毒不太可能代表向野生型C株序列的真正回复。为了鉴定负责回复体表型的突变，病毒群体需要就回复体病毒进行富集，以便能够测序其基因组。通过在96孔板中接种病毒的稀释物，可以选择就表型回复体富集的群体。在重复这个选择后，获得包含足够量的回复体病毒的群体，以测定其基因组序列。在2个单独实验中，表型回复体显示在其中引入Asn的位置上(即CSFV多聚蛋白质的位置833)包含Ser残基，这是由Asn密码子中的单个转换(从AAU到AGU)导致的。因为这个突变导致PNGS的丧失，所以它伴随着mAbs识别A结构域的能力恢复并不令人惊讶。总之，回复体亚群的检测证实研究的vFlc-N1通过突变增加其适合度的可能性。然而，因为新近引入的AAU密码子通过主要基因型得到维持，所以病毒被视为在群体水平上是遗传稳定的。 

vFlc-N2的分析揭示具有与用vFlc-N1的实验过程中观察到的那些相似特征的表型变体，但未对它们进一步表征。 

具有一个或多个新近引入的PNGSs的E2蛋白质的相对电泳迁移率的分析。为了测定在vFlc-N1和vFlc-N2的TAVSPTTLR表位中新近引入的PNGSs是否导致新碳水化合物部分与E2的附着，通过在还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、随后为蛋白质印迹研究 经修饰的E2蛋白质的相对电泳迁移率。包含由vFlc34、vFlc-N1和vFlc-N2感染的细胞的分离蛋白质的蛋白质印迹证实vFlc-N1的E2蛋白质具有比vFlc34的相应蛋白质更高的分子量(图4)。还检测到包含E2的寡聚物，然而，考虑到这些蛋白质是在变性条件下进行分析的，这些寡聚物可能不是生理性的(图4)。用从蛋白质中去除N联聚糖的酶PNGase F处理细胞裂解物，获得具有相同分子量的E2蛋白质。 

包含vFlc-N2的分离蛋白质的蛋白质印迹暗示2个新近引入的糖基化序列子(sequons)中的至少一个用作碳水化合物部分的锚定位点(图4)。这些裂解物看起来也包含甚至更高分子量的E2蛋白质，暗示第二个糖基化位点的糖基化。 

在TAVSPTTLR表位中具有靶向缺失的C株突变体的产生和表征。如上文对于糖基化突变体所述构建编码在TAVSPTTLR表位中具有靶向缺失的C株病毒的全长cDNA构建体(图1)。TAVSPTTLR表位的中心Pro残基的缺失获得vFlc-ΔP，这产生与vFlc34比较略微更小、(图2)并且在大多数实验中生长至低10倍滴度(图3B)的传染灶。然而，所获得的最高滴度超过10⁶TCID50/ml。通过IPMAs的vFlc-ΔP分析证实这种C株突变体不能被我们的A结构域特异性mAbs中的任何一种所检测到。值得注意的是，在20次传代后，共有区测序证实在Ser⁷⁸⁹密码子中有转换型突变(从UCC到UUC)，这导致Ser由苯丙氨酸(Phe)置换。所得到的病毒命名为vFlcΔPa1(图1)。 

与vFlc-ΔP形成对比，具有超过一个氨基酸的缺失的病毒是高度变弱的。类似于先前对于糖基化突变体vFlc-N3和vFlc-N4描述的，来自由编码这些病毒的质粒转染的细胞上清液的病毒可以传代数次，但随后丧失。为了通过突变给病毒提供增加其适合度的机会，使由这些构建体转染的细胞反复传代。由pFlc-ΔSP、pFlc-ΔSPT、pFlc-ΔVSP、pFlc-ΔAVSP和pFlc-ΔSPTTL转染的细胞的传代未导致病毒生成的增加。 

在用pFlc-ΔPT转染的细胞的起始传代过程中，结果类似于用其他缺失构建体获得的结果，得到具有恒定小尺寸的传染灶(平均10-20个细胞)。然而，在数次另外传代后，免疫染色证实有突然改善的病毒生长，这暗示病毒已引入适合度补偿突变。所得到的病毒命名为vFlc-ΔPTa1。为了鉴定vFlc-ΔPTa1中的推定复苏突变，测定其E2基因的共有序列。值得注意的是，这证实病毒已保留引入的缺失，并且已在E2基因中引入2个突变。方便地，在突变之一的序列层析谱中的清晰双重峰暗示首先发生导致从GAC到AAC的密码子改变的转换型突变(数据未显示)。这个突变导致Asp^774w至Asn的置换，并且有趣地，在E2的A结构域中引入了新PNGS(图1和7)。第二个改变是在TAVSPTTLR表位中的缬氨酸(Val)-831密码子内的颠换(从GUG到GGG)，这导致Val至甘氨酸(Gly)置换。 

考虑到适应性突变还可以存在于编码其他结构蛋白质的基因中的可能性，还测定了C、E^RNS和E1基因的共有序列。C基因和E^RNS基因的序列分析揭示了仅在后者中有单个沉默突变(U1549→C)。有趣地，在E1基因中，检测到在位置2275上的颠换突变(A2275→U)，这导致谷氨酸(Glu)-634被天冬氨酸(Asp)置换(表2)。 

相对于vFlc34和vFlc-ΔP，vFlc-ΔPTa1的体外生长特征通过多级生长曲线显现(图3)。尽管vFlc-ΔPTa1病毒生长略微慢于vFlc34，但获得相同的最终滴度。 

由质粒pFlc-ΔPT产生的病毒的实验进化。得自vFlc-ΔPTa1的序列分析的结果暗示：在E^RNS中的沉默突变、在E1中的氨基酸置换和在E2中的2个置换负责适合度恢复。为了测试这个假设，执行用pFlc-ΔPT的10次独立转染，并且测序编码结构蛋白质的基因。使转染细胞反复传代，并且使用mAb WB103通过IPMAs监控病毒的存在。在仅2-3次传代后，阳性细胞的数目明显增加，暗示病毒已引入适合度补偿突变。在11次传代后，如对于vFlc-ΔPTa1所述分析病毒的基因组。这个实验的结果概括于表2中。导致Asp⁷⁷⁴→Asn置换的突变在10种进化病毒中的6种中发现，明确证实平行进化。然而，在这些 病毒之一中，发现导致Asp⁷⁷⁴→Glu置换的突变，并且在3种其余病毒中，在氨基酸774的密码子中未发现突变。在一种病毒中检测到在vFlc-ΔPTa1中负责Val⁸³¹→Gly的突变(即vFlc-ΔPTa8，表2)。 

有趣地，在所有病毒中发现在位置1549上的沉默突变。这个结果暗示自然选择也在RNA水平上进行，并且另外的适应性突变可能可以在这个实验中未分析的基因组的区域中发现。然而，令人惊讶的是发现在vFlc-ΔPTa1的基因组中检测到的4个突变中的3个在目前实验中的病毒进化过程中再次引入。值得注意的是，在病毒vFlc-ΔPTa5中，检测到在第5个位置上的突变。除在E^RNS基因的沉默突变和在E2中的Asp⁷⁷⁴→Asn置换外，这种病毒已引入在E^RNS基因的Ala⁴⁴⁵密码子上的转换型突变(从GCA到ACA)，这导致Ala⁴⁴⁵被Thr置换(表2)。 

针对vFlc-ΔP和vFlc-N1的抗体应答的分析。A结构域特异性抗体在体外无法识别vFlc-ΔP和vFlc-N1证实我们成功修饰了A结构域的抗原性结构。然而，为了适合于作为DIVA疫苗，在体内诱导的抗体应答必须被足够抑制，以便能够血清学区分受感染的动物与接种疫苗的动物。尽管疫苗候选物将最终就其在猪中的DIVA性质和保护功效进行测试，但由于2个主要原因，在目前工作中，我们优选使用兔用于分析体液免疫应答。首先，我们希望测定在研究中的疫苗病毒在体内是否能够生产性感染。在猪中，C株病毒的接种不诱导任何临床症状，而在兔中的接种诱导暂时性热性疾病。因此，使用兔使得我们能够证实生产性感染，并且另外允许我们研究所选候选物的毒力中的潜在差异，这可以提供有关病毒在体内的适合度的某些信息(de Smit，等人，2000.Vaccine 18：2351-8)。使用兔的第二个优点是可以从血液中分离C株病毒，这在使用猪时通常是不成功的。在体内复制后疫苗病毒的分离允许我们测定所引入的遗传修饰是否得到稳定维持。4只兔的组用vFlc-ΔP或vFlc-N1进行接种。对照动物用vFlc34或培养基进行接种。在适应期期间，兔的平均体温是正常的(39.2℃，SD±0.28，n＝68)。发热定义为体温超过40.1℃。首先在用vFlc34(40.7℃，SD ±0.48，n＝4)和vFlc-N1(40.5℃，SD±0.32，n＝4)接种的组中注意到发热，两者都在接种后2天时。在接种后3天时注意到用vFlc-ΔP接种的兔中升高的体温(40.0℃，SD±0.13，n＝4)。 

从用vFlc34接种的4只兔中的3只、用vFlc-N1接种的4只兔中的3只和用vFlc-ΔP接种的4只兔中的2只的PBLs中分离病毒。共有区测序证实这些病毒的E2基因未通过在兔中的传代改变。为了测定C株突变体是否使得能够区分受感染动物与接种疫苗的动物，通过Ceditest 2.0E2ELISA(Prionics)分析兔抗血清。这种ELISA特异性检测到针对E2的A结构域的抗体。作为有效免疫接种的参考对照，使用CHEKIT CSF E^RNS ELISA(IDEXX实验室)。 

由vFlc34、vFlc-N1和vFlc-ΔP诱导的E^RNS应答是可比较的(图5)。通过Ceditest 2.0ELISA比较由vFlc34和vFlc-N1诱导的A结构域特异性E2应答证实在vFlc-N1中存在的修饰对这种应答具有较小作用。相比之下，比较vFlc-ΔP的E2应答与vFlc34的E2应答证实了Pro⁸³³的缺失的确导致针对A结构域的抗体应答的定量转移(图5)。考虑到vFlc-N1的新近引入的N-连接糖基化位点对A结构域特异性抗体应答的令人失望的作用，我们未研究vFlc-N2在兔中的抗原性性质，而是集中于缺失突变体用于进一步实验。 

针对vFlc-ΔPTa1的抗体应答的分析。在第二个动物试验中，针对vFlc-ΔPTa1的抗体应答与针对vFlc34诱导的抗体应答进行比较。在接种前兔的平均体温是正常的(39.2℃，SD±0.37，n＝28)。在这个实验中，用vFlc34接种的2只兔中仅1只在接种后2天时经历发热(40.3℃)。用vFlc-ΔPTa1接种的1只兔(兔2.1)未显示体温的任何升高。相比之下，在用vFlc-ΔPTa1接种的其余2只动物(兔2.2和2.3)中注意到发热。在这些动物之一中，在接种后5天时注意到40.6℃的温度，而在其他兔中，在接种后7天时注意到40.4℃的温度。考虑到vFlc-ΔP不诱导发热的事实，这个发现是高度出乎意料的。然而，必须指出，在接种后不久，兔2.2和2.3发生争吵，导致伤口折磨。考虑到这些伤口诱导皮肤的感染和这种感染的症状与发热的出现同时发 生的事实，推定发热起因于皮肤感染而不是病毒接种的后果似乎是合理的。在接种后4天时，从用vFlc34接种的2只动物中分离病毒。从用vFlc-ΔPTa1接种的3只动物的PBLs中未分离出病毒，这可能涉及这种病毒的减毒。 

用vFlc34接种的2只兔的血清(动物1.1和1.2；图6，左图)在E^RNS和E2ELISA中得到与第一次实验中可比的结果。通过E2ELISA测定的阻断百分比高于通过E^RNS ELISA检测到的那些。相比之下，来自用vFlc-ΔPTa1接种的兔2.1的血清分析证实在E2ELISA中的阻断百分比低于在E^RNS ELISA中检测到的结果。这个结果与用vFlc-ΔP获得的结果一致(图5)，两者都证实A结构域特异性抗体应答的特异性抑制。然而，出乎意料的是，来自动物2.2和2.3的血清分析未证实这个结果。这些动物明确发展高水平的A结构域特异性E2抗体。考虑到用动物2.1获得的结果和用vFlc-ΔP获得的较早结果，这个发现是非常令人惊讶的。在动物2.2和2.3中A结构域特异性抗体的诱导可能可以通过A结构域特异性抗体应答朝向除TAVSPTTLR表位外的A结构域表位重新集中加以解释，所述表位通常是亚显性的。 

为了更彻底地分析抗体应答，我们利用PEPSCAN分析，使用先前构建的衍生自CSFV株Brescia的E2蛋白质的15氨基酸长的重叠肽。这个分析揭示在第36天时从用野生型C株接种的动物中获得的血清识别CSFV株Brescia的2个表位(图6，右图)。如预期的，这些表位中的第一个是⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷表位。特别地，残基 ⁸³¹VSPTTLR⁸³⁷看起来最关键(图6，上图)。第二个表位包括氨基酸 ⁷⁵⁴YLASLHKDAPT⁷⁶⁴。有趣地，首次发现的这个表位定位于先前定义的A结构域外(即，氨基酸766-866；图7)。得自用vFlc-ΔPTa接种的兔的血清无一识别上述表位中任一个。尽管对⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷表位的识别的缺乏(图6B，下图)可以通过vFlc-ΔPTa1中引入的突变加以解释，但⁷⁵⁴YLASLHKDAPT⁷⁶⁴表位的识别的缺乏更令人惊讶。这个发现暗示⁷⁵⁴YLASLHKDAPT⁷⁶⁴表位以某种方式与 ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷表位相互作用，并且这些表位定位于天然E2结构 附近(图7)。尽管PEPSCAN分析未揭示由兔2.2和2.3的抗血清识别的A结构域的几个表位，但它的确证实这些血清无一识别TAVSPTTLR表位。由此，我们可以得出结论，当伴随基于TAVSPTTLR的肽ELISA时，vFlc-ΔPTa1满足DIVA标准。 

讨论 

在过去20年中，已开发了需要伴随E2或E^RNS ELISA的几种实验性DIVA疫苗。在文献中通常指出2种诊断测试均适合于在本领域中检测CSF。尽管这在原则上是正确的，但必须指出，E^RNS ELISAs相比E2ELISAs具有2个主要缺点。首先，尽管E^RNS ELISAs可以用于可靠地检测受感染兽群，但先前发现这些ELISAs对于诊断个体动物是不够灵敏的。其次且更加重要的是，E^RNS ELISAs不是CSF特异性的(2003/265/EC).SANCO/10809/2003.European Commission，Directorate-General for Health and Constumer Protection，Brussels)。因此，在其中BVDV和/或BDV病毒散布的地区不推荐E^RNS ELISAs的使用。 

目前工作的目的是构建与E2ELISA相容的基于C株的DIVA疫苗。我们旨在通过在A结构域的TAVSPTTLR表位中引入慎重选择的突变来达到这点，所述TAVSPTTLR表位是这些ELISAs中的占优势靶。在这2种方法的第一种中，TAVSPTTLR表位的中心Pro(即Pro⁸³³)残基由Asn置换，从而在TAVSPTTLR表位的中心引入PNGS。尽管N联聚糖因其使免疫原性结构域屏蔽体液免疫系统的能力是众所周知的，但它们在功能上重要的结构域上或附近可以是显著充分耐受的，这2个特征归于碳水化合物链的结构弹性。尽管我们成功产生了稳定维持与TAVSPTTLR表位中心锚定的新近引入的N联聚糖的C株突变型，即vFlc-N1，但这种修饰看起来对A结构域特异性抗体应答仅具有较小作用。为此，我们选择不继续这种方法。 

在备选方法中，我们旨在通过从TAVSPTTLR表位缺失氨基酸来改变A结构域的抗原性结构。中心Pro残基(即Pro⁸³³)的缺失获得命名为vFlc-ΔP的病毒，其稳定维持所引入的缺失，尽管该病毒最终 获得适应性突变，导致Ser⁷⁸⁹至苯丙氨酸(Phe)的置换。我们发现这个非保守置换非常有趣，因为Ser⁷⁸⁹存在于所有C株病毒和相关的兔化CSFV株中，而Phe⁷⁸⁹在强毒CSFV株中是完全保守的，并且甚至在瘟病毒属的其他成员中也是高度保守的(van Rijn等人，1997.Virology 237：337-48)。尽管C株病毒的历史并未得到充分阐述，但明确的是该病毒通过在兔中传代数百次得到减毒(van Oirschot，2003.Vet Microbiol 96：367-84)。因此，可以假设Ser⁷⁸⁹对于兔中C株复制是有利的。如果这个假定是正确的，那么追询C株在体外在猪细胞上生长后为何不回复成Phe⁷⁸⁹的原因是非常有趣的。这可以通过Wright(Wright，1931.Genetics 16：97-159)的适合度景观(landscape)概念加以解释。根据这个概念，当基因型在适合度峰的上部区域出现时，如野生型C株病毒很可能适用的，有利突变缓慢地出现，而当基因型以适合度峰的较低水平出现时(如对于vFlc-ΔP的情况)，有利突变将更快速地出现。 

得自用vFlc-ΔP接种的兔的血清分析证实Pro⁸³³的缺失已足以相当大地抑制A结构域的免疫原性。尽管这个结果证实我们方法的概念证明，但也明确表明A结构域的抗原结构需要更广泛地修饰，以致使所得到的病毒适合于作为DIVA疫苗。尽管编码具有来自TAVSPTTLR表位的2-4个氨基酸缺失的C株突变体的质粒(ΔSP、ΔPT、ΔSPT、ΔVSP、ΔAVSP)产生传染性病毒，但这些是高度弱化的，并且无法维持生长。然而，在包含vFlc-ΔPT的细胞的数次传代后，注意到适合度的显著增加。经援救的病毒命名为vFlc-ΔPTa1。我们考虑E2基因中的适应性突变负责适合度恢复是最可能的。事实上，在E2基因中检测到2个适应性突变(图1)。第一个突变导致TAVSPTTLR表位的Val残基由Gly置换。尽管可能已预期在所引入缺失的紧密接近处的适应性突变，但发现第二个突变定位于线性E2序列中TAVSPTTLR表位的远侧。此外，感兴趣的是注意到这个第二个突变(Asp⁷⁷⁴→Asn)在A结构域中引入PNGS。 

在通过反向遗传学构建相似病毒(即vFlc-N1；图1和7)后不久 在A结构域中具有PNGS的C株突变体的援救(即vFlc-ΔPTa1，图1和7)看起来是惊人的一致。然而，回顾提示我们开始我们研究的先前发现，暗示我们的发现可能不是巧合。我们的工作通过CSFV突变体的表型得到启发，所述CSFV突变体通过在中和性mAbs的存在下生长病毒进行选择(van Rijn，等人，1994.J Virol 68：3934-42)。命名为vPK26.2的株Brescia的这种MAR(单克隆抗体抗性的)突变体，在E2中具有影响A结构域的抗原性结构的2个氨基酸置换，即Pro⁸³³→Leu(在TAVSPTTLR表位内)和Thr⁸⁵⁸→Asn(24)。另外其他MAR突变体的分析证实Pro⁸³³→Leu置换负责中和逃避且另外干扰第二种A结构域特异性mAb的结合。然而，尽管仅包含Leu⁸³³的MAR突变体仍由2种其他A结构域特异性mAbs识别，但我们的A结构域特异性mAbs中的任何一种未检测到包含Leu⁸³³和Asn⁸⁵⁸二者的MAR突变体vPK26.2。考虑到Asn⁸⁵⁸明确影响A结构域的抗原性结构，我们假设位置⁸⁵⁸以某种方式与天然E2结构中的TAVSPTTLR表位相互作用，或与之紧密接近。此外感兴趣的是注意到Thr⁸⁵⁸→Asn置换在A结构域中引入新PNGS(图7)。尽管这个位点上的糖基化先前未阐明，但这种突变对E2的抗原性结构的影响可以通过A结构域由N联聚糖的屏蔽加以解释。vPK26.2的表型提示我们不仅研究缺失TAVSPTTLR表位的中心Pro的效果，还研究通过N联聚糖屏蔽A结构域的可行性。我们发现很方便用Asn置换Pro⁸³³，得到病毒vFlc-N1，去除结构上重要的Pro⁸³³残基，并且同时在TAVSPTTLR表位中引入新PNGS。必须指出这种修饰可以被视为Pro⁸³³由Asn替换，但还可以被视为Asn残基在缺乏Pro⁸³³的病毒中的插入。尽管这看起来是语义学的问题，但它展开了可以解释vPK26.2的表型以及vFlc-N1的遗传稳定性和适合度的全新视角。这些病毒的令人惊讶的共同特征是它们都缺乏Pro⁸³³且在A结构域中都包含新PNGS。由此，尝试推测位置833和858事实上定位于天然E2结构中的相似位置上，并且在这些位置中的任何一个上的Ash部分直接地或借助于其作为用于碳水化合物部分的锚定位点的功能而可以补偿由Pro⁸³³的缺失或置 换造成的适合度成本(图7)。 

回到病毒vFlc-ΔPTa1，感兴趣的是注意到在vFlc-ΔPTa1中在位置774上新近引入的PNGS也可能定位于天然E2结构中的TAVSPTTLR表位附近。即，在这种病毒中的Asp⁷⁷⁴→Asn置换定位于包括氨基酸⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸的近期鉴定的表位的中心(Peng等人，2008.Virus Res 135：267-72)。如同⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷表位， ⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸表位共享限定A1结构域的所有3个特征：CSFV特异性、进化上保守和作为中和性抗体的靶。基于上述和我们的实验发现，我们假设TAVSPTTLR和LFDGTNP表位共定位于E2的天然结构中，并且可能一起构成A1结构域。 

总之，我们假设TAVSPTTLR表位的中心Pro残基的突变可以通过定位于E2蛋白质中的3个可能位置之一上的N联聚糖补偿，并且这些位置定位于天然E2结构附近。第一个定位于⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷表位其自身内，第二个在⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸表位中，并且第三个结构域包括氨基酸序列⁸⁵⁸TT⁸⁶⁰(图7)。有可能后面的氨基酸也是定位于A结构域中的仍未鉴定的表位的部分。证实这些假设的实验在进行中。 

尽管假定E2基因中的适应性突变在适合度恢复中起重要作用似乎是合理的，但我们推论在编码结构蛋白质的其他基因中的突变也可以起作用。因此，还测序了vFlc-ΔPTa1的C、E^RNS和E1基因。基因组的这个部分的测序事实上揭示了2个另外突变。第一个在E1基因中检测到。这个突变导致完全保守的Glu⁶³⁴残基由Asp置换。考虑到已知E2蛋白质与E1蛋白质装配成二硫键合的异二聚体(Thiel，等人，1991.J Virol 65：4705-12)，可以想象这个突变促成vFlc-ΔPTa1的适合度恢复。尽管在C基因中未检测到突变，但在E^RNS基因中检测到单个沉默突变。记住野生型CSFV的共有序列是特别稳定的，在体外或在体内传代后实际上不积累突变(Vanderhallen，等人，1999.ArchVirol 144：1669-77)，此类沉默突变通过共有区测序检测到证实自然选择也在RNA水平上起作用，并且从而在基因组的其他区域中的同义突变也可以促成vFlc-ΔPTa1的适合度恢复。 

为了获得对适合度恢复的分子途径的了解，执行进化实验。这个实验证实在E^RNS基因中的沉默突变的平行进化，导致Val⁸³¹→Gly置换的突变和在位置774上引入新PNGS的突变(表2)。尽管明显需要另外的研究以完全阐明适合度恢复的分子机制，但这个发现支持上述突变事实上涉及Flc-ΔPTa1的适合度恢复的想法。非常可能这些突变可以恢复在TAVSPTTLR表位中具有较大缺失的突变体的适合度。 

值得一提的是，在进化实验中研究的病毒之一中(即vFlc-ΔPTa5)，在E^RNS基因中检测到导致Ala⁴⁴⁵至Thr的置换的突变(表2)。如同在vFlc-ΔP进化中发现的先前描述的Ser⁷⁸⁹至Phe置换，在vFlc-ΔPTa5中改变的氨基酸(在这种情况下是Ala⁴⁴⁵)变成在CSFV野外株中保守的氨基酸(在这种情况下是Thr⁴⁴⁵)。尽管这在目前工作的范围外，但这个发现再次证实CSFV的减毒可以提供对其分子进化的有价值的了解。 

由Van Rijn等人执行的用MAR突变体的先前研究暗示TAVSPTTLR表位的Pro⁸³³和Thr⁸³⁴对于A结构域的保守表位的完整性是非常重要的(van Rijn，等人，1994.J Virol 68：3934-42)。缺乏这2个氨基酸和另外包含Val⁸³¹→Gly置换的充分生长的C株突变体的成功产生，暗示这种病毒的A结构域的抗原性结构急剧改变。我们因此预期使用Ceditest 2.0E2ELISA，由vFlc-ΔPTa1诱导的免疫应答将可与由野生型CSFV诱导的应答区分开。发现vFlc-ΔPTa1在诱导A结构域特异性抗体中实际上是非常有效的，这是令人惊讶的。关于这个发现的可能解释是在其他方面免疫显性的TAVSPTTLR表位的破坏可以导致抗体应答再集中到通常为亚显性的A结构域表位。在鉴定这些表位的尝试中，通过PEPSCAN分析来分析抗血清。尽管这个分析未揭示新近识别的表位，但它的确证实这些抗血清无一识别包含TAVSPTTLR表位的肽。有趣地，这暗示基于TAVSPTTLR表位的ELISA可以用作DIVA测试，以伴随vFlc-ΔPTa1疫苗病毒。 

总之，目前工作证实被迫的病毒进化可以是遗传修饰CSF病毒的有力工具。此处，这种方法已成功地用于产生遗传上稳定的、可以在 血清学上与野生型CSFV区分的C株突变体。 

实施例2 

材料与方法 

如实施例1中所述产生C株缺失突变体病毒vFlc-ΔPTa1。SK6-T7细胞是组成性表达T7RNA聚合酶的猪肾细胞(van Gennip等人，1999.Vaccine 19(4-5)，447-59)。这些细胞在K1000培养基中生长，所述K1000培养基补充有谷氨酰胺(0.3mg/ml，Gibco，Invitrogen，Breda，荷兰)、5％胎牛血清(FBS)以及抗生素青霉素(100U/ml，Gibco)、链霉素(100U/ml，Gibco)和两性霉素B(2.5μg/ml，Gibco)。病毒原种在SK6.T7细胞上滴定，并且报道为50％组织培养物感染剂量(TCID₅₀)。 

不含针对瘟病毒的抗体的13只普通猪分成5只猪的2个组和3只猪的1个组。来自第1组的猪(编号3166-3170)在第0天时经由肌内途径疫苗接种一次，用包含2％胎牛血清(FBS)和10⁵TCID₅₀的重组C株病毒vFlc34的1ml培养基进行(参见实施例1)。来自第2组的猪(编号3171-3175)通过相同方案进行疫苗接种，采用vFlc-ΔPTa1疫苗。来自第3组的猪(编号3176-3178)用包含2％FBS的培养基接种一次。 

在第28天时，来自第1、2和3组的猪用包含200x 50％致死剂量的CSFV株Brescia的1ml(每个鼻孔0,5ml)进行鼻内攻击。所有猪就疾病每天进行观察，并且其体温从第-3天时开始进行测量。临床症状的严重性使用先前定义的10CSF特异性标准列表进行评分(Mittelholzer等人，2000.Vet Microbiol 74(4)，293-308)。 

每周由所有猪制备血清样品。在攻击当天(第28天)以及随后在第30、32、35、37、39、42、44、46、49、52和56天时，收集来自第1、2和3组的所有猪的EDTA样品和口咽流体。EDTA样品用于测定白细胞和凝血细胞的数目。这种分析用Medonic CA 620库尔特计数器(Boule Medical AB)执行。在常规饲养的猪中，在血液中的白细胞和凝血细胞浓度范围分别为11x 10⁹-23x 10⁹和320x 10⁹-720 x 10⁹/升。因此，白血球减少症定义为＜8x 10⁹细胞/l血液，并且血小板减少症定义为＜200x 10⁹凝血细胞/l血液。 

基本上如所述的(Weesendorp等人，2OO9.Vet Microbiol 135(3-4)，222-30)执行使用外周血白细胞(PBLs)或咽喉拭子的病毒分离和定量实时逆转录PCR(qRRT-PCR)。 

根据制造商的说明书，使用商业E2ELISA(PrioCHECK CSFVAb 2.0E2ELISA，Prionics，Lelystad，荷兰)和商业E^RNS ELISA(Chekit CSF E^RNS ELISA，IDEXX laboratories，Hoofddorp，荷兰)分析血清样品。 

结果 

我们比较了vFlc-ΔPTa1病毒与其亲本病毒vFlc34针对用高毒性Brescia株的致死攻击的保护功效。5只猪的2个组在第0天时用vFlc34(第1组)或vFlc-ΔPTa1(第2组)进行疫苗接种。由3只猪组成的对照组(第3组)仅用细胞培养基进行接种。在第28天时，来自第1、2和3组的猪用高毒Brescia株进行攻击。 

对照组中的所有猪发展CSF的典型临床体征，包括高热(图8C)、白血球减少症(图9A)和血小板减少症(图9B)。在攻击后第4天时从3只猪中的2只以及第7和9天时从所有3只猪的PBLs中分离出病毒。在攻击后第7天时从2只动物和在攻击后第9天时从1只动物的咽喉拭子中分离出病毒。发现来自这个组的猪处于垂死状态，并且在感染后9天(猪3178)或10天(猪3176和3177)实施安乐死。 

用重组C株疫苗(即vFlc34)接种疫苗的猪无一在攻击后发展临床体征(图8A)，尽管一只猪(编号3168)发热1天，并且另一只猪(编号3166)展示出血小板减少症至少1天(图9B)。从PBLs或咽喉拭子中未分离出病毒。 

用vFlc-ΔPTa1接种疫苗的所有猪有3-6天的发热，并且在攻击后展示出弱临床体征(图8B)，但所有猪都完全恢复。在攻击后第2天时从1只猪(猪编号3175)的PBLs中分离出病毒。由此，我们得出结论用vFlc-ΔPTa1进行单次疫苗接种提供了针对用高毒Brescia株 的致死攻击的保护。 

用PrioCHECK CSFV Ab 2.0E2ELISA(Prionics)和Chekit CSFE^RNS ELISA(IDEXX实验室)分别就抗E2和抗E^RNS抗体的存在分析所有血清。用vFlc34接种疫苗的所有猪在21天p.i.时在E2ELISA中是阳性的(图10A)，而这些猪在在35天p.i.时在E^RNS ELISA中是阳性的(图10B)。用vFlc-ΔPTa1接种疫苗的猪无一在攻击前在E2ELISA中是阳性的(图10A)。在攻击后7天内，所有猪在E2ELISA中是阳性的(图10B)。感兴趣的是注意到用vFlc-ΔPTa1接种疫苗的2只猪(即猪3171和3172)对于E^RNS抗体血清转化比用vFlc34接种疫苗的早得多(图10B)。 

因此，结论是用vFlc-ΔPTa1接种疫苗的所有猪保持低于PrioCHECK E2ELISA的临界值直至攻击时，显示vFlc-ΔPTa1也可以在猪中用作DIVA疫苗。 

总之，我们证实了用vFlc-ΔPTa1进行单次疫苗接种可以在所有接种疫苗的猪中提供了针对高毒攻击的保护，并且提供了出现极少病毒屏蔽或无病毒屏蔽的证据。 

表1 

表1.用于构建C株突变体的引物 

^a指示了ApaLI限制位点(有下划线的)和核苷酸置换(粗体)。 

表2 

由p Flc-ΔPT^b产生的独立进化病毒的C、E1、E^RNS和E2基因的序列测定^a。 

^a鉴定的突变以粗体指示。 

^b病毒vFlc-ΔPTa1的体外生长特征在图2和3b中显示。未测定其他病毒的生长特征。 

Claims (9)

1.重组猪瘟病毒CSFV，其特征在于，在对应于Cedipest株亲本CSFV多聚蛋白质的位置829–837的E2蛋白质内“TAVSPTTLR”结构域中，脯氨酸缺失。

2.根据权利要求1的重组CSFV，其中Cedipest株是亲本株，其在所述E2蛋白质内“TAVSPTTLR”结构域的位置833和834处的脯氨酸和苏氨酸缺失，并且在E^RNS基因中位置1549处发生U至C改变、在E1蛋白质位置634处是天冬氨酸D、在所述E2蛋白质中位置774处是天冬酰胺N、和在位置831处是甘氨酸G。

3.根据权利要求1-2中任一项的重组CSFV，其中亲本基因组是减毒CSFV株的基因组。

4.根据权利要求1-2中任一项的重组CSFV，其中亲本基因组是C株即中国株的基因组。

5.活猪瘟疫苗，其包含根据权利要求1-4中任一项的重组CSFV。

6.权利要求5的疫苗在制备用于保护动物不受CSF的试剂中的用途。

7.权利要求5的疫苗在制备用于区分由CSFV感染的动物与未感染的动物或用权利要求5的疫苗进行接种的动物的试剂中的用途，所述区分包括在血清学测试中分析动物的血清。

8.权利要求7的用途，其中所述血清学测试是基于肽的ELISA。

9.cDNA分子，其编码重组猪瘟病毒CSFV基因组，其中所述基因组编码的E2蛋白质在对应于Cedipest株亲本CSFV多聚蛋白质的位置829–837的E2蛋白质内“TAVSPTTLR”结构域中，脯氨酸缺失。