CN115850498A - 单克隆抗硫氰酸荧光素抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的单克隆抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体、包括该抗体的试剂盒、及其相关应用。本发明的抗FITC抗体表现出针对FITC的高灵敏度和高特异性,能够用于FITC检测,并且可以作为通用指示试剂,通过FITC与其他免疫化学试剂桥联。FITC‑抗FITC抗体系统与生物素‑链霉亲和素系统具有相似的敏感性和稳定性,可以用于放大免疫检测信号,进而用于免疫检测如磁微粒分离酶联免疫检测、ELISA检测、免疫印迹检测、或流式检测等。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测领域,并具体地涉及一种单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体、包括该抗体的试剂盒及相关应用。
背景技术
异硫氰酸荧光素(FITC,Fluorescein Isothiocyanate)是一种荧光染料,能够吸收紫外光或蓝光,使得分子被激发后发出黄绿色光。一旦移除引起分子激发的紫外线或蓝光,黄绿色发光则会立刻停止。FITC的异硫氰酸基团可以与蛋白质的氨基末端或者伯胺反应,因而能够与蛋白质发生偶联,被广泛地用于抗体的标记。
FITC与抗体偶联后不丧失其抗原结合特异性,FITC偶联的抗体与待测抗原反应形成抗原-抗体复合物,该复合物上带有FITC标记,通过对FITC发光的检测,则可以快速、准确的检测出待测抗原。FITC也易与抗原结合,标记率高,FITC偶联的抗原也同理地可与待测抗体反应,形成抗原-抗体复合物,从而实现对抗体的检测。
目前现有的FITC抗体在灵敏度、特异性方面上都存在不足,还有较大的改善空间。因此,本领域仍需要一种具有高的特异性和灵敏度FITC抗体。
发明内容
如前所述,本领域需要一种具有高的特异性和灵敏度FITC抗体。
本发明人通过以FITC作为半抗原,与大分子载体蛋白偶联后诱导动物产生免疫应答,再利用杂交瘤技术获得既能无限增殖又能分泌抗FITC单抗的杂交瘤细胞株(分别命名为Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5,其中Y8D7-6E5于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45186,最后通过体外转瓶培养的方法收取上清,获得大量的抗FITC单克隆抗体,经筛选得到具有高灵敏度和高特异性的抗FITC的抗体。本发明的抗FITC抗体不仅能够用于FITC检测,而且可以作为通用指示试剂,将FITC与其他免疫化学试剂桥联。由此,实现了本发明。
在第一方面,本发明提供了一种单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体,所述抗体的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述抗体的轻链包括分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQID NO:1所示序列为GFTFX1X2F,SEQ ID NO:2所示序列为SSDSRT,SEQ ID NO:3所示序列为SRAX3YRSLX4Y,其中X1为S或I,X2为S或T,X3为F或Y,X4为E或D。
在第二方面,本发明提供了一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45186。
在第三方面,本发明提供了一种免疫检测方法,其包括使用第一方面所述的单克隆抗FITC抗体的步骤。
在第四方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括第一方面所述的单克隆抗FITC抗体以及使用说明书。
综上,本发明提供了一种具有高灵敏度和高特异性的抗FITC单克隆抗体。本发明的抗FITC抗体能够与FITC发生特异性结合,得到的FITC-抗FITC抗体系统与生物素-链霉亲和素系统具有相似的敏感性和稳定性,可用于放大免疫荧光检测信号。本发明的抗FITC抗体通过抗原-抗体反应,可以特异性地结合与FITC偶联的抗体或抗原。由于一个抗FITC抗体可以结合多个FITC,这样可以形成多级放大效应,极大地提高检测、分析的灵敏度。本发明的抗体可以用于ELISA检测,细胞捕获、分选和富集,免疫印迹检测,流式检测等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的Ab400、Ab401和Ab402单克隆抗体分别在1.268mg/mL、1.74mg/mL和1.941mg/mL的浓度下的SDS-PAGE电泳结果,每孔上样8μg。
图2示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的单克隆抗体Ab401的竞争抑制曲线。
图3示出了根据本发明的一个实施方案制备得到的单克隆抗体Ab402的竞争抑制曲线。
具体实施方式
在下文中,将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解,以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明,而无意于对本发明的范围进行限制,本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且,本领域技术人员理解,在不背离本发明的精神和主旨的情况下,可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前,提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中,例如浓度范围、百分比范围或比率范围,应当理解,除非上下文另有明确规定,否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中,并且此类实施方案也包括在所述主题内,受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中,排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中,很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述,表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外,还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外,在本文中,表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述,表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤,而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时,该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围,除非另外指出,否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此,除非相反地指出,否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值,其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少,每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用,术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链,其可变区各自包含三个CDR,即CDR1、CDR2和CDR3。因此,各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义:Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991));Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987;196:901-917;Chothia et al.,Nature 1989;342:878-883;Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009;38(suppl_1):D301-D307。
在本文中,发明人使用了Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。根据Chothia等人的编号系统,抗体的VH CDR1位于第26至32位,VH CDR2位于第52至57位,VH CDR3位于第99至108位,而VL CDR1位于第24至39位,VL CDR2位于第55至61位,并且VL CDR3位于第94至102位。还可以采用例如Kabat编号系统来定义CDR。根据Kabat编号系统,抗体的VH CDR1位于第31至35位,VH CDR2位于第50至66位,VH CDR3位于第99至108位,而VL CDR1位于第24至39位,VL CDR2位于第55至61位,并且VL CDR3位于第94至102位。然而,可以理解,应用任一定义来定义抗体的CDR,也在如本文所定义和使用的术语的范围内。
如本文中所使用,术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段,也即除可能自发出现的自然突变外,一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,MilsteinC.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].nature,1975;256(5517):495),但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中使用的,术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用;术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
在本发明中,还采用引物对编码抗体的核苷酸序列进行了PCR扩增。在引物序列中,一些位点仅仅涉及单独的一种碱基,如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)中的任一种,而一些位点却涉及两种、三种或者四种碱基的组合,在这种情况下,这些碱基被称为彼此的简并碱基,其主要是基于密码子的简并性确定的。简并碱基可以用字母R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D、N表示,其中,R代表A/G,Y代表C/T,M代表A/C,K代表G/T,S代表C/G,W代表A/T,H代表A/T/C,B代表G/T/C,V代表G/A/C,D代表G/A/T,以及N代表A/T/C/G。
在第一方面,本发明提供了一种单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体,所述抗体的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述抗体的轻链包括分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQID NO:1所示序列为GFTFX1X2F,SEQ ID NO:2所示序列为SSDSRT,SEQ ID NO:3所示序列为SRAX3YRSLX4Y,其中X1为S或I,X2为S或T,X3为F或Y,X4为E或D。
在一个具体的实施方案中,在所述单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体中,X1为S,X2为S,X3为F,X4为E,并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5表示。
各CDR的具体序列如下(依据Chothia编码系统):
VH CDR1:GFTFSSF(SEQ ID NO:4);
VH CDR2:SSDSRT(SEQ ID NO:2);
VH CDR3:SRAFYRSLEY(SEQ ID NO:5);
VL CDR1:RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:10);
VL CDR2:RVSNRFS(SEQ ID NO:11);
VL CDR3:LQVTHVPFT(SEQ ID NO:12)。
相应地,如果采用Kabat编号系统,则该抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别表示为SFGMH、FISSDSRTIYYADTVKG、SRAFYRSLEY,VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别表示为RSSQSLENSNGNTYLN、RVSNRFS、LQVTHVPFT。
在又一个具体的实施方案中,在所述单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体中,X1为S,X2为T,X3为Y,X4为D,并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:7表示。
各CDR的具体序列如下(依据Chothia编码系统):
VH CDR1:GFTFSTF(SEQ ID NO:6);
VH CDR2:SSDSRT(SEQ ID NO:2);
VH CDR3:SRAYYRSLDY(SEQ ID NO:7);
VL CDR1:RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:10);
VL CDR2:RVSNRFS(SEQ ID NO:11);
VL CDR3:LQVTHVPFT(SEQ ID NO:12)。
相应地,如果采用Kabat编号系统,则该抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别表示为TFGMH、FISSDSRTIYYTDTVKG、SRAYYRSLDY,VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别表示为RSSQSLENSNGNTYLN、RVSNRFS、LQVTHVPFT。
在又一个具体的实施方案中,在所述单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体中,X1为I,X2为T,X3为Y,X4为D,并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:9表示。
各CDR的具体序列如下(依据Chothia编码系统):
VH CDR1:GFTFITF(SEQ ID NO:8);
VH CDR2:SSDSRT(SEQ ID NO:2);
VH CDR3:SRAYYRSLDY(SEQ ID NO:9);
VL CDR1:RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:10);
VL CDR2:RVSNRFS(SEQ ID NO:11);
VL CDR3:LQVTHVPFT(SEQ ID NO:12)。
相应地,如果采用Kabat编号系统,则该抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别表示为TFGMH、FISSDSRTIYYTDTVKG、SRAYYRSLDY,VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别表示为RSSQSLENSNGNTYLN、RVSNRFS、LQVTHVPFT。
在一个优选的实施方案中,所述抗体是由2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏号为CGMCC No.45186的杂交瘤细胞生产的。
在本发明的抗体中,可以使用任何构架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列,也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。需要注意的是,在本文中,所谓“原FR或恒定区”是指由各杂交瘤细胞分泌的各单克隆抗体所包含的原始FR或恒定区。本领域普通技术人员能够理解,基于原FR或恒定区的氨基酸序列进行的一个或多个修饰得到的新构架区或恒定区,仍在本发明要求保护的技术方案的范围以内。
在一个更具体的实施方案中,所述抗体的IC50小于17ppb。
在第二方面,本发明提供了一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45186。
在第三方面,本发明提供了一种免疫检测方法,其包括使用第一方面所述的单克隆抗FITC抗体的步骤。
在一些实施方案中,所述单克隆抗FITC抗体作为包被抗体使用。所述包被抗体结合至固相。在一些实施方案中,所述包被抗体可以用于包被固相支持物。在一些实施方案中,固相支持物没有特别限制,其可以是例如磁性颗粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。
在一个具体的实施方案中,所述单克隆抗FITC抗体作为包被抗体使用。例如,本发明的单克隆FITC抗体可以作为包被抗体来包被介质如磁珠。通过与FITC的特异性结合,可以将与FITC偶联的其他免疫化学试剂如其他抗体、抗原、第二抗体等与介质如磁珠桥联。在本发明中,由于一个抗FITC抗体可以结合多个FITC,这样可以形成多级放大效应,极大地提高检测、分析的灵敏度。
在一个具体的实施方案中,所述免疫检测方法可以是磁微粒分离酶联免疫检测方法、ELISA检测方法、免疫印迹检测或流式检测方法。例如,在磁微粒分离酶联免疫检测中,用抗FITC抗体包被磁微粒,通过抗FITC抗体-FITC之间的特异性结合,可以使FITC标记的抗体(或抗原)间接偶联到磁微粒上,间接偶联的抗体(或抗原)可以特异性地捕获样品中的待测物质,再加入酶标抗体和显色底物,就可以对样品中的待测物质进行检测。结合外磁场的施加,则可以轻易地将样品中与磁珠偶联的待测物质分离,从而实现快速灵敏的检测。
在一个进一步具体的实施方案中,所述磁微粒分离酶联免疫检测方法可以为磁微粒化学发光免疫检测方法。本领域技术人员能够理解,FITC作为荧光染料能够被紫外光或蓝光激发而发出黄绿色光,通过对FITC发光的检测,则可以快速准确的检测出经外磁场而分离得到的待测物质。
在又一个进一步具体的实施方案中,所述ELISA检测为胶体金法。
例如,以FITC标记特异性抗体,再以胶体金标记抗FITC抗体,检测线(T线)为与所述FITC标记特异性抗体结合相同抗原的配对抗体,划膜得到检测线(T线)。按照免疫试纸条制备方式,组装得到免疫层析检测试纸。检测时,阳性样品中存在的抗原,与FITC标记特异性抗体结合,经进一步层析与胶体金标记抗FITC抗体结合形成复合物,所述复合物在T线处与包被抗体结合,形成夹心复合物,此处胶体金发生聚集沉淀显示红色,指示样品为阳性。在这种情况下,经由这种FITC-抗FITC抗体系统将样品中可能存在的抗原与胶体金桥联。本发明的这种FITC-抗FITC抗体系统不仅表现出与生物素-链霉亲和素系统相似的敏感性和稳定性,而且能够放大免疫检测信号。
利用本发明的单克隆抗FITC抗体与FITC之间的特异性结合、FITC-抗FITC抗体系统的敏感性和稳定性、以及一个抗FITC抗体结合多个FITC的放大效应,除前述的免疫检测之外,本领域技术人员能够理解,本发明的单克隆抗FITC抗体还可以进行免疫印迹检测、或流式检测,例如细胞的捕获、分选和富集等等。
在第四方面,本发明提供了一种试剂盒,其包括第一方面所述的单克隆抗FITC抗体、以及使用说明书。
实施例
在下述实施例中,示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明,其中采用的试验方法均为常规方法,并且如无特殊说明,下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意,本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的,无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下,本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1:抗FITC单克隆抗体的制备
抗原偶联和免疫:将FITC与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次,每次免疫间隔2周,免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将偶联BSA的FITC与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经背部皮下多点注射,后三次免疫将偶联BSA的FITC与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经腹腔注射。第四次免疫后7天,对小鼠断尾采血,分离血清,采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平,以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1:10000的小鼠进行细胞融合实验,在细胞融合实验前3天用不加佐剂的FITC-BSA经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立:融合当天,在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例融合,充分混匀,在与PEG融合前,洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500,轻轻振荡,以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞,再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中,并且在37℃、5%CO2条件下培养细胞。培养4至7天后,改用HT培养基进行培养,当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时,取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选:取卵清蛋白(OVA)偶联的FITC,用包被缓冲液(0.05mol/L,pH9.6,PBS)稀释,最终浓度为1μg/ml,以100μL/孔加入至96孔板中,于4℃包被过夜;弃包被液,用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次,拍干;用含3%脱脂奶的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干;将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)底物,100μL/孔,室温避光显色10min;每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下,检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1,以测定孔(FITC-BSA)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化:将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后,稀释成100个细胞/10mL培养基,将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。6-7天后,显微镜下可观察到克隆细胞的形成,标记出单个克隆生长孔,取出细胞上清,进行ELISA检测(与上述融合检测相同),选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得三株稳定分泌抗FITC抗体的细胞株,分别命名为杂交瘤细胞株Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5。
细胞上清单抗的制备与纯化:将这三株细胞株用含15%血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养,当扩培至约4×107个/皿时,以800rpm离心5min,弃上清并将细胞转移到2L转瓶中,加入无血清培养基,使细胞密度约为3×105个/ml,转瓶培养。继续培养1~2周后,当细胞死亡率达到80%-90%时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml),收取细胞悬液,以6000rpm高速离心20min,取上清,对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由Y3B8-2C8杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作Ab400;将由Y3G10-5G5杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作Ab401;将由Y8D7-6E5杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作Ab402。
经微量分光光度计鉴定,Ab400、Ab401和Ab402单克隆抗体的浓度分别为1.268mg/mL、1.74mg/mL和1.941mg/mL。将纯化后的单抗分装(100μL/管,浓度为1mg/ml),并保存在4℃-8℃。用SDS-PAGE电泳鉴定三种抗体(每孔上样8μg),结果如图1所示。从该图中可以看出,三个抗体均出现约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测:用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析三株单克隆抗体,在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下,利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比,纯度均达到大于98%。
实施例2:间接ELISA法检测抗体效价
用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释OVA偶联的FITC,使其浓度为1μg/ml,以100μL/孔加入至96孔酶标板,于4℃包被过夜,在自动洗板机上用PBST洗涤3次,拍干。用含3%脱脂奶粉的PBST封闭,100μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗FITC单克隆抗体Ab400、Ab401和Ab402进行梯度稀释,得到不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板,于37℃孵育1h,洗涤3次,拍干。加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干。TMB底物以100μL/孔加入,于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值,以形成明显梯度的阳性反应的最高稀释倍数作为抗体的效价,具体测试参数和结果见下表1。本发明的三种抗体的效价均达到500K。这证明了本发明的抗体效价高,具有很好的亲和力。
表1:抗体效价检测的参数和结果
实施例3:单克隆抗体特异性分析
采用间接ELISA法,用1μg/ml的卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、FITC-OVA分别包被酶标板,100μL/孔,检测杂交瘤细胞培养上清,测定本发明的三株单克隆抗体与这些蛋白的交叉反应的OD450nm值,判断抗体的特异性,三株单克隆抗体稀释倍数为1:100K,以100μL/孔加入稀释的单克隆抗体,经显色后,结果具体如下表2:
表2:抗体与OVA、BSA和FITC-OVA的交叉反应的OD450nm
由上表2的结果可知,本发明的这三种抗FITC抗体对FITC具有特异性识别活性,与OVA、BSA无交叉反应。这证明了本发明的抗体具有很高的特异性。
实施例4:间接竞争ELISA法检测抗体
在本实施例中,以竞争ELISA法进一步对筛选出的3株单克隆抗体进行了测定,该方法包括样品稀释、抗原包被、封闭、加单抗、加酶标抗体、显色与终止、测定OD450nm读数,数据处理。
具体地,在该间接竞争ELISA检测方法中:取100μL 1μg/ml的包被抗原FITC-OVA加入至96孔酶标板小孔中,包被过夜。然后将经FITC-OVA包被的96孔酶标板用PBST洗涤液洗涤两次,加入封闭液(3%脱脂奶粉/洗涤液)室温封闭2小时,将封闭液倒掉,得到封闭后的酶标板。将本发明的三种抗体做100K稀释,得到待测样品。将该待测样品以每孔100μL加入到封闭后的酶标板中,然后加入50μL 100ppb的FITC标准品,混匀,室温孵育1小时,将上清液倒掉,用洗板机洗2次。加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,酶标抗体的稀释浓度为1:4000,每孔50μL,于室温孵育1小时,用洗涤液洗3次,吸水纸上拍干。加入新鲜配制的100μLTMB显色反应底物,室温显色30分钟后用2mol/L H2SO4终止反应,读取波长450nm处的吸光度OD450nm。最后,利用测定的吸光值OD450nm计算出吸光度百分数(%)=(B/B0)×100%,其中B为加入竞争物FITC的检测孔的OD450nm,B0为未加竞争物的对照孔的OD450nm,抑制率为100%减去吸光度百分比。具体结果如表3所示。
表3:抗体的间接竞争ELISA检测结果
在间接竞争ELISA中,抗体是限量的,加入的游离标准品FITC与包被的固相FITC-OVA抗原一起竞争地与抗FITC抗体结合,固相吸附的抗FITC抗体与游离标准品FITC的加入量成反比。以梯度稀释的标准品FITC与包被抗原竞争,当加入标准品FITC浓度在125ppb附近,吸光度百分比小于10%,即抑制率>90%。标准品FITC浓度在15ppb附近,吸光度百分比约50%,达到约一半抑制。在标准品FITC浓度为100ppb时,三种抗体的吸光度百分比分别为15.59%、33.06%和18.21%,即抑制率分别达到了84.41%、66.9%和81.79%,这显示出三株抗体有很好的亲和力和特异性。
实施例5:抗FITC抗体的IC50测定
将溶于碳酸盐(CB)缓冲液的浓度为1μg/ml的FITC-OVA以50μL/孔加入到96孔酶标板的小孔中,于4℃封闭过夜。然后将经FITC-OVA包被的96孔酶标板用洗涤液(含有0.05%Tween的PBS缓冲液)洗两次。加入封闭液(3%脱脂奶粉/洗涤液)室温封闭2小时。以1:100000预稀释抗FITC抗体(纯化后的单克隆抗体)。将FITC游离小分子预调整到合适起始浓度,随后在稀释板上做倍比稀释,共八个梯度(0.0006μg/ml至1μg/ml,每一浓度均作三复孔)。将封闭液倒掉,加入50μL不同稀释度的FITC溶液,然后加入100μL稀释的抗体,混匀。室温孵育1小时,将上清液倒掉,用洗涤液洗板2次,然后加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG抗体,室温孵育1小时,用洗涤液洗2次,加入100μl TMB显色反应底物,于室温显色30分钟后用2mol/L H2SO4终止反应,读取波长450nm处的吸光度。
然后,以竞争物FITC竞争浓度为横坐标,以加入竞争物FITC的检测孔的OD450nm(B)与未加竞争物的对照孔的OD450nm(B0)的比例(B/B0%,称为结合率)为纵坐标制作竞争抑制曲线,得到IC50。图2为单克隆抗体Ab401的竞争抑制曲线。其中,游离FITC与包被的FITC-OVA竞争结合FITC抗体,洗涤后加入酶标二抗,显色读取波长450nm处吸光度,计算结合率,X值为FITC游离小分子浓度取对数,Y值为结合率。经计算,结合率50%时,X值为16.9μg/L,即IC50。按此方法,做单克隆抗体Ab400和Ab402的竞争抑制曲线,单克隆抗体Ab402的竞争抑制曲线如图3所示,计算IC50,结果如表4所示,表明本发明的三株抗FITC单克隆抗体Ab400、Ab401和Ab402的IC50分别为15.6ppb、16.9ppb和14.8ppb(1ppb等同于1μg/L),该结果表明本发明的三株FITC单克隆抗体均具有高灵敏度。
表4:本发明的三株抗FITC单克隆抗体的IC50
实施例6:抗FITC杂交瘤细胞株抗体Ab400、Ab401和Ab402可变区序列的克隆和测序
从杂交瘤细胞株Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5克隆分离总RNA,通过反向转录制备cDNA,以从Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5克隆免疫球蛋白序列,进而对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
(1)RNA的提取:参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书,对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取,并立即进行下述反转录的步骤;
(2)将RNA反转录成为cDNA:参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit聚合酶(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录,制得cDNA,冻存于-20℃备用;
(3)可变区序列的PCR扩增及回收:以步骤(2)中所得cDNA为模板,用下表5中给出的重链引物MulgVH5’-A和MulgGVH3’-2,通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA;相似地,用下表5中给出的轻链引物MuIgκVL5'-G和MuIgκVL3'-1,通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA,对PCR产物进行回收;PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。
表5:引物序列
(4)可变区序列的克隆和序列测定:按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书,将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
对测序得到的杂交瘤细胞株Y3B8-2C8、Y3G10-5G5和Y8D7-6E5的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析。经分析,重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表6所示。
表6:三种抗体的重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
Claims (10)
1.一种单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体,所述抗体的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述抗体的轻链包括分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQ ID NO:1所示序列为GFTFX1X2F,SEQ ID NO:2所示序列为SSDSRT,SEQ ID NO:3所示序列为SRAX3YRSLX4Y,其中X1为S或I,X2为S或T,X3为F或Y,X4为E或D。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体,其中,X1为S,X2为S,X3为F,X4为E,并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:5表示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体,其中,X1为S,X2为T,X3为Y,X4为D,并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:7表示。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗硫氰酸荧光素(FITC)抗体,其中,X1为I,X2为T,X3为Y,X4为D,并且所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:9表示;优选地,所述抗体是由2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏号为CGMCC No.45186的杂交瘤细胞生产的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗FITC抗体,其中,所述抗体的IC50小于17ppb。
6.一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞于2022年06月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45186。
7.一种免疫检测方法,其包括使用权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗FITC抗体的步骤。
8.根据权利要求7所述的免疫检测方法,其中,所述免疫检测方法为磁微粒分离酶联免疫检测方法如磁微粒化学发光免疫检测方法、ELISA检测方法如胶体金法、免疫印迹检测、或流式检测方法。
9.根据权利要求7或8所述的免疫检测方法,其中,所述单克隆抗FITC抗体连接至固相,固相例如是磁性微粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。
10.一种试剂盒,其包括权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗FITC抗体以及使用说明书。
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